专利名称：北五味子体细胞胚发生和植株再生方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞胚发生和植株再生方法。
背景技术：
北五味子(Schisandra Chinensis Baill)属于五味子科(Schisandraceae)多年生野生木质藤本，其果实既是重要的传统中药、也可用于酿酒和制作果汁饮料。近年来在北五味子果实、种子和茎中发现药物成分联苯环辛二烯类木脂素，所以北五味子日益受到重视，发展前景十分广阔。由于生态环境破坏和长期掠夺式采摘，野生资源破坏严重，北五味子市场供不应求。我国北五味子无性系品种“红珍珠”具有优良的性状，但因其采用实生繁殖，没有成熟的无性繁殖体系，难以得到推广。目前采用的无性繁殖法存在诸多缺陷，如扦插繁殖法插条必须带2年生的枝才能生根，枝条数量少，培育周期长；地茎繁殖法根系太弱，离开母体后成活率低，不能应用于生产；诱导腋芽发芽法增殖倍数低，只有3.2倍，芽生长速度慢，所以也不适合应用于生产；合子胚诱导体细胞胚发生和植株再生法方法繁琐，而且以合子胚为体细胞胚诱导材料，再生植株的遗传性状不能保持与母本一致。
发明内容
本发明的目的是为了解决目前北五味子无性繁殖法培育周期长、成活率低、增殖倍数低、芽生长速度慢、再生植株的遗传性状不能保持与母本一致的问题，而提供的一种北五味子体细胞胚发生和植株再生方法。北五味子体细胞胚发生和植株再生方法按以下步骤进行(一)切取优良北五味子个体营养器官进行预处理，然后接种到加入0.5～10mg/L生长素、10～60g/L蔗糖和5.0～8.0g/L琼脂的培养基上；(二)在温度为29±1℃，光周期是明16h/暗8h的培养室中培养7～9周，得到体细胞胚；(三)将体细胞胚转移到与第一步成分相同的固体培养基中继代培养2～3个月，得到愈伤组织；(四)将继代培养的半透明乳白色胚性愈伤组织转入外加0.5～10mg/L生长素的培养基上培养25～35天，之后再转移到添加了10～60g/L蔗糖和5.0～8.0g/L琼脂、无机盐浓度为1/4～1/2的培养基上，在25±1℃、光周期是明16h/暗8h的条件下培养4～5周，得到发芽的体细胞胚；(五)将发芽的体细胞胚转移到与第四步成分相同的培养基中培养4～5周，得到完整的再生植株；(六)再生植株土壤移栽培养，即得到北五味子苗木。北五味子体细胞胚发生和植株再生方法还可按以下步骤进行(一)切取优良北五味子个体营养器官进行预处理，然后接种到加入0.5～10mg/L生长素、10～60g/L蔗糖和5.0～8.0g/L琼脂的培养基上；(二)在温度为29±1℃，光周期是明16h/暗8h的培养室中培养7～9周，得到体细胞胚；(三)将体细胞胚转移到与第一步成分相同的固体培养基中继代培养2～3个月，得到愈伤组织；(四)将继代培养的半透明乳白色胚性愈伤组织转入外加0.5～10mg/L生长素的培养基上培养4～5个月，之后选取生长旺盛的胚性愈伤组织切成25～35mg的小团转移到添加了10～60g/L蔗糖和5.0～8.0g/L琼脂、无机盐浓度为1/4～1/2的培养基上，在25±1℃、光周期是明16h/暗8h的条件下培养4～5周，得到发芽的体细胞胚；(五)将发芽的体细胞胚转移到与第四步成分相同的培养基中培养4～5周，得到完整的再生植株；(六)再生植株土壤移栽培养，即得到北五味子苗木。
北五味子体细胞胚的继代培养周期为4周。本发明可诱导出具有幼根、幼芽的双极性结构，比需要两种不同激素分别诱导不定芽、不定根的器官发生方式更利于实现苗木的自动化生产。本发明体细胞胚发生取材范围广，对母本破坏小，繁殖速度快，增殖倍数高，30mg胚性愈伤组织2个月内可得到1800～2200个体细胞胚，芽生长速度快、培养15天生长2.0～3.0cm，成活率高达80％以上。本发明可固定杂种优势，大量生产与母本具有相同优良性状的再生植株，多年使用而无需三系配套等复杂的育种过程。而且本发明也可作为研究植物胚胎发生过程中不同生物事件的模式系统。
