专利名称：一种棉花超氧化物歧化酶及其编码基因与应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种棉花超氧化物歧化酶及其编码基因与应用。
背景技术：
我国人多地少，粮棉生产争地的矛盾历来突出，因此如何使粮棉生产协调发展，改革耕作制度，提高复种指数是一条重要的技术途径。我国迫切需要更多适应不同地理环境的品质优良、丰产性好的短季棉新品种。目前短季棉育种中存在的突出问题是许多短季棉品种早熟早衰品质产量不佳，因此解决早熟早衰问题是短季棉育种的关键问题之一。棉花早衰主要是棉花自身的生理生化机制引起的。在棉花生长后期，提供合适光、温湿度，有些品种仍然早衰，显然早衰是由其内在因素决定的；对短季棉品种的研究表明(喻树迅，黄祯茂，姜瑞云等。清除活性氧酶类对棉花早熟不早衰特性的遗传影响[J]。棉花学报，1999，11(2)100-105 Shu-XunYU，Mei-Zhen SONG，Shu-Li FAN etal.Biochemical Genetics of Short-seasonCotton Cultivars that Express Early Maturity Without Senescence[J].Journalof integrative plant biology.2005，47(3)334-342)品种是否早衰和后期棉叶内的活性氧自由基清除酶SOD、POD、CAT等活性有关，从SOD酶活性分析显示早熟不早衰品种前期SOD酶活性高于其它类型；后期SOD酶活性明显高于其它类型且下降缓慢，曲线变化平稳，说明在不早衰类型中，SOD酶在整个生育期中能及时高效清除有害自由基，起着重要的保护作用。SOD酶是影响棉花早衰的重要酶成分之一，克隆SOD酶基因并进一步研究该酶在短季棉早熟不早衰机理中的作用是研究棉花早熟不早衰的重要手段之一。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种棉花超氧化物歧化酶及其编码基因。
本发明所提供的棉花超氧化物歧化酶，来源于棉花，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №2；2)将序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且可催化超氧自由基(O2·-)发生歧化反应的蛋白质。
反应方程
其中，序列表中的序列1由215个氨基酸残基组成。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述棉花超氧化物歧化酶编码基因也属于本发明的保护范围。
上述棉花超氧化物歧化酶的编码基因，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №1的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
高严谨条件是指杂交温度为49℃，在0.1×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下洗膜。
其中，序列表中的SEQ ID №1由1043个脱氧核苷酸组成，自5′端第98-745位脱氧核苷酸为编码序列。
含有本发明基因的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
本发明的棉花超氧化物歧化酶的编码基因可用现有的方法构建到现有的植物表达载体中，可在其转录超始核苷酸前加上包括组成型启动子、增强启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、发育阶段特异性启动子在内的任何一种启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(BAR基因、GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。携带有本发明的棉花超氧化物歧化酶的编码基因基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织。
实验表明本发明的棉花超氧化物歧化酶基因在原核表达载体中可表达具有活性的超氧化物歧化酶。本发明的棉花超氧化物歧化酶基因可用于遗传转化微生物生产商用SOD酶蛋白，可用于药物/化妆品/食品加工等领域。本发明还为转基因棉花改良提供了一个优质基因。本发明的棉花超氧化物歧化酶基因转入棉花中，可延缓棉花早衰。
图1为pET-SOD载体构建过程图2为本发明的棉花超氧化物歧化酶基因表达蛋白的PAGE图谱具体实施方式
实施例中的方法如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、本发明棉花超氧化物歧化酶基因的获得利用其它植物的同源酶蛋白的氨基酸序列设计一对兼并引物JM-15’-GCACGGCTGGCACCTC(A/C)A(C/T)GA(A/G)T(A/T)(C/T)GG-3’，JM-25’-CGAGGTCGTCCTCCGTC(T/G)C(A/G)T(A/G)(A/T/C/G)AC(A/T/C/G)AC-3’。在针刺叶片，37℃暗处理5小时诱导陆地棉(中棉所36)花叶片表达超氧化物歧化酶基因，提取叶片总RNA，RT-PCR得到基因的cDNA，利用兼并引物扩增得到保守性的基因中间片段，PCR扩增程序先95℃预变性4min，然后95℃1min，35℃2min，72℃1min，30循环；最后72℃延伸10min，PCR产物1.0％琼脂糖凝胶检测，回收胶得到特异中间片段。
