专利名称::使用带电荷分子用于实时酶测定的组合物、方法和试剂盒的利记博彩app使用带电荷分子用于实时酶测定的组合物、方法和试剂盒相关申请的交叉引用本申请要求2004年12月30日提交的序号为60/641,177的申请在35U.S.C.§119(e)下的利益,其内容通过引用并入本申请。技术背景酶是提高化学反应速率的分子。用于检测、定量和/或表征酶活性的酶测定具有显著的生物学、医学和工业用途。在生物系统中,酶参与核酸的合成及复制、多肽的修饰和降解、代谢产物的合成以及许多其他功能。在医学检验中,酶是人类患者的健康或疾病的重要指示物。在工业中,酶用于许多目的,例如洗衣去污剂中使用的蛋白酶、制备专业化学制品例如氨基酸和维生素的代谢酶以及用于制备对映体纯的药物的手性专一酶。使用报道分子的测定是用于研究和检测介导许多生物和工业过程的酶的重要工具。尽管已经开发了许多使用报道分子测定酶的方法,但依然存在寻找可用以廉价且方便地检测和表征许多种酶的新测定设计的极大需求。
发明内容这里提供了特别用于检测、定量和/或表征感兴趣的酶或试剂的组合物、方法和试剂盒。在一些实施方案中,所述组合物包括(i)包含疏7JC部分(moiety)、染料部分和任选的电荷部分的疏水分子,和(ii)一种或多种电荷平衡分子。当加入处于或高于其临界胶束浓度(CMC)的水溶剂中时,所述疏水部分能够将所述疏水分子聚集成胶束。所迷电荷平衡分子可以促进或促使胶束形成。虽然不想受任何操作理论的束縛,但相信所述电在一些实施方案中,所述疏水分子和/或电荷平衡分子可各自独立地包含感兴趣的酶或试剂的底物或推定底物。在一些实施方案中,所述任选的电荷部分包含酶底物。在一些实施方案中,所述疏水分子和电荷平衡分子两者都包含相同的底物。在一些实施方案中,所述疏水分子和电荷平衡分子包含不同的底物。可以作用于所述底物的酶的非限制性实例包括激酶、磷酸酶、碌u酸酯酶、肽酶和羧化酶。在一些实施方案中,所述染料部分可以是荧光部分。当酶或试剂作用于所述组合物的底物时,所述荧光部分可以产生荧光信号。可包含所述荧光部分的适当荧光染料的非限制性实例包括夹氧杂蒽染料,例如荧光素,硫代荧光素和若丹明染料,花青染料,氟硼焚染料(bodipydye)和方酸菁染料(squarainedye)。还可以使用包含萸光部分的其他萸光染料。在一些实施方案中,所述疏水分子和电荷平衡分子两者都包含染料部分。例如,疏水分子可包含荧光部分,且电荷平衡分子可包含淬灭部分。淬灭部分可以是当接近所述焚光部分时能够淬灭焚光部分的萸光的任何部分。在一些实施方案中,所述疏水分子可包含淬灭部分,且所述电荷平衡分子可包含荧光部分。在一些实施方案中,淬灭部分可作为分离的淬灭分子加入所述胶束。所述淬灭分子可包含疏水部分和淬灭所述荧光部分光信号的淬灭部分。在另一方面,提供了检测和/或表征样品中酶活性的方法。将所述样品与胶束接触并检测焚光信号。在一些实施方案中,所述胶束包括(i)包含疏水部分、染料部分和任选的电荷部分的疏水性分子;和(ii)一种或多种电荷平衡分子。在一些实施方案中,疏水分子和/或电荷平衡分子可彼此独立地包含感兴趣的酶或试剂的底物或推定底物。在一些实施方案中,所述任选的电荷部分包含酶底物。在一些实施方案中,所述疏水分子和电荷平衡分子两者都包含相同的底物。在一些实施方案中,所述疏水分子和电荷平衡分子包含不同的底物。在另一方面,提供了用于检测和/或表征样品中酶活性的试剂盒。在一些实施方案中,所述试剂盒包括(i)包含疏水部分、染料部分和任选的电荷部分的疏水性分子;和(ii)一种或多种电荷平衡分子。在一些实施方案中,疏水分子和/或电荷平衡分子可彼此独立地包含感兴趣的酶或试剂的底物或推定底物。在一些实施方案中,所述任选的电荷部分包含酶底物。在一些实施方案中,所述疏水分子和电荷平衡分子都包含相同的底物。在一些实施方案中,所述疏水分子和电荷平衡分子包含不同的底物。本发明的教导内容的这些和其他特征在下文描述。附图简迷本领域技术人员将理解下述附图仅是用于说明目的。附图不是要以任何方式限制本发明的教导内容的范围。图1A-B显示了包含疏水分子CnOOOK(tet)RQGSFRA-酰胺(图1A)和磷酸化的疏水分子CnOOOK(tet)RQGS(p)FRA-酰胺(图1B)的胶束的电子显微照片;所示条代表100nm。图2描绘了不同浓度(0、2.5、5、10、20、50一)的髓磷脂碱性蛋白(MBP)在20mMTris(pH7.6)和5mMMgCl2中对淬灭疏水分子d6000K(染料2)EEIYGEF-酰胺(10ixM)的焚光的作用。图3A-C显示了PKC(3II(图3A)、MAP激酶1/Erkl(图3B)和MAP激酶2/Erk2(图3C)在25mMTris(pH7.6)、5mMMgCl2以及0和500ATP中抑制MPB(10一)和疏水分子C^OOOK(染料2)EEIYGEF-酰胺(10^M)的反应速度。图4A-C显示了PKCPII(图4A)、MAP激酶1/Erkl(图4B)和MAP激酶2/Erk2(图4C)与MPB(10nM)和疏水分子C,6000K(染料2)EEIYGEF-酰胺(10^iM)在25mMTris(pH7.6)和5mMMgCl2中的表观KmATP。图5A-B显示了十字胞碱(图5A)和H89(图5B)在25mMTris(pH7.6)和5mMMgCl2中抑制PKC卩ii与MPB(10mM)和疏水分子CwOOOK(染料2)EEIYGEF-酰胺(10(iM)。具体实施方式应理解,前述概述和下述各种实施方案的描述仅是示例性和解释性的,且不限制本发明的教导内容。在该申请中,除非另有特别说明,单数的使用包括复数。而且,除非另有说明,"或"的使用意思是"和/或"。类似地,"包含,,(comprise、comprises、comprising)、"包括"(include、includes、including)非意为限制性的。5.1定义如本文使用的,下述术语意于具有下述含义"检测"和"测定"具有其标准含义,并意于包括选定的酶或酶活性的检测、测定和表征。例如,可以在4企测、筛选或表征酶活性的抑制剂、激活剂和调节剂的过程中"检测"酶活性。"脂肪酸"具有其标准含义并意于指长链烃羧酸,其中所述烃链是饱和的、单不饱和的或多不饱和的。所述烃链可以是线性、分支或环状的,或者可包含这些特征的组合,并可以是未被取代或净皮取代的。脂肪酸通常具有结构式RC(O)OH,其中R是被取代或未被取代的、饱和的、单不饱和的或多不饱和的包括6至30个碳原子的烃,其具有线性、分支或环状或它们的组合的结构。"胶束"具有其标准含义并意于指由两亲性分子在水或水环境中形成的聚集物,这样它们的极性末端或极性段与所述水或水环境接触,且它们的非极性末端或极性段在所述聚集物的内部。胶束可以采用任何形状或形式,包括但不限于非片状"去污剂样"聚集物,其不封入一部分水或水环境;或单层或多层"嚢泡样"聚集物,其封入一部分水或水环境,例如脂质体。"淬灭"具有其标准含义并意于指在特定波长下测定的荧光基团或部分的荧光强度的减少,不论所述减少是通过何种机制实现的。作为具体实施例,所述淬灭可归因于分子碰撞、能量转移例如FRET、光诱导的电子转移例如PET、荧光基团或部分的荧光光镨(色)的变化或任何其他机制(或机制的组合)。所述减少的量不是关键性的,并可在宽范围内变化。唯一的要求是所述减少可通过使用的检测系统检测。因此,如果在特定波长下荧光信号强度减少了任何可测定的量,则所述荧光信号被"淬灭"。如果在特定波长下荧光信号强度减少了至少50%,例如减少50%、60%、70%、75%、80°/。、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至100%,则所述荧光信号被"基本淬灭"。肽序列被提供了N末端至C末端的定向(左至右),且氨基酸残基由标准的3-字母或1-字母码表示(例如,St而.L.,Biochemistry,第二版,W.H.FreemanandCo"SanFrancisco,CA,第16页(1981))。"多核苷酸或寡核苷酸"指核苷酸碱基聚合物或寡聚物,其中所述核苷酸碱基通过糖磷酸键连接(糖磷酸骨架)。示例性的多核苦酸和寡核苷酸包括2'脱氧核糖核苷酸(DNA)的聚合物和核糖核苷酸(RNA)的聚合物。多核苷酸可以全部由核糖核苷酸、全部由2,脱氧核糖核苷酸或它们的组合所组成。"多核苷酸或寡核苷酸类似物"指核苷酸碱基聚合物或寡聚物,其中所述核苷酸碱基通过包含一个或多个糖磷酸类似物的糖磷酸骨架连接。通常的糖磷酸类似物包括但不限于糖烷基膦酸酯、糖亚磷酰胺、糖烷基或取代烷基磷酸三酯、糖磷硫酰、糖二硫代磷酸酯、糖磷酸酯和糖磷酸酯类似物,其中所述糖不是2,-脱氧核糖或核糖,核苷酸碱基聚合物具有带正电荷的糖-胍基链接,如美国专利第6,013,785号和美国专利第5,696,253号中描述的那些(还参见,Dagani1995,Chem.