专利名称：vasostatin－荧光素酶的融合蛋白及其制法和用途的利记博彩app
技术领域：
本发明属于基因表达显像领域。具体地说，本发明涉及一种治疗基因-血管生成抑制因子vasostatin和生物发光显像报告基因-萤火虫荧光素酶(以下简称fluc)的融合蛋白，该融合表达载体的构建，涉及用双荧光素酶报告系统筛选出荧光素酶活性最佳的融合蛋白，涉及用生物发光显像技术进行体外显像进一步了解融合蛋白的活性。
背景技术：
血管生成是指从已存在的血管系统生成新的血管的过程。很多研究表明实体瘤的发生、发展以及转移都与血管生成密切相关。利用血管生成抑制剂进行的肿瘤抗血管生成治疗为实体瘤的治疗提供了新的策略。一些血管生成抑制剂如endostatin、angiostatin、TNP-470等已被发现并被应用于研究肿瘤的治疗。Vasostatin是1998年Pike等从Epstein-Barr病毒永生化细胞株的培养上清液中分离纯化出的一种血管生成抑制因子，经鉴定证实为多功能蛋白质钙网蛋白的N端1-180位氨基酸。Vasostatin在体外可抑制内皮细胞如人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖；在裸鼠肿瘤形成试验中，vasostatin可明显减低人Burkitt淋巴瘤、人结肠癌和胰腺癌的生长，延长带Meth A和LL/2c肿瘤小鼠的存活时间。
近些年来，基因治疗特别是肿瘤基因治疗发展很快。对转染基因的定位和表达进行监测，基因显像是最有效的方法。一些非侵入性的活体成像技术，如PET、SPECT MRI、超声、CT、生物发光显像和荧光显像可用于活体动物进行基因表达显像。其中，生物发光显像(Bioluminescence imaging，BLI)是利用荧光素酶，在ATP、氧气的辅助下，与外源注入的特异底物荧光素反应产生荧光，使用高度灵敏的CCD相机可观测并纪录发出的光子，进行显像。
将报告基因与所感兴趣的治疗基因偶联，通过对报告基因显像可以间接监测治疗基因的表达。这一策略需要报告基因与治疗基因能成比例且恒定的表达。治疗基因与报告基因偶联的方案包括融合表达方案、双顺反子方案、双启动子方案、双载体方案、双向转录方案等。本发明采用融合表达方案，将治疗基因(vasostatin)和报告基因(fluc)偶联构建融合表达载体，通过生物发光显像技术对报告基因fluc显像来监测治疗基因vasostatin的抗肿瘤生成作用。最终建立一种灵敏的方法，通过对报告基因显像来监测治疗基因在活体动物体内的位置、活性以及持续时间，为肿瘤基因治疗提供一个优异方法。
发明内容
本发明的一个目的就是提供一种新的具有治疗基因vasostatin和生物发光报告基因fluc两者生物活性的融合蛋白。
本发明的另一目的是提供编码所述融合蛋白的DNA、含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞。
本发明的另一目的是提供一种用生物发光显像技术在体外对融合蛋白的荧光素酶活性检测的方法。
1.本发明克隆了血管生成抑制因子vasostatin基因，该因子来源于人钙网蛋白N端1-180位氨基酸；克隆了生物发光显像报告基因——萤火虫荧光素酶基因fluc，该荧光素酶来源于北美萤火虫，已经进行了修饰以适合在哺乳动物细胞中表达；同时将上述治疗基因vasostatin与报告基因fluc串联。为使表达的融合蛋白中两个蛋白互相不干扰，并有天然的特性，在治疗基因vasostatin和报告基因fluc之间加入了四种不同长度的柔性短肽，其氨基酸序列为(GGGGS)n。
2.本发明在293ET和PC3细胞中测定了四种融合重组质粒荧光素酶的活性。其中，含柔性肽段(GGGGS)2的融合表达重组质粒(v10fl)荧光素酶活性最佳。
3.本发明用免疫印迹法检测了融合蛋白的表达情况。
3.本发明用G418筛选和分离了稳定表达V10FL融合蛋白和阳性对照Fluc的PC3细胞。
4.本发明应用生物发光显像技术进行了体外显像。阳性对照FLuc能检测到的最少细胞数为300～700/孔，而V10FL融合蛋白为1500～3000/孔。两种稳定细胞系中，每孔发出的光子数与细胞数的相关性均很好。