具体实施例方式
具体实施方式
一本实施方式北五味子体细胞胚发生和植株再生方法按以下步骤进行(一)切取优良北五味子个体营养器官进行预处理，然后接种到加入0.5～10mg/L生长素、10～60g/L蔗糖和5.0～8.0g/L琼脂的培养基上；(二)在温度为29±1℃，光周期是明16h/暗8h的培养室中培养7～9周，得到体细胞胚；(三)将体细胞胚转移到与第一步成分相同的固体培养基中继代培养2～3个月，得到愈伤组织；(四)将继代培养的半透明乳白色胚性愈伤组织转入外加0.5～10mg/L生长素的培养基上培养25～35天，之后再转移到添加了10～60g/L蔗糖和5.0～8.0g/L琼脂、无机盐浓度为1/4～1/2的培养基上，在25±1℃、光周期是明16h/暗8h的条件下培养4～5周，得到发芽的体细胞胚；(五)将发芽的体细胞胚转移到与第四步成分相同的培养基中培养4～5周，得到完整的再生植株；(六)再生植株土壤移栽培养，即得到北五味子苗木。
北五味子体细胞胚的继代培养周期为4周。本实施方式可通过生物反应器培养体细胞胚，扩大了培养规模，降低了成本，实现了优良北五味子的工厂化生产和新品种的快速推广。
具体实施例方式
二本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤(一)选用“红珍珠”品系的北五味子个体营养器官进行预处理。其它步骤与实施方式一相同。
本实施方式建立了北五味子无性系优良品种“红珍珠”的无性繁殖体系。
具体实施例方式
三本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤(一)中的营养器官为无菌组织培养苗的根、茎、叶、芽或者为多年生植株的根、茎、叶、花、芽或顶端分生组织。其它步骤与实施方式一相同。
具体实施例方式
四本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤(一)中预处理是将营养器官用自来水冲洗一天后放入浓度为70％的酒精中浸泡30s，再用蒸馏水冲洗2次，放入浓度3％的次氯酸钠溶液中消毒10min，之后用无菌蒸馏水冲洗4～6遍。其它步骤与实施方式一相同。
具体实施例方式
五本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤(一)中培养基先用1N的NaOH或HCl调节pH值到5.75后再加入琼脂。其它步骤与实施方式一相同。
具体实施例方式
六本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤(一)和(四)中的生长素为2，4二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸或吲哚丁酸。其它步骤与实施方式一相同。
具体实施例方式
七本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤(一)和(四)中每升培养基加入2～8mg的2，4二氯苯氧乙酸。其它步骤与实施方式一相同。
具体实施例方式
八本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤(一)和(四)中每升培养基加入4mg的2，4二氯苯氧乙酸。其它步骤与实施方式一相同。
本实施方式通过测试选用每升培养基中加入4mg 2，4二氯苯氧乙酸的方案。2，4-D浓度对胚性愈伤组织诱导率影响的测试结果如表1所示。
表1
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤(一)至(五)中使用同一种培养基，培养基是MS(Murashige and Skoog)培养基、SH培养基、Gamborg B5培养基、N6培养基或Heller培养基中的一种。其它步骤与实施方式一相同。
本实施方式只使用一种培养基，这样可以简化操作步骤、可以节省劳动力和降低生产成本，有利于实现苗木的工厂化生产。