&Eng.News4-5:1153;Dempey等,1995,J.Am.Chem.Soc.117:6140-6141)。其中糖是2,-脱氧核糖的这类带正电荷的类似物被称为"DNG",而其中糖是核糖的这类带正电荷的类似物被称为"RNG"。特别包括在多核苷酸和寡核香酸类似物定义内的是锁核酸(LNA;见,例如Elayadi等,2002,Biochemistry41:9973-9981;Koshkin等,1998,J.Am.Chem.Soc.120:13252-3;Koshkin等,1998,TetrahedronLetters,39:4381-4384;Jumar等,1998,Bioorganic&MedicinalChemistryLetters8:2219-2222;Singh和WengeL1998,Chem.Co腿un.,12:1247-1248;WO00/56746;WO02/28875;和WO01/481卯;其全部通过引用整体并入本文)。"多核苷酸或寡核苷酸模拟物"指其中一个或多个骨架糖磷酸键被糖磷酸类似物取代的核苷酸碱基聚合物或寡聚物。这种模拟物能够杂交至互补的多核苷酸或寡核苷酸或多核苷酸或寡核苷酸类似物,或者杂交至其他多核苷酸或寡核苷酸模拟物,并可以包括包含一个或多个以下键的骨架如美国专利第5,786,461号、美国专利第5,766,855号、美国专利第5,719,262号、美国专利第5,539,082号和WO98/03542中描述的具有烷基胺侧链的带正电荷的聚酰胺骨架(还参见,Haaima等,1996,AngewandteChemieInt,l14.inEnglish35:1939-1942;Lesnick等,1997,Nucleosid.Nucleotid.16:1775-1779;D,Costa等,1999.Org.Lett.1:1513-1516,还参见Nielsen,1999.Curr.Opin.Biotechnol.10:71-75);如WO92/20702和美国专利第5,539,082号中描迷的不带电荷的聚酰胺骨架;如美国专利第5,698,685号、美国专利第5,470,974号、美国专利第5,378,841号和美国专利第5,185,144号中描述的不带电荷的吗啉代-氨基磷酸酯骨架(还参见,Wages等,1997,BioTechniques23:1116-1121);基于肽的核酸模拟物骨架(参见,例如,美国专利第5,698,685号);氨基甲酸酯骨架(参见,例如,Stirchak&Su廳erton,1987,丄Org.Chem.52:4202);酰胺骨架(参见,例如,Lebreton,1994,Svnlett.February.1994:137);曱基羟基胺骨架(参见,例如,Vasseur等,1992,J.Am.Chem.Soc.114:4006);3,-硫曱缩醛骨架(参见,例如,Jones等,1993,J.Org.Chem.58:2983)和氨基磺酸酯骨架(参见,例如,美国专利第5,470,967号)。前述参考文献全部通过引用并入本文。"肽核酸"或"PNA"指多核苷酸或寡核苦酸才莫拟物,其中核苷酸碱基通过氨基键连接(不带电荷的聚酰胺骨架),例如美国专利第5,539,082、5,527,675、5,623,049、5,714,331、5,718,262、5,736,336、5,773,571、5,766,855、5,786,461、5,837,459、5,891,625、5,972,610、5,986,053、6,107,470、6,451,968、6,441,130、6,414,112和6,403,763号的任何一个或多个中所描述的,其全部通过引用并入本文。术语"肽核酸,,或"PNA,,还将适用于包含以下公开中描述的那些多核苦酸模拟物的两个或更多个亚单位的任何寡聚物或聚合物Lagriffoul等,1994.Bioorganic&MedicinalChemistryLetters,4:1081-1082;Petersen等,1996,Bioorganic&MedicinalChemistryLetters.6:793-796;Diderichsen等,1996,Tett.Lett.37:475-478;Fujii等,1997,Bioorg.Med.Chem,Lett.7:637-627;Jordan等,1997,Bioorg.Med.Chem.Lett.7:687画6卯;Krotz等,1995,Tett.Lett.36:6941-6944;Lagriffoul等,1994,Bioorg.Med.Chem.Lett.4:1081-1082;Diederichsen,U.,1997.Bioorganic&MedicinalChemistry25Letters.7:1743-1746;Lowe等,1997,J.Chem.Soc.PerkinTrans.1,1:539-546;Lowe等,1997.J.Chem.Soc.PerkinTrans.11:547-554;Lowe等,1997,1.Chem.Soc.PerkinTrans.11:555-560;Howarth等1997,I.Org.Chem.62:5441-5450;Altmann,K-H等,1997,Bioorganic&MedicinalChemistryLetters.7:1119-1122;Diederichsen,U.,1998,Bioorganic&Med.Chem.Lett.,8:165-168;Diederichsen等,1998,Angew.Chem.mt.Ed"37:302-305;Cantin等,1997,Tett,Lett.,38:4211-4214;Ciapetti等,1997,丁strah6d鼠53:1167-1176;Lagriffoule等,1997,Chem.Eur,l.,3:912-919;Kumar等.,2001,OrganicLetters3(9):1269-1272;和Shah等在WO96/04000中公布的基于肽的核酸模拟物(PENAM)。其全部通过引用并入本文。5.2组合物这里提供了特别用于检测、定量和/或表征酶的组合物、方法和试剂盒。所述组合物一般包含疏水分子和一种或多种电荷平衡分子。在一些实施方案中,所述疏水分子包含一种或多种带电荷化学基团,这些基团的存在可以阻碍或抑制胶束形成。在一些实施方案中,所述电荷平衡分子包含具有与包含所述化学基团的疏水分子相反电荷的化学基团,这些基团的存在可促进或促使胶束形成。在一些实施方案中,所述疏水分子包含疏水部分、染料部分和任选的电荷部分。当加入处于或高于其临界胶束浓度的水溶剂中时,所述疏水部分能够将所述疏水分子聚集成胶束。在一些实施方案中,所述染料部分可以是荧光部分并可以产生荧光信号。虽然不想受任何操作理论的束缚,但相信所述电荷平衡分子包含足以促进或促使胶束形成的与所述疏水分子相反的电荷,从而所述荧光部分被聚集为胶束,且其信号可以被淬灭。所述疏水部分、染料部分和任选的电荷部分可以以任何允许其行使各自功能的方式相互连接。所述疏水分子和/或电荷平衡分子包含感兴趣的酶或试剂的至少一种底物或推定底物。在一些实施方案中,所述任选的电荷部分包含酶底物。例如,所述疏水分子和/或电荷平衡分子可以各自独立地包含酶底物。在一些实施方案中,所述疏水分子和电荷平衡分子都包含相同的底物。在一些实施方案中,所述疏水分子和电荷平衡分子包含不同的底物。所述底物可以受酶或试剂和/或多种酶或试剂的作用。当所述底物由酶或试剂作用时,其可以促进所述染料部分从所述胶束的离解,从而减少或消除由染料部分和胶束之间相互作用所引起的淬灭作用。所述离解可由酶识别位点的切割或化学基团例如带电荷的基团的添加、删除或取代所引起,其可以使胶束不稳定,促进所述染料部分从其释放。所述染料部分从所述胶束的释;改减少或消除了淬灭作用,从而导致光信号的可测定的增加。在一些实施方案中,疏水分子和电荷平衡分子都包含染料部分。在一些实施方案中,所述疏水分子可以包含荧光部分,且所述电荷平衡分子可以包含淬灭部分。淬灭部分可以是当接近焚光部分时能够淬灭所述荧光部分的荧光的任何部分。在一些实施方案中,所述淬灭部分可以作为分离的淬灭分子加入所述月交束。在一些实施方案中,所述疏水分子可以包含淬灭部分,且所述电荷平衡分子可以包含荧光部分。5.3疏水部分疏水部分可以将这里描述的各种分子锚定或聚集成胶束。所述疏水部分的确切数目、长度、大小和/或组成可以是改变的。例如,在采用两个或多个疏水部分的实施方案中,各疏水部分可以是相同的,或者一些或全部疏水部分可以不同。作为具体实施例,在一些实施方案中,所述疏水分子和电荷平衡分子各自可以包含疏水部分。所述两个疏水部分可以是相同的,或者可以彼此不同。在一些实施方案中,所述疏水分子的疏水部分的长度、大小和/或组成可以与所述电荷平衡分子的疏水部分相同。在一些实施方案中,所述疏水分子的疏水部分的长度、大小和/或组成可以与所述电荷平衡分子的疏水部分不同。