专利名称：猪促卵泡激素β亚基基因单体型的分离鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种猪促卵泡激素β亚基基因单体型的分离鉴定方法，通过这种方法构建了一个新的猪促卵泡激素β亚基基因单体型，利用其与猪繁殖性状显著相关的特性，可为猪的标记辅助选种和选配提供新的分子标记方法。属于家畜分子生物学技术领域。
背景技术：
猪的繁殖性状关乎养猪场的生产水平及其经济效益。据著名的动物遗传育种学家Chris Haley 1990年计算，如果母猪每胎产仔数提高1头，英国的养猪业每年可净增7亿英镑纯利，而整个原欧共体每年可净增约20亿英镑纯利。在我国，如果母猪产仔数每胎提高1头，每年也将增加190亿元人民币的纯利。
促卵泡激素β亚基基因(FSHβ)是影响猪只繁殖性状的一个重要的候选基因，许多科研工作者都试图在促卵泡激素β亚基基因中寻找影响猪繁殖性状多态)位点。经文献检索和专利检索发现，赵要风等(1999)应用PCR的方法，鉴定了FSHβ基因结构区插入片段的确切位置，并对其进行了克隆测序，序列分析表明，该插入片段位于内含子1上靠近外显子2，长度为292bp，两端具有相同序列并具有一个polyA结构，为一典型的哺乳动物基因组内的逆转座子结构。Linville等(2001)采用RFLP(限制性片段长度多态性)的方法，发现了该基因的αTaqI酶切位点存在多态性，但是并未证实该位点能够影响猪种的繁殖性能。迄今为止，尚没有关于促卵泡激素β亚基基因单体型的报道，更没有促卵泡激素β亚基基因单体型与繁殖性状的相关研究。
SNP标记是指在染色体基因组水平上单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性。位于一条染色体上或某一区域的一组相关联的SNP等位位点被称为单体型(haplotype)。从广义上讲，也可以用单体型的分析方法分析插入或缺失多态性。在家畜分子生物学技术领域，单体型主要作为一种标记辅助技术应用于家畜的筛选，从而指导家畜的选种和选配。
关于猪的单体型的研究进展十分迅速，与此同时有关猪单体型的专利争夺正逐步展开。鉴于猪单体型数目多，还有大量未被发现，且它们有重要的理论和应用价值，因此在我国开展猪的标记单体型的分析、鉴定和应用研究，开发具有我国知识产权的单体型显得十分迫切和必要。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足和实际需求，提出一种猪促卵泡激素β亚基基因单体型的分离鉴定方法，并通过此方法寻找新的与猪繁殖性状显著相关的单体型，可以用于猪只的辅助选种和选配，从而降低饲养成本。
为实现这一目的，本发明提出的方法包括，提取猪的基因组DNA，猪促卵泡激素β亚基基因的PCR(聚合酶链式反应)扩增，扩增产物的多态性检测，单体型的构建及其与猪繁殖性状的相关性分析，分离鉴定出一个新的与猪促卵泡激素β亚基基因的单体型H21。本发明利用猪促卵泡激素β亚基基因的单体型与猪繁殖性状显著相关的特性，为猪的标记辅助选种和选配提供了新的分子标记方法。
本发明提供的猪促卵泡激素β亚基基因单体型的分离鉴定方法包括如下步骤1)采集猪耳组织，利用常规的苯酚/氯仿抽提方法提取基因组DNA，DNA样品被稀释成100ng/μL备用。
2)针对猪促卵泡激素β亚基基因的αTaq I单核苷酸多态性位点C/T，设计促卵泡激素β亚基基因特异性引物，进行PCR反应，得到扩增产物1；其中，所述的基因特异性引物具有5’-TTGCTGGAAAGCCATCTG-3’和5’-GGTACTTTCACGGTCTCG-3’的序列，所述的扩增产物1长度为300～2000bp，且含有猪促卵泡激素β亚基基因的αTaq I单核苷酸多态性位点C/T。
3)针对猪促卵泡激素β亚基基因是否含有272bp的插入片段，设计猪促卵泡激素β亚基基因特异性引物，进行PCR反应，得到扩增产物2；其中，所述的基因特异性引物具有5’-CCTTTAAGACAGTCAATGGC-3’和5’-ACTGGTCTATTCATCCTCTC-3’的序列，所述的扩增产物2长度为100～2000bp。
4)检测扩增产物1的αTaq I单核苷酸多态性位点C/T和扩增产物2是否含有272bp的插入片段的多态性。
