专利名称：多杀巴斯德氏菌聚合酶链式反应检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及兽医学和水产学诊断技术，特别是一种多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)PCR快速检测试剂盒和检测方法。利用PCR技术特异性扩增16S-23S核糖体RNA转录间区，达到区分多杀巴斯德氏菌和相近致病菌的目的，能够大大提高诊断多杀巴斯德氏菌的效率。
背景技术：
多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)是巴斯德氏菌属中最重要的畜禽致病菌，它是能引起多种畜禽巴氏杆菌病(亦称出血性败血症)的病原体，主要可引起家禽霍乱的暴发性流行，牛的出血性败血病、原发性或继发性肺炎等。目前对于多杀巴斯德氏菌的诊断主要基于生化检验，对于多杀巴斯德氏菌的诊断需要排除在生化性状上极其相近的其它致病菌，并且要经过数目众多的一组反应才能确诊，而且有时结果并不准确。目前，对于该致病菌的检测效率十分低下，完全确诊需要5天的时间。
发明内容
本发明的目的是提供一种多杀巴斯德氏菌PCR快速检测试剂盒和检测方法。运用PCR技术检测多杀巴斯德氏菌的方法，提高了检测效率和检测的准确度，本发明通过分析特异性DNA检测多杀巴斯德氏菌，不需要像生化鉴定那样进行多组实验，可大大节省时间，劳动力和检验成本，结果重现性好，检测精确。
本发明提供的多杀巴斯德氏菌PCR快速检测试剂盒包括(1)DNA提取试剂TE缓冲液，5-15mmol/L Tris，0.5-1.5mmol/L EDTA，pH8.0；溶菌酶，浓度10-20mg/mL，pH8.0；蛋白酶K溶液，浓度10-20mg/mL，pH8.0；Tris饱和酚，pH8.0；乙酸钠，浓度2-5mol/L；乙醇，浓度95％；(2)PCR试剂盒成分为10×buffer含100mmol/L Tris-HCl，450-550mmol/L KCl，pH8.3；dNTPsdATP，dTTP，dCTP，dGTP混合物，每种浓度5-15mmol/L；特异性寡核苷酸引物引物1为5’CGAAAGCAAAAGAGTGAA 3’、引物2为5’CCGTAATCAGACCTATCC 3’，各引物浓度均为5-15μmol/L；双蒸水；Taq DNA聚合酶5u/μL；MgCl210-20mmol/L；使用多杀巴斯德氏菌PCR快速检测试剂盒的检测方法程序如下(1)DNA抽提挑取疑似菌落加入到0.4mL TE缓冲液(pH8.0)中振荡混匀。加入100μL溶菌酶溶液，37℃保温10分钟，加同体积Tris饱和酚(pH8.0)，强烈振荡，10000r/min离心3分钟，取上清液，重复酚抽提；取上清液，加入0.1倍体积的乙酸钠(3mol/L)，混匀，再加等体积的冰乙醇，混匀后低温静置30分钟，12000r/min离心5分钟，弃上清，加70％冷乙醇洗涤一次，室温下12000r/min离心5分钟，弃上清，加入50μL TE溶液，置-20℃保存；(2)PCR扩增①PCR反应混合物成分成分 体系中各组分最终浓度PCR缓冲液10mmol/L Tris-HCl，50mmol/LKClMgCl21.5mmol/LTaq DNA聚合酶1.5u引物10.3μmol/L引物20.3μmol/LdNTPs每种80nmol/LDNA样品 50ng双蒸水 补足至50μL②PCR方法中扩增程序1)94℃5分钟2)94℃30秒3)58℃30秒4)72℃30秒5)回到第2)-4)步 重复30次6)72℃5分钟(3)被检测样品目的PCR扩增和电泳检验PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙锭染色，电泳结果在紫外光分析仪下观察，如果发现有特异性扩增产生的DNA片段，引物1、引物2扩增结果得到178bp的特异片段，说明样品有多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)感染或污染，反之则没有。
本发明利用多杀巴斯德氏菌的特异性基因，使用特异性引物通过PCR方法产生特异性片段，在已试验的35种不同属或种的其它致病菌中均未发现假阳性结果。
本发明与现有技术相比，有益效果在于基于DNA的鉴定方法适用于直接从患病禽兽含菌体液、组织等样本中直接用PCR方法扩增特异性靶基因，从而检测多杀巴斯德氏菌。PCR方法具有检测准确、特异性强的特点，可以快速、准确地鉴定特异的目标细菌。首先，它用PCR的方法扩增细菌特异性靶基因，避免了反复培养，冗长的一系列生化反应，节约时间，劳动力和成本；PCR鉴定方法不受培养条件和细菌生理状态的影响，较生理生化鉴定方法更为准确；能够排除一些生理生化鉴定方法不能排除的干扰菌。
