专利名称：枸杞类胡萝卜素合成酶基因psy及包括该基因的质粒的利记博彩app
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体地说涉及一种枸杞类胡萝卜素合成酶基因PSY及含有该基因的质粒。
背景技术：
植物体内类胡萝卜素均通过异戊二烯化合物或萜类化合物合成。代谢主链上有5种酶参与，分别是八氢番茄红素合成酶(PSY)、八氢番茄红素脱饱和酶(PDS)、ξ-胡萝卜素脱饱和酶(ZDS)、番茄红素β-环化酶(LycB)和番茄红素ε-环化酶(LycE)。随着分子生物学研究手段的发展，编码这些酶的基因已从番茄、烟草、辣椒、拟南芥、玉米等植物中陆续分离鉴定。据报道枸杞中的总胡萝卜素含量为2.9527mg·g-1，其含量之高为植物所罕见。目前有关枸杞类胡萝卜素合成酶基因的克隆国内外还未见报道。主要技术文献有陶俊，张上隆，徐昌杰，等。类胡萝卜素合成的相关基因及基因工程.生物工程学报，2002，18(3)276～281；Cunningham F X，Gantt E.Genes and enzymes of carotenoid biosynthesisin plants.Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，1998，6(49)557～583；李忠，彭光华，张声华.枸杞子中的类胡萝卜素的组成及含量.植物资源与环境，1999，8(4)57～58等。
发明内容
本发明的目的是提供一种枸杞类胡萝卜素合成酶基因PSY。
本发明的第二个目的是提供一种枸杞类胡萝卜素合成酶基因PSY编码的多肽。
本发明的第三个目的是提供一种包含一种枸杞类胡萝卜素合成酶基因PSY的重组质粒。
本发明的技术方案概述如下一种枸杞类胡萝卜素合成酶基因PSY，它具有序列表SEQ ID No.1所述的核苷酸序列。
一种枸杞类胡萝卜素合成酶基因PSY编码的多肽，它具有序列表SEQ ID No.2所述的氨基酸序列。
一种包含权利要求1基因的重组质粒pGEM-lbPSY，是以序列表SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4为引物PCR扩增出的DNA序列，回收得到1292bpDNA，将其克隆到pGEM-T载体上，构建了重组质粒pGEM-lbPSY。
本发明参照其它植物的PSY基因序列设计引物，采用PCR技术从枸杞cDNA文库中分离到PSY基因，将其克隆到T载体，并采用生物信息软件对所获得的PSYcDNA及其推导的氨基酸序列进行分析。
本发明成功的获得枸杞类胡萝卜素合成酶基因PSY，为通过基因工程手段调控植物体内类胡萝卜素的代谢和积累，创造类胡萝卜素含量更高的品系，改良果蔬的营养品质，实现工厂化生产天然类胡萝卜素奠定基础。
图1为以从枸杞cDNA文库中提取到的λ噬菌体DNA为模板，SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4为引物的扩增产物凝胶电泳图谱，图中，1.Marker2000；2.PCR产物。
图2为重组质粒pGEM-lbPSY的PCR扩增鉴定，图中，1.2 pGEM-lbPSY的PCR结果；3.Marker2000。
图3为重组质粒pGEM-lbPSY的酶切鉴定，图中，1.2 pGEM-lbPSY的双酶切结果；3.Marker2000。
图4为枸杞类胡萝卜素合成酶基因PSY序列的开放读码框分析。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1PCR模板的制备枸杞cDNA文库由本实验室提供，采用液体培养法提取λ噬菌体DNA。
本领域的技术人员都可以在实验室构建枸杞cDNA文库。该文库的构建步骤(1)总RNA提取及mRNA纯化；(2)cDNA双链的合成；(3)用连接酶将cDNA与接头连接；(4)去除小片段及多余接头；(5)将cDNA克隆到载体上；(6)噬菌体的包装；(7)cDNA文库质量检测。
在cDNA文库构建过程中，使用了mRNA分离试剂盒、cDNA合成试剂盒、LambdaDNA包装试剂盒、载体λExCell等，这些试剂盒均已经商品化。
实施例2PCR体外扩增根据番茄、辣椒、拟南芥、玉米等植物PSY基因的保守序列设计一对引物引物1(正向SEQ ID No.3)GAA TTC ATG TCT ATT TGT ACG CTA TGG GTT GTT；引物2(反向、SEQ ID No.4)GC GGC CGC TCA TGT TTG GGG TAT CAT AAA AGA，在25μL反应体系中，加入10×PCRBuffer(Mg2+15mmol·L-1)3.0μL，dNTP(各2.5mmol·L-1)2.5μL，引物1(20μmol·L-1)和引物2(20μmol·L-1)各1.5μL，TaqDNA聚合酶(5U·μL-1)0.5μL，模板DNA 1.5ng。反应条件94℃ 3min→(94℃ 1min→55℃ 1min→72℃ 2min)35→72℃ 10min。扩增反应在德国UNOII Biometra DNA扩增仪上进行。反应结束后在1％琼脂糖凝胶上电泳检查。(见图1)实施例3扩增产物的克隆与DNA序列测定采用北京鼎国生物技术发展中心的DNA片段回收试剂盒回收PCR扩增产物。回收产物与pCEM-T载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌JM109。在含氨苄青霉素的培养基上进行蓝白斑筛选。随机挑取白色菌落，用碱裂解法小量提取质粒DNA，并进行PCR和双酶切(SacI，NcoI)鉴定。由华大基因上海鼎安生物科技有限公司用DNA荧光自动序列分析仪进行序列测定。
