专利名称：永生化猪肝细胞的制备方法
技术领域：
本发明属于医学生物技术领域，涉及用于生物人工肝的永生化猪肝细胞的制备方法。
背景技术：
人工肝是公认为治疗肝衰竭的有效途径之一，在临床上得到广泛的应用；而且，生物人工肝是目前人工肝研究的热点和发展方向。由于猪肝细胞的大小和结构与人肝细胞相似，其生物功能和免疫功能与人肝细胞相似有较高的代谢活性，因而，大多数动物和临床的研究都是使用原代猪肝细胞。虽然原代猪肝细胞来源丰富，容易大量获取；然而，由于原代肝细胞的在体外存活时间短、传代困难、及质量控制困难等不足之处，限制了生物型人工肝的发展。获得大量的、高活性的猪肝细胞成了生物人工肝的临床应用的关键步骤和技术。目前，绝大多数均采用seglen的两步灌流法或者改良的胶原酶灌流法，得到大量的原代的猪肝细胞；并且，采用该方法需要的成本高，且耗时长，仍有一部分(5-10％)的死细胞。为此，试图通过细胞永生化的技术，得到能够无限传代，具有原代猪肝细胞功能的猪肝细胞系。国外，也曾经报道建立了永生化猪肝细胞，先构建含SV40大T抗原基因的SV40LT/Bluescript SK重组载体，通过脂质体转染的方法，将重组载体倒入到原代猪肝细胞，经过药物压力筛选获得永生化猪肝细胞，该细胞传代60代，具有P450活性，尿素合成等一定的肝细胞功能，无致瘤性。但是由于该细胞在传代过程中失去分泌白蛋白的功能，后来也未见该细胞在基础或临床上的应用报道。为了能够获得可以持久表达白蛋白等具有原代猪肝细胞功能的猪肝细胞系，本发明的目的就是改进猪肝细胞永生化的方法，而获得无致瘤性、具有分泌白蛋白等肝细胞特异功能的永生化猪肝细胞。
发明内容
本发明公开了一种永生化猪肝细胞的制备方法，该方法主要包括以下步骤(1)用Dispase-胶原酶灌流法分离猪的肝脏组织，得到高活率的新鲜原代猪肝细胞，经过24h培养后更换培养液，在浓度为8ūg/ml的polybrene存在下，用含SV40大T抗原的重组逆转录病毒的细胞上清对原代猪肝细胞进行感染，1周后，用500ūg/ml的G418进行药物压力筛选，待细胞克隆出现并生长至1.0-2.0cm时，挑取单个克隆的细胞接种于6孔板，扩大培养，获得能够传代的猪肝细胞。
(2)在浓度为8ūg/ml的polybrene存在下，用含人端粒酶逆转录酶的重组逆转录病毒的细胞上清对能够传代的猪肝细胞进行再次感染，1周后，用2ūg/ml的嘌呤霉素进行药物压力筛选，待细胞克隆出现并生长至1.0-2.0cm左右时，挑取单个克隆的细胞接种于6孔板，继而进行扩大培养，获得永生化猪肝细胞。
上述步骤(1)中所述含SV40大T抗原重组病毒载体的逆转录构建方法是以SV40 DNAstrain 776为模板，用PCR方法扩增约2400bp的SV40大T基因的DNA片段，经EcoRI/BamH I内切酶的酶切、克隆、测序，获得SV40 LT/pLXSN重组逆转录病毒载体。
上述步骤(2)中所述含人端粒酶逆转录酶重组逆转录病毒载体的构建方法是用EcoRI内切酶将hTERT从PIRES2-EGFP-hTERT亚克隆至pLPCX逆转录病毒载体，经酶切和测序鉴定，获得hTERT/pLPCX重组逆转录病毒载体。
用标准的磷酸钙沉淀法分别将重组逆转录病毒载体SV40 LT/pLXSN和hTERT/pLPCX转染至对数生长期的PT67细胞，分别经过G418和嘌呤霉素药物筛选，获得耐G418和嘌呤霉素药物的两种产毒细胞株，含SV40大T抗原的高滴度的逆转录病毒的细胞上清，以及人端粒酶逆转录酶的高滴度的逆转录病毒的细胞上清。
本发明采用逆转录病毒载体的方法将SV40大T抗原基因和人端粒酶逆转录酶导入到原代猪肝细胞，建立了永生化猪肝细胞系。所获得的永生化猪肝细胞具有原代猪肝细胞的类似的典型形态学特征，和如氨代谢、尿素合成等生物学功能，传代100代后，仍能够继续分泌白蛋白，且不具有致瘤性，细胞增殖速度快，每隔6小时细胞数增加一倍。
具体实施例方式
