专利名称：：同时检测和鉴定引起人体呼吸感染多种病毒的探针和方法
技术领域：
：本发明涉及核苷酸序列的检测，尤其是用于同时检测单一检验样品中的多数核酸序列的探针和检验。更具体些，本发明涉及到检测引起人体呼吸感染的病毒的多数核酸序列的探针和方法，通过杂交的方式，最终在单个检验样品中得到体现，病毒中包括A型流感病毒，B型流感病毒，C型流感病毒，A型人呼吸道合胞病毒，B型人呼吸道合胞病毒，人腺病毒，1型人副流感病毒，2型人副流感病毒，3型人副流感病毒，4A型和4B型人副流感病毒，肠道病毒，鼻病毒，229E型人冠状病毒，OC43型人冠状病毒，引起严重急性呼吸道综合征(SARS)的冠状病毒，人偏肺病毒和它们的组合。
背景技术：
：从临床学的观点来看，由不同病毒甚至一些细菌弓i起的呼吸道病毒感染的迹象和症状一般很难进行区分。因此有必要提供一种不仅能够鉴定弓l起感染的病原物，还能使这一鉴定过程在短时间内就能完成的诊断工具，这样所得结果才能有助于快速实施适当的治疗或者缓解病情的措施，同时，在由病毒引起感染的情况下，能够避免抗生素不必要的施用，避免了耐药细菌的产生。另外，快速而可靠的病毒性感染的诊断方法对于可肯旨通过施用抗病毒药物进行治疗的病毒性疾病，例如流感病毒的情况，是极为重要的。舰于降低高危人群，例如群人、婴幼儿和免疫力低下的病人，由这类病毒引起的病死率将发挥极大的作用。考虑到新型的抗病毒药物可能在不久的将来问世，对于灵敏的诊断方法的需求也将增大，这类微生物实验室中的常规方法可以快速鉴定弓l起呼吸道感染的不同病毒。因此，检测和鉴定弓胞上呼吸道感染的导致临床无法区分迹象和症状的病毒的实验室诊断显得尤其必要。有一种观点被错误地认为，例如，从一个病人身上可以将链球菌性咽炎与病毒性咽炎中可靠地区分开来。这样的概率甚至可以估算出来(例如，普通感冒的症^^细菌性咽炎的诊断的阴性预测值为80。％)，但是这一结果必须通过实验分析手段才能得到证实。通常对人体病毒性呼吸道感染的病因诊断，到目前为止，是运用传统方法，例如分离自细胞i咅养物或者通过间接免疫荧光(IF)技术，这些方法虽然具有较高的灵敏度，但是只允许，除了极少数情况下，区分一种以上共同感染样品的病毒的存在，这可能由几个因素造成，例如(i)高细胞病变活性病毒对细胞单层的破坏，可能掩盖了对样品中可能存在的其他生长较慢或者细胞病变作用较不明显的病毒生长的检测，同时(ii)掩盖了用于鉴定的共同感染样品的病毒的特定单克隆抗体的未利用率。因此，对共同感染的诊断由于缺乏足够灵敏和特异的检测技术而被低估。基于对临床样品或者细胞培养物中病毒基因组检测的常规检验如今正越来越多地被弓l入常规临床诊断。允许检观摘毒基因组的检验类型通常基于杂交法或者扩增法。在第一种情况(杂交法)，病毒基因组可以通过利用探针或者寡核苷酸而被检测出来，这样的探针或者寡核苷酸带有一段可能出现在待检测样品中的病毒基因组的同源序列。这类技术通常简单并且利用非放射性方式显示出来，例如通过荧光或者化学发光。基于杂交法的方法在特异性、灵敏性和对样品中病毒核苷酸总量(病毒负荷量)的定量可能性方面也具有优势，这可以用来监控病人对抗病毒治疗的反应。基因组扩增法允许将某种病毒的基因组序列扩增几百万倍以便使它们可以很容易被检测出来。聚合酶链式反应(PCR)在简单和多种格式中已经被证明是在病毒弓胞的呼吸道感染诊断中的一个非常灵敏而且特异性很高的基因组扩增方法。基于通常情况下，传统的呼吸道样品(鼻咽冲洗或抽吸物、咽涂片、漱口液等)中病毒的数量通常稀少的事实，基因组扩增在呼吸道感染诊断的检验中的应用相对常见。因此，为了得到最高的灵敏度，通常有必要在第一次扩增反应结束后，对获得的片段进行第二次扩增，例如，用套式PCR。一般来说，第一次扩增反应是RT-PCR(RT:逆转录或反转录)，因为大部分弓l起人呼吸道感染的病毒有一个由RNA构成的基因组。即使套式PCR操作起来很简单而且容易引入诊断实验室的常规，旨，基于病毒基因组片段的大量扩增导致相邻样品片段的扩增产物可能导致样品受到污染的事实，这一方法仍是假阳性的可能来源。所以为了能够在常规条件下操作套式PCR技术，有必要采取特殊的预防措施，包括，例如，扩增，骄的步骤必须在物理上分隔的实验室进行，使用不同的层流舱，每个里面提供的反应物、微量移液器装置、无菌管和无菌过滤器，都是完全独立的。在小型实验室或者不能提供足够试验材料或设备的实验室，这通常是不太可行。另外，基于扩增反应的方法可以同时检测一种或者多种病毒病原物，但不是所有可以弓胞呼吸道感染的可能病毒，这是因为，众所周知，操作能够同时检测几种病毒的多重PCR在技术上还有难度，比如增加反应混合物中弓胸的数量，或者调整引物在被扩增基因中的位置以获得容易在琼脂糖凝胶电泳中根据片段大小而区分的病毒，将导致灵敏度下降。尽管如此，已有关于多重RT-PCR的报道，这一方法同时对一些弓胞人呼吸道感染的病毒检测和分型，尤其是A、B、C型流感病毒，A和B型呼吸道合胞病毒和腺病毒(Coiras等，2003，JMedVirol《医学微生物学杂志》69:132-144)。诊断病毒引起的呼吸道感染的一个值得注意的可选方法是基于基因扩增和带有特定探针的杂交技术的组合应用。这一方法遵循"Hexaplex"检验，这是基于通过含有探针和酶标的杂交体系中的多重RT-PCR扩增的方法。通过这一技术，检测下列病毒成为可能A和B型呼吸道合胞病毒，A和B型流感病毒和1，2，3型副流感病毒。不过，这个方法不能检测其他弓胞人呼吸道感染的重要病毒，例如腺病毒，一类呼吸道重要病原体；4型副流感病毒，一般引起2岁以下儿童感染，弓|起的症状没有之前报道的严重；肠道病毒、鼻病毒或冠状病毒，后两个类型是能够引起病人严重并发症的上呼吸道感染最常见和可能的病原体。另夕卜，后三个类型的病毒在呼吸道感染病人的临床样品中能够被重复检湖倒，但是它们作为弓胞呼吸道感染的病原物的角色尚不清楚，由于通过标准方法检测它们尚有困难，它们的流行病学也不清楚。因此，目前应用于常规实验室人呼吸道感染病毒的诊断方法具有如下几个缺点-灵敏度和/或特异性不足；-使用基于IF的技术时会出现假阴性；-使用基于套式PCR的技术时会出现假阳性；-获得结果需要数天甚至数周的时间，尤其在从细胞培养物中分离病毒的情况;-根据临床样品，取样结果，储存和运输条件而依赖其他技术。这一点在从细胞培养物中分离病毒的情况和可能出测叚阴性的免疫荧光技术的情况中尤为重要；-样品被采样区域中的正常菌丛的细菌所污染，这样会导致通过细胞培养物分离病毒等方法变得困难，由此可能造成假阳性；同时-在某些情况下，需要相关专业和有经验的技术人员在场。因此有必要发展出可以同时检测和鉴定弓胞人呼吸道感染的主要病毒病原物，解决所有或者部分现行常规实验室诊断人呼吸道感染病毒方法缺陷的有效方法。上述的的方法必须提供快速的、特异的和敏感的方式，得到的结果可以用于临床做出治疗、预防或者减缓病痛的决定。通过阐述，一种合适的诊断方法将是一个可以将弓l起其他症状轻微的呼吸道感染病毒，与能够弓虚需要立即住院治疗或者隔离病人的呼吸道感染的病毒区分开来。进一步来说，上述的方法必须肖g够在靠近病人所在的地方的实验室操作，所需工具和设备不贵，操作中也不需要特别专业熟练的技术人员。
发明内容本发明由探针和方法构成的，以快速的、特异的和敏感的方式，为当前的同时检测和鉴定在一个检验样品中可能存在的弓l起人呼吸道感染的主要病毒的需要，提供了解决的办法。为此，本发明是基于杂交系统的发展，其中带有特异序列(探针)的不同寡核苷酸被固定在固体支持物上。这些探针被设计来与之前提到的病毒目标核苷列进行特异性杂交，这样不仅可以检湖U和鉴定引起呼吸道疾病的病毒，还能同时对病毒进行分型。这一系统适合打算建立人传染性呼吸道疾病病因诊断的微生物实验室发展易操作的试剂盒。通过这个发明提供的方法能够鉴定的引起人呼吸道感染的病毒包括A型流感病毒，B型流感病毒，C型流感病毒，A型人呼吸道合胞病毒，B型人呼吸道合胞病毒，人腺病毒，1型人副流感病毒，2型人副流感病毒，3型人副流感病毒，4A和4B型人副流感病毒，肠道病毒，鼻病毒，229E型人冠状病毒，OC43型人冠状病毒，引起严重急性呼吸道综合征(SARS)的冠状病毒，人偏肺病毒和它们的组合。因此，一方面，这个发明涉及到一种用于鉴定弓胞人呼吸道感染病毒的探针，病毒包括A型流感病毒，B型流感病毒，C型流感病毒，A型人呼吸道合胞病毒，B型人呼吸道合胞病毒，人腺病毒，1型人副流感病毒，2型人副流感病毒，3型人副流感病毒，4A和4B型人副流感病毒，肠道病毒，鼻病毒，229E型人冠状病毒，OC43型人冠状病毒，引起严重急性呼吸道综合征的(SARS)冠状病毒和人偏肺病毒。另一方面，本发明涉及到一个由固体支持物和至少一种以上的固定在支持物上的上述探针构成的杂交平台。再一方面，本发明涉及到一种用于鉴定弓l起人呼吸道感染病毒的方法，这里的病毒包括A型流感病毒，B型流感病毒，C型流感病毒，A型人呼吸道合胞病毒，B型人呼吸道合胞病毒，人腺病毒，l型人副流感病毒，2型人副流感病毒，3型人副流感病毒，4A和4B型人副流感病毒，肠道病毒，鼻病毒，229E型人冠状病毒,OC43型人冠状病毒，弓胞严重急性呼吸道综合征(SARS)的冠状病毒，人偏肺病毒和它们的组合，方法基于对上述病毒基因组目标序列的杂交，通过采用上述探针进行扩增反应来随意扩增。再一个方面，本发明涉及到鉴定引起人呼吸道感染病毒的试剂盒，这里的病毒包括A型流感病毒，B型流感病毒，C型流感病毒，A型人呼吸道合胞病毒，B型人呼吸道合胞病毒，人腺病毒，1型人副流感病毒，2型人副流感病毒，3型人副流感病毒，4A和4B型人副流感病毒，肠道病毒，鼻病毒，229E型人冠状病毒，OC43型人冠状病毒，引起严重急性呼吸道综合征(SARS)的冠状病毒，人偏肺病毒和它们的组合，基于上述方法，由至少一种上述探针或者一种上述杂交平台构成。图1显示了通过尼划莫杂交和化学发光观察对细胞培养物中的弓胞人呼吸道感染病毒的参考菌株的检测。被检验的病毒是A型流感病毒(IVA),B型流感病毒(IVB)，A型人呼吸道合胞病毒(RSVA)，B型人呼吸道合胞病毒(RSVB)，人腺病毒(ADV1)，229E型人冠状病毒(HCV229E)，1型人副流感病毒(PIV1)，2型人副流感病毒(PIV2)，3型人副流感病毒(PIV3)，4A型人副流感病毒(PIV4A)，OC43型人冠状病毒(HCVOC43)，人肠道孤病毒(Echo30)，鼻病毒(Rhino14)，人偏肺病毒(metapneumovirus)和C型流感病毒(IVC)。