作为另一具体实施例,在一些实施方案中,所述疏水分子可以包含两个疏水部分。所述两个疏水部分可以是相同的,或者可以彼此不同。在一些实施方案中,所述疏水部分的长度、大小和/或组成可以相同。在一些实施方案中,所述疏水部分的长度、大小和/或组成可以不同。在2004年11月24日提交的标题为"含有配基的胶束及其用途(Ligand-containingmicellesandusesthereof)"的美国专利申请第10/997,066号中描述了包含两个疏水部分的分子的其他示例性实施方案,其公开内容通过引用并入本文。在一些实施方案中,所述疏水部分包含具有足够疏水特征(例如,长度和/或大小)的取代或未取代的烃,当疏水分子和/或电荷平衡分子净皮置于高于形成胶束的阈值的浓度(例如处于或高于其临界胶束浓度(CMC))的水环境中时,所述烃可以将所述分子聚集成或合并成月交束。在其他实施方案中,所述疏水部分包含取代或未取代的烃,所述烃包含6至30个碳原子,或6至25个碳原子,或6至20个碳原子,或6至15个碳原子,或8至30个碳原子,或8至25个碳原子,或8至20个石灰原子,或8至15个碳原子,或12至30个碳原子,或12至25个碳原子,或12至20个碳原子。所述烃可以是线性、分支、环状或它们的任何组合,并可以任选包括一个或多个相同或不同的取代基。示例性的线性烃部分包括C6、C7、C8、C9、CIO、Cll、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C22、C24和C26烷基链。在一些实施方案中,所述疏水部分是完全饱和的。在一些实施方案中,所述疏水部分可以包含一个或多个碳-碳双键,和/或一个或多个碳碳巻键,所述双键可以彼此独立地为顺式或反式构型。在一些情况下,所述疏水部分可以具有一个或多个环炔基,或一个或多个芳环或芳烷基,如一个或两个苯环。在一些实施方案中,所述疏水部分是非芳香部分,其不具有环芳香族Tl电子系统。在一些实施方案中,如果所迷疏水部分包含一个或多个不々包和碳-碳键,那么这些碳-碳键不是共辄的。在另一实施方案中,所述疏水部分的结构不能够通过FRET或堆积相互作用与所述焚光部分相互作用,以淬灭所述荧光部分的荧光。这里还包括涉及任何两个或更多个前述实施方案的组合的实施方案。可以通过制备具有不同疏水部分的几种疏水分子和/或电荷平衡分子进行优化实验。在一些实施方案中,所述組合物的分子包含通过酯键(或其他键)与甘油基的Cl和C2碳连接的两个疏水部分。所述两个疏7jc部分可以是相同的,或者可以彼此不同。在一个具体实施方案中,选择每个疏水部分以对应天然存在的脂肪酸的烃链或"尾"。在另一具体实施方案中,选择所述的烃链或"尾"。表l中提供了通常存在的脂肪酸的烃链或"尾"的非限制性实施例,如下表1<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>在一些实施方案中,疏水部分包含具有疏水侧链的氨基酸或氨基酸类似物。选择所述氨基酸或类似物以提供足够的疏水性,以在用以检测所述酶的测定条件下将所述组合物分子聚集成胶束。如Alberts,B.,等,MolecularBiologyoftheCell,第四版,GarlandScience,NewYork,NY,图3.3(2002)中描述的,疏水氨基酸的实例包括丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸和半胱氨酸。氨基酸类似物的实例包括原缬氨酸、氨酷酸、丙氨酸环己酯、丁基甘氨酸、苯基甘氨酸和N-甲基缬氨酸(见"氨基酸和氨基酸类似物(AminoAcidsandAminoAcidAnalogs)"节2002-2003Novabiochem目录)。多肽的疏水性可以通过为每个氨基酸指定疏水性值并然后沿所述多肽链叠加所述值来计算。普通氨基酸的疏水性值显示于表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>'Monera等J.ProteinSci1:219-329(1995)(所述值是经标准化的,这样最具疏水性的残基(笨丙氨酸)被给定相对于被认为是中性(0值)的甘氨酸的值100。2-HoopTP和WoodsKR:从氨基酸序列预测蛋白质抗原决定蔟(Predictionofproteinantigenicdeterminantsfromaminoacidsequences).ProcNatlAcadSciUSA78:3824.1981。1KyteJ和DoolittleRF:展示蛋白质亲水特征的简单方法(Asimplemethodfordisplayingthehydropathiccharacterofaprotien).JMolBiol157:105.1982。所选择的氨基酸或氨基酸类似物的确切数目将根据所选择的氨基酸的序列和其他组分的存在而变化。在一些实施方案中,所述疏水部分包含相同的氨基酸或氨基酸类似物。例如,所述疏水部分可以包含1至10个亮氨酸残基的聚(亮氨酸)。在一些实施方案中,所述疏水部分包含氨基酸或氨基酸类似物的混合物。例如,所述疏水部分可以包含例如亮氨酸和异亮氨酸的氨基酸混合物,可以使用1至10个亮氨酸残基和1至10个异亮氨酸残基。.在一些实施方案中,所述疏水部分可以包含氨基酸、氨基酸类似物和烃的混合物。例如,在一些实施方案中,所述疏水部分可以包含1至10个氨基酸残基或类似物和含有2至30个碳原子的烃。所述疏水部分可以以任何允许其行使其各自功能的方式连接至所述疏水分子和/或电荷平衡分子包含的其他部分。例如,如果所述疏水分子包含疏水部分、染料部分和电荷部分,则所述部分可以相互直接连接,即彼此共价连接。在其他实施方案中,一个、一些或全部所述部分可以相互间接连接,即通过一个或多个任选连接体连接。对于其中所述疏水部分连接至所述染料部分(如下所述)的组合物分子的实施方案,应该理解,所述疏水部分不同于染料部分,园为所述疏水部分不包含所述染料部分中的任何原子,所述原子是产生荧光信号的芳香族或共轭7C电子系统的部分。因此,如果疏水部分连接至夹氧杂蒽环的C4位置(例如,荧光素或若丹明染料的C4,位置),则疏水部分不包含夹氧杂蒽环的任何芳香环原子。5.4染并+部分这里描述的组合物包括至少一个染料部分。在一些实施方案中,所述染料部分包含荧光部分,所述焚光部分可以在所述酶底物如本文所述^^奮饰时被选择性"打开"。所述荧光部分可以包含任何提供荧光信号并能根据本文描述的方法和原理祐使用的实体。在一些实施方案中,所述染料部分包含淬灭部分。所述淬灭部分可以是当接近所述荧光部分时能够淬灭荧光部分的荧光的任何部分。可以以多种不同的方式实现所述胶束内荧光部分的淬灭。在一个实施方案中,所述淬灭作用可以通过"自淬灭,,实现或引发。当包含所述焚光部分的分子以足够使其荧光部分相互间足够接近以便其荧光信号被淬灭浓度或者摩尔比存在于所述胶束中时,可以发生自淬灭。所述焚光部分从所述胶束的释放减少或消除了所述"自淬灭",导致其荧光信号的增加。如本文使用的,如光部分从胶束"释》文"或"除去"。在一些实施方案中,所述疏水分子包含至少一个染料部分。在一些实施方案中,所述疏水分子包含焚光部分。在一些实施方案中,所述疏水分子包含能够自淬灭的两个染料部分。在一些实施方案中,所述电荷平衡分子包含至少一个染料部分。在一些实施方案中,所述电荷平衡分子包含萸光部分。在一些实施方案中,所述电荷平衡分子包含能够自淬灭的两个染料部分。在一些实施方案中,所述疏水分子和电荷平衡分子各自包含至少一个染料部分。在一些实施方案中,所述疏水分子和电荷平衡分子可以各自包含相同的染料部分。在一些实施方案中,所述疏水分子和电荷平衡分子可以各自包含不同的染料部分。在一些实施方案中,一个分子包含淬灭部分,且一个分子包含荧光部分。在一些实施方案中,所述疏水分子包含染料部分,且所述电荷平衡分子包含能够自淬灭的染料部分。在一些实施方案中,所述电荷平衡分子包含染料部分,且所述疏水分子包含能够自淬灭的染料部分。在一些实施方案中,所述淬灭部分可以作为分离的淬灭分子加入。所述淬灭分子可包含疏水部分和淬灭所述染料部分光信号的淬灭部分。所述淬灭部分可以被定位,以便其能够分子内淬灭包含其的淅述疏水分子和/或电荷平衡分子上的染料部分的荧光,或者,所述淬灭部分可以被定位,以便不发生分子内淬灭。在任一实施方案中,所述淬灭部分可以分子间淬灭所述胶束中另一分子上与其紧密接近的荧光部分的荧光。当所述底物受特定酶作用时,其通过解除所述淬灭部分和焚光部分的紧密接近而"去活"所述淬灭作用,从而导致可测定的荧光信号增加。所述染料部分可以以任何允许本文描述的分子行使各自功能的方式连接至所述分子。例如,如果所述疏水分子包含疏水部分和染料部分,则所述部分可以相互直接连接,即彼此共价连接。在其他实施方案中,一个、一些或全部所述部分可以相互间接连接,即通过一个或多个任选连接体连接。