具体实施例方式
十本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤(一)至(五)中使用MS培养基。其它步骤与实施方式一相同。
具体实施例方式
十一本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤(六)将生根并有3片以上叶片的再生植株用自来水洗去培养基，移栽到装有草炭土的容器中，在温室条件下覆膜培养2～4周、每天浇水1次，当新叶片长出后去掉覆盖的塑料薄膜。其它步骤与实施方式一相同。
本实施方式再生植株成活率高于80％。
具体实施例方式
十二本实施方式与具体实施方式
十一的不同点是步骤(六)中移栽到装有草炭土容器中的再生植株在20℃条件下覆膜培养2～4周。其它步骤与实施方式十一相同。
本实施方式再生植株成活率可高达100％。
具体实施例方式
十三本实施方式北五味子体细胞胚发生和植株再生方法，北五味子体细胞胚发生和植株再生方法按以下步骤进行(一)切取优良北五味子个体营养器官进行预处理，然后接种到加入0.5～10mg/L生长素、10～60g/L蔗糖和5.0～8.0g/L琼脂的培养基上；(二)在温度为29±1℃，光周期是明16h/暗8h的培养室中培养7～9周，得到体细胞胚；(三)将体细胞胚转移到与第一步成分相同的固体培养基中继代培养2～3个月，得到愈伤组织；(四)将继代培养的半透明乳白色胚性愈伤组织转入外加0.5～10mg/L生长素的培养基上培养4～5个月，之后选取生长旺盛的胚性愈伤组织切成25～35mg的小团转移到添加了10～60g/L蔗糖和5.0～8.0g/L琼脂、无机盐浓度为1/4～1/2的培养基上，在25±1℃、光周期是明16h/暗8h的条件下培养4～5周，得到发芽的体细胞胚；(五)将发芽的体细胞胚转移到与第四步成分相同的培养基中培养4～5周，得到完整的再生植株；(六)再生植株土壤移栽培养，即得到北五味子苗木。
本实施方式对胚性愈伤组织进行多次继代培养，其结果如表2所示。胚性愈伤组织经过多次继代培养，生长旺盛，接种量增大，体细胞胚个数显著增多。
表2
具体实施方式
十四本实施方式北五味子体细胞胚发生和植株再生方法按以下步骤进行(一)切取“红珍珠”北五味子4年生以上植株的一年生枝条上的饱满冬芽进行预处理，然后接种到加入4mg/L 2，4二氯苯氧乙酸、30g/L蔗糖和5.5g/L琼脂的MS培养基上；(二)在温度为29℃，光周期是明16h/暗8h的培养室中培养8周，得到体细胞胚；(三)将体细胞胚转移到与第一步成分相同的固体培养基中继代培养2～3个月，得到愈伤组织；(四)将继代培养的半透明乳白色胚性愈伤组织转入外加4mg/L 2，4二氯苯氧乙酸的MS培养基上培养4～5个月，之后选取生长旺盛的胚性愈伤组织切成28～32mg的小团转移到添加了20g/L蔗糖和5.5g/L琼脂、无机盐浓度为1/2的培养基上，在25℃、光周期是明16h/暗8h的条件下培养4～5周，得到发芽的体细胞胚；(五)将发芽的体细胞胚转移到与第四步成分相同的培养基中培养4～5周，得到完整的再生植株；(六)将生根并有3片以上叶片的再生植株用自来水洗去培养基，移栽到装有草炭土的容器中，在温室条件下覆膜培养3周，当新叶片长出后去掉覆盖的塑料薄膜，转移到20℃环境中继续培养，在土壤移栽培养过程中每天浇1次水，即得到北五味子苗木。
本实施方式中体细胞胚的发生率为1.7～3.5％，经过步骤(三)培养20天，体细胞胚的鲜重增加10倍以上。
权利要求
