专利名称：一种戊二酰－7－氨基头孢烷酸酰化酶的固定化方法
技术领域：
本发明属于生物酶工程技术领域，特别是提供了一种戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶的固定化方法，采用酶法生产7-氨基头孢烷酸(7-ACA)用的关键酶之一——戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶的一种固定化载体和方法。
背景技术：
7-氨基头孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid，7-ACA)是目前半合成头孢菌素的重要原料，主要由头孢菌素C(Cephalosporin C，CPC)通过化学法或酶法裂解脱去7-位上的D-α-氨基己二酰侧链得到。
酶法替代传统的化学法裂解头孢菌素C生产7-ACA，具有工艺简单、效率高、成本低、安全、无污染及产品质量稳定等优点，在经济和环保上都具有很大的竞争力。近些年来，人们已对酶法生产半合成抗生素的研究和开发投入了大量资金和力量。用酶法裂解生产7-ACA，首先，CPC在D-氨基酸氧化酶(D-Amino acid oxidase，DAAO)的作用下，产生一个具酮基的中间体，这个中间体较不稳定，很容易被同时生产的H2O2化学氧化脱羧，转变成戊二酰基-7-氨基头孢烷酸(Glutaryl-7-amidocephalosporanic acid，GL-7-ACA)；然后在戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶(Glutaryl-7-amidocephalosporanic acid acylase，GL-7-ACA酰化酶)的作用下脱去其侧链，生成7-ACA。
目前，利用两步酶法催化裂解CPC制造7-ACA的技术在国外已经工业化，国内也已经引进国外技术进行7-ACA试生产，但是所用固定化酶均需进口。另外这种方法具有一定的缺点，例如在制备固定化酶之前需要对酶进行多步分离纯化，会造成酶的大量损失；固定化酶和固定化细胞都会增加底物和产物的扩散阻力，使催化反应速率下降；固定化酶和固定化细胞的酶活收率都较低，一般低于50％。在7-ACA生产领域，尽管已有多家企业从国外引进了酶法生产线和生产技术，但由于不能自主生产固定化酶，而进口的固定化酶价格昂贵，采用酶法生产的7-ACA成本甚至高于化学法的成本。因此，寻找价格低、能耗低、对酶活性损失小的新型载体和新的固定化方法以降低固定化的成本，对在国内实现酶法生产代替化学法生产7-ACA尤为重要。
在现代生物工程领域中，膜分离技术得到越来越多的关注。应用膜分离设备，可以将大分子物质(或细胞)和小分子物质进行很好的分离，而且作为催化剂的大分子物质(酶分子)和细胞的活性损失较小，可以进行反复使用。膜分离技术操作简单，成本较低，容易实现连续化操作。游离态的菌催化结合膜分离的方法进行7-ACA的制备已被证明是可行的(中国专利，申请号200410039573.1)。但是直接用未经处理的游离态的菌进行催化，通常只催化几个批次酶即失去活性，如何提高游离态菌的酶催化稳定性是关键(现代化工，2005，25卷增刊，138～141)。
随着中国加入WTO，国外先进技术生产的头孢菌素将大量涌入中国，国内抗生素工业将面临严峻的形势。因此，加紧开发具有先进水平的酶法生产7-ACA的技术，满足国内需求和增强国际市场竞争力已迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于提供一种戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶的固定化方法，以游离态菌为载体的固定化GL-7-ACA酰化酶的方法，以便于结合膜分离技术，在简化生产工艺的同时降低生产成本。
本发明通过下述方法实现的1、培养并收集具有GL-7-ACA酰化酶活性的游离细胞，2、将步骤1中收集得到的游离细胞重悬于pH6～9缓冲溶液中，然后加入终浓度为5～100mmol/l的交联剂；0～45℃下，交联1～4小时，离心，所得固体用缓冲液冲洗，得到以游离态菌为载体的固定化戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶。4℃保存备用。
3、在生产7-氨基头孢烷酸中的应用；所述的固定化酶与催化产物的分离以及固定化酶的重复使用，采用的是离心或膜分离的方法，进行重复使用；或者采用中空纤维超滤膜分离的方法将固定化酶与催化产物分离，使固定化酶得到重复使用。
本发明所述具有戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶活性的游离细胞为GL-7-ACA酰化酶的重组大肠杆菌。所述的缓冲溶液为三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCl缓冲液，浓度为0～1mol/L，pH为6～9；所述缓冲溶液优选为pH8.0的0.1mol/L Tris-HCl缓冲液。所述的交联剂为戊二醛。
本发明的优点在于通过以游离态菌为载体对GL-7-ACA酰化酶进行交联固定化，固定化后，酶活提高了20～40％，催化稳定性增加了10～20倍。
具体实施例方式