5)构建单体型，针对扩增产物的多态性用统计分析的方法共分离鉴定出4种单体型H12，H21，H11，H22，对于本领域普通技术人员来说，单体型的构建方法可以根据需要而改变只要适合检测本发明的单体型即可。
6)通过偏回归分析方法确定与猪繁殖性状相关的单体型，其中，单体型H21与初产活仔数显著正相关，携带有上述单体型H21的个体初产活仔数性状显著优于含有其它单体型的个体。
其中所述的单体型H21在αTaq I单核苷酸多态性位点C/T为C，且不含有272bp的插入片段。
本发明具有显著的积极效果(1)发明一种猪促卵泡激素β亚基基因单体型的分离鉴定方法，并利用此方法在猪促卵泡激素β亚基基因中分离鉴定出一个单体型H21，经文献检索和专利检索，证明为新的单体型。
(2)经将上述的单体型与梅山猪群90头梅山猪个体的繁殖性状进行相关性分析，新分离鉴定出的一个单体型H21与猪繁殖性状显著相关，可以用于猪只的早期筛选，从而降低饲养成本，增加产品的附加值。
具体实施例方式
本发明针对梅山猪群90头梅山猪进行了深入的研究。针对猪促卵泡激素β亚基基因两个多态位点位点组成的单体型进行分析，其中统计分析结果显示，猪促卵泡激素β亚基基因的单体型H21与反映繁殖性状的初产活仔数显著正相关(p＝0.0083)。因此这个单体型可作为检测猪繁殖性状的特异性单体型，用于猪的标记辅助选种和选配。在此基础上完成了本发明。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验手册(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1)采集猪耳组织，利用常规的苯酚/氯仿抽提方法提取基因组DNA，DNA样品被稀释成100ng/μL备用，其中实验猪共90头，来自上海市嘉定区梅山猪育种中心的梅山猪保种群。
2)针对猪促卵泡激素β亚基基因的αTaq I单核苷酸多态性位点C/T，设计促卵泡激素β亚基基因特异性引物，进行PCR反应，得到扩增产物1；引物设计和PCR反应体系参考Linville等(2001)提供的方法，利用Primer Premier 5.0软件设计引物。其中，所述的基因特异性引物具有5’-TTGCTGGAAAGCCATCTG-3’和5’-GGTACTTTCACGGTCTCG-3’的序列，所述的扩增产物1长度为1765bp，且含有猪促卵泡激素β亚基基因的αTaq I单核苷酸多态性位点C/T。
3)针对猪促卵泡激素β亚基基因是否含有272bp的插入片段，设计猪促卵泡激素β亚基基因特异性引物，进行PCR反应，得到扩增产物2；引物参考猪促卵泡激素β亚基基因蛋白编码序列(GenBank Acc №D00621)，利用PrimerPremier5.0软件自行设计引物。由上海华诺生物技术有限公司合成。其中，所述的基因特异性引物具有5’-CCTTTAAGACAGTCAATGGC-3’和5’-ACTGGTCTATTCATCCTCTC-3’的序列，当含有272bp的插入片段时所述的扩增产物2长度为0.5kb；当不含有272bp的插入片段时所述的扩增产物2长度为0.22kb。PCR反应体系为反应总体积为25μL，10×缓冲液成分为100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，500mmol/L KCl，10mmol/L MgCl2，0.1％明胶，dNTP终浓度为200μmol/L，引物终浓度为1.0μmol/L，2U Taq DNA聚合酶。反应条件95℃热变性2min，然后95℃ 30s，54.5℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃保温5min。
4)检测扩增产物1的αTaq I单核苷酸多态性位点C/T和扩增产物2是否含有272bp的插入片段的多态性；其中酶切反应体系如下表所示表1FSHβ基因酶切反应体系
5)单体型的构建，用本领域所熟知的PL-EM version 1.0(http://www.people.fas.harvard.edu)构建单体型。针对扩增产物的多态性用统计分析的方法共分离鉴定出4种单体型H12，H21，H11，H22，中的每一个位置的核苷酸用数字1和2来代表。
本领域普通技术人员已知，上述单体型的构建方法可以根据需要而改变，只要适合检测本发明的单体型即可。