作为另一具体实施例,如果所述疏水分子包含疏水部分、染料部分和电荷部分,则所述部分可以相互直接连接,即彼此共价连接。在其他实施方案中,一个、一些或全部所述部分可以相互间接连接,即通过一个或多个任选连接体连接。对于任何给定的测定而言,所述荧光部分可以是可溶或不可溶的。例如,在一些实施方案中,所述荧光部分在测定条件下是可溶的,以促进从所述胶束释放的荧光部分移入所述测定介质。在其他实施方案中,假设不发生自淬灭,则所述荧光部分在测定条件下是不可溶的,这样所述荧光部分可以从溶液沉淀析出,并集中于其生成的位置,从而导致与溶液中观察到的信号相比荧光信号的增加。所述淬灭作用可以通过包含其他部分的胶束实现或引起。不论所述淬灭是通过何种机制实现的,这些部分都被称为"淬灭部分"。这类淬灭部分和淬灭分子在下面更具体描述。通过修饰所述淬灭部分以减少或消除其淬灭作用,i或通过将所述荧光部分从接近所述淬灭部分移开,可以基本恢复所述荧光部分的荧光。在本文描述的胶束和方法中可以使用能够导致淬灭或荧光性质变化的任何机制。胶束内达到的淬灭程度对成功不是关键的,条件是所述淬灭可通过使用的检测系统检测。应理解的是,较高程度的淬灭是希望的,因为淬灭作用越大,消除所述淬灭作用之前的背景焚光越低。理论上,相当于完全抑制可测萸光信号的100°/。淬灭作用将是理想的。实际上,任何可测的量都是满足需要的。除其他因素外,提供希望的胶束内淬灭程度所必需的胶束内疏水分子和/或电荷平衡分子和任选的淬灭分子的量和/或摩尔百分比可根据荧光部分的选择而变化。可经验确定胶束中含有的疏水分子和/或电荷平衡分子和任选的淬灭分子(或任选淬灭分子的混合物)的量和/或摩尔百分比,以获得足够程度的淬灭。所述荧光染料又包含共振离域系统或芳环系统,所述系统在第一波长处吸收光,并在第二波长处发射荧光以响应所述吸收事件。许多这类荧光染料分子是本领域已知的。例如,荧光染料可以选自多种荧光化合物的任何一种,例如夹氧杂蒽、若丹明、荧光素、花青、酞菁、方酸菁、氟硼荧染料、香豆素、噁噪和碳派洛宁(carbopyronine)。在一些实施方案中,所述荧光染料包括夹氧杂蒽染料。一般,夹氧杂蒽染料被表征为具有三个主要特征(l)夹氧杂蒽母环;(2)环外羟基或胺取代基;和(3)环外氧或亚铵取代基。环外取代基通常位于夹氧杂蒽母环的C3和C6碳上,但稠合至C5/C6和C3/C4碳之一或两者的"延伸的"夹氧杂蒽也是已知的,其中夹氧杂蒽母环包含苯并部分。在这些延伸的夹氧杂蒽中,特征的环外取代基位于所述延伸的夹氧杂蒽环的相应位置。因此,如本文使用的,"夹氧杂蒽染料"一般包含以下母环的一种<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>在上述母环中,A'是OH或NH2,且A"是0或NH2+。当Ai是OH且A2是O时,所述母环是焚光素型夹氧杂蒽环。当A1是NH2且A2是NH2+时,所述母环是若丹明型夹氧杂蒽环。当八1是1^2且八2是0时,所述母环是对曱氨基酚型夹氧杂蒽环。Ai和A2的一个或两个氮(当存在时)和/或位于Cl、C2、C2"、C4、C4"、C5、C5"、C7"、C7和C8位置的一个或多个碳原子可独立地被许多种相同或不同的取代基所取代。在一个实施方案中,通常的取代基包括但不限于-X、-Ra、-ORa、-SRa、-NRaRa、过囟代(d-C6)烷基、-CX3、-CF3、-CN、-OCN、-SCN、-NCO、國NCS、-NO、-N02、-N3、-S(0)2CT、-S(0)2OH、-S(0)2Ra、-C(O)R、-C(O)X、-C(S)Ra、-C(S)X、-C(0)ORa、-C(O)O、-C(S)ORa、-C(0)SRa、-C(S)SRa、-C(0)NRaRa、-C(S)NRaRa和-C(NR)NRaRa,其中各个X独立为卣素(优选-F或-C1),且各Ra独立为氢、(d-C6)烷基,(C广C6)链烷基、(d-C6)链烯基、(d-C6)炔基、(C5-C2Q)芳基、(CVC26)芳烷基、(C5-C20)芳基芳基(arylaryl)、5-20元杂芳基、6-26元杂芳烷基、5-20元杂芳基-杂芳基、羧基、乙酰基、硫酰基、亚硫酰基、砜、磷酸酯或膦酸酯。一般,不易于完全淬灭所述母环焚光的取代基是优选的,但在一些实施方案中,淬灭取代基可能是希望的。易于淬灭夹氧杂蒽母环荧光的取代基是吸电子基团,例如-N02、-Br和-I。Cl和C2取代基和/或C7和C8取代基可以一起用以形成取代的或未取代的[1,3]丁二烯并基或(CVC2())亚芳并基桥。为说明目的,包括稠合至Cl/C2和C7/C8碳的未取代苯并基桥的示例性夹氧杂蒽母环描述如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>所述苯并基桥或芳烯并基桥可以用多种不同取代基在一个或多个位置取代,所述取代基例如之前上述的结构(Ia)-(Ic)中碳Cl-C8的取代基。在包括多种取代基的实施方案中,所述取代基可以全部相同,或者一些或全部所述取代基可以彼此不同。当八1是朋2和/或八2是顺2+时,氮原子可以包括在一个或两个涉及相邻碳原子的桥中。所述桥连基团可以是相同或不同的,并通常选自(C广Q2)烷二基、(C广Cu)烷烯并基、2-12元杂烷二基和/或2-12元杂烷烯并基桥。非限制性示例的包含涉及环外氮的桥的母环说明如下所述母环还可以包含C9位置上的取代基。在一些实施方案中,C9取代基选自乙炔、低级(例如1至6个碳原子)链烷基、低级链烯基、氰基、芳基、苯基、杂芳基、富含电子的杂芳基和任何前述基团的取代形式。在其中所述母环包含稠合至Cl/C2和C7/C8位置的苯并基桥或芳烯并基桥的实施方案中,例如上述环(Id)、(Ie)和(If),C9碳优选未被取代。在一些实施方案中,C9取代基是取代或未取代的苯环,这样夹氧杂蒽染料包含一个下述结构位置3、4、5、6和7上的碳可以用多种不同取代基所取代,如之前描述的碳Cl-C8的取代基。在一些实施方案中,位置C3上的碳用羧基(-COOH)或硫酸(-S03H)基团,或它们的阴离子所取代。其中A1是OH且A"是O的式(IIa)、(IIb)和(IIc)的染料在本文被称为荧光素染料;其中A1是NH2且八2是NH2+的式(IIa)、(IIb)和(IIc)的染料在本文被称为若丹明染料;以及其中V是OH且八2是>^2+(或其中At是NH2且八2是0)的式(IIa)、(IIb)和(IIc)的染料在本文称为对曱氨基酚染料。如上述结构所突出显示的,当夹氧杂蒽环(或延伸的夹氧杂蒽环)包含在荧光素、若丹明和对甲氨基酚染料中时,其碳原子编号不同。特别地,其碳原子编号包括撇号(prime)。尽管为方便起见,提供了上述关于荧光素、若丹明和对甲氨基酚染料的编号系统,但要理解,可以使用其他编号系统,并且其不意为限制性的。还要理解,虽然描述了所述染料的一种异构体形式,但其可以以其他异构体形式存在,包括(作为例子并非限制)其他的互变异构形式或几何异构形式。作为具体实施例,羧基若丹明和突光素染料可以以内酯形式存在。在一些实施方案中,所述荧光染料包括若丹明染料。示例性的适当若丹明染料包括但不限于若丹明B、5-羧基若丹明、若丹明X(ROX)、4,7-二氯若丹明X(dROX)、若丹明6G(R6G)、4,7-二氯若丹明6G、若丹明IIO(RIIO)、4,7-二氯若丹明110(dR110)、四甲基若丹明(TAMRA)和4,7-二氯-四甲基若丹明(dTAMRA)。其他适当的若丹明染料包括例如下述文献中描述的那些美国专利第6,248,884、6,111,116、6,080,852、6,051,719、6,025,505、6,017,712、5,936,087、5,847,162、5,840,999、5,750,409、5,366,860、5,231,191和5,227,487;PCT公布WO97/36960和WO99/27020;Lee等,NUCL.ACIDSRES.20:2471-2483(1992),Arden-Jacob,NEUELANWEIXIGEXANTHEN國FARBSTOFFEFURFLUORESZENZSONDENUNDFARBSTOFFLASER,VerlagShaker,Germany(1993),Sauer等,J.FLUORESCENCE5:247-261(1995),Lee等,NUCL.ACIDSRES.25:2816-2822(1997),和Rosenblum等,NUCL.ACIDSRES.25:4500-4504(1997)。特别优选的若丹明染料亚类是4,7,-二氯若丹明。在一个实施方案中,所述荧光部分包括4,7-二氯-邻羧基若丹明染料。在一些实施方案中,所述荧光染料包括荧光素染料。示例性适当荧光素包括但不限于下述文献中描述的荧光素染料美国专利第6,008,379、5,840,999、5,750,409、5,654,442、5,188,934、5,066,580、4,933,471、4,481,136和4,439,356;PCT公布WO99/16832,和EPO公布050684。