更多信息请看例l。图2显示了通过尼龙膜杂交和化学发光观察对弓胞人呼吸道感染病毒的检观IJ，病毒分离自接种于细胞培养物的呼吸道临床样品。被检验的病毒是A型流感病毒(InfluenzaA)，B型流感病毒(InfluenzaB)，A型呼吸道合胞病毒(RSVA)，B型呼吸道合胞病毒(RSVB)，人腺病毒(ADV1)和3型副流感病毒(Parainfluenzatype3)。不同浓度的探针用来观察探针浓度对灵敏度的影响。更多信息请看例2。图3显示通过尼龙膜上杂交(图3A)和套式PCR(图3B)对临床样品中A型流感病毒的检测。X寸检验的说明请看例3。图3A显示来自被检验的用固定在膜(1-12道)上的探针(SEQIDNO:l和SEQIDNO:2)检测A型流感病毒临床样品核苷酸的杂交结果。A型流感病毒在样品2，7和8中没有被检测出来。图3B显示用来检查灵敏度和特异性之前的技术(杂交)的套式PCR的结果。l-12道与图3A中看到的1-12道匹配。M道与罗氏诊断公司(RocheDiagnostics)提供的分子质量标记XIV(100bp标记)匹配。一个含有721个碱基对(bp)的条带与A型人流感病毒核蛋白基因的扩增片段匹配，一条含有837个碱基对(bp)的条带与作为从样品中提取遗传物质的对照的内标匹配，而且条带在PCR反应(例3)的所有道中都能看到(除了2，7和8)。可以看到两种技术得到的结果是一致的。图4显示了通过尼龙膜杂交和化学发光观察对临床样品中弓l起严重急性呼吸道综合征(SARS)的冠状病毒的检测。几种浓度的探针(SEQIDN0:18)在检验中被使用。对检验的描述请看例4。图5显示了通过玻璃支持物(玻片)和荧光观察对来源于呼吸道症状病人的临床样品(呼吸道分泌物)的人腺病毒的检测。可以看到通过初始化人腺病毒的特异性寡核苷酸得到的扩增产物出现的Cy3分子放射出的荧光。引起人体呼吸道感染的从属于血清型l(图片O、2(图片2)、4(图片3)、5(图片4)和7(图片5)的腺病毒稀释液通过PCR被用来扩增和标记，这些稀释液等价于103拷贝的含有人腺病毒六邻体(hexon)基因片段的质粒在例5条件下的扩增结果。阴性对照也包含在餅。具体实施例方式本发明为同时鉴定在同一个检验样品中可能存在的引起人呼吸道感染的主要病毒的多数核苷酸序列提供了探针和方法。探针一方面，本发明涉及到探针，以下谈及的本发明的探针，通过特异性杂交，可以鉴定，引起人呼吸道感染的主要病毒，包括A型流感病毒、B型流感病毒，C型流感病毒，A型人呼吸道合胞病毒，B型人呼吸道合胞病毒，人腺病毒，1型人副流感病毒，2型人副流感病毒，3型人副流感病毒，4A和4B型人副流感病毒，肠道病毒，鼻病毒，229E型人冠状病毒，OC43型人冠状病毒，引起严重急性呼吸道综合征(SARS)的冠状病毒和人偏肺病毒。这里所用的术语"探针"指的是一个具有特定序列的可以和核苷酸的互补序列杂交的寡核苷酸，它可以通过特异性杂交，用来检测和鉴定核苷酸中的互补或者充分互补序列。同样，这里所用的术语"杂交"指的是两个核苷酸基于互补碱基对的双螺旋结构的形成。杂交可以发生在完全互补核苷酸链之间，或者包含少量不酉浏区域的"充分互补"核苷酸链之间。完全互补核苷酸链杂交的条件指的是"严格的杂交^(牛"或者"序列特异性杂交条件"。不过，充分互补稳定的核苷酸双链在严格性较低的杂交割牛下仍可以得到，在这种情况下错误匹配的忍受程度可以通M杂交^f牛的适当调整而得到调整。一个熟悉此工艺人可以根据经验将几个变量考虑其中而判断双螺旋的稳定性，例如探针的长度和其中碱基的浓度，离子强度和错配碱基对的范围，目前这种工艺的规定也可以作为指导(看，例如，Sambrook等，《分子克隆实验手册》，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，(1989)(MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y(1989));和Wetmur，《生物化学和分子生物学批评综述》(CriticalReviewsinBiochem.andMol.Biol):26(3/4):227-259(1991))。本发明的探针与上述引起人呼吸道感染的病毒基因组中特异目标序列完全互补或者充分互补(A型流感病毒，B型流感病毒，C型流感病毒，A型人呼吸道合胞病毒，B型人呼吸道合胞病毒，人腺病毒，1型人副流感病毒，2型人副流感病毒，3型人副流感病毒，4A和4B型人副流感病毒，肠道病毒，鼻病毒，229E型人冠状病毒，OC43型人冠状病毒，引起严重急性呼吸道综合征(SARS)的冠状病毒和人偏肺病毒)，这样才能用于属的检测。本发明探针的长度可以在一个相当宽的范围内波动，但由于实践因素在实际应用中偏好于短探针，典型探针由15到30个碱基之间组成，其中碱基数在19到23个之间最适合。使用较长或较短的探针将不会影响本技术的灵敏度和特异性，但是可能要求通过改变融合温度和GC含量等方法，对技术实施的条件进行一系列的修改，其中GC含量的改变将根本上影响杂交温度和时间。在一个特定的实施方式中，本发明提供了检测和鉴定A型流感病毒的探针，该方法通过特异性杂交，包括含有15到30个碱基的多核苷酸，會的多在严格的杂交条件下与定位在核蛋白基因上的一段核酸序列或者其互补链杂交。上述包含多核苷酸的探针的示例标记为SEQIDNO:l和SEQIDNO:2。上述探针可以单独或者一起使用以提高检测的灵敏度。在另外一个待定的实施方式中，本发明提供了检测和鉴定B型流感病毒的探针，该方法通过特异性杂交，包括含有15到30个5鹏的多核苷酸，能够在严格的杂交条件下与定位在核蛋白基因上的一段核酸序列或者其互补链序列杂交。上述包含多核苷酸的探针的示例标记为SEQIDNO:3和SEQE)NO:4。上述探针可以单独或者一起使用以提高检测的灵敏度。在另外一个牛寺定的实施方式中，本发明提供了检测和鉴定C型流感病毒的方法，该方法通过特异性杂交，包括含有15到30个碱基的多核苷酸，能够在严格的杂交条件下与定位在核蛋白基因上的一段核酸序列或者其互补链序列杂交。上述包含多核苷酸的探针的示例标记为SEQIDNO:5。在另外一个待定的实施方式中，本发明提供了检测和鉴定A型人呼吸道合胞病毒的方法，该方法通过特异性杂交，包括含有15到30个碱基的多核苷酸，能够在严格的杂交条件下与定位在融合蛋白(F蛋白)基因上的一段核酸序列或者其互补链序列杂交。上述包含多核苷酸的探针的示例标记为SEQIDNO:6和SEQIDNO:7。上述探针可以单独或者一起使用以提高检测的灵敏度。在另外一个特定的实施方式中，本发明提供了检测和鉴定人B型呼吸道合胞病毒的方法，该方法通过特异性杂交，包括含有15到30个碱基的多核苷酸，能够在严格的杂交条件下与定位在融合蛋白(F蛋白)基因上的一段核酸序列或者其互补链序列杂交。上述包含多核苷酸的探针的示例标记为SEQIDNO:8。在另外一个待定的实施方式中，本发明提供了检测和鉴定人腺病毒的方法，该方法通过特异性杂交，包括含有15到30个碱基的多核苷酸，能够在严格的杂交条件下与定位在六邻体蛋白基因上的一段核列或者其互补链序列杂交。上述包含多核苷酸的探针的示例标记为SEQIDNO:9。在另外一个待定的实施方式中，本发明提供了检测和鉴定1型人副流感病毒的方法，该方法通过特异性杂交，包括含有15到30个f咸基的多核苷酸，能够在严格的杂交劍牛下与定位在血凝素蛋白基因上的一段核酸序列或者其互补链序列杂交。上述包含多核苷酸的探针的示例标记为SEQIDNO:10。在另外一个特定的实施方式中，本发明提供了检测和鉴定2型人副流感病毒的方法，该方法通过特异性杂交，包括含有15到30个5jtt的多核苷酸，能够在严格的杂交条件下与定位在血凝素蛋白基因上的一段核,列或者其互补链序列杂交。上述包含多核苷酸的探针的示例标记为SEQIDNO:11。在另外一个特定的实施方式中，本发明提供了检测和鉴定3型人副流感病毒的方法，该方法通过特异性杂交，包括含有15到30个5驢的多核苷酸，能够在严格的杂交^{牛下与定位在血凝素蛋白基因上的一段核列或者其互补链序列杂交。上述包含多核苷酸的探针的示例标记为SEQIDN0:12。在另夕卜一4^寺定的实施方式中，本发明提供了检观,鉴定4A和4B型人副流感病毒的方法，该方法通过特异性杂交，包括含有15到30个碱基的多核苷酸，能够在严格的杂交割牛下与定位在血凝素蛋白基因上的一段核酸序列或者其互补链序列杂交。上述包含多核苷酸的探针的示例标记为SEQIDNO:13，它能够检测4A或者4B型人副流感病毒的存在但是不能够分辨它们。在另外一个待定的实施方式中，本发明提供了检测和鉴定人肠道病毒的方法，该方法通过特异性杂交，包括含有15到30个碱基的多核苷酸，能够在严格的杂交条件下与定位在5'端非编码区的一段核酸序列或者其互补链序列杂交。上述包含多核苷酸的探针的示例标记为SEQIDNO:14。在另外一^^寺定的实施方式中，本发明提供了检测和鉴定人鼻病毒的方法，该方法通过特异性杂交，包括含有15到30个碱基的多核苷酸，能够在严格的杂交条件下与定位在5'端非编码区的一段核,列或者其互补链序列杂交。上述包含多核苷酸的探针的示例标记为SEQIDNO:15。在另外一个特定的实施方式中，本发明提供了检测和鉴定229E型人冠狀病毒的方法，该方法通过特异性杂交，包括含有15到30个碱基的多核苷酸，育g够在严格的杂交条件下与定位在S蛋白(spikeprotein)基因的一段核酸序列或者其互补链序列杂交。上述包含多核苷酸的探针的示例标记为SEQIDNO:16。在另外一个待定的实施方式中，本发明提供了检观,鉴定OC43型人冠狀病毒的方法，该方法通过特异性杂交，包括含有15到30个碱基的多核苷酸，能够在严格的杂交条件下与定位在S蛋白基因的一段核酸序列或者其互补链序列杂交。上述包含多核苷酸的探针的示例标记为SEQIDNO:17。