1、含SV40大T抗原重组逆转录病毒载体的构建以上游引物5’-GCCCAGGATCCTTAACAACAACAACAAT-3’，下游引物5’-ACGCTGAATTCCCTCTGAGCTAT-3’为引物，以SV40DNA(strain 776)为模板，用高保真长片断PCR方法扩增约2400bp的SV40大T DNA片段，分别经EcoR I/BamH I内切酶双酶切后，插入至pLXSN逆转录病毒载体的EcoR I/BamH I位点；然后，用T4连接酶22℃连接，转化至感受态E.coli DH5-alpha大肠杆菌，37℃培养过夜，经x-gal筛选，挑选无色菌落接种于3ml LB液中，37℃培养过夜，用质粒纯化试剂盒纯化重组质粒；经酶切和测序鉴定，序列准确无误后，将含有SV40 LT重组质粒的大肠杆菌扩大培养，用Endotoxin-Free的质粒纯化试剂盒纯化SV40 LT/pLXSN重组逆转录病毒载体，供生产重组逆转录病毒用。
2、含人端粒酶逆转录酶重组逆转录病毒载体的构建用EcoR I内切酶酶切PIRES2-EGFP-hTERT质粒得到hTERT cDNA片段，去磷酸化后，将其亚克隆至pLPCX逆转录病毒载体多克隆位点的EcoR I位点；然后，用T4连接酶22℃连接，转化至感受态E.coli DH5-alpha大肠杆菌，37℃培养过夜，经x-gal筛选，挑选无色菌落接种于3ml LB液中，37℃培养过夜，用质粒纯化试剂盒纯化重组质粒；经酶切和测序鉴定，序列准确无误后，将含有hTERT重组质粒的大肠杆菌扩大培养，用Endotoxin-Free的质粒纯化试剂盒纯化hTERT/pLPCX重组逆转录病毒载体，供生产重组逆转录病毒用。
3、产生重组逆转录病毒细胞株的建立、筛选，以及病毒滴度的测定将含有人端粒酶逆转录酶重组逆转录病毒载体(hTERT/pLPCX)和含SV40大T抗原重组逆转录病毒载体(SV40 LT/pLXSN)各10ūg，分别用标准的磷酸钙沉淀法转染至对数生长期的PT67细胞，转染24h后，用10％DMSO处理2分钟，换新鲜培养液，转染72h后，经转染hTERT/pLPCX的细胞用4ūg/ml的嘌呤霉素，经SV40 LT/pLXSN用500ūg/ml的G418进行药物压力筛选1-3周，待细胞克隆生长至1.0-2.0cm时，挑取细胞克隆，扩大培养，获得耐G418和嘌呤霉素药物的两种产毒细胞株；同时收集培养上清液过0.45ptm的低蛋白吸附的一次性滤器，分装后置-70℃保存。
生长状态良好的NIH 3T3细胞常规培养24h至60％汇合，将制备好的两种病毒液相应作10-2、10-4、10-6倍稀释，加入polybrene至终浓度为8ūg/ml。弃去细胞培养液，将稀释好的1ml的病毒液分别加入到NIH 3T3细胞培养皿中，常规培养5h，补加2ml含10％胎牛血清的培养基常规培养24h，更换含10％胎牛血清的培养基，每3d，分别更换为含4ūg/ml的嘌呤霉素和500ūg/ml的G418培养液，培养14d待长出肉眼可见的集落后，倾去培养液，以纯甲醛固定后用Giemsa染色并计数，得到两种细胞上清的病毒滴度，含有人端粒酶逆转录酶重组逆转录病毒载体(hTERT/pLPCX)和含SV40大T抗原重组逆转录病毒载体(SV40LT/pLXSN)的细胞上清的病毒滴度分别为2.0×107和8.0×105。
4、原代猪肝细胞的分离及其永生化采用Dispase-胶原酶四步灌流法分离杜洛克猪肝组织，得到较高活率的新鲜原代猪肝细胞。将新鲜分离的猪肝细胞以8.0×105个浓度接种到T25塑料培养瓶中，细胞培养液中含10mg/L HGF，10ug/L EGF，250IU/L胰岛素、200ug/L地塞米松，2mmol/L的谷氨酰胺，10％的胎牛血清，置于37℃，5％CO2培养箱中。
24h后更换培养液，用含SV40大T抗原的重组逆转录病毒的细胞上清，对新鲜培养的原代猪肝细胞进行感染(polybrene浓度为8ūg/ml)，1周后用500ūg/ml的G418进行药物压力筛选4周，细胞克隆出现后，待细胞克隆生长至1.0-2.0cm时，挑取细胞克隆接种于6孔板，继而进行扩大培养。
再用含人端粒酶逆转录酶的重组逆转录病毒的上清对能够传代的猪肝细胞进行再次感染(polybrene浓度为8ūg/ml)，1周后用2ūg/ml的嘌呤霉素进行药物压力筛选，待细胞克隆生长至1.0-2.0cm，挑取细胞克隆接种于6孔板，继而进行扩大培养。
进一步做细胞形态学，生物学功能进行鉴定。