优选的荧光素染料亚类是4,7-二氯荧光素。其他优选的荧光素染料包括但不限于5-羧基荧光素(5-FAM)和6-羧基荧光素(6-FAM)。在一个实施方案中,所述荧光素部分包括4,7-二氯-邻羧基荧光素染料。在一些实施方案中,所述荧光染料可以包括花青、酞菁、方酸菁或氟硼荧染料,如下述参考文献及其引用的参考文献中描述的那些美国专利第6,080,868、6,005,113、5,945,526、5,863,753、5,863,727、5,800,996和5,436,134号;和PCT公布WO96/04405。在一些实施方案中,所述荧光染料可以包括例如通过FRET或另一机制相互协同操作的染料网络,以提供大的斯托克位移(Stoke,sshift)。这类染料网络通常包含荧光供体部分和焚光受体部分,并可以包含同时作为荧光受体和供体起作用的其他部分。假设能够相互协同作用的染料被选择,所述荧光供体和受体部分可以包含任何之前描述的染料。在具体实施方案中,所述荧光染料包括包含荧光素染料的荧光供体染料,和包含荧光素或若丹明染料的荧光受体染料。适当染料对或染料网络的非限制性实施例在美国专利第6,399,392、6,232,075、5,863,727和5,800,996号中有述。在一些实施方案中,所述荧光部分包含荧光稀土元素金属。稀土元素的焚光性质描述于Lackowicz,1999,PrinciplesofFluorescenceSpectroscopy,第二版,KluwarAcademic,NewYork。示例性的适当稀土金属包括但不限于铕(Ei^+)和铽(TV+)。在一些实施方案中,所述焚光部分包含鳌合稀土元素。示例性鳌合物包括但不限于四异酞酰亚胺(TIAM)。在一些实施方案中,所述荧光部分包括TIAM(Tb)。5.5电荷部分所述疏水分子可进一步包含电荷部分,其在存在时可阻碍和/或抑制胶束形成。所述电荷部分包含任何能够携带电荷的化学基团。在一些实施方案中,所述电荷部分可以是包含酶底物的化学基团。在一些实施方案中,所述电荷部分可以是包含染料部分的化学基团。在一些实施方案中,所述电荷部分可以是用以连接染料部分至所述疏水分子的化学基团。在一些实施方案中,电荷部分包含净负电荷。在一些实施方案中,所述电荷部分包含净正电荷。电荷部分的适当实例包括染料、氨基酸、寡核苦酸及它们的类似物和书f生物。在一些实施方案中,所述电荷部分包括带正电荷的氨基酸,如精氨酸和赖氨酸。赖氨酸和精氨酸含有在生理pH下携带单个正电荷的侧链。组氨酸的咪唑侧链的pKa约为6,所以其在约6或更小的pH下携带完全的正电荷。所述电荷部分可以包含带负电荷的氨基酸,如天冬氨酸和谷氨酸。天冬氨酸和谷氨酸含有具有单个负电荷的羧基側链。半胱氨酸的pKa约为8,所以其在pH高于8时携带完全的负电荷。所述电荷部分可以包含磷酸化的氨基酸。例如,磷酸丝氨酸残基在磷酸基团上携带两个负电荷。在一些实施方案中,所述电荷部分可进一步包含不带电荷的氨基酸,例如丙氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和缬氨酸(即生理pH6至9)。在一些实施方案中,所述电荷部分可包含不带电荷的氨基酸类似物。适当的例子包括2-氨基-4-对氟苯曱酸、2-氨基-3-曱氧苯甲酸,3,4-二氨基苯甲酸、4-氨甲基-L-苯丙氨酸、4-溴-L-苯丙氨酸、4-氰-L-脯氨酸、3,4-二羟基-L-苯丙氨酸、乙基-L-酪氨酸、7-氮杂色氨酸(azaatiyptophan)、4-氨马尿酸、2-氨基-3-胍基丙酸、L-瓜氨酸,和衍生物。在一些实施方案中,所述电荷部分可包含带正电荷的氨基酸类似物,如N-co,Q)-二曱基-L-精氨酸、a-甲基-DL-鸟氨酸、N-co-硝基-L-精氨酸,和4汙生物。在一些实施方案中,所述电荷部分可包含带负电荷的氨基酸类似物,如2-氨基己二酸、N-a-(4-氨基笨曱酰基)-L-谷氨酸、亚氨二醋酸、a-曱基-L-天冬氨酸、a-曱基-DL-谷氨酸、y-亚甲基-DL-谷氨酸,和衍生物。在一些实施方案中,所述电荷部分包含寡核苷酸。在一些实施方案中,所述电荷部分包含脱氧核糖核苷酸(DNA)。在一些实施方案中,所述电荷部分包含核糖核芬酸(RNA)。在一些实施方案中,所述电荷部分包含DNA和RNA的组合。在一些实施方案中,所述电荷部分包含寡核苷酸类似物。所述寡核苷酸类似物可以是核苷酸碱基聚合物或寡聚物,其中所述核苷酸碱基通过包含一个或多个糖磷酸类似物的糖磷酸骨架连接。通常的糖磷酸类似物包括但不限于糖烷基膦酸酯、糖亚磷酰胺、糖烷基-或取代垸基磷酸三酯、糖磷硫酰、糖二疏代磷酸酯、糖磷酸酯和糖磷酸酯类似物,其中所述糖不是2,-脱氧核糖或核糖,核普酸碱基聚合物具有带正电荷的糖-胍基链接。在一些实施方案中,所述电荷部分包含寡核苷酸模拟物。所述寡核苷酸模拟物可以是核苷酸碱基聚合物或寡聚物,其中一个或多个骨架糖磷酸键用糖磷酸类似物取代。在一些实施方案中,电荷部分包含带正电荷的聚酰胺骨架,例如烷基胺侧链。在一些实施方案中,电荷部分包含带负电荷的聚酰胺骨架。在一些实施方案中,所述电荷部分包含不带电荷的聚酰胺骨架。非限制性的例子包括吗啉代-磷酰胺酯骨架、基于肽的核酸模拟物骨架、氨基曱酸酯骨架、酰胺骨架、曱基羟基胺骨架、3,-硫曱缩醛骨架和氨基磺酸酯骨架。在一些实施方案中',电荷部分包含肽核酸(PNA),其中所述核苷酸碱基通过氨基键连接。在一些实施方案中,所述电荷部分包含肽。在一些实施方案中,所迷肽可包含酶或试剂的底物。在一些实施方案中,所述肽的长度等于或小于30个氨基酸残基、25个残基、20个残基、15个残基、10个残基或5个残基。在另一实施方案中,所述肽的长度范围为2至30个残基,或2至25个残基,或2至20个残基,或2至15个残基,或2至10个残基,或2至5个残基,或5至30个残基,或5至25个残基,或5至20个残基,或5至15个残基,或5至10个残基,或10至30个残基,或10至25个残基,或10至20个残基,或10至15个残基。在又一实施方案中,所述肽片段含有至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基。如下所描述的,在一些实施方案中,所述电荷部分可以包含酶或试剂的底物。5.6电荷平衡分子电荷平衡分子可以促进或促使胶束形成。通常,所述电荷平衡分子包含足以促进或促使胶束形成的与所述疏水分子相反的电荷。例如,如果所述疏水分子包含一个或多个带电荷的化学基团(即电荷部分和染料部分),则这些基团的存在可使所述胶束中的疏水分子不稳定,从而促进了所述疏水分子在缺乏特定酶时从所述胶束释放。通过加入包含足以促进或促使胶束形成的与所述疏水分子相反电荷的电荷平衡分子,可以防止或最小化带电荷的疏水分子从所述胶束的释放。在一些实施方案中,所述疏水分子可以是带负电荷的,且所述电荷平衡分子可以是带正电荷的。在一些实施方案中,所述疏水分子可以是带正电荷的,且所述电荷平衡分子可以是带负电荷的。因此,通过加入电荷平衡分子,可以在所述疏水分子中去稳定化学基团存在下形成胶束。通过加入适当数目的带负电荷和带正电荷的基团,可以将所述电荷平衡分子设计为具有净负电荷或净正电荷。例如,为建立净正电荷(即,净电荷+2),可以将所述电荷平衡分子设计为含有带正电荷的基团,或者比带负电荷的基团更多数目的带正电荷的基团。为建立净负电荷(即,净电荷—2),可以将所述电荷平衡分子设计为含有带负电荷的基团,或者比带正电荷的基团更多数目的带负电荷的基团。在设计电荷平衡分子时,所述净电荷部分地取决于包括所述疏水分子的电荷在内的许多因素。例如,在一些实施方案中,所述疏水分子包含荧光染料和电荷部分,两者都包含一个或多个能够去稳定或防止胶束形成的带电荷的化学基团。通过加入包含足够的与所述疏水分子相反的电荷的电荷平衡分子,可以促进或促使胶束的形成。因此,所述电荷平衡分子的净电荷部分地取决于疏水分子包含的带电荷的基团的存在。所述电荷平衡分子的总电荷还部分地取决于其他因素,例如所述疏水分子与所述电荷平衡分子的摩尔比、所述测定介质的pH和所述测定介质的盐浓度。电荷平衡分子与疏水分子的摩尔比可以是能够促进或促使胶束形成的任何比例。在一些实施方案中,所述电荷平衡分子与疏水分子的摩尔比为约1:1。在其他实施方案中,所述电荷平衡分子与疏水分子的摩尔比为约9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1。在其他实施方案中,所述电荷平衡分子与疏水分子的摩尔比为约1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2。作为具体实施例,如果所述疏水分子的净电荷是+2,则等摩尔比的净电荷为—2的电荷平衡分子可用以促进或促使胶束形成。