在另外一个特定的实施方式中，本发明提供了检领,鉴定严重急性呼吸道综合症(SARS)的方法，该方法通过特异性杂交，包括含有15到30个碱基的多核苷酸，能够在严格的杂交条件下与定位在S蛋白基因的一段核酸序列或者其互补链序列杂交。上述包含多核苷酸的探针的示例标记为SEQIDNO:18。在另外一个特定的实施方式中，本发明提供了检领,鉴定人偏肺病毒的方法，该方法通过特异性杂交，包括含有15到30个碱基的多核苷酸，能够在严格的杂交条件下与定位在多聚酶蛋白基因的一段核酸序列或者其互,卜链序列杂交。上述包含多核苷酸的探针的示例标记为SEQIDNO:19。本发明提j共的探针可以同时检测和鉴定弓l起人类呼吸道感染的主要病毒，甚至是对它们同时分型和/或亚分型。本发明的探针，尤其是标号为SEQIDNO:l到SEQIDNO:19所示的核駒亨列探针，有很多优点。它们的长度比较短(至多23个碱基)，使得它们的合成非常经济，它们可以进一步进行对造成人类呼吸道感染的主要病毒进行属的检测以及分型。这些病毒主要包括A型流感病毒的所有子型，C型流感病毒的病毒变异体，A型人呼吸道合胞病毒，B型人呼吸道合胞病毒，所有类型的人类腺病毒，1型人副流感病毒，2型人副流感病毒，3型人副流感病毒，4A型和4B型人副流感病毒，肠道病毒，鼻病毒，229E型人冠狀病毒的变异体，OC43型人冠状病毒，引起严重急性呼吸道综合症(SARS)的冠状病毒以及人类偏肺病毒的变异体。上述探针，可以以较低的成本，用来检测和鉴定引起呼吸道感染的数百种病毒，因此向生产育^够整合杂交技术的所有优点并同时检测和鉴定弓胞人类呼吸道感染的主要病毒的诊断工具迈出重要的一步。使用寡核苷酸探针检测和鉴定引起人类呼吸道感染的病毒，如该项发明的探针，其它的优点有-不仅使鉴定和特征引起呼吸道感染的病毒成为可能，还能够知道它们是否对现有的抗病毒药物敏感或具有抗药性，--利用寡核苷酸探针的杂交试验能够定量待分析的样本中的病毒负荷量，并用来对病人进行抗病毒治疗效率的实时检测；并且，-由于它们能够快速i舰多种病毒同时进行检测和分型，因此可以用来进行实时的流行病学研究。本发明的探针被方便地固定在固体支持物上，正如下面描述的那样，进行对引起人类呼吸道感染的病毒同时检测和鉴定甚至是它们的同时分型和亚分型。上述己被固定的探针的固体支持物，形成了杂交的平台，代表了该项发明的额外一个功能。为了有禾盱探针在固体支持物上固定，该探针整合了额外的功能，这些额外的能允许支持物上固定却不可以改变它们的主要特征(与互补核,列杂交)。如插图中所示，上述探针在5，端含有一个氨基酸组，用来固定探针并且在膜的表面上对探针进行空间排布。如果是玻璃支持物，表面用多聚-L-赖氨酸处理，该氨基酸组可以不通过空间排布而进行探针的固定。杂交平台另一方面，本发明涉及到一个杂交平台，这个平台由一个固体支持物和至少一个固定在上述固体支持物上的本发明的探针组成。在这个说明书中，术语"固体支持物"涉及到一种不可溶解的材料，或者一种在随后的反应中不能溶解的材料。上述固体支持物可以根据它固定寡核苷酸探针的固有能力，或者它可以结合某种附加的、具有固定寡核苷酸探针能力的受体，使得这种材料可以通过结合附加受体而具有固定寡核苷酸探针的能力，取。上述附加受体可以是一种装有与探针相反的材料的物质，也可以是一种固定(或结合)在固体支持物上的、能够通过特异性结合反应而固定探针的特异性结合成员，例如，可以固定生物素标记寡核苷酸探针的抗生素蛋白或者链霉素。这种固体支持物可以用任何能够直接或者间接将探针固定在上述支持物上的合适材料加工而成，例如，塑料，塑料衍生物，聚合物，橡胶，光纤，玻璃或者硅表面，瓷表面，金属表面等。上述材料可以让任何熟悉此工艺的技术人员知道的适当构造来使用，例如，薄膜、薄片、膜、平板、芯片等，或者它们可以完全或者部分覆盖在或者被绑定在惰性载体上，例如纸张、尼龙、玻璃、塑料膜、织物等。另外，如果需要，固体支持物被包被以使探针能够更好地固定在其表面。在特定的实施中，上述固体支持物是尼龙膜或者玻璃表面，例如，一块被包被的玻片，还有例如，被包被的硅支持物和聚合物支持物等。在特定的实施中，本发明的固定在上述固体支持物上的探针是从以下标明序号的多核苷酸中扭隨的SEQIDNO:l、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQBDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQEDNO:14、SEQIDNO:15、SEQDDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19和它们的组合。即使杂交平台可以含有一系列固定在固体支持物上的本发明的探针，在特定的实施中，本发明的杂交平台由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或者19号上述探针组成(SEQIDNO:l到SEQIDNO:19)。具体说，本发明的杂交平台由本发明的19个探针组成(SEQIDNO:l到SEQIDNO:19)。本发明的探针可以按(已知)顺序排列或者无序排列在固体支持物上。在这里所用的，术语"樹顷序排列"的意思是探针被固定在支持物的特定位置上(这个位置是已知的)。因此，在特定的实施中，本发明的杂交平台由无序排列的两个或者更多固定在上述固体支持物上的本发明的探针组成。此外，在特定的实施中，本发明的杂交平台也可以由樹顷糊咧的两个或者更多固定在上述固体支持物上的本发明的探针组成。也就是说，本发明的探针樹顷序被固定在固体支持物上，形成一个阵列或芯片。DNA生物芯片或者阵列涉及到支持物上的单独区域中一系列特异探针的排列。由于探针是在显微点阵安置的，一个生物芯片上可以安放数目巨大的不同探针，每个生物芯片包含的不同探针的数目可以达到10,000到500,000个，这样可以同时检观何能出现在一个临床样品中含有的弓胞人呼吸道感染的不同病毒病原体。除了检测和鉴定弓胞感染的病毒，为了有利于对病人的治疗，生物芯片还可以量化病毒负荷量，甚至可以鉴定出敏感的或者具有抵抗作用的抗病毒药物。实际上，任何熟悉此工艺的技术人员所知道的方法，都可以用来将本发明的探针固定到固体支持物上。一个常用的方法由固体支持物的非共价涂层和特异结合对中的其中之一成员组成，例如，链霉素，和固定的生物素标记的寡核苷酸探针。另外，寡核苷酸探针可以通过环敦胺类偶合反应直接固定在固体支持物上。在特定的实施中，固体支持物是一^有负电荷表面的膜，例如尼龙膜。在这种情况下，在结合探针之前，膜用l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙酸)碳二酰亚胺(EDAC)处理，以激活膜表面的羧基基团。在这种情况下为了在膜上排布探针，探针被设计成在5'端含有氨基酸基团。在特定的实施中，固体支持物是玻璃支持物，例如玻璃片，玻璃片经过多聚赖氨酸处理，而使氨基酸基团排列在玻璃表面，它们将与探针上的磷酸基团通过静电反应的方式结合，而这些磷酸基团在玻璃表面上的排列并不是空间有序的。固体支持物上探针的浓度可能会根据几个因素，包括固体支持物的性质和类型，探针的性质，等，在一个相当大的范围内波动；但是，在特定的实施中，当固体支持物是尼龙膜的时候，探针的浓度可以在大约每道60到400pmoles的范围内波动，0.8-lpmoles/(il最佳。可选的，如果固体支持物是玻璃片，探针的浓度可以是在大约1到40pmol/W之间波动，大约20pmo1^1时最佳。同时检湖,鉴定引起人体呼吸道感染病毒的方法另一方面，发明设计到鉴定引起人呼吸道感染的病毒的方法，下文中提及的本发明的方法其中涉及的病毒包括A型流感病毒，B型流感病毒，C型流感病毒，A型人呼吸道合胞病毒，B型人呼吸道合胞病毒，人腺病毒，1型人副流感病毒，2型人副流感病毒，3型人副流感病毒，4A型和4B型人副流感病毒，肠道病毒，鼻病毒，229E型人冠状病毒，OC43型人冠状病毒，弓胞严重急性呼吸道综合征(SARS)的冠状病毒，人偏肺病毒和它们的组合，这些病毒很可能包含在一个检验样品中，检验中可能包括a)从与上述杂交平台相接触的上述检验样品中定位出核苷酸，这样的杂交平台由固体支持物和固定在上述固体支持物上的本发明的至少一种探针组成，每个上述探针与上述每种引起人呼吸道感染的病毒的特异性靶序列充分互补；同时b)用上述探针检测上述耙序列可能存在的杂交。这里提到的术语"检验样品"涉及到任何可能含有一种或者更多可以引起人呼吸道感染的病毒的生物样品，例如A型流感病毒，B型流感病毒，C型流感病毒，A型人呼吸道合胞病毒，B型人呼吸道合胞病毒，人腺病毒，l型人副流感病毒，2型人副流感病毒，3型人副流感病毒，4A型和4B型人副流感病毒，肠道病毒，鼻病毒，229E型人冠状病毒，OC43型人冠状病毒，弓胞严重急性呼吸道综合征(SARS)的冠状病毒和人偏肺病毒。上述病毒的基因组含有耙序列，这样的序列可以通过利用适合的探针与其杂交而被检测和鉴定，有时候还能进一步区分它们的亚型。检验样品可以来自任何生物来源，例如，源自人体的生物液体或者组织样品，比如血液、唾液、漱口液、涂片(鼻或咽的)、抽吸液(鼻咽的、支气管的、气管的或者胸膜的)等，也可以是血液样品(血浆、血清、白细胞)。检验样品也可以来自病毒细胞培养物。检验样品既可以从其来源上直接使用，也可以为了修改部分性质而经过处理后再使用，例如，希释粘液，灭活干扰成分，将双链核苷酸转变成单链核苷酸，浓缩，纯化或者扩增耙序列等。即使杂交平台可以含有本发明的单个探针，在实际应用中最好使用两个或者更多的本发明探针，比较理想的情况是使用2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或者19号核苷酸探针，它们分别从被编号为SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，SEQK)NO:6，SEQIDNO:7，SEQIDNO:8，SEQIDNO:9，SEQIDNO:10，SEQIDNO:ll，SEQIDNO:12，SEQIDNO:13，SEQIDNO:14，SEQIDNO:15，SEQIDNO:16，SEQIDNO:17,SEQIDNO:18和SEQIDNO:19的核苷瞎列中挑选出来的。