专利名称：用微细胞团块再生法脱除丹参病毒的方法
技术领域：
本发明属于植物的提纯复壮和繁育，特别是指一种用微细胞团块再生法脱除丹参病毒的方法。
背景技术：
常规的“热处理+茎尖培养”脱除植物病毒方法存在着热处理虽钝化病毒，但持续高温处理也对植株造成伤害，甚至死亡，易造成植株干枯、死亡。脱毒处理过程时间长、效果差的问题。
发明内容
本发明的目的在于是根据植物分裂的细胞中基本未受病毒侵染，分生顶点(茎尖)或分裂细胞中不含病毒，由顶点(茎尖)或分化细胞得到的植株不含病毒或含病毒率很低这样一个基本原理。避开常规方法脱病毒的热处理过程，提供一种用微细胞团块再生法脱除丹参病毒的方法以脱除丹参中的黄瓜花叶病毒(CMV)。
本发明的整体技术构思是用微细胞团块再生法脱除丹参病毒的方法，包括如下工艺步骤(1)愈伤组织诱导将丹参外植体洗净消毒后，接种在愈伤诱导培养基上在黑暗条件下进行诱导愈伤得到诱导后的愈伤组织；(2)愈伤组织调控将诱导出的愈伤组织从母体上分离出来后，进行继代培养，使愈伤组织呈松散、颗粒状；(3)细胞悬浮培养将步骤(2)中获得的松散、颗粒状愈伤组织1～2克，压碎后接种于培养基上培养，过滤获得微小细胞团块；(4)愈伤诱导再生植株将步骤(3)中获得的微小细胞团块，转移到培养基上培养，诱导再生植株；(5)再生植株的病毒检测用酶链免疫吸附法检测，获得脱除了病毒的丹参植株并进行组培扩繁。
本发明的具体工艺步骤和工艺参数是步骤(1)中的丹参外植体包括其根茎、叶片、幼茎。
步骤(1)是将丹参外植体消毒，用水洗净，再用肥皂水刷洗，在超净工作台上采用70％酒精表面灭菌10-20秒，然后用0.1％升汞溶液灭菌1～3分钟，然后接种在愈伤诱导培养基上诱导愈伤得到诱导后的愈伤组织；其中愈伤诱导培养基配比为MS+6-BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+2，4-D1.0mg/L，蔗糖20～30g/L，琼脂5g/L，pH5.6-5.8；培养条件为温度为25±2℃，在黑暗条件下培养。
步骤(2)是将步骤(1)中得到的诱导出的愈伤组织从母体上分离出来后，接种到培养基上继代培养，培养基配比为N6+BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+2，4-D1.0mg/L+蔗糖3％+琼脂5g/L，pH5.6-5.8，并在培养基中添加氯化钾100-500mg/L使愈伤组织呈松散、颗粒状。
步骤(3)是将步骤(2)中获得的松散、颗粒状愈伤组织1～2克，压碎后接种于装有50ml液体培养基的250ml三角瓶中，于转速为110rpm的恒温旋转摇床上振荡培养，温度为27～28℃；培养基配比为N6+BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+2，4-D1.0mg/L+蔗糖3％，pH5.6-5.8；一周后用新鲜的液体培养基，更换三角瓶中1/3体积的培养液，以后每周更换一次培养液，培养1个月后，过滤获得微小细胞团块。
步骤(4)是将步骤(3)获得的将微小细胞团块，转移到培养基上培养20-40天，诱导愈伤植株的再生，愈伤诱导植株再生培养基为MS+BA1-4mg/L+NAA0.1mg/L+糖30g/l+琼脂5g/l；经30天，微细胞团块出现再生芽点，再生芽经分化培养长到2-4cm后，进行生根培养，获得待检植株；分化培养基为MS+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+糖30g/l+琼脂5g/l，生根培养基为1/2MS+NAA0.2mg/L+蔗糖2％，pH5.6-5.8。
以上描述中BA6-苄基氨基嘌呤，NAA萘乙酸，2，4-D2，4-二氯苯氧乙酸(下同)。
本发明所取得的技术进步在于本发明避开了热处理的过程，直接采用体细胞诱导脱分化成为分裂细胞(愈伤)，分生细胞经状态调控直接诱导再生，形成植株，脱除病毒。因此，这种方法克服了因常规“热处理+茎尖培养”脱毒方法造成的热处理使植株干枯、死亡的问题。特别适用于丹参脱病毒，也适用于多数植物脱病毒。
具体实施例方式
以下结合实施例对本发明作进一步描述，但不作为对本发明的限定。
用微细胞团块再生法脱除丹参病毒的方法，包括如下工艺步骤(1)愈伤组织诱导将丹参外植体(根茎、叶片、幼茎等)消毒，用水洗净，再用肥皂水刷洗，在超净工作台上采用70％酒精表面灭菌10-20秒，然后用0.1％升汞溶液灭菌1～3分钟；然后接种在愈伤诱导培养基上诱导愈伤得到诱导后的愈伤组织。其中愈伤诱导培养基配比为MS+6-BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+2，4-D1.0mg/L，蔗糖20～30g/L，琼脂5g/L，pH5.6-5.8；培养条件为温度为25±1℃，在黑暗条件下进行。