实施例1GL-7-ACA酰化酶的固定化过程为首先将GL-7-ACA酰化酶重组大肠杆菌pET-ACY的发酵液离心收集菌体，再用浓度为100mM/L、pH为8.0的Tris-HCl缓冲溶液重悬，最后加入事先配好的戊二醛溶液，使其终浓度为40mmol/l，放4℃交联4小时后离心，弃上清液，所得固体用Tris-HCl缓冲液冲洗，即得到以游离态菌为载体的固定化GL-7-ACA酰化酶。固定化后测得GL-7-ACA酰化酶酶活是固定化前的1.38倍。
实施例2
GL-7-ACA酰化酶的固定化过程为首先将GL-7-ACA酰化酶重组大肠杆菌pET-ACY的发酵液离心收集菌体，再用浓度为100mM/L、pH为8.0的Tris-HCl缓冲溶液重悬，最后加入事先配好的戊二醛溶液，使其终浓度为70mmol/l，放25℃交联2小时后离心，弃上清液，所得固体用Tris-HCl缓冲液冲洗，即得以游离态菌为载体的固定化GL-7-ACA酰化酶。固定化后测得GL-7-ACA酰化酶酶活是固定化前的1.36倍。
实施例3利用实施例1制备的以游离态菌为载体的固定化GL-7-ACA酰化酶，进行GL-7-ACA催化生成7-ACA的实验。在装有固定化酶的试管中，加入用浓度为100mM/L、pH为8.0的Tris-HCl缓冲溶液配制的GL-7-ACA溶液(5g/L)，37℃下进行催化反应，催化30min为一批次，离心收集固定化酶进行反复催化。经检测，催化30批次后，固定化酶的活性还保留了62％。
实施例4先将GL-7-ACA酰化酶重组大肠杆菌pET-ACY的发酵液离心收集菌体，再用浓度为100mM/L、pH为8.0的Tris-HCl缓冲溶液重悬。利用未经交联处理的游离态的菌体进行GL-7-ACA催化生成7-ACA的实验。在装有游离态菌体的试管中，加入用浓度为100mM/L、pH为8.0的Tris-HCl缓冲溶液配制的GL-7-ACA溶液(5g/L)，37℃下进行催化反应，催化30min为一批次，离心收集菌体进行反复催化。经检测，催化3批次后，固定化酶的活性还保留了36％。
实施例5利用实施例1制备的以游离态菌为载体的固定化GL-7-ACA酰化酶，进行GL-7-ACA催化生成7-ACA的实验。在装有固定化酶的试管中，加入用浓度为100mM/L、pH为8.0的Tris-HCl缓冲溶液配制的GL-7-ACA溶液(10g/L)，37℃下进行催化反应，反应120min，GL-7-ACA基本都转化生成7-ACA，转化率约为90.3％。得到的催化反应液，采用膜过滤法进行固定化GL-7-ACA酶与产物的分离。选择中空纤维超滤膜(截留分子量30,000)。采用膜过滤法分离的反应液，采用6N HCl调节反应液的pH至3.5，使7-ACA进行等电结晶。经过减压过滤和真空干燥，得到白色的7-ACA晶体，产物纯度为92.5％。
实施例6将实施例5中经膜分离得到的固定化GL-7-ACA酰化酶，按实施例5的条件再次催化GL-7-ACA溶液(5g/L)。经过120min的催化反应，GL-7-ACA基本都转化生成7-ACA，转化率约为91.2％。这说明，经过催化反应及膜分离的固定化GL-7-ACA酰化酶仍具有很好的催化活性，可以进行多次循环使用。
权利要求
1.一种戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶的固定化方法，其特征在于a、培养并收集具有戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶活性的游离细胞；b、将步骤a中收集得到的游离细胞重悬于pH6.0～9.0缓冲溶液中，然后加入终浓度为5～100mmol/L的交联剂；0～45℃下，交联1～4小时，离心，所得固体用缓冲液冲洗，得到以游离态菌为载体的固定化GL-7-ACA酰化酶；c、在生产7-氨基头孢烷酸中的应用；所述的固定化酶与催化产物的分离以及固定化酶的重复使用，采用的是高速离心的方法收集固定化酶；或者采用中空纤维超滤膜分离的方法将固定化酶与催化产物分离。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述具有戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶活性的游离细胞为戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶的重组大肠杆菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的缓冲溶液为Tris-HCl缓冲液，浓度为0～1mol/L，pH为6～9。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于所述的缓冲溶液选择pH8.0的0.1mol/L Tris-HCl缓冲液。
全文摘要
本发明提供了一种戊二酰－7－氨基头孢烷酸酰化酶的固定化方法，属于生物酶工程技术领域。工艺步骤为培养并收集具有戊二酰－7－氨基头孢烷酸酰化酶活性的游离细胞；收集得到的游离细胞重悬于Ph 6～9缓冲溶液中，然后加入终浓度为5～100mmol/L的交联剂；0～45℃下，交联1～4小时，离心，所得固体用缓冲液冲洗，得到以游离态菌为载体的固定化戊二酰－7－氨基头孢烷酸酰化酶。本发明的优点在于与传统的固定化酶、固定化细胞方法相比，具有明显的优势，结合膜分离工艺，展现了强有力的工业应用前景。
文档编号C12P35/02GK1844383SQ20061001174
公开日2006年10月11日 申请日期2006年4月18日 优先权日2006年4月18日
发明者罗晖, 史芫芫, 于慧敏, 李强, 沈忠耀 申请人:北京科技大学, 清华大学