具体说，本发明的杂交平台包含本发明的19种探针(SEQIDNO:l到SEQIDNO:19)。实际上本发明的任何探针，只要其核苷序列与上述引起呼吸道感染的病毒的一段特定耙序列互补或者充分互补，就可以在发明的方法中使用，因为探针与耙序列的杂交意味着待检测样品中相应病毒的存在。不过，在本发明方法的特定实施中，在上述固体支持物上固定的本发明的探针是从包含以下SEQIDNO:的多核苷酸类群中选取的SEQK)NO:l、SEQEDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQE)NO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19。在这种情况下耙序列与一个标定为SEQIDNO:l，SEQIDNO:2和/或它们的组合的多核苷酸探针杂交，指示样品中是否含有A型流感病毒；耙序列与一个标定为SEQIDNO:3，SEQIDNO:4禾B/或它们的组合的多核苷酸探针杂交，指示样品中是否含有B型流感病毒；革巴序列与一个标定为SEQIDNO:5的多核苷酸探针杂交，指示样品中是否含有C型流感病毒；靶序列与一个标定为SEQIDNO:6，SEQEDNO:7禾n/或它们的组合的多核苷酸探针杂交，指示样品中是否含有A型人呼吸道合胞病毒；革巴序列与一个标定为SEQIDNO:8的多核苷酸探针杂交，指示样品中是否含有B型人呼吸道合胞病毒；耙序列与一个标定为SEQIDNO:9的多核苷酸探针杂交，指示样品中是否含有人腺病毒；革巴序列与一个标定为SEQEDNO:10的多核苷酸探针杂交，指示样品中是否含有1型人副流感病毒；耙序列与一个标定为SEQIDNO:ll的多核苷酸探针杂交，指示样品中是否含有2型人副流感病毒；耙序列与一个标定为SEQIDNO:12的多核苷酸探针杂交，指示样品中是否含有3型人副流感病毒；紀序列与一个标定为SEQIDNO:13的多核苷酸探针杂交，指示样品中是否含有4A和4B型人副流感病毒；革巴序列与一个标定为SEQIDNO:14的多核苷酸探针杂交，指示样品中是否含有肠道病毒；耙序列与一个标定为SEQIDNO:15的多核苷酸探针杂交，指示样品中是否含耙序列与一个标定为SEQIDNO:16的多核苷酸探针杂交，指示样品中是否含有229E型人冠状病毒；耙序列与一个标定为SEQIDNO:17的多核苷酸探针杂交，指示样品中是否含有OC43型人冠状病毒；耙序列与一个标定为SEQIDNO:18的多核苷酸探针杂交，指示样品中是否含有引起严重急性呼吸道综合征(SARS)的冠状病毒；同时革巴序列与一个标定为SEQIDNO:19的多核苷酸探针杂交，指示样品中是否含有人偏肺病毒。对耙序列和该发明的探针进行杂交的检测能被人所皆知的任何合适的方法实现。待杂交的遗传材料(核酸)的标记根据选择的检观仿法有所不同。标记既可以整合至lj与探针杂交的耙序列中，也可以整合到实际的探针里。在特定的实施中，杂交的检测(步骤b)通过方妇中性的方法实现，然而在另一个特定的实施中，杂交的检测(步骤b)通过非方妇針生的方法实现，比如荧光法，比色法，发光法(生物发光或者化学发光)。按照附图所说的方式，对于化学发光检测，标记可以通过荧光素或者生物素实现，对于化学发光检测或者化学荧光检测等，标记可以通过地高辛实现。为执行该项发明的方法，病毒核酸不需分离病毒颗粒便可以检测和鉴定。在特定的实施中，本发明的方法在进行杂交步骤[步骤a)]之前先进行病毒核苷酸扩增反应。当呼吸道分泌物中待测的弓胞人呼吸道感染病毒的浓度非常低的时候(这种情况经常发生)，这一方法尤其值得注意，因为此时可以和本发明的探针发生杂交反应的包含耙序列的病毒遗传物质(核苷酸)的含量也是很低的。要增加其浓度，在杂交步骤[步骤a]]之前可容易先进行核苷酸扩增反应。因此，在特定的实施中，本发明提供了鉴定引起人呼吸道感染的方法，这里的病毒指的是A型流感病毒，B型流感病毒，C型流感病毒，A型人呼吸道合胞病毒，B型人呼吸道合胞病毒，人腺病毒，1型人副流感病毒，2型人副流感病毒，3型人副流感病毒，4A型和4B型人副流感病毒，肠道病毒，鼻病毒，229E型人冠状病毒，OC43型人冠状病毒，弓胞严重急性呼吸道综合征(SARS)的冠状病毒，人偏肺病毒和它们的组合，这些病毒很可能包含在一个检验样品中，检验中可能包括(i)从上述检验样品中一个核苷酸与上述引起呼吸道感染病毒的特异性耙序列的引物相接触；(ii)将步骤(i)得到的混合液引入酶联扩增反应中，这一反应扩增上述样品中可能存在的上述弓l起呼吸道感染的病毒的靶序列；(iii)将步骤(ii)得到的扩增产物加入本发明的杂交平台，该平台由一个固体支持物和至少一种本发明的、有序或者无序固定在上述固体支持物上的探针组成，上述每个探针与可能在样品中存在的弓胞呼吸道感染的病毒的一个耙序列充分互补；接着(iv)检测上述探针与上述耙序列之间可能的杂交。对含有耙序列的核苷酸片段的扩增实际上可以通过任何耙序列的扩增方法，比如，聚合酶链式反应(PCR)，连接酶链反应(LCR)，移带扩增[一般参考GWalker等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA《美国国家科学院学报》89:392-396;GWalker等，(1992).NucleicAcidRes.《核酸研究》20:1691-1696],依赖转录的扩增(transcription-basedamplification)[D.Kwoh等，(1989).Proc.Natl.Acad.Sci.USA《美国国家科学院学报》86:1173-1177]，自身连续序列复制GSR)(self-sustainedsequencereplication(3SR))[J.Guatelli等(1992).Proc.Natl.Acad.Sci.USA《美国国家科学院学报》87:1874-1878]，QPRNA复制酶系统(Q卩replicasesystem)[P.Lizardi等，(1988).BioTechnology《生物工艺》6:1197-1202]，核酸序列依赖扩增(NASBA)(nucleicacidsequence-basedamplification(NASBA))[R.Lewis,(1992).GeneticEngineeringNews《基因工程进展》，12(9):1]，修复链式反应(RCR)(repairchainreaction(RCR)12(9):1)[R.Lewis,(1992).GeneticEngineeringNews《基因工程进展》)以及phi29噬菌体聚合酶扩增(phi29phagepolymeraseamplification)[L.Blanco等，(1989)JBiolChem.《生物化学杂志》264:8935-8940]。为了获得cDNA文库，扩增之前有必要进行反转录或者逆转录(RT)反应，因为大部分引起人呼吸道感染的病毒的基因组由RNA构成。即使对样品中核苷酸的扩增反应可以不经过提取而直接进行，上述样品中的核苷酸最好经过提取以后再进行扩增反应。实际上可以采用任何适合提取核苷酸的方法；不过，在特定的实施中，偏好于使用一步核苷酸提取法对样品中的核苷酸进行提取。样品中的遗传物质的提取，包括DNA和RNA，都可以用这类方法，即使实际上所有的呼吸道病毒基因组由RNA构成，腺病毒基因组由DNA构成。可以使用RNeasy(Qiagen)等商业方法，虽然其他方法，例如基于含有异硫氰^M基团的裂解缓冲液的方法也可以使用[Casas等，1995，ViralMethods《病毒学方法杂志》53:25-36]。在特定的实施中，对含有耙序列(待扩增，检观,分析的序列)的病毒核苷酸片段的扩增是通过多重RT-PCR进行的。为此，将使用能够与靶序歹U—端匹配的适当引物。扩增A、B、C型流感病毒，A型和B型人呼吸道合胞病毒基因组耙序列的反应中，使用的适合于RT反应和多重PCR反应的弓嫩的例示在下面的文献中有提到Coiras等，2003，JournalofMedicalVirology《医学病毒学杂志》69:132-144。扩增l，2，3，4A和4B型人副流感病毒，229E和OC43型人冠状病毒，鼻病毒和肠道病毒基因组耙序列的反应中，使用适合于RT反应和多重PCR反应的弓l物的例示在下面的文献中有提至U:Coiras等，2004，JournalofMedicalVirology《医学病毒学杂志》72(3):484-495。扩增引起严重急性呼吸道综合征(SARS)的冠状病毒基因组靶序列的反应中，使用的引物的例示在下面的文献中有提到Drosten等，2003，NEnglMed《新英格兰医学杂志》348(20):1967-1976。扩增人偏肺病毒基因组耙序列的反应中，使用的引物的例示在下面的文献中有提至U:VanDenHoogen等，JInfectDis.《4专染病杂志》2003Nov15;188(10):1571-7。使用多重RT-PCR来同时检测和分型A型、B型和C型流感病毒，A型和B型人呼吸道合胞病毒，以^X寸人腺病毒的种属检测的方法在(Coiras等，2003，JMedViral《医学病毒学杂志》69:132-144)中有描述。本发明中检验样品和杂交平台的特征以及本发明的方法(常规)己经在前面提到。实际上本发明的任何探针，會g够与上述弓(起呼吸道感染的病毒的特异性耙序列互补或充分互补的核苷序列，都可以用于本发明的方法，因为探针与耙序列的杂交表明待分析样品中相应病毒的存在。即使杂交平台可以带有本发明的单个探针，在实际应用中上述杂交平台最好带有两种或更多探针，较理想的情况是带有2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18或者19个本发明的探针，这些探针的核苷序列从以下标明序号的序列中钐随SEQIDNO:l，SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，SEQIDNO:6，SEQIDNO:7，SEQEDNO:，SEQIDNO:9，SEQDDNO:10，SEQIDNO:ll，SEQEDNO:12，SEQIDNO:13，SEQIDNO:14，SEQIDNO:15，SEQIDNO:16，SEQIDNO:17，SEQIDNO:18和SEQIDNO:19。