图1引物特异性测试2阳性样本1检测结果3阳性样本2检测结果图
具体实施例方式
下面结合具体实施方式
对本发明作进一步详细说明。
实施例1样本11.DNA抽提取患病鸡组织，涂布于一次性分离培养血平板，然后根据菌落形态等特征做初步鉴定，挑取疑似菌落加入到0.4mL TE缓冲液(pH8.0)中振荡混匀。加入100μL 20mg/mL，pH8.0的溶菌酶溶液，37℃保温10分钟，加同体积Tris饱和酚(pH8.0)，强烈振荡，10000r/min离心3分钟，取上清液，重复酚抽提。取上清液，加入0.1倍体积的乙酸钠(3mol/L)，混匀，再加等体积的冰乙醇，混匀后低温静置30分钟，12000r/min离心5分钟，弃上清，加70％冷乙醇洗涤一次，室温下12000r/min离心5分钟，弃上清，加入50μL TE溶液，置-20℃保存。
2.PCR扩增(1)PCR反应混合物成分成分 体系中各组分最终浓度PCR缓冲液10mmol/L Tris-HCl，50mmol/LKClMgCl21.5mmol/LTaq DNA聚合酶1.5u引物10.3μmol/L引物20.3μmol/LdNTPs每种80nmol/LDNA样品 50ng双蒸水补足至 50μL(2)PCR方法中扩增程序1)94℃5分钟2)94℃30秒3)58℃30秒4)72℃30秒5)回到第2)-4)步，重复30次6)72℃5分钟3.被检测样品目的PCR扩增和电泳检验PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙锭染色。电泳结果在紫外分析仪下观察，可发现对多杀巴斯德氏菌进行特异性扩增产生的DNA片段，其中引物1、引物2扩增结果可得到178bp的特异片段，结果如图2。实验表明样品中含有多杀巴斯德氏菌。
图1引物特异性测试图(纯培养检测，以多杀巴斯德氏菌为阳性对照模板，以禽兽及鱼类常见病源细菌的纯培养物DNA作为阴性对照模板，阴性对照没有发现非特异扩增，所用引物为引物1和引物2。)。
图中的各个泳道分别是1多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)；2流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)；3胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)；4荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)；5嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)；6金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureaus)；7大肠杆菌(Escherichia coli)；8星状诺卡氏菌(Nocardia asteroides)；9副溶血弧菌(Bibrio Parahemolyticus)；10肠炎沙门氏菌(Salmonellosis.enteritidis)；11鸡基因组DNA；12鱼基因组DNA；图2样本1检测结果图泳道1病鸡样本PCR扩增产物，所用引物为引物1和引物2；实施例2样本21.DNA抽提取患病鱼组织，涂布于一次性分离培养血平板，然后根据菌落形态等特征做初步鉴定，挑取疑似菌落加入到0.4mL TE缓冲液(pH8.0)中振荡混匀。加入100μL 20mg/mL，pH8.0的溶菌酶溶液，37℃保温10分钟，加同体积Tris饱和酚(pH8.0)，强烈振荡，10000r/min离心3分钟，取上清液，重复酚抽提。取上清液，加入0.1倍体积的乙酸钠(3mol/L)，混匀，再加等体积的冰乙醇，混匀后低温静置30分钟，12000r/min离心5分钟，弃上清，加70％冷乙醇洗涤一次，室温下12000r/min离心5分钟，弃上清，加入5为μL TE溶液，置-20℃保存。
2.PCR扩增(1)PCR反应混合物成分成分 体系中各组分最终浓度PCR缓冲液 10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L mol/LKClMgCl21.5mmol/LTaq DNA聚合酶 1.5u引物1 0.3μmol/L引物2 0.3μmol/L