1.北五味子体细胞胚发生和植株再生方法，其特征在于北五味子体细胞胚发生和植株再生方法按以下步骤进行(一)切取优良北五味子个体营养器官进行预处理，然后接种到加入0.5～10mg/L生长素、10～60g/L蔗糖和5.0～8.0g/L琼脂的培养基上；(二)在温度为29±1℃，光周期是明16h/暗8h的培养室中培养7～9周，得到体细胞胚；(三)将体细胞胚转移到与第一步成分相同的固体培养基中继代培养2～3个月，得到愈伤组织；(四)将继代培养的半透明乳白色胚性愈伤组织转入外加0.5～10mg/L生长素的培养基上培养25～35天，之后再转移到添加了10～60g/L蔗糖和5.0～8.0g/L琼脂、无机盐浓度为1/4～1/2的培养基上，在25±1℃、光周期是明16h/暗8h的条件下培养4～5周，得到发芽的体细胞胚；(五)将发芽的体细胞胚转移到与第四步成分相同的培养基中培养4～5周，得到完整的再生植株；(六)再生植株土壤移栽培养，即得到北五味子苗木。
2.根据权利要求1所述的北五味子体细胞胚发生和植株再生方法，其特征在于步骤(一)选用“红珍珠”品系的北五味子个体营养器官进行预处理。
3.根据权利要求1所述的北五味子体细胞胚发生和植株再生方法，其特征在于步骤(一)中的营养器官为无菌组织培养苗的根、茎、叶、芽或者为多年生植株的根、茎、叶、花、芽或顶端分生组织。
4.根据权利要求1所述的北五味子体细胞胚发生和植株再生方法，其特征在于步骤(一)和(四)中的生长素为2，4二氯苯氧乙酸、萘乙酸或吲哚丁酸。
5.根据权利要求1所述的北五味子体细胞胚发生和植株再生方法，其特征在于步骤(一)和(四)中每升培养基加入4mg的2，4二氯苯氧乙酸。
6.根据权利要求1所述的北五味子体细胞胚发生和植株再生方法，其特征在于步骤(一)至(五)中使用同一种培养基，培养基是MS培养基、SH培养基、Gamborg B5培养基、N6培养基或Heller培养基中的一种。
7.根据权利要求1所述的北五味子体细胞胚发生和植株再生方法，其特征在于步骤(一)至(五)中使用MS培养基。
8.根据权利要求1所述的北五味子体细胞胚发生和植株再生方法，其特征在于步骤(六)将生根并有3片以上叶片的再生植株用自来水洗去培养基，移栽到装有草炭土的容器中，在温室条件下覆膜培养2～4周、每天浇水1次，当新叶片长出后去掉覆盖的塑料薄膜。
9.根据权利要求8所述的北五味子体细胞胚发生和植株再生方法，其特征在于步骤(六)中移栽到装有草炭土容器中的再生植株在20℃条件下覆膜培养2～4周。
10.北五味子体细胞胚发生和植株再生方法，其特征在于北五味子体细胞胚发生和植株再生方法按以下步骤进行(一)切取优良北五味子个体营养器官进行预处理，然后接种到加入0.5～10mg/L生长素、10～60g/L蔗糖和5.0～8.0g/L琼脂的培养基上；(二)在温度为29±1℃，光周期是明16h/暗8h的培养室中培养7～9周，得到体细胞胚；(三)将体细胞胚转移到与第一步成分相同的固体培养基中继代培养2～3个月，得到愈伤组织；(四)将继代培养的半透明乳白色胚性愈伤组织转入外加0.5～10mg/L生长素的培养基上培养4～5个月，之后选取生长旺盛的胚性愈伤组织切成25～35mg的小团转移到添加了10～60g/L蔗糖和5.0～8.0g/L琼脂、无机盐浓度为1/4～1/2的培养基上，在25±1℃、光周期是明16h/暗8h的条件下培养4～5周，得到发芽的体细胞胚；(五)将发芽的体细胞胚转移到与第四步成分相同的培养基中培养4～5周，得到完整的再生植株；(六)再生植株土壤移栽培养，即得到北五味子苗木。
全文摘要
北五味子体细胞胚发生和植株再生方法，它涉及一种细胞胚发生和植株再生方法。它解决了目前北五味子无性繁殖法培育周期长、成活率低、再生植株的遗传性状不能保持与母本一致的问题。其方法是(一)切取优良北五味子个体营养器官预处理；(二)培养营养器官；(三)体细胞胚继代培养；(四)培养胚性愈伤组织得到发芽的体细胞胚；(五)培养得到完整的再生植株；(六)再生植株土壤移栽培养，即得到北五味子苗木。本发明体细胞胚发生取材范围广，繁殖速度快，增殖倍数高，成活率高达80％以上，而且本发明可大量生产与母本具有相同优良性状的再生植株。
文档编号C12N5/04GK1817106SQ20061000978
公开日2006年8月16日 申请日期2006年3月8日 优先权日2006年3月8日
发明者李成浩, 杨传平, 刘桂丰, 牛遇达, 赵波, 韩君 申请人:东北林业大学