以得到的特异中间片段为模板，设计一对嵌套引物chl sp15’-AATGCGGTTGTTGGAAGAGC-3’；chl sp25’-GGTTGTTGGAAGAGCATTTG-3’。采用RACE技术，进行PCR扩增，扩增程序为先95℃预变性4min，94℃30sec，58℃30sec，72℃2min 36个循环最后72℃延伸10min，PCR产物1.0％琼脂糖凝胶检测，回收胶后，测序(上海生物工程技术有限公司)得到基因3′序列。
以得到的特异中间片段为模板，设计一条反转录引物chl-RT5’-(P)TTCCAACAACCG-3’，和两对嵌套引物chl s15’-AATGCGGTTGTTGGAAGAGC-3’chl s25’-TTGTAGTTTATGAGACGGAG-3’；chl a15’-ATTGTTGCCTCTGCCACTCC-3’chl a25’-GTTGCCTCTGCCACTCCATC-3’进行PCR扩增，反应程序为先95℃预变性4min，94℃30sec，55℃30sec，72℃1.5min 36个循环；最后72℃延伸10min，PCR产物1.0％琼脂糖凝胶检测，回收胶后，测序(上海生物工程技术有限公司)得到基因的5′序列；利用序列软件拼接三段，得到全长基因序列；在起始密码子和终止子处设计一对引物，ZY-15′-GTCGCGGATCCATGGCTGCCCCATATTTTCC-3′(BamHI)，ZY-25′-GCGACAAGCTTTATACCGGAGTCAAGCC-3′(HindIII)，以cDNA为模板，反应程序为先95℃预变性4min，94℃30sec，55℃30sec，72℃1.5min 36个循环最后72℃延伸10min；PCR扩增体系为10x Buffer 5ul，d NTP(2.5Mm)4ul，ZY-1(20mM)1ul，ZY-2(20mM)1ul，cDNA 1ul，Taq酶2.5U，ddH2O补足50ul。PCR产物1.0％琼脂糖凝胶检测，扩增得到基因序列全长，经测序，得到棉花超氧化物歧化酶的基因，测序证明该基因具有序列表中序列1的核苷酸序列，自5′端第98-745位为其编码序列，编码序列表中序列2的氨基酸残基序列。
实施例2、本发明棉花超氧化物歧化酶基因的表达及其表达蛋白的功能验证。
载体pET 21a(+)购于novagen公司，表达菌株BL21(DE3)购自北京鼎国生物技术有限公司；将实施例1中引物ZY-1和ZY-2扩增得到的棉花超氧化物歧化酶的基因，用BamHI和HindIII酶切后插入到pET 21a(+)的BamHI和HindIII酶切位点之间，经过测序，得到含有具有序列表中序列1的核苷酸序列的棉花超氧化物歧化酶的基因的载体pET-SOD。
将pET-SOD转化BL21(DE3)受体菌株，筛选得到转入pET-SOD的菌株，命名为BLpET-SOD，对BLpET-SOD进行过夜培养，然后按1∶50的体积比稀释转入LB培养液，培养4小时，取1毫升培养液，所得到的菌体悬浮于0.2毫升的Laemmli缓冲液(0.0625M Tris-HCl pH 6.8，2％ SDS，10％ glycerol，5％ 2-mercaptoethanol，0.001％ bromophenol blue)中，100℃加热5分钟后离心，取30微升的上清液在12％的SDS-PAGE中进行电泳分析，蛋白质经考马斯亮蓝R250染色，脱色后鉴定。同时以转空载质粒pET 21a(+)的BL21(DE3)作为对照。
结果如图2所示，图2中，泳道M为标准分子量，从上到下依次为97.2kDa，66.4kDa，44.3kDa，29.0kDa，20.1kDa和14.3kDa，泳道1为不含质粒菌株BL21(DE3)，泳道2为转空载质粒pET 21a(+)的菌株，泳道3为BLpET-SODIPTG诱导表达4小时，泳道4为BLpET-SOD IPTG诱导表达3小时，泳道5为BLpET-SOD IPTG诱导表达2小时，泳道6为BLpET-SOD IPTG诱导表达1小时。表明经过IPTG诱导后，重组质粒pET-SOD表达一条大约25kDa的条带(箭头示)，与预期的表达目标蛋白一致，IPTG诱导表达4小时的表达量最高。pET 21a(+)载体的N端有T7·Tag序列，产生的融合蛋白被其编码的部分只有11个氨基酸，加上酶切位点编码的部分总共16个氨基酸，基因完整的阅读框架为645bp，编码215个氨基酸，可表达理论上为27.26kDa的蛋白，加上表达系统的融合蛋白部分，预期表达产物29.0kDa，SDS-PAGE图谱显示在分子量29.0kDa左右有一条明显蛋白差异带，说明已经表达目标蛋白。
