专利名称：一种检测鸡脂肪性状的方法
技术领域：
本发明涉及检测鸡脂肪性状的方法，特别是涉及一种利用PGC-1α基因的单核苷酸多态性检测鸡脂肪性状的方法。
背景技术：
伴随着肉鸡业的兴起，肉鸡育种技术和生产规模不断发展，使肉鸡生产性能得到了很大程度地提高。但是，育种过程中对肉鸡生长速度的过度追求也带来了两大负面影响，即鸡体内脂肪沉积过多和肉品质下降。脂肪沉积过多，主要体现在腹脂沉积上，这不仅降低饲料转化率和经济效益，同时也影响到肉质风味并可造成环境污染。因此，控制脂肪在鸡体内的过多蓄积、改善胴体品质是我国和世界家禽业亟需解决的重大问题，选育低脂肉鸡品系是当今世界范围内肉鸡育种的奋斗目标之一。然而由于鸡的腹脂性状难以进行活体测量，传统的选育手段效率低下。随着分子生物学理论和技术的飞速发展，从分子生物学的角度去研究脂肪代谢的候选基因和相关分子遗传标记，通过标记辅助选择或直接基因型选择，可以在较短时间内高效地解决这一育种难题。
过氧化物酶增殖激活受体γ辅激活因子α(peroxisomeproliferators-activated receptor-γcoactivator-1α，PGC-1α)是1998年首先从小鼠棕色脂肪组织cDNA文库克隆得到的一个核受体辅激活因子，主要在富含线粒体的组织如心脏、棕色脂肪、骨骼肌、肝脏、大脑等能量需求高的部位表达。诸多研究发现PGC-1α广泛调节能量生成和利用过程，不仅可以诱导线粒体增殖、呼吸及适应性产热，也与糖尿病、运动过程中的能量代谢、肥胖等密切相关，还在脂肪酸氧化、肌肉中葡萄糖转运、骨骼肌肌纤维类型转变、软骨形成以及肝糖异生等过程中起到重要作用。此外，PGC-1α显示出极强的RNA后加工能力，参与一些核受体以及多种转录因子的激活，从而调控下游基因的表达。Ueda等(Ueda等，Possible role foravPGC-1α in the control of expression of fiber type，along with avUCP andavANT mRNAs in the skeletal muscles of cold-expressed chickens.FEBS Letters，57911-17，2005)已经成功地克隆了鸡的PGC-1α基因，其cDNA全长为2388bp，包括13个外显子，共编码796个氨基酸残基(GenBank登录号AB170013)。鉴于其在脂肪细胞分化、脂肪酸氧化以及骨骼肌纤维类型决定过程中的关键作用，PGC-1α基因现已成为研究脂肪代谢和肌肉生长发育的候选基因。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。这种变异可能是转换(C→T，在其互补链上则为G→A)，也可能是颠换(C→A，G→T，C→G，A→T)。转换的发生率总是明显高于其它几种变异，具有转换型变异的SNP约占2/3，其它几种变异的发生几率相似。
SNP检测方法常采用一些已有的成熟技术，如单链构象多态性(SSCP)、DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)等，也采用根据DNA列阵的微测序法、动态等位基因特异的杂交、寡聚核苷酸特异的连接、DNA芯片以及TaqMan系统等。但不管哪一种方法，首先必须进行靶序列的扩增，然后才能进行其它检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用鸡过氧化物酶增殖激活受体γ辅激活因子α(peroxisome proliferators-activated receptor-γ coactivator-1α，PGC-1α)基因的单核苷酸多态性检测鸡脂肪性状的方法。
本发明所提供的检测鸡脂肪性状的方法，是检测待测鸡的PGC-1α基因cDNA自5’端第646位碱基为A还是G。
如果待测鸡的PGC-1α基因cDNA序列的自5’端第646位碱基为G时，其纯合体的基因型为GG；如果鸡的PGC-1α基因cDNA序列的自5’端第646位碱基为A时，其纯合体的基因型为AA；它们的杂合体基因型为AG。