本发明应用基因组信息学原理、分子克隆、DNA序列测定、荧光素酶活性测定，稳定克隆筛选，生物发光显像技术等，克隆了血管生成抑制因子vasostatin基因及生物发光显像报告基因——萤火虫荧光素酶基因fluc，构建了真核表达系统表达治疗基因vasostatin和报告基因fluc偶联的融合蛋白，通过测定融合蛋白荧光素酶活性，为上述融合蛋白用于对报告基因显像来监测治疗基因在活体动物体内的位置、活性以及持续时间提供依据，为肿瘤基因治疗提供一个优异方法。
本发明的主要技术特征在于1.Vasostatin是从Epstein-Barr病毒免疫细胞株的培养上清液中分离纯化的一种血管生成抑制因子，该因子来源于人钙网蛋白N端1-180位氨基酸，具有抗肿瘤血管生成作用。
2.用pGL3basic为模板，获得生物发光显像所需的报告基因fluc的基因片段，该报告基因——荧光素酶来源于北美萤火虫，已经进行了修饰以适合在哺乳动物细胞中表达。
3.通过加入不同长度的柔性短肽将治疗基因vasostatin与报告基因fluc融合。
4.在293ET和PC3细胞中测定了融合蛋白荧光素酶的活性，筛选出了荧光素酶活性最佳的融合蛋白V10FL。
5.筛选和分离了稳定表达V10FL融合蛋白和阳性对照Fluc的PC3细胞。
6.用生物发光显像技术进行了体外显像，进一步验证了融合蛋白体外生物学活性。为融合蛋白既可用于抗肿瘤血管生成，又能用于生物发光显像以监测治疗基因的表达提供依据。
下面结合附图对本发明作进一步详细描述。
图1融合表达载体pcDNA3.1(+)/Vaso-Fluc的构建示意2vasostaitn基因和fluc基因的PCR产物经1％琼脂糖电泳分析的结果泳道1DNA分子量Marker，从上到下依次为1,857、1,058、929、383bp大小的条带泳道2vasostatin基因的位置，片段大小约540bp泳道3fluc基因的位置，片段大小约1663bp图3A图pcDNA3.1(+)/v10fl的酶切鉴定图谱泳道1DNA分子量Marker，从上到下依次为1,857、1,058、929、383bp大小的条带泳道2pcDNA3.1(+)/vaso的酶切结果，得到540bp的片段泳道3pcDNA3.1(+)/fluc的酶切结果，得到1663bp的片段泳道4pcDNA3.1(+)/v10fl的酶切结果，得到2193bp(540bp+1663bp+linker30bp)的片段B图确定pcDNA3.1(+)/v10fl融合载体中linker(GGGGSGGGGS)引入的测序结果图4在293ET(1)和PC3(2)细胞系中四种融合蛋白的荧光素酶活性图5Western blot分析检测融合蛋白V10FL在真核哺乳动物细胞293ET细胞中的表达情况1图用羊抗FLuc特异性的抗体能检测到大小约85kDa的条带，与融合蛋白V10FL预期分子量一致
2图用羊抗钙网蛋白N端特异性的抗体能检测到大小约85kDa的条带，与融合蛋白V10FL预期分子量一致图6用羊抗FLuc特异性的抗体检测稳定表达细胞群PC3前列腺癌细胞中融合蛋白的表达情况泳道1蛋白质Marker，由上至下依次为分子量175、83、62、48、33千道尔顿的条带泳道2稳定表达融合蛋白V10FL的细胞裂解液泳道3稳定表达阳性对照FLuc的细胞裂解液图7稳定表达融合蛋白V10FL和阳性对照FLuc的PC3细胞的体外生物发光显像A图稳定表达阳性对照FLuc的PC3细胞的体外显像B图稳定表达融合蛋白V10FL的PC3细胞的体外显像C图两种稳定细胞系中每孔发出的光子数与细胞数之间的相关性具体实施方式
本发明以下将结合实施例和说明附图作进一步详述实施例1本发明中使用的引物序列及用途
实施例2(1)治疗基因vasostatin的获得用Teasy-calriticulin作为聚合酶链式反应(PCR)的模板，扩增vasostatin基因，使用的引物为vaso 1#/2#(序列见实施例1)。