(2)愈伤组织调控是将步骤(1)中得到的诱导出的愈伤组织从母体上分离出来后，接种到培养基上继代培养，培养基配比为N6+BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+2，4-D1.0mg/L+蔗糖3％+琼脂5g/L，pH5.6-5.8，并在培养基中添加氯化钾100-500mg/L使愈伤组织呈松散、颗粒状；(3)细胞悬浮培养将步骤(2)将步骤(2)中获得的松散、颗粒状愈伤组织1～2克，压碎后接种于装有50ml液体培养基的250ml三角瓶中，于转速为110rpm的恒温旋转摇床上振荡培养，温度为27～28℃；培养基配比为N6+BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+2，4-D1.0mg/L+蔗糖3％，pH5.6-5.8；一周后用新鲜的液体培养基，更换三角瓶中1/3体积的培养液，以后每周更换一次培养液，培养1月后，过滤获得微小细胞团块；(4)愈伤诱导再生植株将步骤(3)获得的将微小细胞团块，转移到培养基上培养20-40天，诱导愈伤植株的再生，愈伤诱导植株再生培养基为MS+BA1-4mg/L+NAA0.1mg/L+糖30g/l+琼脂5g/l。经30天，微细胞团块出现再生芽点，再生芽经分化培养长到2-4cm后，进行生根培养，获得待检植株；分化培养基为MS+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+糖30g/l+琼脂5g/l，生根培养基为1/2MS+NAA0.2mg/L+蔗糖2％，pH5.6-5.8。
(5)再生植株的病毒检测用酶链免疫吸附法检测，获得脱除了病毒的丹参植株并进行组培扩繁。
权利要求
1.用微细胞团块再生法脱除丹参病毒的方法，其特征在于包括如下工艺步骤(1)愈伤组织诱导将丹参外植体洗净消毒后，接种在愈伤诱导培养基上在黑暗条件下进行诱导愈伤，得到诱导后的愈伤组织；(2)愈伤组织调控将诱导出的愈伤组织从母体上分离出来后，进行继代培养，使愈伤组织呈松散、颗粒状；(3)细胞悬浮培养将步骤(2)中获得的松散、颗粒状愈伤组织1～2克，压碎后接种于培养基上培养，过滤获得微小细胞团块；(4)愈伤诱导再生植株将步骤(3)中获得的微小细胞团块，转移到培养基上培养，诱导再生植株；(5)再生植株的病毒检测用酶链免疫吸附法检测，获得脱除了病毒的丹参植株。
2.根据权利要求1所述的用微细胞团块再生法脱除丹参病毒的方法，其特征在于所述的步骤(1)中的丹参外植体包括其根茎、叶片、幼茎。
3.根据权利要求1所述的用微细胞团块再生法脱除丹参病毒的方法，其特征在于所述的步骤(1)是将丹参外植体消毒，用水洗净，再用肥皂水刷洗，在超净工作台上采用70％酒精表面灭菌10-20秒，然后用0.1％升汞溶液灭菌1～3分钟；然后接种在愈伤诱导培养基上诱导愈伤，得到诱导后的愈伤组织；其中愈伤诱导培养基配比为MS+6-BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+2，4-D1.0mg/L，蔗糖20～30g/L，琼脂5g/L，PH5.6-5.8；培养条件为温度为25±2℃，在黑暗条件下培养。
4.根据权利要求1所述的用微细胞团块再生法脱除丹参病毒的方法，其特征在于所述的步骤(2)是将步骤(1)中得到的诱导出的愈伤组织从母体上分离出来后，接种到培养基上继代培养，培养基配比为N6+BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+2，4-D1.0mg/L+蔗糖3％+琼脂5g/L，PH5.6-5.8，并在培养基中添加氯化钾100-500mg/L使愈伤组织呈松散、颗粒状。
5.根据权利要求1所述的用微细胞团块再生法脱除丹参病毒的方法，其特征在于所述的步骤(3)是将步骤(2)中获得的松散、颗粒状愈伤组织1～2克，压碎后接种于装有50ml液体培养基的250ml三角瓶中，于转速为110rpm的恒温旋转摇床上振荡培养，温度为27～28℃；培养基配比为N6+BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+2，4-D1.0mg/L+蔗糖3％，pH5.6-5.8；一周后用新鲜的液体培养基，更换三角瓶中1/3体积的培养液，以后每周更换一次培养液，培养1月后，过滤获得微小细胞团块。
6.根据权利要求1所述的用微细胞团块再生法脱除丹参病毒的方法，其特征在于所述的步骤(4)是将步骤(3)获得的将微小细胞团块，转移到培养基上培养20-40天，诱导愈伤植株的再生，愈伤诱导植株再生培养基为MS+BA1-4mg/L+NAA0.1mg/L+糖30g/l+琼脂5g/l；经30天左右，微细胞团块出现再生芽点，再生芽经分化培养长到2-4cm后，进行生根培养，获得待检植株；分化培养基为MS+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+糖30g/l+琼脂5g/l，生根培养基为1/2MS+NAA0.2mg/L+蔗糖2％，pH5.6-5.8。
全文摘要
本发明属于植物的提纯复壮和繁育，特别是指一种用微细胞团块再生法脱除丹参病毒的方法。包括愈伤组织诱导、愈伤组织调控、细胞悬浮培养、愈伤诱导再生植株、再生植株的病毒检测(酶链免疫吸附法)获得脱除CMV病毒的丹参植株等工艺步骤。本发明避开了常规热处理钝化病毒的过程，直接采用体细胞诱导脱分化成为分裂细胞(愈伤)，分生细胞经状态调控直接诱导再生，形成植株，脱除病毒。因此，这种方法克服了因常规“热处理+茎尖培养”脱毒方法造成的热处理植株干枯、死亡的问题。特别适用于丹参脱病毒，也适用于多数植物脱病毒。
文档编号C12N5/04GK1926964SQ20061004834
公开日2007年3月14日 申请日期2006年9月26日 优先权日2006年9月26日
发明者温春秀, 刘铭, 吴志明, 田伟, 谢晓亮, 周巧梅 申请人:河北省农林科学院经济作物研究所