采用酶溶法提取表达蛋白进行SOD酶活的测定，取10ul的BLpET-SOD在3ml LB液体培养基中，进行过夜培养12小时，然后取1ml稀释转入50ml LB培养液，培养4小时。同时以转pET 21a(+)菌株进行上述同样处理做为对照。
将BLpET-SOD培养液和转pET 21a(+)菌株培养液分别在4℃，8000g离心15分钟，弃上清，收集菌体，称重。按3ml/g湿菌体加入裂解液(50mmol/lTris-HCl，pH 8.0；1mmol/lEDTA；0.1mol/lNaCl)悬浮沉淀。按3ul/g湿菌体的比例加入50mmol/l的蛋白酶抑制剂PMSF，按100ul/g湿菌体的比例加入溶菌酶(10mg/ml)，搅拌20分钟，在搅拌同时按每克菌4mg脱氧胆酸的比例加入脱氧胆酸。4℃，8000g离心15分钟，吸取上清液转入透析袋在透析液中透析过夜，分别得到转pET 21a(+)大肠杆菌BL21(DE3)酶液和转pET-SOD大肠杆菌BL21(DE3)酶液。吸取酶液，进行SOD酶活测定实验。
采用氯化硝基四氮唑蓝(NBT)光化还原法测定SOD活力，一个酶活单位(U)定义为SOD抑制NBT光还原相对百分率为50％时的酶量作为一个酶活力单位(U)。具体方法如下取7支试管统一编号，1-2号试管每管加4ml反应液(由0.05M，pH7.8磷酸缓冲液；13mM Met；0.075mM NBT和0.1mM EDTA配成)+10ul转pET 21a(+)大肠杆菌BL21(DE3)酶液+100ul(160mmol/l)核黄素；3-4号试管每管加4ml反应液+10ul转pET-SOD大肠杆菌BL21(DE3)酶液+100ul(160mmol/l)核黄素；5-7号试管以磷酸缓冲液代替酶液做空白对照，每管加4ml反应液+10ul磷酸缓冲液+100ul(160mmol/l)核黄素。除7号试管置于暗处外，其余均为25℃、光照强度4000LX，照光15分钟，然后立即遮光停止反应。于560nm用7号试管液调零，测定OD560。以5和6号试管液光密度的平均值作为还原率100％，分别计算1-2号试管液和3-4号试管液的抑制NBT光还原的相对百分率的平均值，得出转pET21a(+)大肠杆菌BL21(DE3)上清液的SOD酶活为0.3615U/kg，转pET-SOD大肠杆菌BL21(DE3)酶液的SOD酶活为0.4256U/kg。转pET-SOD大肠杆菌BL21(DE3)酶液的SOD酶活比转pET 21a(+)大肠杆菌BL21(DE3)上清液的SOD酶活提高17％，证明克隆的棉花超氧化物歧化酶基因已经表达，本发明的棉花超氧化物歧化酶具有较高的SOD酶活性。
序列表<160>2<210>1<211>1043<212>DNA<213>棉属陆地棉(Gossypium.hirsutum)<400>1aaaacagcca cccacatcct tggctcccgt tatccccctc caaaatcctc actttcactc 60ccttcacaaa cctgaaaagc tgcggcaata gcagccaatg gctgccccat attttccacg120aacaaccccg tcccacctcg ctctctcttt tccatcctca actaaccctt caaacccacc180ggttcttctc tcctcatttc gtggggtctc tcttaagctc cctcgtcaat ccctctccct240tgctgccact attcccaaga agcccttttc tgtgtttgct gttaccaaga aagctgtcgc300tgttcttaaa ggtaattcgg aagttgaagg cgttgtcacg ttgacccagg aaaatgatgg360tcctacaact gtgaatgttc gaattactgg tcttactcct gggcctcatg gcttccacct420acatgagtat ggtgacacaa cgaatgggtg catgtctaca ggagcacatt tcaatcctaa480caatatgaca catggtgctc ctgaggatga agtacgccat gcgggtgacc tgggaaacat540aattgctaat gctgatggag tggcagaggc aacaattgtg gacaatcaga taccactaag600tggccccaat gcggttgttg gaagagcatt tgtggttcat gagcttgagg atgatcttgg660aaagggtgga catgaactta gtctaaccac tgggaatgct ggcggaagat tggcatgtgg720tgttgttggc ttgactccgg tataaatctt atcgatgaaa ccagtttggt gttgtgctat780ttgttggttg gatttggcag cttcttttat agagccgcat gtgatgttgc tttcaatgtt840gatagcgtgt tatatgagat tgtgcagaca agtatttagt cgaataacat ttgtagacct900ttgttatgtc attattctca acccaataaa aaattagcac atggcttgtg aacctgtaga960ctgtaaaact tgcctttttg agcttatgaa attttatggt gctgctggtc atcaggaaaa 1020aaaaaaaaga aaaaaaaaaa aaa 1043<210>2<211>215