PCR反应的条件分别是94度5分钟后，94度30秒，60度30秒，72度延伸0秒，进行30个循环，使用Pfu酶。
利用PCR合成的vasostatin cDNA片段，得到片段的大小与预期的相同，约540bp，见图2。
(2)报告基因fluc的获得用pGL3 basic作为PCR的模板，扩增fluc基因。使用的引物分别为Luc1#/2#(序列见实施例1)。
PCR反应的条件分别是94度5分钟后，94度30秒，56度30秒，72度延伸2分钟，进行30个循环，使用Pfu酶。
PCR产物，经过Taq酶在72度条件下进行加尾反应30分钟。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定显示，扩增产物分别为540bp和1663bp左右的DNA带。PCR产物经过割胶回收后，直接和pGEM-T载体(PROMEGA公司产品)连接，连接反应按照试剂盒说明进行，在4度过夜或者室温进行1-2小时。转化连接产物于感受态DH5a细菌，涂布于含氨卞青霉素的LB固体培养基上，37度培养8小时以上，挑选单克隆进行PCR鉴定，条件同上。阳性克隆培养于LB液体培养基，提取质粒即得到基因的cDNA克隆。进行测序以进一步确定序列。
实施例3vasostatin和fluc的真核表达载体的构建使用pcDNA3.1(+)作为表达载体，将编码vasostatin的基因片段克隆到pcDNA3.1(+)的双酶切位点(BamHI/EcoRI)中，得到重组质粒pcDNA3.1(+)/vaso，反应条件为酶切在10ul体系中进行连接，其中含有1ul 10x连接缓冲液、1ul T4连接酶、100ng消化后的PCR片段、200ng消化后的载体片段、水补足10ul。在16度连接10小时以上。转化大肠杆菌DH5a，涂布于含氨卞青霉素的LB固体培养基上，37度培养8小时后，挑取单菌落进行PCR鉴定，PCR条件同上。挑取PCR阳性克隆，经过含氨卞青霉素LB液体培养后，提取质粒，经过BamHI/EcoRI双酶切鉴定得到阳性克隆。使用pcDNA3.1(+)作为表达载体，将编码fluc的基因片段克隆到pcDNA3.1(+)的双酶切位点(EcoRI/NotI)中，反应条件同上，得到重组质粒pcDNA3.1(+)/fluc。
实施例4融合表达载体的构建为使表达的融合蛋白中两个蛋白互相不干扰，并有天然的特性，本发明在治疗基因vasostatin和报告基因fluc之间加入了不同长度的柔性短肽，其氨基酸序列为(GGGGS)n。同时本发明选择将报告基因fluc放在治疗基因vasostatin的下游。本发明在fluc报告基因的上游引物加入了不同长度的Linker，一共设计了四条不同的上游引物(序列见实施例1)，分别编码不同长度的(GGGGS)短肽，包括(GGGGS)3、(GGGGS)2、(GGGGS)1以及(GGGGS)0。四条引物均引入EcoRI酶切位点，vasostatin基因的下游引物也引入EcoRI酶切位点。首先用含不同长度linker的引物PCR扩增fluc基因，经EcoRI/NotI双酶切，同时用相同的酶处理真核表达载体pcDNA3.1(+)/vaso，消化后用琼脂糖电泳回收DNA片段，在10ul体系中进行连接，其中含有1ul 10x连接缓冲液、1ul T4连接酶、100ng消化后的PCR片段、200ng消化后的载体片段、水补足10ul。在16度连接10小时以上。转化大肠杆菌DH5a，涂布于含氨卞青霉素的LB固体培养基上，37度培养8小时后，挑取单菌落进行PCR鉴定，PCR条件同上。挑取PCR阳性克隆，经过含氨卞青霉素LB液体培养后，提取质粒，经过BamH 1/NotI双酶切鉴定得到阳性克隆。最终将fluc基因连接到vasostatin基因的下游，得到融合载体pcDNA3.1(+)/v15fl(GGGGSGGGGSGGGGS)；pcDNA3.1(+)/v10fl(GGGGSGGGGS)；pcDNA3.1(+)/v5fl(GGGGS)；pcDNA3.1(+)/v0fl(GI)。
实施例5荧光素酶报告基因分析1.样品制备(1)将细胞以1×105接种于12孔板，90％汇合时用LIPOFECTAMINE2000进行转染。