实施例4PSY基因的序列分析重组质粒pGEM-lbPSY的DNA序列分析结果表明，分离克隆的PSY基因cDNA全长1292bp，阅读框位于7～1284bp之间，共编码425个氨基酸。与其他植物PSY基因核苷酸序列同源性比较发现，与番茄(A21360)、辣椒(X68017)、拟南芥(L25812)、玉米(U32636)、黄水仙(X78814)、甜瓜(Z37543)的同源性分别为78％，80％，77％，75％，79％，80％。另外，该基因所编码的氨基酸序列与其他植物PSY基因的氨基酸同源性高达70％～80％，肽链长度相仿，由410～425个氨基酸组成。
实施例5PSY基因所编码的蛋白质特性分析用Antheprot软件对PSY基因编码蛋白质的基本特性和氨基酸组成进行分析。结果为，分子量(Molecular Weight)是48 327，等电点(Isoelectric Point)为8.825。在pH 7.0时，电荷为6.983。
表1 PSY基因编码的蛋白质氨基酸组成Table.1 The amino acid components by PSY
SEQ ID No.1gaattcatgt ctatttgtac gctatgggtt gtttcgccga gttctgaagt tttgagtggcaatgttttct tggagccaat tcgagaaagt taccattttt cggataaaag tttaatgtacaatggaagag ttaagaaaag tagacaccaa aggcgtagat cacgttatgg ggttggagatttgagttcat tttgcttgag agagtctgga ttagagaccc cgggaagaag attatcggtatcctccagta ttatagctac cccggcagga gaaatgacga tgacatcaga gcaaaaggtttatgatgtcg ttttaaagca agcagctttg attaatagac agttgaggtc tagagaaaatttggaggtga aaccggacat tattttgcca ggaaacgcga acgtgttgaa tgaagcttatgatcggtgtc gagaagtatg tgctgaatat gccaagtcat tctactgggg aacccagctcatgacaccgg agaggcgttt agctatctgg gcgatatatg tatggtgtag gaggacagatgagcttgttg atgggcctaa cgcgtcacac ataaatccaa ccgcgttaga taggtgggaagcaagattag aagatgtttt caaagggcaa ccttttgata tgcttgatgc tgctttatctgataccatta ccaagtatcc tgtggacatc cagccattta gagatatgat agaaggaatgcggatggatc tgaagaaatc gagatacaag aatttcgatg agctgtatct ttactgctattatgtggctg gtacagttgg cttgatgagt gtaccagtaa tgggcattgc acctgaatctaaggcaacaa cagaaagtgt gtataatgca gctttatctt tggggatcgc gaaccagctgactaacattc taagggatgt tggagaagat gcaagaagag ggagagtgta cctacctcaagatgaattag cacaagcagg tttatcagat gaggacattt ttgctggaaa agttacagacaaatggagga tttttatgaa gaagcaaatc aaaagggcta gaaaattcta tgatgatgcagagaaaggag tccccgaact cagctccgcg agcagattgc ctgtgtgggc agcgttgcttttttatagaa aaatattgga tgagatagaa gcaaatgact acaacaattt cacaaaaagggcttatgtaa acaaggcaaa gaagctatta gctatgcctg tagcatgtgc caagtctctctcttttatga taccccaaac atgagcggcc gcSEQ ID No.2MetSerIleCysThr LeuTrpValValSer ProSerSerGluVal