上述基因型中，GG基因型鸡的脂肪性状(腹脂重、腹脂率)显著高于AA基因型和AG基因型。GG基因型鸡的腹脂重比AA、AG基因型鸡分别高15.97g和13.96g，腹脂率分别高0.87％和0.76％，差异达到极显著水平(P＜0.01)，而其它生长相关性状(如生长速度)及屠体性状(包括胸肌重、腿肌重、肝脏重、心脏重)在不同的基因型间没有显著差异(P＞0.05)。
所述用于检测鸡脂肪性状的PGC-1α基因的单核苷酸多态性位点位于该基因的第5外显子，即PGC-1α基因的cDNA自5’端第646位碱基，该碱基的变化导致PGC-1α蛋白序列自氨基(N)端第216位氨基酸残基产生Asp和Asn之间的变化。
所述检测方法可为常规的PCR-SSCP法、DNA测序等方法。
其中，PCR扩增待测鸡的包含PGC-1α基因cDNA自5’端第646位碱基的核苷酸序列所用的引物对可为序列表中的SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。
所述检测方法中的PCR反应体系可为鸡基因组DNA 100ng，10×PCR扩增缓冲液2.0μL，dNTPs 200μmol/L，上、下游引物各50ng，Taq DNA聚合酶0.6U，Mg2+2.5mmol/L，用ddH2O补充反应体系至20μL。PCR反应条件可为先95℃变性5min；然后94℃变性20s，69℃退火20s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸7min。
本发明提供了一种利用PGC-1α基因的单核苷酸多态性检测鸡脂肪性状的方法。实验证明可以利用PGC-1α基因的cDNA自5’端第646位碱基的多态性，并根据基因型对鸡的腹脂性状进行选择，剔除不利等位基因(GG)。用本发明的方法对鸡的腹脂进行选择，可以使每只鸡的腹脂量减少约15g，使得饲料转化率大大提高，从而获得可观的经济效益。本发明为肉鸡育种工作的分子标记辅助选择提供了一个更加高效准确、简便易行的分子遗传标记，为鸡的腹脂性状改良提供了一种有效的分子标记育种手段。用该遗传标记对肉鸡的脂肪性状进行标记辅助选择，可有效地缓解实际生产中的脂肪问题，提高经济效益，并为加速改善肉鸡脂肪性状的分子育种奠定了基础，将加快育种进程。本发明的检测方法操作简单，费用低廉，准确度高，并可实现自动化的直接检测。此外，可根据本方明的方法开发出相应的检测试剂盒，用于选择携带有利等位基因(AA)的个体，为鸡的育种工作提供便利。本发明将在鸡的育种中发挥巨大作用。
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
图1为PCR-SSCP方法检测PGC-1α基因SNP基因型的结果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所有引物合成及序列测定工作均由北京华大中生基因有限公司完成。
实施例1、PCR-SSCP检测方法的建立及多态性位点的确定1、PCR扩增选择2个蛋鸡品种(白来航蛋鸡和农大3号节粮小型蛋鸡)，一个肉鸡品种(白洛克)和三个中国地方品种(东乡绿壳蛋鸡、丝羽乌骨鸡和北京油鸡)为实验材料，根据鸡PGC-1α基因的cDNA序列(GenBank登录号AB170013)设计引物，序列如下F(正向引物)5’-GACTGAGAATTCGTGGAGCA-3’(序列表中SEQ ID NO1)R(反向引物)5’-ACCTTCCCTCCAAAACCAAC-3’(序列表中SEQ ID NO2)分别以上述5个鸡种的基因组DNA为模板，在引物F和R的引导下进行PCR扩增，20μl PCR反应体系为鸡基因组DNA 100ng，10×PCR扩增缓冲液2.0μL，dNTPs200μmol/L，上、下游引物各50ng，Taq DNA聚合酶0.6U，Mg2+2.5mmol/L，用ddH2O补充反应体系至20μL。PCR反应条件为先95℃变性5min；然后94℃变性20s，69℃退火20s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸7min；4℃保温。PCR产物经琼脂糖凝胶检测后于-20℃保存。