(2)24-48收集细胞。PBS洗三遍，吸净残余液体，每孔加入150裂解液，室温放置15-20分钟，每隔几分钟晃动一次，使裂解液完全覆盖细胞。
(3)收集细胞裂解液，4℃12,000rpm离心2min，收集上清，-70℃保存备用。
2.报告基因活性测定使用Promega公司双荧光素酶报告系统。基本原理实验所用报告基因载体为pGL3，编码萤火虫荧光素酶。为了衡量每个孔的转染效率，实验时共转pRL-TK作为内对照，该质粒编码海肾荧光素酶。这两种酶的底物和反应缓冲液不同，可以用同一样品在同一个试管中测定。萤火虫荧光素酶反应体系为LAR II，海肾荧光素酶反应体系为Stop & Glo Reagent，均由试剂盒提供。
(1)预热荧光计，设定参数，每次延迟2秒后开始测定，测定时间为十秒。
(2)将100μl LAR II加入荧光管，接着加入20μl细胞裂解液，用枪头混匀2-3次，放入荧光计开始读数。
(3)记录萤火虫荧光素酶读数，重复一次。
(4)在同一个管中加入100μl Stop & Glo Reagent，混匀，重新放入荧光计开始测定，记录海肾荧光素酶读数，重复一次。
实施例6Western Blot分析检测目的蛋白的表达1.SDS-PAGE将细胞裂解液进行SDS-PAGE，电泳结束后不作染色处理。
2.转膜(半干法)1)SDS-PAGE结束后，将凝胶放入预冷的电转缓冲液中平衡5分钟。
2)依凝胶大小，裁剪出相同大小的厚滤纸和NC膜。于预冷的电转缓冲液中平衡5分钟。
3)于半干式电转仪的正极极板上依次放置4层厚滤纸、NC膜、凝胶和4层厚滤纸，赶走各层间气泡，压上负极极板。
4)在冰浴中以1.25mA/cm2的恒流进行电转。电转时间与欲转移的蛋白大小有关。25-45kDa大小的蛋白可以50mA转移30分钟。
5)电转结束后，将膜置于TBS中漂洗三次，每次5分钟。
3.抗原抗体反应1)封闭将转印膜放入杂交袋内，加入适量封闭液，室温轻摇2小时。
2)一抗反应倒掉封闭液(5％脱脂奶粉)，以购自Santa Cruz Biotechnique公司的羊抗钙网蛋白N端抗体和购自Promega公司的羊抗FLuc抗体分别作1∶200和1∶1000稀释后为一抗，于4℃过夜。
3)漂洗取出转印膜，用TBS-T(10mM Tris，150mM NaCl，0.02％Tween 20，pH 7.5)洗三次，每次10分钟。
4)二抗反应将转印膜放入杂交袋内，加入按1∶1000～2000稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG为二抗，于室温2小时。
5)漂洗取出转印膜，用TBS-T洗三次，每次10分钟。
4.显色反应辣根过氧化物酶化学发光法1)各取等体积ECL试剂A液、B液混合(按每平方厘米转印膜0.125ml ECL混合液计算)。
2)将转印膜轻轻接触滤纸吸干液体，有蛋白质的一面朝上放在保鲜膜上。
3)将ECL混合液加到转印膜上，反应3分钟，提起转印膜，轻轻接触滤纸吸干液体。
4)用保鲜膜覆盖转印膜，注意表面要平整。
5)用透明胶带将保鲜膜覆盖的转印膜固定在暗盒中，有蛋白质的一面朝上。
于暗室进行X光片曝光，冲片观察结果。
实施例7转染克隆的G418筛选和分离1.剂量-反应分析1)制备不含青霉素或链霉素的完全培养基。
2)加入0到22μl 50mg/ml的G418抗生素溶液(终浓度为0至1000μg/ml完全培养基，以200μg/ml梯度增加)。
3)用胰酶消化细胞，稀释到4000细胞/ml。
4)在6孔板的每孔中加入100μl细胞悬浮液，每孔中已预先加入2ml含稀释G418抗生素的培养基。将培养板在湿润的5％CO2中37℃孵育。每周用含G418抗生素的新鲜培养基更换培养基两次。
5)在10到14天，确定杀死所有细胞的G418抗生素最低浓度。使用紧邻的稍高的浓度进行筛选。
2.转染和筛选1)用含编码抗生素抗性基因表达序列的质粒(如pcDNA3.1(+)/v10fl)转染细胞。