dNTPs 每种80nmol/LDNA样品50ng双蒸水补足至 50μL(2)PCR方法中扩增程序1)94℃5分钟2)94℃30秒3)58℃30秒4)72℃30秒5)回到第2)-4)步，重复30次6)72℃5分钟3.被检测样品目的PCR扩增和电泳检验PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙锭染色。电泳结果在紫外分析仪下观察，可发现对多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)进行特异性扩增产生的DNA片段，其中引物1、引物2扩增结果可得到178bp的特异片段，结果如图3。实验表明样品中含有多杀巴斯德氏菌。
图3样本2检测结果图。
泳道1病鱼样本PCR扩增产物，所用引物为引物1和引物2；后来通过16S rDNA测序证明，所检验的目的菌落98％为多杀巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)。
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权利要求
1.一种多杀巴斯德氏菌PCR快速检测试剂盒，其特征在于试剂盒包括(1)DNA提取试剂TE缓冲液，5-15mmol/L Tris，0.5-1.5mmol/L EDTA，pH 8.0；溶菌酶，浓度10-20mg/mL，pH8.0；蛋白酶K溶液，浓度10-20mg/mL，pH8.0；Tris饱和酚，pH8.0；乙酸钠，浓度2-5mol/L；乙醇，浓度95％；(2)PCR试剂盒成分为10×buffer含100mmol/L Tris-HCl，450-550mmol/L KCl，pH 8.3；dNTPsdATP，dTTP，dCTP，dGTP的混合物，每种浓度5-15mmol/L；特异性寡核苷酸引物引物1为5’-CGAAAGCAAAAGAGTGAA-3’、引物2为5’-CCGTAATCAGACCTATCC-3’，各引物浓度均为5-15μmol/L；双蒸水；Taq DNA聚合酶5u/μL；MgCl210-20mmol/L。
2.一种使用多杀巴斯德氏菌PCR快速检测试剂盒的检测方法，其特征在于，程序如下(1)DNA抽提挑取疑似菌落加入到0.4mL TE缓冲液(pH8.0)中振荡混匀，加入100μL溶菌酶溶液，37℃保温10分钟，加同体积Tris饱和酚(pH8.0)，强烈振荡，10000r/min离心3分钟，取上清液，重复酚抽提；取上清液，加入0.1倍体积的乙酸钠(3mol/L)，混匀，再加等体积的冰乙醇，混匀后低温静置30分钟，12000r/min离心5分钟，弃上清，加70％冷乙醇洗涤一次，室温下12000r/min离心5分钟，弃上清，加入50μL TE溶液，置-20℃保存；(2)PCR扩增①PCR反应混合物成分成分 体系中各组分最终浓度PCR缓冲液 10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KClMgCl21.5mmol/LTaq DNA聚合酶 1.5u引物1 0.3μmol/L引物2 0.3μmol/LdNTPs 每种80nmol/LDNA样品 50ng双蒸水补足至50μL②PCR方法中扩增程序1)94℃ 5分钟2)94℃ 30秒3)58℃ 30秒4)72℃ 30秒5)回到第2)-4)步，重复30次6)72℃ 5分钟(3)被检测样品目的PCR扩增和电泳检验PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙锭染色，电泳结果在紫外光分析仪下观察，如果发现有特异性扩增产生的DNA片段，引物1、引物2扩增结果得到150-200bp的特异片段，说明样品有多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)感染或污染，反之则没有。
3.多杀巴斯德氏菌PCR快速检测试剂盒在检测多杀巴斯德氏菌中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种多杀巴斯德氏菌PCR快速检测试剂盒和检测方法。属于兽医学和水产学诊断技术领域，主要技术方案是利用PCR技术特异性扩增16S－23S核糖体RNA转录间区，达到区分多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)和相近致病菌的目的，并且能够排除一些用传统的生化鉴定难以排除的与多杀巴斯德氏菌相近的几个致病菌。该方法与传统方法相比能够大大提高兽医临床诊断多杀巴斯德氏菌的效率，缩短诊断时间，准确度更高，节省劳动力和成本。
文档编号C12Q1/04GK1877297SQ20061001476
公开日2006年12月13日 申请日期2006年7月12日 优先权日2006年7月12日
发明者黄熙泰, 周浩, 刘寅, 郑泽军, 李永君, 魏小娜 申请人:南开大学