专利名称：一种对单核苷酸多态性及点突变进行分析检测的方法
技术领域：
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种对单核苷酸多态性及点突 变进行分析检测的方法。
背景技术：
目前对单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP) 及点突变进行分析检测的方法中最常见的为TDI-FP技术 (Template-directed Dye—terminator Incorporation with Fluorescence Polarization detection, TDI—FP)，艮卩模板指导的荣光 染料终止物掺入反应-荧光偏振检测方法。 该方法的主要步骤包括
(1) 首先对待分析的DNA片段进行PCR扩增加入2.5份缓冲液， 1份DNA引物，1. 5份单核苷酸，0. 5份DNA聚合酶，10. 5份去离子水， 5士0.05份DNA模板，进行扩增反应。反应过程为95'C热变性5分钟后 进入一个扩增循环，循环条件为94。C变性15秒，55°C退火30秒，72i:延伸 60秒，循环35次；循环完成后，72°C再延伸10分钟。
(2) 消化过程加0.5份磷酸酶和0.5份核酸外切酶I到步骤1完 成后的体系中，对PCR产物进行酶解消化，去除产物中没有用完的DNA 引物和单核苷酸，以消除多余的DNA引物和单核苷酸对后面的荧光染料 终止物掺入反应带来的影响。消化条件为37°C消化1-2小时。.
(3) 8(TC灭活80°C 15分钟，灭活磷酸酶和核酸外切酶I 。
(4) 向步骤3完成后的体系中加入1份荧光染料终止物、1份DNA探 针，进行DNA探针及荧光染料终止物的掺入反应。反应条件为95°C变 性2分钟后进入循环，循环条件95°C 15秒，55°C 30秒，30个循环，循环 完成后15t:保持20分钟使样品冷却。
(5)对反应完成的产物进行荧光偏振分析，通过对荧光偏振数值的读取， 判定检测结果。
现有技术存在的问题是
(1) 反应过程步骤烦琐，耗费时间长由于荧光染料终止物与DNA探针
的结合会受到体系中扩增完成后剩余的DNA引物和单核苷酸的竞争，从 而影响实验结果，因此需要有消化的过程来去除剩余的DNA引物和单核 苷酸的影响。这样就增加了反应的环节，使整个检测过程需要6-8个小时。
(2) 试剂易受污染由于在步骤1到步骤2之间，以及步骤3到步骤4之 间，需要进行试剂管的倒换，因此就增加了试剂受到污染的可能性，最终影响 测试结果。
(3)对实验操作条件要求严格在步骤2中需要用到两种消化酶，这两种 酶对热非常敏感，稀释到使用浓度后，室温下60分钟后就会失去30%的活性， 因此对实验操作条件要求严格。
发明内容
本发明要克服现有技术存在的反应过程步骤烦琐，耗费时间长，试剂易受 污染和对实验操作条件要求严格的问题。
为克服现有技术存在的问题，本发明的解决方案是 一种对单核苷酸多
态性及点突变进行分析检测的方法，首先是对待分析的DNA片段进行PCR 扩增在反应管中加入5士0.05份缓冲液，l土O.Ol份DNA引物，l士O.Ol 份单核苷酸，l士O.Ol份DNA聚合酶，0. 5土0.005份荧光基团标记DNA 探针，27. 5±0. 3份去离子水，5±0.05份DNA模板，进行扩增反应； 然后进行荧光偏振检测及数据分析，对上述步骤完成的产物进行荧光偏振检 测，通过对荧光偏振数值的读取，判定检测结果。
进行扩增反应的具体反应过程为92 96"C热变性3 5分钟后进入 一个扩增循环，循环条件为92 96。C变性15 25秒，55 60。C退火35 45秒，70 74"C延伸25 35秒，循环35次，循环完成后14 16°C保持 15 25分钟使样品冷却。 上述扩增步骤中还加入1±0. 01份UNG酶。可降解其他PCR产物，防 止非特异信号的产生，起到防污染的作用。