<212>PRT<213>棉属陆地棉(Gossypium.hirsutum)<400>2Met Ala Ala Pro Tyr Phe Pro Arg Thr Thr Pro Ser His Leu Ala Leu1 5 10 15Ser Phe Pro Ser Ser Thr Asn Pro Ser Asn Pro Pro Val Leu Leu Ser20 25 30Ser Phe Arg Gly Val Ser Leu Lys Leu Pro Arg Gln Ser Leu Ser Leu35 40 45Ala Ala Thr Ile Pro Lys Lys Pro Phe Ser Val Phe Ala Val Thr Lys50 55 60Lys Ala Val Ala Val Leu Lys Gly Asn Ser Glu Val Glu Gly Val Val65 70 75 80Thr Leu Thr Gln Glu Asn Asp Gly Pro Thr Thr Val Asn Val Arg Ile85 90 95Thr Gly Leu Thr Pro Gly Pro His Gly Phe His Leu His Glu Tyr Gly100 105 110Asp Thr Thr Asn Gly Cys Met Ser Thr Gly Ala His Phe Asn Pro Asn115 120 125Asn Met Thr His Gly Ala Pro Glu Asp Glu Val Arg His Ala Gly Asp130 135 140Leu Gly Asn Ile Ile Ala Asn Ala Asp Gly Val Ala Glu Ala Thr Ile145 150 155 160Val Asp Asn Gln Ile Pro Leu Ser Gly Pro Asn Ala Val Val Gly Arg165 170 175Ala Phe Val Val His Glu Leu Glu Asp Asp Leu Gly Lys Gly Gly His180 185 190Glu Leu Ser Leu Thr Thr Gly Asn Ala Gly Gly Arg Leu Ala Cys Gly195 200 205Val Val Gly Leu Thr Pro Val210 21权利要求
1.一种棉花超氧化物歧化酶，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №2；2)将序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且可催化超氧自由基发生歧化反应的蛋白质。
2.权利要求1所述棉花超氧化物歧化酶的编码基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述棉花超氧化物歧化酶编码基因的编码序列为自序列1的5′端第98-745位脱氧核苷酸。
4.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述棉花超氧化物歧化酶的编码基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №1的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
5.含有权利要求2或3或4所述基因的表达载体。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于所述表达载体为pET-SOD。
7.含有权利要求2或3或4所述基因的细胞系。
8.含有权利要求2或3或4所述基因的宿主菌。
9.权利要求2或3或4所述的基因在培育抗早衰植物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述植物为棉花。
全文摘要
本发明公开了一种棉花叶绿体超氧化物歧化酶及其编码基因与应用。该棉花叶绿体超氧化物歧化酶，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №2；2)将序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有超氧化物歧化酶功能的蛋白质。该基因在原核表达载体中可表达具有活性的超氧化物歧化酶。本发明的棉花叶绿体超氧化物歧化酶基因转入棉花中，可延缓棉花早衰。
文档编号C12N15/63GK1869209SQ20061008097
公开日2006年11月29日 申请日期2006年5月26日 优先权日2006年5月26日
发明者喻树迅, 胡根海, 范术丽, 宋美珍 申请人:中国农业科学院棉花研究所