在其他实施方案中,如果所述疏水分子的净电荷是+2,则净电荷为-1的电荷平衡分子可以以1:2(疏水分子比电荷平衡分子)的摩尔比用以促进或促使胶束形成。作为另一具体实施例,如果所述疏水分子的净电荷是—5,则非等摩尔比的净电荷为+18的电荷平衡分子可用以促进或促使胶束形成。影响所述电荷平衡分子的电荷的另一因素是所述测定介质的pH和包含所述电荷平衡分子的基团的pKa。例如,在一些实施方案中,如果所述电荷平衡分子被设计成在pH7.6下携带正电荷,则可以选择带有pKa高于7.6的侧链的氨基酸,即赖氨酸(pKa10.5)和精氨酸(pKa12.5),以在pH7.6下携带正电荷。在一些实施方案中,如果所述电荷平衡分子被设计成在pH7.6下携带负电荷,则可以选择带有pKa低于7.6的侧链的氨基酸,即天冬氨酸(pKa3.9)和谷氨酸(pKa4.3),以在pH7.6下携带负电荷。普通氨基酸在不同pH下的pKa值显示于表3。_表31<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>iGarerett,R.H.和GrishamM.Biochemistry第二版(1999)SaundersCollege出版。pKa值取决于温度、离子强度和可电离基团的孩"不境。电荷平衡分子包含任何能够携带电荷的基团。基团的非限制性实例包括金属离子、伯胺、肿胺、叔胺、铵基、金属离子、氨基酸、肽、蛋白质、寡核苷酸及它们的组合。在一些实施方案中,所述电荷平衡分子包含金属离子。能够使用的金属离子的非限制性实例包括镁、锰、镧及它们的任何组合。在一些实施方案中,所述电荷平衡分子包含寡核苷酸。在一些实施方案中,所述电荷平衡分子包含脱氧核糖核苦酸(DNA)。在一些实施方案中,所述电荷平衡分子包含核糖核香酸(RNA)。在一些实施方案中,所述电荷平衡分子包含DNA和RNA的组合。在一些实施方案中,所述电荷平衡分子包含寡核香酸类似物。所述寡核苷酸类似物可以是核苷酸碱基聚合物或寡聚物,其中所述核苦酸碱基通过包含一个或多个糖磷酸类似物的糖磷酸骨架连接。通常的糖磷酸类似物包括但不限于糖烷基膦酸酯、糖亚磷酰胺、糖烷基或取代烷基磷酸三酯、糖磷疏酰、糖二硫代磷酸酯、糖磷酸酯和糖磷酸酯类似物,其中所述糖不是2,-脱氧核糖或核糖,核苦酸碱基聚合物具有带正电荷的糖-胍基链接。在一些实施方案中,所述电荷平衡分子包含寡核苷酸模拟物。所述寡核苷酸模拟物可以是核苦酸碱基聚合物或寡聚物,其中一个或多个骨架糖磷酸键用糖磷酸类似物取代。在一些实施方案中,电荷平衡分子包含带正电荷的聚酰胺骨架,例如烷基胺侧链。在一些实施方案中,电荷平衡分子包含带负电荷的聚酰胺骨架。在一些实施方案中,所述电荷平衡分子包含不带电荷的聚酰胺骨架。非限制性的例子包括吗啉代-氨基磷酸酯骨架、基于肽的核酸模拟物骨架、氨基曱酸酯骨架、酰胺骨架、甲基羟基胺骨架、3,-硫甲缩醛骨架和氨基磺酸酯骨架。在一些实施方案中,所述电荷平衡分子包含肽核酸(PNA),其中所述核苷酸碱基通过氨基键连接。在一些实施方案中,所述电荷平衡分子包含带电荷的氨基酸或氨基酸类似物。在一些实施方案中,所述电荷平衡分子包含带正电荷的氨基酸,如精氨酸和赖氨酸。在一些实施方案中,所述电荷平衡分子可包含带正电荷的氨基酸类似物,如N-co,cD-二曱基-L-精氨酸、a-甲基-DL-鸟氨酸、N-co-硝基-L-精氨酸,和书f生物。在一些实施方案中,所述电荷平衡分子包含带负电荷的氨基酸,如天冬氨酸和谷氨酸。天冬氨酸和谷氨酸含有具有单个负电荷的羧基側链。半胱氨酸的pKa约为8,所以其在pH高于8时携带完全的负电荷。在一些实施方案中,所述电荷平衡分子包含磷酸化的氨基酸或类似物。例如,磷酸丝氨酸残基在磷酸基团上携带两个负电荷。在一些实施方案中,所述电荷部分可包含带负电荷的氨基酸类似物,如2-氨基己二酸、N-a-(4-氨基苯曱酰基)-L-谷氨酸、亚氨二醋酸、a-曱基-L-天冬氨酸、a-曱基-DL-谷氨酸、y-亚曱基-DL-谷氨酸,和衍生物。在一些实施方案中,所述电荷平衡分子可进一步包含不带电荷的氨基酸,例如丙氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和缬氨酸。在一些实施方案中,电荷平衡分子包含不带电荷的氨基酸类似物。适当的例子包括2-氨基-4-对氟苯曱酸、2-氨基-3-曱氧苯甲酸,3,4-二氨基苯甲酸、4-氨曱基-L-苯丙氨酸、4-溴-L-苯丙氨酸、4-氰-L-脯氨酸、3,4,-二羟基-L-苯丙氨酸、乙基-L-酪氨酸、7-氮杂色氨酸、4-氨马尿酸、2-氨基-3-胍基丙酸、L-瓜氨酸,和衍生物。在一些实施方案中,所述电荷平衡分子可以包含肽。在一些实施方案中,所述肽可包含酶或试剂的底物。在一些实施方案中,所述肽的长度等于或小于30个氨基酸残基、25个残基、20个残基、15个残基、10个残基或5个残基。在另一实施方案中,所述肽的长度范围为2至30个残基,或2至25个残基,或2至20个残基,或2至15个残基,或2至10个残基,或2至5个残基,或5至30个残基,或5至25个残基,或5至20个残基,或5至15个残基,或5至10个残基,或10至30个残基,或10至25个残基,或10至20个残基,或10至15个残基。在又一实施方案中,所述肽片段含有至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基。在一些实施方案中,电荷平衡分子可以包含肽E-E-I-Y-G-E-F(SEQIDNO:l)。在一些实施方案中,电荷平衡分子可以包含肽K-K-A-A-G-K-L(SEQIDNO:2)。在一些实施方案中,所述电荷平衡分子包含带电荷的蛋白质。在这些实施方案中,所述带电荷的蛋白质的浓度比样品中内源性带电荷的蛋白质的浓度高约2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。在一些实施方案中,所述电荷平衡分子带电荷的蛋白质和所述样品中的内源性带电荷的蛋白质是相同的蛋白质。在一些实施方案中,所述电荷平衡分子带电荷的蛋白质和所述样品中的内源性带电荷的蛋白质是不同的蛋白质。能够使用的带电荷的蛋白质的非限制性实例包括髓磷脂碱性蛋白(MBP)、髓磷脂P2蛋白和酪蛋白。在一些实施方案中,所述胶束可以包含超过一个电荷平衡分子。可以使用能够促进或促使胶束形成的电荷平衡分子的任何组合。在一些实施方案中,所述胶束可以包含含有相同的能够携带电荷的基团的电荷平衡分子。在一些实施方案中,所述胶束可以包含含有不同的能够携带电荷的基团的电荷平衡分子。例如,在一具体实施方案中,所述胶束可以包含含有金属离子的电荷平衡分子,和含有蛋白质的电荷平衡分子。5.7底物所述疏水分子和/或电荷平衡分子包含可受酶或试剂作用的底物或推定底物。在一些实施方案中,所述任选的电荷部分包含酶底物。在一些实施方案中,所述疏水分子和/或电荷平衡分子可各自独立地包含感兴趣的酶或试剂的底物或推定底物。在一些实施方案中,所述疏水分子和电荷平衡分子同时包含相同的底物。在一些实施方案中,所述疏水分子包含一种底物。在一些实施方案中,所述疏水分子包含2、3、4或更多种底物,其中所述底物可以是相同的或不同的。所述底物可以以任何允许其行使其各自功能的方式连接。在一些实施方案中,所述底物可彼此直接连接。在其他实施方案中,所述底物可通过一个或多个键基团彼此间接连接。而在其他实施方案中,所述底物可通过染料部分或疏水部分彼此间接连接。在一些实施方案中,所述电荷平衡分子包含一种底物。在一些实施方案中,所述电荷平衡分子包含2、3、4或更多种底物,其中所述底物可以是相同的或不同的。所述底物可以以任何允许其行使其各自功能的方式连接。在一些实施方案种,所述底物可彼此直接连接。在其他实施方案中,所述底物可通过一个或多个键基团彼此间接连接。而在其他实施方案中,所述底物可通过染料部分;f皮此间接连接。在一些实施方案中,所述电荷平衡分子包含一种底物。在一些实施方案中,所述疏水分子包含2、3、4或更多种底物,其中所述底物可以是相同的或不同的。所述底物可以以任何允许其行使其各自功能的方式连接。在一些实施方案种,所述底物可彼此直接连接。在其他实施方案中,所述底物可通过一个或多个键基团彼此间接连接。而在其他实施方案中,所述底物可通过染料部分彼此间接连接。底物可以包括可受特定酶或试剂作用的底物或推定底物。可以使用作用于所述底物/胶束的任何类型的酶或化学反应,只要其能够生成可测定的荧光变化(例如,增加)。优选地,所述特定酶在所述胶束和所述测定介质之间的界面是基本有活性的。作用于所述底物的特定酶或化学反应的选择可部分地取决于所述疏水分子和/电荷平衡分子的结构以及其他因素。在一些实施方案中,所述酶或试剂作用于所述底物以切割所述底物。在这些实施方案中,所述底物包含可由化学试剂或切割酶切割的切割位点。作为具体实施例,所述底物可包含可由脂酶、磷脂酶、肽酶、核酸酶或糖普酶切割的切割位点。