杂交平台最好含有本发明的上述19个探针(SEQIDNO:l到SEQIDNO:19)。上述探针可以区分之前提到的引起人呼吸道感染的病毒。通过之前提到的涉及检测病毒基因组(未扩增)和本发明的探针之间的杂交的任何方法，可以将扩增反应(扩增)产物中病毒基因组的靶序列与本发明的探针之间杂交的检测出来。在特定的实施中，杂交通过方妇t性方法来检测，然而在另一个特定的实施中，杂交通过非方妇寸性方法检测，例如通过荧光法，比色法或者发光法(生物发光或者化学发光)。比如，对于化学发光检测，标记可以通过荧光素或者生物素实现，对于化学发光检测或者化学荧光检测等，标记可以通过地高辛实现。在这种情况下，标记可以在扩增步骤中或者随后进行，例如在氨基化-dUTP的存在下使用Klenow聚合酶(Wang等，2002，ProcNatlAcadSciUSA《美国国家科学院学报》99(24):15687-15692)或者使用诸如安玛西亚生命科学公司(AmershamLifeSciences)的CyScribe商业标记试剂盒。在特定的实施中，当固定本发明的探针的固体支持物是尼龙膜的时候，适合在扩增程序中用结合在dNTP(也可以是dATP，dUTP,dCGP或者dCTP)上的生物素对样品的基因材料进行标记，随后用链霉菌抗生物素过氧化酶处理，并加入发光氨以便形成化学发光。在其他特定的实施中，当固定本发明的探针的固体支持物是玻璃表面的时候，建议使用荧光标记，例如结合在dNTP(也可以是dATP，dUTP，dCGP或者dCTP)上的Cy3或者Cy5，这样可以在随后用扫描仪检测其荧光。即使检观係统可能是多样的(放射性或者非放射性的方法)，当支持物是尼龙膜或者一个表面附膜的玻璃片(例如，VividTM基因阵列片，Pall生物科学(PallLifeSciences))的时候，最好使用化学发光检测。为此，如前所述，其中的一个生物素标记核苷，例如dCIP(PerkinElmerLifeSciences(铂金埃尔默生物科学))或者dUTP(罗氏诊断公司(RocheDiagnostics)),被加入PCR反应中以获得生物素标记PCR产物，其中这个PCR反应被用于扩增初始病毒基因材料。固定在支持物上的探针和PCR产物的变性链发生杂交以后，推荐浓度为l:4000的链霉菌抗生物素过氧化酶被加入，根据生产商的说明，这样可以在过氧化氢存在的情况下，利用发光氨形成化学发光(例如，ECL检测系统，安玛西亚生物科学(AmershamBiosciences))。在使用功能化以后的玻璃支持物的情况中，例如玻璃被多聚l^、氨酸功能化以后，建议使用荧光燃料对样品进行标记，例如使用安玛西亚生物科学公司(AmershamBiosciences)生产的CyDye荧光染料Cy3或者Cy5。为了获得标记cDNA或者RNA，可以使用安玛西亚生物科学公司生产的试剂盒进行荧光标记。尽管如此，上述与核苷例如dUTP或者dCTP结合的荧光染料已经与这些探针一起使用，产生一个标记PCR的产物，这一产物与之前提到的生物素标记的PCR产物类似。使用合适的检测仪可以读出标记结果。检测限在所有其允许的检测情况中很相似。通过含有PCR扩增片段的质粒己经将检测限量化。所有情况下检测限是10-100质粒拷贝数。本发明的方法与其他检测和鉴定病毒的方法相比具有一系列的优越性，具体如下-灵敏度高于传统技术的灵敏度从细胞培养物中分离，间接免疫荧光；-高特异性；-极少依赖于样品的类型或者其储存和运输条件；-极少依赖样品的细菌污染；-扩增造成的环境污染比基因组扩增技术少(因此技术中的不同步骤不必引发不同依赖的)；-可以同时检测和鉴定(分型)引起人呼吸道感染的主要病毒；-可以适应不同实验室对形式的要求(例如，可以适应于生产成适于销售的试剂盒的不同形式的要求)；同时-Mii—步，由于本方法可以检领洞一样品中两种或更多种不同病毒的共感染，并且将它们鉴定出来，从而使精确的流行病学研究得以进行，这将有助于判断这些共感染在弓跑病人严重感染的过程中所起的作用，对疾病的预测也有重要帮助。另外，使用寡核苷酸探针来检测和鉴定引起人呼吸道感染的病毒，比如本发明的探针，比基于分离细胞培养物或者IF的传统技术另有其他优越性，包括(i)关于分离细胞培养物，基于杂交的技术更快捷也更灵敏(尤其对于生长较漫或者需要特殊生长条件的病毒)；同时(ii)涉及到基于IF的技术的时候特异性更高。试剂盒另一方面，本发明涉及到一种试剂盒，下文中谈到的试剂盒，是为了从一个生物学样品中鉴定弓胞呼吸道感染的病毒，其中病毒选自A型流感病毒，B型流感病毒，C型流感病毒，A型人呼吸道合胞病毒，B型人呼吸道合胞病毒，人腺病毒，1型人副流感病毒，2型人副流感病毒，3型人副流感病毒，4A型和4B型人副流感病毒，肠道病毒，鼻病毒，229E型人冠状病毒，OC43型人冠状病毒，引起严重急性呼吸道综合症(SARS)的冠状病毒和人偏肺病毒。具体说，本发明的试剂盒由本发明的杂交平台组成，杂交平台包含固体支持物以及其上固定的一种或者多种本发明的探针。在特定的实施中，本发明的试剂盒包含本发明的杂交平台，杂交平台包含固体支持物以及其上固定的一种或者多种本发明的探针，其中的探针从标定为SEQIDNO:l，SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，SEQIDNO:6，SEQIDNO:7，SEQIDNO:8，SEQIDNO:9，SEQIDNO:10,SEQIDNO:ll，SEQIDNO:12，SEQIDNO:13，SEQIDNO:14，SEQIDNO:15，SEQIDNO:16，SEQIDNO:17，SEQIDNO:18，SEQIDNO:19和它们的组合的多核苷酸中选取。所述探针的排列方式可以是有序的或者是无序的。本发明的试剂盒包含实施本发明的方法所必需的反应物，也包括达到这一目的的使用说明书。如果需要的话，可以额外包含扩增耙序列所需的特异性引物(在扩增反应发生在杂交之前的情况下)，同时也可以包含阳性和阴性对照。以下是本发明的具体实施例子，但是本发明不仅仅局限于下述例子限定的范围。实施例1从细胞培养物中检测引起呼吸道感染的病毒病原体参考株从接种有上述病毒株的细胞培养物的样品中对引起呼吸道感染的病毒病原体参考株的检测M过检皿行的，该检验基于扩增和标记的遗传物质与固定在尼龙膜上的探针的杂交，使用Kaufhold等已经报道的方法(Kaufhold等，1994，FEMSMicrobiologyLetters《FEMS微生物学通讯》119:19-25)。1.1材料l丄l样品进行本检验的样品采自细胞培养的弓l起呼吸道感染的病毒参考株。所述参考株由知名实验室提供，并且这些参考株是被国际科学界广泛接受的病毒参考株。列表如下A型流感病毒B型流感病毒C型流感病毒A型人呼吸道合胞病毒(RSVA)B型人呼吸道合胞病毒(RSVB)人腺病毒1型人副流感病毒(PIV1)2型人副流感病毒(PIV2)3型人副流感病毒(PIV3)4B型人副流感病毒(PIV4B)人冠状病毒人冠状病毒人肠道瓜病毒30(Echo30)鼻病毒14(Rhino14)A/Panama(巴拿马)/2007/99B/Yamanashi(山梨县)/166/98C/Johannesburg(约翰内斯堡yi/66Long(朗)RSN隱2血清型1(ADV1)C-35Greer(吉儿)C-243M-25229EOC43Bastianni105900人偏肺病毒每次检测使用的病毒浓度都经过计数A型和B型流感病毒100TCID5。；C型流感病毒经过l(T3倍稀释达到2048滴定量以防止红血球凝聚；RSVA和RSVB经过10—3倍稀释，相当于用间接免疫荧光法检测一个受感染的细胞；ADV1，l型、2型、3型、4型和4B型人副流感病毒，229E型人冠状病毒，OC43型人冠状病毒和人偏肺病毒均经过10—3倍稀释，均相当于105个质粒拷贝；Echo30和Rhino14也稀释104倍，相当于0.1TCID50。l丄2探针与每种病毒的模版链以及互补链同源的探针，在检测中被单独和/或一起使用，以便检查灵敏度最高的结果。每种探针的浓度采用之前描述的浓度。每个检测中探针的定位都是特异的(图l)。检验中使用的探针如表l所示。表1使用的探针<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>所述探针的5'端含有己基化氨基基团，如Kaufhold等人的描述(FEMSMicrobiol.Lett.《FEMS微生物学通讯》1994Junl;119(1-2):19-25)。氨基酸基团的存在有禾盱探针的固定，并且可以对探针在膜上的分布进行空间排列。为了将探针固定在膜上，探针被溶解在新配的pH8.4含有500mMNaHC03的溶液中，参照前人报道的方法[Vin^J和KoopmansMPG，JClinMicrobiol《临床微生物学杂志》2000，38:2595-2601]。这里，所有探针使用的浓度均为0.8|oM。U.3薄應本检验中使用的薄膜表面带有负电荷，尺寸大小约为14.5cmX14.5cm，(BiodyneC，Pall生命科学公司)。上述膜的制备根据已有的报道[上面提到的Vin^和Koopmans]。将探针结合到膜上之前，先简单地将膜用新配的16%的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺(EDAC)溶液处理至少15分钟，随后用水清洗。制备好的膜应该立即使用或者放在滤纸中在4°C下保存备用，保存时间最长为一周。1.2方法1.2.1提取遗传物质遗传物质，包括RNA和DNA，是通过传统方法从样品(l丄l节)中提取的。这里采用基于使用异硫氰隱的方法，Casas等己对此方法进行描述(Casas等，1995，JVirolMethods《病毒学方法杂志》53:25-36)。1.2.2酶联扩增遗传物质的提取采用一个酶联扩增反应，这是为了扩增含有与所使用的探针(表1)同源的序列片段，以便检测固定在尼龙膜上的不同病毒病原物(A型，B型和C型流感病毒，RSVA，RSVB，ADV1，PIV1，PIV2，PIV3,PIV4，冠状病毒，肠道孤病毒，鼻病毒和偏肺病毒)。