2)转染后48小时，开始使用抗生素。将转染的细胞在含抗生素的培养基中培养，抗生素的浓度由剂量-反应分析确定。含抗生素的培养基每周更换两次。
10到14天后，可以观察到抗性克隆，未转染的对照应该没有细胞生长。此时可以用原来抗生素浓度的一半来维持。根据需进行传代。
实施例8体外生物发光显像生物发光显像由IVIS显像系统(Xenogen)完成。
将权利要求6所述的细胞按倍比稀释的方式(100,000-196个细胞)接种于96孔板，等到90％满度时，每孔加入荧光素至终浓度为150μg/ml，37℃、5％CO2孵箱中孵育7～10分钟，将96孔板置于成像暗箱中显像1分钟，用Xenogen公司的IVIS显像系统进行图像获取及分析。
权利要求
1.一种融合蛋白，其特征在于，它包括(1)血管生成抑制因子vasostatin，该因子来源于人钙网蛋白N端1-180位氨基酸，蛋白大小为20千道尔顿(kDa)；(2)生物发光显像报告基因——萤火虫荧光素酶(firefly luciferase，以下简称fluc)，该荧光素酶来源于北美萤火虫，已经进行了修饰以适合在哺乳动物细胞中表达，蛋白大小为65千道尔顿(kDa)；以及(3)位于治疗基因vasostatin与fluc报告基因之间的四种不同长度的柔性短肽，其氨基酸序列为(GGGGS)n。
2.一种DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的融合蛋白。
3.一种真核表达载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的DNA分子，是pcDNA3.1(+)/Vaso-FLuc重组体。
4.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求3所述的表达载体。
5.如权利要求4所述的宿主菌，其特征在于，该宿主菌是大肠杆菌。
6.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是真核哺乳动物细胞293ET或PC3前列腺癌细胞。
7.一种活性测定方法，其特征在于，将融合蛋白转染权利要求6所述的宿主细胞，测定融合蛋白荧光素酶的生物学活性。
8.一种蛋白检测方法，其特征在于，将融合蛋白转染权利要求6所述的宿主细胞293ET，48小时后收集细胞裂解液，将细胞裂解液作十二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳，用羊抗钙网蛋白N端抗体和抗FLuc抗体作为一抗，用免疫印迹法检测目的蛋白的表达情况。
9.一种稳定表达权利要求1所述的融合蛋白的宿主细胞，其特征在于，它包括步骤在合适表达所述融合蛋白的条件下，培养权利要求6所述的宿主细胞PC3前列腺癌细胞，用G418进行筛选和分离，从而稳定表达所述的融合蛋白。
10.对权利要求9所述的细胞进行的体外生物发光显像，其特征在于，它包括步骤将权利要求9所述的细胞按倍比稀释的方式(100,000-196个细胞)接种于96孔板，等到90％满度时，每孔加入荧光素至终浓度为150μg/ml，37℃、5％CO2孵箱中孵育7～10分钟，将96孔板置于成像暗箱中显像1分钟，用Xenogen公司的IVIS显像系统进行图像获取及分析。
全文摘要
本发明提供了治疗基因——血管生成抑制因子vasostatin和生物发光显像报告基因——萤火虫荧光素酶FLuc的融合蛋白(V－FL融合蛋白)，该融合表达载体的构建方法以及用双荧光素酶报告系统筛选出荧光素酶活性最佳的融合蛋白的过程。所制备的稳定表达融合蛋白的宿主细胞能用生物发光显像技术进行体外显像。为上述融合蛋白既可用于抗肿瘤血管生成，又能用于生物发光显像以监测治疗基因的表达提供依据，为肿瘤基因治疗提供一个优异方法。
文档编号C12Q1/26GK101078018SQ20061008123
公开日2007年11月28日 申请日期2006年5月26日 优先权日2006年5月26日
发明者邱飞婵, 阴彬, 彭小忠, 袁建刚, 强伯勤, 王世真 申请人:中国医学科学院基础医学研究所, 中国医学科学院首都核医学中心