2、SSCP分析取步骤1的PCR产物各1.5μl，分别与7μl上样缓冲液(98％甲酰胺，0.09％溴酚兰，0.09％二甲苯氰，2％甘油，0.1mol/L EDTA)混合，置于PCR仪上98℃变性10min，迅速置冰上冷却10min，再进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳(12-14h，电压8V/cm)，银染显色，根据染色结果分析基因型。结果如图1所示，上述PCR扩增产物具有两种带型，表明扩增序列存在多态性位点(SNP)，基因纯合个体经扩增产生单一条带，基因杂合个体经扩增产生两条带。
3、克隆测序及序列分析根据SSCP分析结果，将不同基因型纯合个体的PCR扩增产物用北京鼎国生物技术有限责任公司的“PCR片断快速胶回收试剂盒”并参照试剂盒说明书回收并纯化，再将回收的DNA片段与载体pGEM-T(Promega公司)连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，测序。结果两种基因纯合子个体的扩增片段分别具有序列表中SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的核苷酸序列，长度均为253bp。对两序列进行比对分析，结果两序列存在一个碱基的差异(G/A)，该多态性位点(命名位6646A)位于序列表中SEQ ID NO3和SEQ ID NO4自5’端第101位，即PGC-1α基因的cDNA自5’端第646位碱基。如果待测鸡的G646A为G时，其纯合体的基因型为GG；如果鸡的G646A为A时，其纯合体的基因型为AA；它们的杂合体基因型为AG。
实施例2、检测分子标记在不同鸡群中的多态性分布情况对2个蛋鸡品种(白来航蛋鸡和农大3号节粮小型蛋鸡)，一个肉鸡品种(白洛克)和三个中国地方品种(东乡绿壳蛋鸡、丝羽乌骨鸡和北京油鸡)用与实施例1相同的方法检测PGC-1α基因cDNA自5’端第646位碱基的G/A多态性，检测结果如表1所示。在所检测的鸡种中，白洛克肉鸡中占优势的G等位基因的基因频率为0.67，而白来航蛋鸡中占优势的A等位基因的基因频率为0.82，而在东乡绿壳蛋鸡、丝羽乌骨鸡和北京油鸡中G等位基因和A等位基因的频率接近。x2适合性检验分析结果表明这些群体中的基因型分布情况均处于平衡状态(P＞0.05)，说明在进化过程中基因频率没有受到选择的影响，所得出的结果是可信的。
表1PGC-1α基因G646A多态性在不同鸡种中的分布情况
实施例3、分子标记与脂肪性状的相关性分析为确定PGC-1α基因cDNA自5’端第646位碱基(G646A)的G/A多态性与鸡表型差异是否相关，现以白洛克×丝羽乌骨鸡的F2代群体(332只)为试验材料，用与实例1相同的方法进行多态性检测，并分析了鸡PGC-1α基因G646A不同基因型与生产性状间的相关关系。采用SAS统计分析软件GLM程序进行单标记方差分析，基因型、正反交和批次为固定效应，对屠体性状而言，屠宰时体重作为协方差引入模型中进行统计分析。
结果在所检测的332只F2个体中，AA基因型有109个，AB基因型有176个，GG基因型47个。不同基因型与生产性状间的统计分析结果如表2所示，PGC-1α基因G646A基因型不同时，脂肪性状存在极显著的差异(P＜0.01)，其中具有GG基因型鸡的腹脂重较AA、AG基因型鸡的分别高15.97g和13.96g，腹脂率分别高0.87％和0.76％，差异达到极显著的水平(P＜0.01)，而其它生长相关性状(生长速度)及屠体性状(胸肌重、腿肌重、肝脏重、心脏重)在不同的基因型间没有显著差异(P＞0.05)。用该方法对鸡的脂肪性状进行选择时可以使腹脂重降低约15g，且既不影响其生长速度，也不影响其它屠体性状，同时又能提高饲料转化率，大大提高经济效益。
表2PGC-1α基因G646A不同基因型与生长、屠体性状的相关性分析统计表
注以上数值为最小二乘均值±标准误；小写字母表示差异显著(P＜0.05)，大写字母表示差异极显著(P＜0.01)。
序列表<160>4<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1gactgagaat tcgtggagca20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2accttccctc caaaaccaac20<210>3<211>253<212>DNA<213>鸡(Gallus domestiaus)<400>3