对不同片段的酶联扩增反应采用Coiras等人报道的引物(Coiras等，JournalofMedicalVirology《医学微生物学杂志》69:132-144(2003);禾卩Coiras等，JournalofMedicalVirology《医学病毒学杂志》72(3):484-495(2004))。扩增反应在200dATP，dGTP和dCTP，130|liMdTTP和70pM生物素-16-dUTP存在的条件下进行，通过扩增反应，标记的遗传物质(扩增产物或扩增子)被杂交。1.2.3将探针固定到尼龙膜上将本检验中用到的探针(表1)固定至呢龙膜上的方法参照已有附艮道[Vin^J，KoopmansMPGJClinMicrobiol《MPGJ临床微生物学杂志》2000，38:2595-2601]。为了将探针固定在膜上，参照之前提到的方法，先将探针溶解在新配的pH8.4含有500mMNaHCO3的溶液中。同样，将探针结合到膜上之前，先简单地将膜用新配的16%的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺(EDAC)溶液处理至少15分钟，随后再用水清洗。制备好的膜随即使用或者放在滤纸中在4°C下保存，保存时间最长为一周。经过上述处理的探针通过传统方法[上面提到的VinJ6和Koopmans]被固定到经过上述处理的尼龙膜，依据的原理是探针中的氨基酸基团可以与经过EDAC处理的膜上的活性羧基基团发生共价结合。为此，尼龙膜被放到45-槽迷你转渍槽(miniblotter)上(Biometra)。向不含探针的凹槽中滴加新配pH8.4的500mMNaHC03溶液，而那些将含有探针的凹槽则被滴加上述新配的探针溶液。探针和膜在室温下(18-22°C)被一起孵化10分钟。接着用真空泵将凹槽中的液体抽出。再把膜在室温下与100mMNaOH溶液孵{七不超过1063中，从而将膜上仍具有活性的酯基水解。最后，用超纯蒸馏水清洗带有探针的膜数次。尼龙3莫上最后体积为150[il的探针的浓度大约为0.8-5pmoles/nl(或者每道120-750pmoles)，迷你转渍槽(Biometra)上的道将被完全±真满。膜上的探针的排列与其在迷你转渍槽道上的排列一致。所得结果采用模板分析，这种模板能够快速鉴定已经在样品中检测出来的病毒o1.2.4固定在尼龙膜上的探针与已被扩增和标记的遗传物质杂交在杂交被标记的遗传物质(扩增产物)之前，先将带有探针的膜进行预杂交处理。为此，在56。C条件下，用含有0.1%十二烷基磺酸钠(SDS)的2倍SSPE溶液(360mMNaCl，20mMNaH2PO4，2mMEDTA，pH7.2)清洗带探针的膜10分钟。为了保证固定探针与遗传物质的杂交，带有探针的膜被放到迷你转渍槽上相对之前的位置旋转90。。将10微升标记的遗传物质溶解到150|il杂交缓冲液中(含有0.5%SDS的2倍SSPE溶液)。如果被杂交的产物是双链DNA，反应条件是99°C保温10分钟之后快速冷却到4°C并维持1分钟。之后在室温条件下继续进行杂交反应1分钟。杂交反应在大约48。C的条件下，持续大概2小时，整个过程需要温和地搅拌。随后用150ml含有0.5%SDS(十二烷基磺酸钠)的2倍SSPE溶液采用多重过滤装置(Biometra)冲洗膜。从迷你转渍槽上取下膜，再用上述溶液冲洗两次，每次10分钟，均在40°C振荡条件下进行。1.2.5病毒病原物的检测和鉴定已经和探针杂交过的带有探针和标记扩增产物的尼龙膜在37°C条件下，与链霉菌抗生物素-过氧化酶(1:4000)孵化45分钟。之后将尼龙膜清洗3次，每次10分钟，其中前两次在37QC振荡条件下，分别用含有0.5Q^SDS的2倍SSPE溶液和含有0.1%SDS的2倍SSPE溶液冲洗，第三次在室温振荡条件下，单独使用2倍SSPE溶液冲洗。化学发光可以在过氧化氢和发光氨存在的条件下，根据制造商的使用说明书，使用商业试剂盒(ECL检观孫统，Amersham生命科学公司)来实现。结果可以通过X光胶片影印(柯达)5分钟，30分钟和4小时来观察。1,3錢所得结果如图1所示，这些结果清楚地表明了可以同时检测引起呼吸道感染的不同病毒病原物的原型株的这一检验技术的特异性和灵敏度。每个生物素标记的扩增产物只与其互补探针发生特异性作用，尽管用于扩增反应的模版数目很大，也没有观察到非特异性杂交。通过使用印在胶片上的模板，就可以快速清楚地鉴定己经被本技术检测出来的病毒。实施例2检测分离自呼吸道感染细胞培养物的临床样品的呼吸道病毒X寸来自细胞培养物的弓胞呼吸道感染的不同呼吸道病毒的检测，是通过一种基于生物素标记遗传物质片段与固定在尼龙膜上的探针的杂交的检验来进行的。2.1材料2丄1样品雜验用到的样品是弓胞呼吸道感染的，分离自接种于细胞培养物呼吸道临床样品的呼吸道病毒。所述病毒如下A型流感病毒，B型流感病毒，A型人呼吸道合胞病毒(RSVA)，B型人呼吸道合胞病毒(RSVB)，人腺病毒(ADV)(几种血清型)，3型人副流感病毒(PIV3)。为了检查本技术的灵敏度，使用了分离自病人呼吸道样品细胞培养物的病毒系列10倍的稀释液。每种病毒使用的稀释液如下初始稀释液，标记为-1(图2)，100TCIDso的A型(1-4道)和B型(5-8道)流感病毒，l(T3倍稀释的RSVA(9-12道)和RSVB(13-16道)，ADV(17-20道)稀释液，相当于通过间接免疫荧光检测一个受感染细胞，和10—3倍3型人副流感病毒(21-24道)稀释液，相当于通过RT-PCR检测含有105拷贝含有扩增片段的质粒。2丄2探针与各种病毒模板链和互补链同源的探针在各个病例中的检测中单独和/或配合使用，以达到获得在佳检测灵敏度的目的。本检验中使用的探针如表2所示。表2使用的探针<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>用于检测A型流感病毒、B型流感病毒和A型人呼吸道合胞病毒的探针可结合使用或者单独使用，检测时探针终浓度为0.8mM。残余的探针浓度分别为5，1和0.8nM，以便观察不同探针浓度下检测灵敏度的差异。所述探针在5'末端有一个己基化氨基基团，Kuafhold等已有描述(FEMSMicrobiolLett《FEMS微生物学通讯》1994Junl;119(l-2):19-25)。这一己基化氨基30酸基团的存在有助于探针的固定和探针在膜上的空间排序。为了将探针固定在膜丄探针要用新配的pH8.4，500mMNaHC03溶液稀释，该方法己有报道[Vin^J和KoopmansMPGJClinMicrobiol《临床微生物学杂志》200038:2595-2601]。2丄3塵本检验中使用的膜是表面带有负电荷的膜(BiodyneC，Pall生命科学公司)，其尺寸大小为14.5cmX14.5cm。所述的膜按照已报道的方法准备[上面提到的Vin^和Koopmans]。在将探针固定在膜上以前，先将膜在新配的16%EDAC溶液中短暂处理至少15分钟并用水冲洗干净。经过这样处理好的膜随即可以使用，或者于4。C条件下在滤纸中保存备用，保存时间最长不超过l周。2.2方法2.2.1遗传物质的提取遗传物质，包括RNA和DNA,是通过常规方法从样品(2丄1节)中提取的。在这里，采用的是基于应用胍硫氰酸盐的提取方法，这一方法已由Casas等人提出(JVirolMethods《病毒学方法杂志》1995，53:25-36)。2.2.2酶联扩增提取出来的遗传物质需要经过一个酶扩增反应，以扩增一些特定的片段，这些片段包含有与固定在尼龙膜上的用来检测不同病毒性病原体(A型流感病毒，B型流感病毒，A型人呼吸道合胞病毒，B型人呼吸道合胞病毒，人腺病毒和3型人副流感病毒)的探针同源的序列。对病毒性病原体A型流感病毒，B型流感病毒，A型人呼吸道合胞病毒，B型人呼吸道合胞病毒，人腺病毒和3型人副流感病毒的不同特殊片段的扩增反应所使用的引物如Coiras等所述(Coiras等，JournalofMedicalVirology《医学微生物学杂志》69:132-144(2003);禾BCoiras等，JournalofMedicalVirology《医学微生物学杂志》72(3):484495(2004))。在所有情况下，扩增反应都是在200(oMdATP，dGTP，禾口dCTP，130|jMdTIP和70nM生物素-16-dUTP存在的情况下进行的，以达到对被杂交的遗传物质进行标记的目的。2.2.3探针在尼龙膜上的固定这一检测中所使用的将探针(表2)固定在尼龙膜上方法与1.2.3中的实施例提到的方法完全一致。2.2.4扩增的遗传物质与固定在尼龙膜上的探针的杂交扩增的遗传物质与固定在尼龙膜上的探针的杂交所使用的方法与1.2.4中的实施例所提到的方法完全一致。2.2.5病毒病原体的检测和鉴定病毒病原体的检测和鉴定所使用的方法与1.2.5中的实施例所提到的方法完全一致。2.3结果所得结果如图2所示，结果清楚地表明这一检验技术的特异性和灵敏度，其中这一检验技术可以对从呼吸道临床样品中分离并接种在细胞培养基上的能够弓胞呼吸道感染的不同病毒病原体进行准确的鉴定。可以观察到，检测灵敏度的变化与病毒的稀释程度和探针的使用浓度相关，同时，灵敏度也与在对A型流感病毒、B型流感病毒和A型人呼吸道合胞病毒进行检测时，探针混合或者单独使用的情况有关。在所有情况下，检测特异性都非常高。实施例3对临床样品中出现的A型流感病毒的检测对临床检验样品中出现的A型流感病毒的直接检测所使用的方法，是一个将经过扩增和标记的遗传物质与固定在尼龙膜上的探针进行杂交的检验。3.1材料3丄1样品用于进行这一检验的样品是取自出现流感症状病人的咽涂片，以便鉴别导致上述症状的病毒。3丄2探针本检验中使用的探针(SEQIDNO:l禾nSEQIDNO:2)在5，末端设计有一个己基化氨基酸基团，如Kaufhold等所报道(FEMSMicrobiolLett.《FEMS微生物学通讯》1994Junl;119(l-2):19-25)。这一己基化氨基基团的存在有助于探针的固定和探针在膜上的空间排序。为了将探针固定在膜上，要将探针用新配的pH8.4，500mMNaHC03溶液稀释，该方法已有报道[Vin^J禾卩KoopmansMPGJClinMicrobiol《临床微生物学杂志》2000，38:2595-2601]。