普通光镜的形态学观察发现，转染细胞呈典型的上皮细胞样贴壁生长，细胞增殖较快，呈椭圆形，梭形。超微结构观察发现永生化猪肝细胞具有原代猪肝细胞的大多数典型特征，如胞浆内含有丰富的糖原颗粒、大量的线粒体和粗面内质网，细胞间可见毛细胆管的形成以及各种细胞间的连接结构和典型的双核细胞。经RT-PCR检测白蛋白，al抗胰蛋白，asialoglycoprotein receptor，b-actin的mRNA的表达，以及端粒酶的mRNA的表达，SV40LT的mRNA的表达。并具有尿素合成和P450活性的生物学功能。
Western blot检测到永生化猪肝细胞的细胞抽提物中白蛋白的表达，端粒酶和SV40LT蛋白的表达，永生化猪肝细胞传代100代后，用ELISA定量法仍然可以检测到永生化猪肝细胞的细胞培养上清猪的白蛋白。细胞生长曲线观察结果表明永生化猪肝细胞系典型的“S”特征，传代一次只需3～4天时间，每隔6小时细胞数增加一倍。永生化猪肝细胞接种裸鼠体内，6个月后无肿瘤形成。以上实验均表明永生化猪肝细胞具有与原代猪肝细胞的类似的形态和生物学功能，永生化猪肝细胞同样具有表达和分泌ALB，尿素合成的能力、以及细胞色素P450活性，并且无潜在的致瘤性。
本发明方法所制备的永生化猪肝细胞作为生物型人工肝的肝细胞材料在生物型人工肝中起着重要作用，将为生物人工肝、细胞移植及体外药物代谢模型等提供理想的肝细胞源。
权利要求
1.永生化猪肝细胞的制备方法，其特征在于以下步骤(1)用Dispase-胶原酶灌流法分离猪的肝脏组织，得到高活率的新鲜原代猪肝细胞，经过24h培养后更换培养液，在浓度为8ūg/ml的polybrene存在下，用含SV40大T抗原的重组逆转录病毒的细胞上清对原代猪肝细胞进行感染，1周后，用500ūg/ml的G418进行药物压力筛选，待细胞克隆出现并生长至1.0-2.0cm时，挑取单个克隆的细胞接种于6孔板，扩大培养，获得能够传代的猪肝细胞。(2)在浓度为8ūg/ml的polybrene存在下，用含人端粒酶逆转录酶的重组逆转录病毒的细胞上清对能够传代的猪肝细胞进行再次感染，1周后，用2ūg/ml的嘌呤霉素进行药物压力筛选，待细胞克隆出现并生长至1.0-2.0cm时，挑取单个克隆的细胞接种于6孔板，继而进行扩大培养，获得永生化猪肝细胞。
2.按权利要求1所述永生化猪肝细胞的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述含SV40大T抗原重组逆转录病毒载体的构建方法是以SV40DNA为模板，用PCR方法扩增约2400bp的SV40大T基因的DNA片段，经EcoR I/BamH I内切酶的酶切、克隆、测序，获得SV40LT/pLXSN重组逆转录病毒载体。
3.按权利要求1所述永生化猪肝细胞的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述含人端粒酶逆转录酶重组逆转录病毒载体的构建方法是用EcoR I内切酶将hTERT从PIRES2-EGFP-hTERT亚克隆至pLPCX逆转录病毒载体，经酶切和测序鉴定，获得hTERT/pLPCX重组逆转录病毒载体。
4.按权利要求1所述永生化猪肝细胞的制备方法，其特征在于用标准的磷酸钙沉淀法分别将重组逆转录病毒载体SV40LT/pLXSN和hTERT/pLPCX转染至对数生长期的PT67细胞，分别经过G418和嘌呤霉素药物筛选，获得耐G418和嘌呤霉素药物的两种产毒细胞株，含SV40大T抗原的高滴度的逆转录病毒的细胞上清，以及人端粒酶逆转录酶的高滴度的逆转录病毒的细胞上清。
全文摘要
永生化猪肝细胞的制备方法，包括以下步骤用Dispase－胶原酶灌流法获高活率的新鲜原代猪肝细胞，经过24h培养后，在浓度为8ūg/ml的polybrene存在下，用含SV40大T抗原的重组逆转录病毒的细胞上清对原代猪肝细胞进行感染，1周后，用500ūg/ml的G418进行药物压力筛选，待细胞克隆出现并生长至1.0－2.0cm时，挑取单个克隆的细胞扩大培养，获得能够传代的猪肝细胞。在浓度为8ūg/ml的polybrene存在下，用含人端粒酶逆转录酶的重组逆转录病毒的细胞上清对能够传代的猪肝细胞进行再次感染，1周后，用2ūg/ml的嘌呤霉素进行药物压力筛选，待细胞克隆出现并生长至1.0－2.0cm左右时，挑取单个克隆的细胞扩大培养，获永生化猪肝细胞。
文档编号C12N5/06GK1869205SQ20061005085
公开日2006年11月29日 申请日期2006年5月23日 优先权日2006年5月23日
发明者李兰娟, 潘小平 申请人:浙江大学