gactgagaat tcgtggagca ataaagcgaa gagcatttgt caacaacaaa agccacaaag60acgtccctgc tctgaacttc tcaaatatct gactacgaac gatgaccctc ctcagaccaa120accagcagag aacaggaaca gcagcaaaga gaaatgcacc tccaaaagga agccccatct180gcagtctcag acaaatcacc tgcaaggtag gtgtgggagc acagaacatc ctgttggttt240tggaggggaa ggt 253<210>4<211>253<212>DNA<213>鸡(Gallus domestiaus)<400>4gactgagaat tcgtggagca ataaagcgaa gagcatttgt caacaacaaa agccacaaag60acgtccctgc tctgaacttc tcaaatatct gactacgaac aatgaccctc ctcagaccaa120accagcagag aacaggaaca gcagcaaaga gaaatgcacc tccaaaagga agccccatct180gcagtctcag acaaatcacc tgcaaggtag gtgtgggagc acagaacatc ctgttggttt240tggaggggaa ggt 25权利要求
1.一种检测鸡脂肪性状的方法，是检测鸡PGC-1α基因cDNA自5’端第646位碱基为A还是G。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述PGC-1α基因cDNA自5’端第646位碱基为G时，其纯合体的基因型为GG；所述鸡的PGC-1α基因cDNA序列的自5’端第646位碱基为A时，其纯合体的基因型为AA；它们的杂合体基因型为AG；所述GG基因型鸡的脂肪性状高于AA、AG基因型鸡，腹脂重比AA、AG基因型鸡分别高15.97g和13.96g，腹脂率分别高0.87％和0.76％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述检测方法为PCR-SSCP法。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述PCR扩增待测鸡的包含PGC-1α基因cDNA自5’端第646位碱基的核苷酸序列所用的引物对为序列表中的SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述PCR反应体系为鸡基因组DNA 100ng，10×PCR扩增缓冲液2.0μL，dNTPs 200μmol/L，上、下游引物各50ng，Taq DNA聚合酶0.6U，Mg2+2.5mmol/L，用ddH2O补充反应体系至20μL。
6.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述PCR反应条件为先95℃5min；然后94℃20s，69℃ 20s，72℃ 45s，共35个循环；最后72℃ 7min。
全文摘要
本发明公开了一种检测鸡脂肪性状的方法。该方法是检测鸡的PGC－1α基因cDNA自5’端第646位碱基为A还是G。本发明为肉鸡育种工作的分子标记辅助选择提供一个更加高效准确、简便易行的分子遗传标记，为鸡的腹脂性状改良提供了一种有效的分子标记育种手段。用该遗传标记对肉鸡的脂肪性状进行标记辅助选择，可有效地缓解实际生产中的脂肪问题，提高经济效益，并为加速改善肉鸡脂肪性状的分子育种奠定了基础，将加快育种进程。本发明的检测方法操作简单，费用低廉，准确度高，并可实现自动化的直接检测。本发明将在鸡的育种中发挥巨大作用。
文档编号C12Q1/68GK1900316SQ20061008880
公开日2007年1月24日 申请日期2006年7月18日 优先权日2006年7月18日
发明者杨宁, 吴桂琴 申请人:中国农业大学