在这种情况下，所有探针的使用浓度均为0.8(jM。3丄3膛本检验中使用的膜是表面带有负电荷的膜(BiodyneC，Pali生命科学公司)，尺寸大小为145cmX14.5cm。膜的准备根据已报道的方法[上面提到的Vkijd和Koopmans]。在将探针固定在膜上以前，先将膜用新配的16%EDAC溶液短暂处理至少15分钟并用7jC冲i先干净。经过这样制备好的，莫可以立g卩使用，或者于4°C条件下在滤纸中保存备用，保存时间最长不超过l周。3.2方法3.2.1遗传物质的提取遗传物质，包括RNA和DNA,是通过常规方法从样品(3丄1节)中提取的。在这里，采用的是基于应用胍硫氰酸盐的提取方纟去，这一方法由Casas等于先前提出(JVirolMethods《微生物学方法杂志》，1995，53:25-36)。3.2.2酶联扩增已提取的遗传物质需要经过一个酶联扩增反应，以扩增一^#定的片段，这些片段包含有与固定在尼龙膜上的用来检测病毒性病原体(A型流感病毒)的探针(SEQIDNO:l和SEQIDNO:2)同源的序列。对不同特殊片段的酶联扩增反应(RT-PCR)所使用的引物和^f牛如Coiras等所述(Coiras等，JournalofMedicalVirology《医学微生物学杂志》69:132-144(2003)。在所有情况下，扩增反应都是在200(jMdATP，dGTP，禾BdCTP，130fiMdTIP和70(jM生物素-16-dUTP(扩增产物或扩增子)存在的情况下进行的，以达到对被杂交的遗传物质进行标记的目的。3.2.3探针在尼龙膜上的固定将本检验中用到的探针(SEQIDNO:l和SEQIDNO:2)固定在尼龙膜上的方法与实施例1.2.3中所提到的方法完全一致。3.2.4扩增的遗传物质与固定在尼龙膜上的探针的杂交扩增的遗传物质与固定在尼龙膜上的探针的杂交所使用的方法与实施例1.2.4中所提到的方法完全一致。3.2.5病毒性病原体的检测和鉴定病毒性病原体的检测和鉴定所使用的方法与例子1.2.5中所提到的方法完全一致。3.2.6套式PCR使用套式PCR，以便检验之前所使用的基于将被扩增和标记的产物与固定在尼龙膜上的探针进行杂交的技术，其中套式PCR采用已报道的方法(Coiras等，JournalofMedicalVirology《医学微生物学杂志》，2003，69:132-144)。用于扩增含有与探针同源的序歹lj片段的引物，用于套式PCR的引物，以及套式PCR的反应条件，也在上述文章中有描述(Coiras等，2003，如上所述)。3.3结果从临床病毒标本中提取的遗传物质与固定在膜上的探针之间的杂交结果，如图3A所示(1-12道)。样品2，7和8中没有检测到A型流感病毒。这些结果清楚表明这一检验技术在检测临床标本中A型流感病毒时的特异性和灵敏度。为了分析这个参考技术的灵敏度和t寺异性，套式PCR与杂交，i/^同时进行，结果如图3B所示，图中1-12道与图3A中的1-12道相对应。图3B中的M道与罗氏诊断公司(RocheDiagnostics)提供的分子量标记XIV(100bp的标记)相对应。含721个$对的条带，与A型流感病毒核蛋白基因的扩增片段相一致，而837个碱基的条带，与样品遗传物质提取对照和PCR反应的内标相一致(内标质粒和用于其扩增的引物如上文提到的Coiras等(2003)的文章所述，套式PCR所使用的引物和反应条件也在该文中有描述)，这两个条带在所有泳道中都能观察到(2，7和8泳道除外)。实施例4弓1起严重急性呼吸道综合症(SARS)的冠状病毒的检测弓胞严重急性呼吸道综合敏SARS)的冠状病毒的检测所使用的方法，是一个将经过扩增和标记的遗传物质与固定在尼龙膜上的探针进行杂交的检验。4.1材料4丄1样品用于进行这一检验的样品是失活病毒中的遗传物质和包含有引起严重急性呼吸道综合症(SARS，由ChristianDrosten博士友情提供(BernhardNocht热带医学研究所，热带传染病国家参考中心，汉堡，德国(BemhardNochtInstituteforTropicalMedicine,NationalReferenceCenterforTropicalInfectiousDiseases,Hamburg,Gennany)))的冠状病毒聚合酶片段的质粒。本检测使用梯度稀释的10—3倍失活病毒稀释液,相当于来自105倍含有CoV-SARS基因组聚合g敏广增片段的质粒稀释液。4丄2探针这一检验中使用的探针(SEQIDNO:18)在5，末端设计有一个己基化氨基酸基团，如Kaufhold等所述(FEMSMicrobiolLett.《FEMS微生物学通讯》1994Junl;119(l-2):19-25)。这一己基化氨基酸基团的存在有助于探针的固定和探针在膜上的空间排序。如图4所示，检验中使用了两种浓度(0.8一和5(jM)的上述探针。为了将探针固定在膜上，先将探针用新配的pH8.4，500mMNaHC03溶液稀释，如前所述[Vinj6J禾nKoopmansMPGJClinMicrobiol《临床微生物学杂志》2000，38:2595-2601]。4丄3應^t验中使用的膜是表面带有负电荷的膜(BiodyneC，Pall生命科学公司，尺寸大小为14.5cmxl4.5cm。所述膜按照已报道的方法制备[上面所提到的Vinj6和Koopmans的文章]。在将探针固定在膜上以前，先用新配的16%EDAC溶液将膜短暂处理至少15分钟并用水冲洗干净。经过这样制备好的膜可以立即使用，或者使用前于4°C条件下在滤纸中保存，保存时间最长不超过1周。4.2方法4.2.1遗传材料的提取遗传物质，包括RNA和DNA，是通过常规方法从样品(3丄1节)中提取的。在这里，采用的是基于应用胍硫氰酸盐的提取方法，这一方法由Casas等于先前提出(JVirolMethods《微生物学方法杂志》，1995，53:25-36)。4.2.2酶联扩增提取出来的遗传物质需要经过一个酶来能扩增反应，以扩增一些特定的片段，这些片段包含有与固定在尼龙膜上的用来检测病毒性病原体(弓l起严重急性呼吸道综合症(SARS)的冠状病毒)的探针(SEQIDNO:18)同源的序列。对不同特殊片段的扩增反应所使用的引物和反应条件如DrostenC等所述(DrostenC等，2003，NEnglJMed.《新英格兰医学杂志》May15;348(20):1967-76)。扩增反应在200|oMdATP，dGTP和dCTP，130(jMdTTP和70MM生物素-16-dUTP存在的情况下进行，以达到对被杂交的遗传物质(扩增产物或者扩增子)进行标记的目的。4.2.3探针在尼龙膜上的固定械验中所用的探针(SEQIDNO:18)在尼龙膜上的固定所使用的方法与实施例1.2.3中所提到的方法完全一致。4.2.4扩增的遗传物质与固定在尼龙膜上的探针的杂交扩增的遗传物质与固定在尼龙膜上的探针杂交所使用的方法与实施例1.2.4中所提到的方纟去完全一致。4.2.5病毒性病原体的检测和鉴定病毒性病原体的检测和鉴定所使用的方法与实施例1.2.5中所提到的方法完全一致。4.3结果从临床病毒标本中提取的遗传物质与固定在膜上的探针之间的杂交结果，如图4所示，结果清楚表明这一检验技术在检测临床标本中引起严重急性呼吸道综合症(SARS)的冠状病毒的特异性和灵敏度。实施例5临床标本中人腺病毒的检测临床标本中人腺病毒的检测所使用的方法，是一个将经过扩增和标记的遗传物质片段与固定在玻璃片上的无序排列的探针进行杂交的检验。5.1材料5丄1样品用于进行这一检验的样品是来自具有呼吸道症状的病人的呼吸道分泌物。遗传物质直接由临床样品中提取，样品中可能存在的病毒通过两次多重RT-PCR和随后的套式PCR进行分析，套式PCR如Coiras等于先前所描述(Coiras等，JournalofMedicalVirology《医学微生物学杂志》，2003，69:132-144;和Coiras等，JournalofMedicalVirology《医学微生物学杂志》，2004，72(3):484-495)。一旦上述临床样品中出现的人腺病毒被检测到，同样的遗传物质会被用来与标记为SEQIDNO:9的探针杂交，这一探针被设计成能与任何一种血清型的人腺病毒杂交。5丄2探针这一检验中所使用的探针(SEQIDNO:9)被直接固定在一个玻璃表面(载玻片)上，探针的空间排列没有特定顺序，探针浓度为20mM。将按照推荐浓度制备好的40MU1探针稀释于3倍SSC中，加入到96-凹槽板的凹槽中，凹槽底最好是U或v形，这样有利于点阵针的检测。与在尼龙膜上杂交的方法不同，这些探针的5'末端没有进行修饰。5丄3玻璃支持物检验中使用的普通载玻片首先经过多聚-L-赖氨酸处理，以使将要与探针上磷酸基团共价结合的氨基基团排歹倒玻片上。探针在经过多聚-L-赖氨酸处理的载玻片上的空间排列是不规则的，但是它们会整个粘附在载玻片上。这一处理方法由Schena等提出(Schena等，1995，Science《科学》270(5235):467-470.)。5.2方法5.2.1遗传材料的提取遗传材料，包括RNA和DNA，是通过常规方法从样品(5丄1节)中提取的。在这里，采用的是基于应用胍硫氰酸盐的提取方法，这一方法由Casas等于先前提出(JVirolMethods《微生物学方法杂志》，1995，53:25-36)。5.2.2酶联扩增提取得到的遗传物质需要经过一个酶扩增反应，以扩增hexon蛋白基因序列的片段，这个片段包含有与固定在尼龙膜上的用来检测腺病毒的探针(SEQIDNO:9)同源的序列。酶扩增反应所使用的弓l物和反应条件如Coiras等所述(Coiras等，JournalofMedicalVirology《医学微生物学杂志》69:132-144(2003))。扩增反应是在200一dATP，dGTP和dTIP，180MMdCTP和20MMCy3-dCTP存在的情况下进行的，以达到对被杂交的遗传物质(扩增产物或者扩增子)进行标记的目的。5.2.3探针在玻璃支持物上的固定将本检验中所使用的探针(SEQIDNO:9)固定到玻璃表面的方法，是将上述探针通过一个带有有GMS417阵列器(GMS417Arrayer)的针环体系(Affymetrix公司)排列在1/3的玻片上。