所述底物可进一步包含促进所述切割酶的特异性、亲和力和/或动力学的其他残基和/或特征。4艮据所述特定切割酶的要求,这种切割酶"识别部分"可包含所述切割位点,或者,所述切割位点可外延至所述识别部分。例如,某些内切核酸酶在^^皮所述内切核酸酶结合的核酸分子的上游或下游区域的位置上切割。所述底物的化学组成将尤其依赖于所述切割酶的要求。例如,如果所述切割酶是蛋白酶,则所述底物可包含由特定蛋白酶识别和切割的肽(或其类似物)。如果所述切割酶是核酸酶,所述底物可包含由特定核酸酶识别并切割的寡核苷酸(或其类似物)。如果所述切割酶是磷脂酶,则所述底物部分可包含由特定磷脂酶识别并切割的二酰基甘油磷酸基团。由各种不同类型的切割酶所识别并切割的序列和结构是公知的。任何这些序列和结构可包含所述底物。尽管所述切割可以是序列特异性的,但在一些实施方案中,其可以是非特异性的。例如,可通过使用非序列特异性核酸酶例如核^t核酸酶实现所述切割。由相应切割酶对所述底物的切割可从所述胶束释放荧光染料,减少或消除了其淬灭,并导致荧光的可测定的增加。在其他实施方案中,所述酶或试剂通过对所述底物的化学部分的添加、删除或取代而作用于所述底物。这些反应可使所述胶束中的疏水分子和/或电荷平衡分子不稳定,从而促进其从所述胶束释放。作为具体实施例,在一些实施方案中,所述酶或试剂作用于所述底物以改变所述底物的净电荷,例如通过由激酶对一个或多个未磷酸化的残基磷酸化,或者由磷酸酶对一个或多个磷酸化的残基去磷酸化。下面更详细描述了可^皮蛋白激酶和磷酸酶修饰的底物的具体实例。通过说明,下面首先根据作为待检测、定量和/或表征的示例性酶的蛋白激酶讨论了所述底物。蛋白激酶除了起重要的生物化学作用,还可用于说明通过添加磷酸基至羟基以形成磷酸化底物而导致底物净电荷增加的酶。在生理条件下,即pH6至pH9,所述底物的磷酸化导致增加两个负电荷,为—2电荷的净变化。还讨论了实现相反反应的酶,即蛋白质磷酸酶,所述酶在生理条件下,即pH6至pH9,导致所述底物中+2电荷的净增加。在任一情况下,所述底物净电荷的幅值增加。例如,如上所述底物磷酸化后,所述底物的净负电荷的幅值增加了—2。另一方面,底物通过磷酸酶去磷酸化后,所述底物的净正电荷的幅值增加了+2。在一些实施方案中,提供了用于检测、定量和/或表征样品中一种或多种蛋白激酶的底物。所述蛋白激酶底物一般包括含有能够被蛋白激酶磷酸化的基团的氨基酸侧链。在一些实施方案中,所述可磷酸化的基团是羟基。通常,所述羟基作为侧链的一部分于酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基中被提供,但可以使用含有可磷酸化的羟基的任何其他天然或非天然氨基酸侧链或其他实体。可磷酸化的基团还可以是氮原子,例如赖氨酸的s氨基中的氮原子、组氨酸的咪唑氮原子或精氨酸的胍基氮原子。可磷酸化的基团还可以是天冬氨酸或谷氨酸残基中的羧基。所述蛋白激酶底物可进一步包括含有一个或多个亚基或残基(除了所述可磷酸化的残基)的片段,通常为多肽片段,所述亚基或残基赋予所述底物以识别特征,以使其符合用于待检测、定量和/或表征的蛋白激酶的特异性底物。在过去几十年已经表征了许多种蛋白激酶,并已经识别了许多类(参见,例如,S.K.Hanks等,Science241:42-52(1988);B.E.Kemp和R.B.Pearson,TrendsBiochem.Sci.15:342-346(1990);S.S.Taylor等,Ann.Rev.CellBiol.8:429-462(1992);Z.Songyang等,CurrentBiology4:973-982(1994);和Chem.Rev.101:2209-2600,"ProteinPhosphorylationandSignaling"(2001))。示例性的几类蛋白激酶包括cAMP依赖性蛋白激酶(也称为蛋白激酶A家族、A蛋白质或PKA)、cGMP依赖性蛋白激酶、蛋白激酶C酶(PKC,包括由二酰基甘油活化的钩依赖性PKC)、Ca"/钩调节素依赖性蛋白激酶I或II、蛋白质酪氨酸激酶(例如,PDGF受体、EGF受体和Src)、有丝分裂原激活蛋白(MAP)激酶(例如,ERK1、KSS1和MAP激酶I型)、周期素依赖性激酶(CDk,例如,Cdk2和Cdc2)和受体丝氨酸激酶(例如,TGF-(3)。下面表4显示了用于各种蛋白激酶的示例性共有序列和/或酶底物。本领域技术人员应理解,这些不同的共有序列和酶底物可用以设计蛋白激酶识别部分,所述识别部分具有希望的针对特定激酶和/或激酶家族的特异性。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>表4<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>a参见,例i口,B.E.Kemp和R.B.Pearson,TrendsBiochem.Sci.15:342-346(1990);Z.Songyang等,CurrentBiology4:973-982(1994);J.A.Adams,ChemRev.101:2272(2001)及其引用的参考文献;X表示任何氨基酸残基,"/"表示替代残基;且Z是疏水氨基酸,例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸bGraff等,J.Biol.Chem.266:14390-14398(1991)CLee等,Proc.Natl.Acad.Sci.91:6413-6417(1994)dStokoe等,Biochem.J.296:843-849(1993)。还可以设计具有希望的针对特定激酶和/或激酶家族的特异性的蛋白激酶底物,例如,使用Brinkworth等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA100(l):74-79(2003)中描述的方法和/或示例性序列。通常,所述蛋白激酶底物包括L氨基酸残基的序列。然而,也可以使用许多种具有不同骨架或侧链结构的氨基酸的任何一种,例如D-裊4基酸或硫酰基的烷基骨架部分、羟基酸酯(相当于用酯键取代酰胺键)、用氮取代a碳以生成氮杂类似物、加入氨基甲酸酯基团的烷基骨架部分、聚乙烯亚胺(PEI),和氨基醛,其生成由仲胺组成的聚合物。更详细的骨架名单包括N-取代的酰胺(-CON(R)-取代-CONH-键)、酯(-COr)、亚甲基酮(-COCH2-)亚曱基胺(-CH2NH-)、硫酰胺(-CSNH-)、亚膦酸酯(-P02RCH2-)、磷酰胺和磷酰胺酯(-P02RNH2)、逆肽(retrop印tide,-NHC(O)-)、反式烯烃(-CR-CH-)、氟代烯烃(例如,-CF=CH-)、二亚甲基(-CH2CH2-)、硫醚(例如,-CH2SCH2-),羟亚乙基(-CH(OH)CH2-)、亚甲基氧(-0120-)、四唑(-CHr)、逆硫酰胺(retrothioamide,-NHC(S)-)、逆还原的(retroreduced,-NHCH2-)、硫酰胺基(-S02NH-)、亚曱基硫酰胺基(-CHRS02NH-)、逆硫酰胺基(retrosulfonamide,"NHS(02)-)和类肽(N-取代的甘氨酸),以及具有丙二酸酯和/或偕二氨基烷基亚基的骨架,例如,如M.D.Fletcher等,Chem.Rev.98:763(1998)及其引用的参考文献所综述的。还可以使用类肽骨架(N取代的甘氨酸)(例如,H.Kessler,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.32:543(1993);R.N.Zuckermarm,Chemtracts画Macromol.Chem.4:80(1993);和Simon等,Proc.Natl.Acad.Sci.89:9367(1992))。在一些实施方案中,蛋白激酶底物包括所有包含给定蛋白激酶识别序列的残基。包含所述识别序列的残基的总数目可定义为iV,其中iV是从1至100的整数。在一些实施方案中,W是从1至15的整数。在其他实施方案中,W是从l至20的整数。作为这些实施方案的具体实施例,PKA的共有识别序列是-R-R-X-S/T-Z,因此iV-5。所述识别序列重复2、3或4或更多次可用以提供包含2、3、4或更多个未磷酸化残基的蛋白激酶底物。在其他实施方案中,所述蛋白激酶底物包含重叠的识别序列。在这些实施方案中,来自识别序列的一个或多个残基在两个识别序列间共有。作为这些实施方案的具体实施例,p38pl1的共有识别序列是P-X-S-P。可通过在两个识别序列间共有-P-残基而产生具有重叠的共有序列的识别部分,例如P-X-S-E-X-S-P。在其他实施方案中,所述蛋白激酶底物可包括包含所述识别序列的残基的亚型。在这些实施方案中,一个或多个残基从所述识别基序略去。