与现有技术相比，本发明的优点是
1、反应步骤简单，检测时间短由于新方法采用的是荧光基团标记
DNA探针，不需要荧光染料终止物与DNA探针的结合的过程，从而也就 避免了剩余的DNA引物和单核苷酸对荧光染料与DNA探针结合的竞争， 省去了消化和8(TC灭活的过程，同时将扩增和DNA探针掺入的反应合 二为一，因此，将原来的5个步骤减少为2个步骤减掉消化和灭活的 步骤，将扩增和掺入的步骤合并为一个歩骤，检测时间也大大縮短，整 个检测过程只需3-4个小时。
2、 检测结果准确首先排除了试剂受污染的可能，整个检测在一个反 应管中便可完成，避免了在倒换反应试剂管过程中产生污染的可能，其 次是不需要消化扩增完成后未反应的DNA引物和单核苷酸，从而避免了 消化酶的使用，减少了影响检测结果的因素和环节。根据探针的序列，可对 单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)及点突变 进行分析检测，检测结果准确，灵敏。
3、 能够判断出模板检测部分的基因序列由于在反应体系中使用
的是荧光基团标记的DNA探针，从而避免了引物以及单核苷酸对荧光染 料与模板结合的竞争。进行反应时，当模板与荧光基团标记的DNA探针 发生杂交时，荧光基团标记DNA探针分子量会发生改变，荧光偏振值也 会相应改变，证明模板基因序列与探针序列互补；而当模板不能够与荧 光基团标记的DNA探针杂交时，荧光偏振值不发生改变。通过对荧光偏 振值的读取，能够判断出模板检测部分的基因序列。
4、 对实验操作条件要求降低整个检测步骤简化，且在一个反应管中 便可完成，产生污染的可能性降低，因此对实验操作条件要求降低，操作 性得到提高。
具体实施例方式
下面将结合具体实施例对本发明做详细的说明。 以人乳头瘤病毒分型荧光偏振检测为例。 实施例1:
本发明依次包括下述步骤
1) 扩增及掺入对从标本中提取的DNA片段进行PCR扩增，扩增 的同时，荧光标记的探针掺入到HPV目的基因中。加入5份缓冲液，1 份DNA引物(HPV型特异性)，l份单核苷酸，1份DNA聚合酶，0. 5份 荧光基团标记DNA探针(HPV型特异性)，27.5份去离子水，5份DNA 模板，1份UNG酶，进行扩增反应。反应过程为94t:热变性4分钟后进 入一个扩增循环，循环条件为94"C变性20秒，57"C退火40秒，72"C延伸 30秒，循环35次；循环完成后15t:保持20分钟使样品冷却。
2) 荧光偏振检测及数据分析对完成步骤1的产物进行荧光偏振 检测，通过对荧光偏振数值的读取，判定检测结果，确定HPV的型别。
实施例2:
本发明依次包括下述步骤
1) 扩增及掺入对从标本中提取的DNA片段进行PCR扩增，扩增 的同时，荧光标记的探针掺入到HPV目的基因中。加入5.05份缓冲液， 0. 99份DNA引物(HPV型特异性)，l.Ol份单核苷酸，1. 01份DNA聚合 酶，0. 5份荧光基团标记DNA探针(HPV型特异性)，27.8份去离子水， 5.05份DNA模板，0. 99份UNG酶，进行扩增反应。反应过程为92。C热 变性5分钟后进入一个扩增循环，循环条件为96r变性25秒，55。C退火 35秒，74'C延伸35秒，循环35次；循环完成后16°C保持16分钟使样 品冷却。
2) 荧光偏振检测及数据分析对完成步骤1的产物进行荧光偏振
检测，通过对荧光偏振数值的读取，判定检测结果，确定HPV的型别。
实施例3:
本发明依次包括下述步骤