LeuSerGlyAsnVal151015 20PheLeuGluProIle ArgGluSerTyrHis PheSerAspLysSer LeuMetTyrAsnGly25 30 3540ArgValLysLysSer ArgHisGlnArgArg ArgSerArgTyrGly ValGlyAspLeuSer45 50 55 60SerPheCysLeuArg GluSerGlyLeuGlu ThrProGlyArgArg LeuSerValSerSer65 70 75 80SerIleIleAlaThr ProAlaGlyGluMet ThrMetThrSerGlu GlnLysValTyrAsp85 90 95 100ValValLeuLysGln AlaAlaLeuIleAsn ArgGlnLeuArgSer ArgGluAsnLeuGlu105 110 115 120
ValLysProAspIle IleLeuProGlyAsn AlaAsnValLeuAsn GluAlaTyrAspArg125 130 135 140CysArgGluValCys AlaGluTyrAlaLys SerPheTyrTrpGly ThrGlnLeuMetThr145 150 155 160ProGluArgArgLeu AlaIleTrpAlaIle TyrValTrpCysArg ArgThrAspGluLeu165 170 175 180ValAspGlyProAsn AlaSerHisIleAsn ProThrAlaLeuAsp ArgTrpGluAlaArg185 190 195 200LeuGluAspValPhe LysGlyGlnProPhe AspMetLeuAspAla AlaLeuSerAspThr205 210 215 220IleThrLysTyrPro ValAspIleGlnPro PheArgAspMetIle GluGlyMetArgMet225 230 235 240AspLeuLysLysSer ArgTyrLysAsnPhe AspGluLeuTyrLeu TyrCysTyrTyrVal245 250 255 260AlaGlyThrValGly LeuMetSerValPro ValMetGlyIleAla ProGluSerLysAla265 270 275 280ThrThrGluSerVal TyrAsnAlaAlaLeu SerLeuGlyIleAla AsnGlnLeuThrAsn285 290 295 300IleLeuArgAspVal GlyGluAspAlaArg ArgGlyArgValTyr LeuProGlnAspGlu305 310 315 320LeuAlaGlnAlaGly LeuSerAspGluAsp IlePheAlaGlyLys ValThrAspLysTrp325 330 335 340ArgIlePheMetLys LysGlnIleLysArg AlaArgLysPheTyr AspAspAlaGluLys345 350 355 360GlyValProGluLeu SerSerAlaSerArg LeuProValTrpAla AlaLeuLeuPheTyr365 370 375 380ArgLysIleLeuAsp GluIleGluAlaAsn AspTyrAsnAsnPhe ThrLysArgAlaTyr385 390 395 400ValAsnLysAlaLys LysLeuLeuAlaMet ProValAlaCysAla LysSerLeuSerPhe405 410 415 420MetIleProGlnThr425SEQ ID No.3gaattcatgt ctatttgtac gctatgggtt gtt 33SEQ ID No.4gcggccgctc atgtttgggg tatcataaaa ga 3权利要求
1.一种枸杞类胡萝卜素合成酶基因PSY，其特征是它具有序列表SEQ ID No.1所述的核苷酸序列。
2.一种枸杞类胡萝卜素合成酶基因PSY编码的多肽，其特征是它具有序列表SEQ ID No.2所述的氨基酸序列。
3.一种包含权利要求1基因的重组质粒pGEM-lbPSY，其特征是以序列表SEQ ID No.3、SEQ ID No.4为引物PCR扩增出的DNA序列，回收得到1292bpDNA，将其克隆到pGEM-T载体上，构建了重组质粒pGEM-lbPSY。
全文摘要
本发明公开了一种枸杞类胡萝卜素合成酶基因PSY及包括该基因的质粒，枸杞类胡萝卜素合成酶基因PSY具有序列表SEQ ID No.1所述的核苷酸序列，本发明的枸杞类胡萝卜素合成酶基因PSY为通过基因工程手段调控植物体内类胡萝卜素的代谢和积累，创造类胡萝卜素含量更高的品系，改良果蔬的营养品质，实现工厂化生产天然类胡萝卜素奠定基础。
文档编号C12N9/00GK1884547SQ20061001448
公开日2006年12月27日 申请日期2006年6月29日 优先权日2006年6月29日
发明者季静, 王罡, 郑阳霞 申请人:天津大学