将经过功能化和印好的载玻片表面的自由氨基基团使用溶解在极性溶剂(n-甲基-吡咯烷酮)中的琥珀酸酐封闭，如Eisen和Brown，1999，MethodsEnzymol《酶学方》303:179-205的描述。载玻片随后90°C水浴2分钟，然后马上浸入纯酒精中以有助于干燥，最后在室温下离心以完成制备。一旦它们被封闭了，载玻片要储存在室温，干燥，无光的环境下，并于24小时内与样品杂交。5.2.4扩增的遗传物质与固定在玻璃支持物上的探针的杂交经过扩增和标记的遗传物质与固定在玻璃支持物上的探针的杂交按照以下程序进行。简述如下，将10pl经过标记的遗传物质稀释在15-20(11的杂交缓冲液中(2倍SSC，0.2%DS)，95。C加热105H中，然后在4°C下M冷却1分钟。样品沉积在玻片上有探针的部分，然后盖上盖玻片。随后将它放入一个保持在湿润和盐度饱和状态下的杂交箱中，杂交过程要在42°C温和振荡条件下进行2小时。5.2.5病毒病原^:的检测和鉴定在室温振荡，避光^i牛下，腿的抝顿序分别使用1XSSC—0.2%SDS，0.1XSSC—0.2%SDS和0.1XSSC对玻片各洗涤10分钟，然后对病毒性病原体进行检测和鉴定。通过在玻片离心机中对它们进行干燥，结果可以立即被读出。5.3结果结果由GMS418扫描仪(GMS418Scanner)读出(Affymetrix公司)。所得的结果如图5所示，结果清楚表明这一检验技术在检测被任何一种人腺病毒感染的临床标本中的遗传物质的特异性和灵敏度。图5显示出扩增产物中通过与人腺病毒特异识别的引物寡核苷酸获得的Cy3分子所释放出的荧光。弓胞呼吸道感染的人腺病毒稀释液属于血清型l(图片l)，2(图片2)，4(图片3)，5(图片4)和7(图片5)，这些稀释液与在上述反应条件下扩增的包含有六邻体(hexon)蛋白基因片段的103拷贝质粒相当，这些稀释液被用过PCR进行扩增和标记(反应^[牛和寡核苷酸序列如Coiras等所述，JournalofMedicalVirology《医学微生物学杂志》69:132-144(2003))。权利要求1.一种含有核苷序列的探针，该核苷序列从标记为SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO7、SEQIDNO8、SEQIDNO9、SEQIDNO10、SEQIDNO11、SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14、SEQIDNO15、SEQIDNO16、SEQIDNO17、SEQIDNO18和SEQIDNO19的核苷序列中选取。2.—种杂交平台，这种杂交平台包含一种固体支持物和至少一种固定在上述固体支持物上的权利要求1中的探针。3.权利要求2的杂交平台，包含一批两种或者更多种固定在上述固体支持物上的，有序排列的探针。4.权利要求2的杂交平台，包含一批两种或者更多种固定在上述固体支持物上的，无序排列的探针。5.—种鉴定引起人呼吸道感染的病毒的方法，这些病毒从A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒、A型人呼吸道合胞病毒、B型人呼吸道合胞病毒、人月泉病毒、1型人副流感病毒、2型人副流感病毒、3型人副流感病毒、4A型和4B型人副流感病毒、肠道病毒、鼻病毒、229E型人冠状病毒、OC43型人冠状病毒、引起严重急性呼吸道综合症(SARS)的冠状病毒、人偏肺病毒和它们的组合中选取，最后在一个检验样品中出现，包括a)将上述检验样本中的核苷酸与至少一种固定在上述固体支持物上的探针组成的杂交平台相接触，其中每种探针与所述检验样品中弓l起呼吸道感染的所述病毒的特异性靶序列充分互补；同时b)检测所述探针与所述耙序列的可能杂交。6.权利要求5的方法，其中所述的固定在上述固体支持物上的探针从标记为SEQE)NO:l、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19和它们的组合的核苷序列中选取。同时，其中靶序列与一种选自iH己为SEQIDNO:l、SEQIDNO:2禾B/或它们的组合的多核苷酸的探针杂交，则指示样品中含有A型流感病毒；革巴序列与一禾中选自标记为SEQIDNO:3、SEQIDNO:4禾口/或它们的组合的多核苷酸的探针杂交，则指示样品中含有B型流感病毒耙序列与一种选自标记为SEQIDNO:5的多核苷酸的探针杂交，则指示样品中含有C型流感病毒；革巴序列与一种选自标记为SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和/或它们的组合的多核苷酸的探针杂交，则指示样品中含有A型人呼吸道合胞病毒；耙序列与一种选自标记为SEQIDNO:8的多核苷酸的探针杂交，则指示样品中含有B型人呼吸道合胞病毒；耙序列与一种选自标记为SEQIDNO:9的多核苷酸的探针杂交，则指示样品中含有人腺病毒；耙序列与一种选自标记为SEQIDNO:10的多核苷酸的探针杂交，则指示样品中含有1型人副流感病毒；耙序列与一种选自标记为SEQIDNO:11的多核苷酸的探针杂交，则指示样品中含有2型人副流感病毒；革巴序列与一种选自标记为SEQIDNO:12的多核苷酸的探针杂交，则指示样品中含有3型人副流感病毒；耙序列与一种选自标记为SEQIDNO:13的多核苷酸的探针杂交，则指示样品中含有4A和4B型人副流感病毒；耙序列与一种选自标记为SEQIDNO:14的多核苷酸的探针杂交，则指示样品中含有肠道病毒；耙序列与一种选自标记为SEQIDNO:15的多核苷酸的探针杂交，则指示样品中含有鼻病毒；耙序列与一种选自标记为SEQIDNO:16的多核苷酸的探针杂交，则指示样品中含有229E型人冠状病毒；耙序列与一种选自标记为SEQIDNO:17的多核苷酸的探针杂交，则指示样品中含有OC43型人冠状病毒；耙序列与一种选自标记为SEQIDNO:18的多核苷酸的探针杂交，则指示样品中含有引起严重急性呼吸道综合症(SARS)的冠状病毒；同时耙序列与一种选自标记为SEQIDNO:19的多核苷酸的探针杂交，则指示样品中含有人偏肺病毒。7.权禾腰求5的方法，其中所述的检验样品是怀疑含有弓跑人呼吸道感染的一种或更多种从A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒、A型人呼吸道合胞病毒、B型人呼吸道合胞病毒、人腺病毒、1型人副流感病毒、2型人副流感病毒、3型人副流感病毒、4A型和4B型人副流感病毒、肠道病毒、鼻病毒、229E型人冠状病毒、OC43型人冠状病毒、引起严重急性呼吸道综合症(SARS)的冠状病毒、人偏肺病毒以及它们的组合中挑选出来的病毒。8.权利要求7的方法，其中所述检验样品是源于人体的生物样品，或者是来自病毒细胞培养物的样品。9.权利要求8的方法，其中源于人体的生物样品是生物液体或者生物组织样品。10.权利要求9的方法，其中源于人体的生物样品是从血液、唾液、漱口液、咽涂片、鼻咽涂片和鼻咽、支气管或者胸膜抽取液。11.权利要求5的方法，其中所述固体支持物是尼龙膜或者玻璃表面。12.权利要求5的方法，其中所述探针是以有序方式排列在固体支持物上。13.权利要求5的方法，其中所述探针是以无序方式排列在固体支持物上。14.权利要求5的方法，其中所述探针排列在固体支持物上形成阵列。15.权利要求5的方法，其中所述固体支持物是生物芯片，其中固定在其上的探针有序排列而形成阵列。16.权利要求5的方法，其中对杂交的检测[步骤b)]通过放射性方法进行。17.权利要求5的方法，其中对杂交的检测[步骤b]]通过非放射性方法进行。18.权利要求17的方法，其中所述非放射性方法是荧光、比色、发光、生物发光或者化学发光方法。19.权利要求5的方法，其中进行步骤a)之前，先对最终出现在检验样品中的所述弓胞人呼吸道感染的病毒核苷酸进行扩增反应，采用与所述弓胞呼吸道感染的每种病毒的特异性靶序歹,配的弓卿。20.权利要求19的方法，其中所述扩增反应包括聚合酶链式反应(PCR)或者多重逆转录(RT)-PCR反应。21.—种鉴定弓胞呼吸道感染的病毒的试剂盒，其中的病毒选自A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒、A型人呼吸道合胞病毒、B型人呼吸道合胞病毒、人腺病毒、1型人副流感病毒、2型人副流感病毒、3型人副流感病毒、4A型和4B型人副流感病毒、肠道病毒、鼻病毒、229E型人冠状病毒、OC43型人冠状病毒、引起严重急性呼吸道综合症(SARS)的冠状病毒、人偏肺病毒和它们的组合，采用权利要求5的方法，包含权利要求l中的至少一种探针，或者至少一种权利要求2到4中的任何杂交平台。22.权利要求21的试剂盒，包含一种杂交平台，其中杂交平台包含一种固定有探针的固体支持物，其中的探针从标记为SEQIDNO:l、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQEDNO:4、SEQIDNO:5、SEQEDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19和它们的组合的核苷序列中选取。全文摘要本发明涉及到的探针和检验是用于在单个检验样品中，同时检测引起人呼吸道感染的一系列病毒的核苷酸序列，病毒选自A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒、A型人呼吸道合胞病毒、B型人呼吸道合胞病毒、人腺病毒、1型人副流感病毒、2型人副流感病毒、3型人副流感病毒、4A型和4B型人副流感病毒、肠道病毒、鼻病毒、229E型人冠状病毒、OC43型人冠状病毒、引起严重急性呼吸道综合征(SARS)的冠状病毒、人偏肺病毒和它们的组合。文档编号C12Q1/68GK101107366SQ200580047068公开日2008年1月16日申请日期2005年12月23日优先权日2004年12月24日发明者印玛克拉达·卡萨斯·弗莱彻,玛利亚·特雷萨·考拉斯·洛佩兹,皮勒·佩雷兹·布兰那申请人:卡洛斯Ⅲ世健康研究所