1) 扩增及掺入对从标本中提取的DNA片段进行PCR扩增，扩增
的同时，荧光标记的探针掺入到HPV目的基因中。加入4.95份缓冲液， 1.01份DNA引物(HPV型特异性)，1. 01份单核苷酸，0.99份DM聚合 酶，0.495份荧光基团标记DNA探针(HPV型特异性)，27. 3份去离子 水，4.95份DNA模板，0.99份UNG酶，进行扩增反应。反应过程为 92。C热变性5分钟后进入一个扩增循环，循环条件为96。C变性23秒，57 。C退火35秒，72。C延伸30秒，循环35次；循环完成后14°C保持25分 钟使样品冷却。
2) 荧光偏振检测及数据分析对完成步骤1的产物进行荧光偏振 检测，通过对荧光偏振数值的读取，判定检测结果，确定HPV的型别。
实施例4:
本发明依次包括下述步骤
1) 扩增及掺入对从标本中提取的DNA片段进行PCR扩增，扩增 的同时，荧光标记的探针掺入到HPV目的基因中。加入5份缓冲液，1 份DNA引物(HPV型特异性)，l份单核苷酸，1份DNA聚合酶，0. 5份 荧光基团标记DNA探针(HPV型特异性)，27.5份去离子水，5份DNA 模板，进行扩增反应。反应过程为94。C热变性4分钟后进入一个扩增循 环，循环条件为94。C变性20秒，57t:退火40秒，72。C延伸30秒，循环 35次；循环完成后15 °C保持20分钟使样品冷却。
2) 荧光偏振检测及数据分析对完成步骤1的产物进行荧光偏振 检测，通过对荧光偏振数值的读取，判定检测结果，确定HPV的型别。
上述实施例，以实施例l为最佳实施例。
权利要求
1、一种对单核苷酸多态性及点突变进行分析检测的方法，首先是对待分析的DNA片段进行PCR扩增在反应管中加入5±0.05份缓冲液，1±0.01份DNA引物，1±0.01份单核苷酸，1±0.01份DNA聚合酶，0.5±0.005份荧光基团标记DNA探针，27.5±0.3份去离子水，5±0.05份DNA模板，进行扩增反应；然后进行荧光偏振检测及数据分析，对上述步骤完成的产物进行荧光偏振检测，通过对荧光偏振数值的读取，判定检测结果。
2、 如权利要求1所述的一种对单核苷酸多态性及点突变进行分析 检测的方法，其特征在于进行扩增反应的具体反应过程为92 96。C热 变性3 5分钟后进入一个扩增循环，循环条件为92 96。C变性15 25秒， 55 6(TC退火35 45秒，70 74°C延伸25 35秒，循环35次，循环完 成后14 16"C保持15 25分钟使样品冷却。
3、 如权利要求1或2所述的一种对单核苷酸多态性及点突变进行 分析检测的方法，其特征在于所述扩增步骤中还加入l土O.Ol份UNG酶。
全文摘要
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种对单核苷酸多态性及点突变进行分析检测的方法。本发明要克服现有技术存在的反应过程步骤繁琐，耗费时间长，试剂易受污染和对实验操作条件要求严格的问题。本发明的解决方案是首先是对待分析的DNA片段进行PCR扩增，在反应管中加入5±0.05份缓冲液，1±0.01份DNA引物，1±0.01份单核苷酸，1±0.01份DNA聚合酶，0.5±0.005份荧光基团标记DNA探针，27.5±0.3份去离子水，5±0.05份DNA模板，进行扩增反应；然后进行荧光偏振检测及数据分析，对上述步骤完成的产物进行荧光偏振检测，通过对荧光偏振数值的读取，判定检测结果。
文档编号C12Q1/68GK101097183SQ200610043069
公开日2008年1月2日 申请日期2006年6月29日 优先权日2006年6月29日
发明者崔崇军, 菊 张, 雷红文 申请人:陕西阳光生物工程股份有限公司