6)单体型的相关性分析确定与猪繁殖性状相关的单体型。收集其生产性能记录，包括产仔日期、初产总仔数、初产活仔数、初生窝重、40天断奶窝重等，产仔日期时间跨度为1999～2004年。
根据每个个体所构建的单体型，用本领域所熟悉的偏回归分析方法进行分析。
y＝1μ+X1H1+X2H2+X3H3+X4H4+X5S+X6B+e模型中，y为个体繁殖性状表型记录向量，μ为总体均数，S为年-季效应向量；B为公畜效应向量；H1、H2、H3、H4为单体型型效应向量；e为随机误差向量，相互独立且服从于N(0，σ2)；1、X1、X2、X3、X4、X5、X6为设计矩阵；其中X1、X2、X3、X4当有0，1，2个拷贝时值为-1，0，+1。统计分析采用SAS(8.02)软件进行分析。
结果，FSHβ单体型对初产总仔数、初生窝重、40天断奶窝重没有显著影响。单体型H21与初产活仔数显著正相关(表2)，携带有上述单体型H21的个体初产活仔数性状显著优于含有其它单体型的个体；
其中所述的单体型H21在αTaq I单核苷酸多态性位点C/T为C，且不含有272bp的插入片段。
表2FSHβ基因单体型与初产活仔数的偏回归分析
根据上述研究，发明了一种猪促卵泡激素β亚基基因单体型的分离鉴定方法，并通过这种方法构建了一个新的猪促卵泡激素β亚基基因单体型，这一发明在猪种选育和品种改良上具有潜在的应用价值。通过对猪促卵泡激素β亚基基因多态位点进行基因型定型，若发现某个个体携带H21单体型，则该个体与携带其它单体型的个体相比期望有更优的繁殖性状。据此，育种工作者可以指导猪只的早期筛选，从而降低饲养成本，增加产品的附加值。可见，猪促卵泡激素β亚基基因单体型在猪的标记辅助选种和选配中有重要的应用前景。
权利要求
1.一种猪促卵泡激素β亚基基因单体型的分离鉴定方法，其特征在于包括如下步骤1)采集猪耳组织，利用苯酚/氯仿抽提方法提取基因组DNA；2)针对猪促卵泡激素β亚基基因的αTaq I单核苷酸多态性位点C/T，设计促卵泡激素β亚基基因特异性引物，进行PCR反应，得到扩增产物1；其中，所述的基因特异性引物具有5’-TTGCTGGAAAGCCATCTG-3’和5’-GGTACTTTCACGGTCTCG-3’的序列，所述的扩增产物1长度为300～2000bp，且含有猪促卵泡激素β亚基基因的αTaq I单核苷酸多态性位点C/T；3)针对猪促卵泡激素β亚基基因是否含有272bp的插入片段，设计猪促卵泡激素β亚基基因特异性引物，进行PCR反应，得到扩增产物2；其中，所述的基因特异性引物具有5’-CCTTTAAGACAGTCAATGGC-3’和5’-ACTGGTCTATTCATCCTCTC-3’的序列，所述的扩增产物2长度为100～2000bp；4)检测扩增产物1的αTaqI单核苷酸多态性位点C/T和扩增产物2是否含有272bp的插入片段的多态性；5)构建单体型，针对扩增产物的多态性用统计分析的方法共分离鉴定出4种单体型H12，H21，H11，H22；6)通过偏回归分析方法确定与猪繁殖性状相关的单体型，其中，单体型H21与初产活仔数显著正相关，携带有上述单体型H21的个体初产活仔数性状显著优于含有其它单体型的个体；其中所述的单体型H21在αTaq I单核苷酸多态性位点C/T为C，且不含有272bp的插入片段。
2.一种猪促卵泡激素β亚基基因单体型H21，其特征在于该单体型在αTaq I单核苷酸多态性位点C/T为C、且不含有272bp的插入片段。
3.一种权利要求2的猪促卵泡激素β亚基基因单体型的应用，其特征在于应用于猪的标记辅助选种和选配。
全文摘要
本发明涉及一种猪促卵泡激素β亚基基因单体型的分离鉴定方法，属于家畜分子生物学技术领域。方法步骤包括，提取猪的基因组DNA，猪促卵泡激素β亚基基因的PCR(聚合酶链式反应)扩增，扩增产物的多态性检测，单体型的构建及其与猪繁殖性状的相关性分析。本发明的特征是分离鉴定出一个新的猪促卵泡激素β亚基基因的单体型H21。本发明利用猪促卵泡激素β亚基基因的单体型与猪繁殖性状显著相关的特性，为猪的标记辅助选种和选配提供了新的分子标记方法。
文档编号C12Q1/68GK1900311SQ20061002914
公开日2007年1月24日 申请日期2006年7月20日 优先权日2006年7月20日
发明者潘玉春, 王起山, 李媛媛, 于丹丹, 李婧 申请人:上海交通大学