亚型在本文定义为包含AA-w氨基酸残基,其中如上所定义的,7V代表包舍所述识别序列的氨基酸残基的总数目,w代表从所述识别序列略去的氨基酸残基的数目。在一些实施方案中,w是从l至9的整数。在其他实施方案中,w是从l至14的整数。而在其他实施方案中,u是从l至19的整数。例如,如果所述识别基序中的氨基酸总数为4,则可生成包含3、2或1个氨基酸残基的亚型。如果所述识别基序中氨基酸总数为5,则可生成包含4、3、2或l个氨基酸残基的亚型。如果所述识别基序中氨基酸总数为6,则可生成包含5、3、2或1个氨基酸残基的亚型。如果所述识别基序中氨基酸总数为7,则可生成包含6、5、4、3、2或1个氨基酸残基的亚型。如果所述识别基序包含8个氨基酸,则可生成包含7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基的亚型。如果所述识别基序中氨基酸总数为9,则可生成包含8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基的亚型。如果所述识别基序包含10个氛基酸,则可生成包含9、8、7、6、5、4、3、2或1个氛基酸残基的亚型。通常,生成包含AM或iV-2个氨基酸残基的亚型。在所述识别序列中包含的残基的数目部分地取决于所述蛋白激酶的特异性。例如,一些蛋白激酶,例如p3印n,需要所有包含所述识别序列的残基存在,用于发生磷酸化作用。其他蛋白激酶,例如PKC,可以磷酸化识别序列,其中一个或多个残基从所述识别序列略去。在其他实施方案中,设计包含未磷酸化的残基的识别序列用于蛋白激酶,例如GSK3,其需要磷酸化的残基以磷酸化一个或多个未磷酸化的残基。前述实施方案的各种组合可用于本文描述的组合物和方法。例如,可以选择用于给定蛋白激酶的包含识别部分的激酶底物,所述识别部分包括包含iV个残基的识别序列。在其他实施方案中,可以选择包含识别部分的激酶底物,其中一个识别序列包含iV个残基,且其他识别序列包含iV-w个残基。因此,可以使用包含具有W和iV-w个识别序列的任何组合的识别部分的底物化合物,条件是当所述蛋白激酶存在时有荧光的可测定的增加。而且,所述识别部分可用于同样的蛋白激酶,或者其可用于不同的蛋白激酶。未磷酸化的残基之间的距离部分地取决于各选定的识别序列中未磷酸化的残基的位置,且部分地取决于选定的识别序列的连接方式。能够被蛋白激酶磷酸化的未磷酸化的残基可以是相邻的,或者其可以被l、2、3或多个不被蛋白激酶磷酸化的残基分开。例如,可通过连接两个识别序列而形成其中未磷酸化的残基由3个残基分开的底物化合物,所述两个识别序列各自包含识别序列-s-x-x-x-以形成具有组分-s-x-x-x-s-x-x-x-的识别部分。在另一实施例中,可通过在两个识别序列之间共有氨基酸残基而形成其中未磷酸化的残基由2个残基分开的底物化合物,例如,可共有识别序列-P-X-S-P-中的-P-以形成识别部分-P-X-S-P-X-S-P-。因此,W和7V-w个识别序列的任何组合可用于所述激酶底物,其中所述未磷酸化的残基是相邻的或由一个或多个残基分开,条件是所述蛋白激酶存在时观察到荧光的增加。所述蛋白激酶识别序列可以以任何允许其行^使其各自功能的方式连接。在一些实施方案中,所述蛋白激酶识别序列可彼此直接连接。在其他实施方案中,所述蛋白激酶识别序列可通过一个或多个键基团彼此间接连接。而在其他实施方案中,所述蛋白激酶识别部分可通过荧光部分或疏水部分彼此间接连接。在一些实施方案中,所述电荷平衡分子包括激酶底物。在一些实施方案中,所述激酶底物可以是全蛋白,例如,髓磷脂碱性蛋白。在一些实施方案中,髓磷脂碱性蛋白受选自以下的激酶作用PKA、PKC、MAPK、钙调节素依赖性蛋白激酶、磷酸化酶激酶、Rafl、MEK、MEKK及它们的任何组合。在另一方面,提供了用于检测、定量和/或表征样品中一种或多种蛋白磷酸酶的底物。而且,所述磷酸酶可以是候选石舞酸酶,以及用以确认和/或表征所述候选的^f岸酸酶活性的方法。已经识别了许多种蛋白磷酸酶(例如,参见P.Cohen,ANN.REV.BIOCHEM.58:453-508(1989);MOLECULARBIOLOGYOFTHECELL,第3版,Alberts等编辑,Garland出版,NY(1994);和CHEM.REV.101:2209-2600,"ProteinPhosphorylationandSignaling"(2001))。丝氨1苏氨酸蛋白质磷酸酶代表逆转蛋白质激酶作用的一大类酶,例如PKA。丝氨酸/苏氨酸蛋白质磷酸酶已经被分为四个基团,命名为I、IIA、IIB和IIC。蛋白质酪氨酸激酶也是一类重要的磷酸酶。组氨酸、赖氨酸、精氨酸和天冬氨酸磷酸酶也是已知的(例如,PJ.Kennelly,CHEMREV.101:2304-2305(2001)及其引用的参考文献)。在一些情况下,磷酸酶仅对一种或几种蛋白质是高度特异性的,但在其他情况下,磷酸酶是相对非特异性的并可以作用于大范围的蛋白质靶。可以被磷酸酶去磷酸化的肽序列的例子在前述的P丄Kennelly中有所描述。可以将所述底物设计为与特定磷酸酶或一组磷酸酶具有反应性。所述磷酸酶识别序列中未磷酸化的残基可以是能够^支磷酸酶去磷酸化的任何基团。在一些实施方案中,所述残基是磷酸酪氨酸残基。在一些实施方案中,所述残基是磷酸丝氨酸残基。在一些实施方案中,所述残基是磷酸苏氨酸残基。磷酸酶识别部分可进一步包括含有一个或多个亚基或残基(除了所述可去磷酸化的残基)的片段,通常为多肽片段,所述亚基或残基赋予所述识别位点以识别特征,以使其符合用以修饰信号分子的蛋白磷酸酶的底物特异性。蛋白激酶或磷酸酶识别部分可包含多肽片段,所述多肽片段含有将被磷酸化或去磷酸化的基团或残基。在一些实施方案中,这种多肽片段的多肽长度等于或少于30个氨基酸残基、25个残基、20个残基、15个残基、10个残基或5个残基。在另一实施方案中,所述多肽片段的多肽长度范围是3至30个残基,或3至25个残基,或3至20个残基,或3至15个残基,或3至10个残基,或3至5个残基,或5至30个残基,或5至25个残基,或5至20个残基,或5至15个残基,或5至10个残基,或10至30个残基,或10至25个残基,或10至20个残基,或10至15个残基。而在另一实施方案中,所述多肽片段含有至少3、4、5、6或7个氨基酸残基。除了具有一个或多个能够被去磷酸化的磷酸化的残基外,所述磷酸酶底物可以包括其他氨基酸残基(或其类似物),其促进结合特异性、亲和力和/或经由磷酸酶的去磷酸化速率。如上所述关于示例性蛋白激酶共有序列,可以设计具有希望的针对特定磷酸酶和/或磷酸酶家族的特异性的磷酸酶底物,条件是至少一个残基被磷酸化。待检测或表征的磷酸酶可以是现有技术已知的任何磷酸酶。在一些实施方案中,所述磷酸酶(phosphate)可以是磷酸酶2C、碱性磷酸酶或酪氨酸磷酸酶。在一些实施方案中,提供了用于检测或表征样品中一种或多种石危酸酯酶的底物。已经识别了许多种疏酸酯酶。在一些情况下,硫酸酯酶仅对一种或几种底物是高度特异性的,但在其他情况下,硫酸酯酶是相对非特异性的并可以作用于大范围的底物,包括但不限于蛋白质、葡萄糖胺聚糖、硫脂和类固醇硫酸酯。下表5中显示了示例性硫酸酯酶和硫酸酯酶底物。这些底物可用以设计具有希望的针对特定疏酸酯酶和/或碌b酸酯酶家族的特异性的硫酸酯酶识别部分。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>可以将疏酸酯酶底物设计为与特定硫酸酯酶或一组硫酸酯酶有反应性,或者可以设计其用于测定底物特异性和其他催化特征,例如测定kcat或Km值。在硫酸酯识别部分中的疏酸酯可以是能够被硫酸酯酶脱硫的任何基团。所述石克酸酯酶底物部分除了具有一个或多个能够被脱>5危的硫酸酯外,还可以包括其他基团,例如促进结合特异性、亲和力和/或经由硫酸酯酶的脱硫速率的氨基酸残基(或其类似物)。在一些实施方案中,提供了用于检测、定量和/或表征样品中一种或多种蛋白质肽酶的肽酶底物。在其他实施方案中,所述肽部分可被_没计为与特定肽酶或一组肽酶有反应性。肽酶是催化肽键水解的水解酶类的酶亚类的任何成员。一般,肽酶分为只接近多肽链末端肽起作用的肽链端解酶和在多肽链内部起作用的肽链内切酶。待检测的所述肽酶可以是本领域已知的任何肽酶。另外,所述肽酶可以是候选肽酶,以及用以证实和/或表征所述候选的肽酶活性的方法。已经识别了许多种肽酶。一般,根据肽酶的催化机制将其分为1)丝氨酸肽酶(例如糜蛋白酶和胰蛋白酶);2)半胱氨酸肽酶(例如木瓜蛋白酶);3)天冬氨酸肽酶(例如胃蛋白酶);和4)金属肽酶(例如嗜热蛋白酶)。在一些情况下,肽酶仅对一种或几种蛋白质是高度特异性的,但在其他情况下,肽酶是相对非特异性的并可以作用于大范围的蛋白质靶。因此,通过适当选择肽酶底物部分,可以i殳计组合物用于检测特定肽酶。下面表6显示了示例性肽酶和优选的切割位点,由"+,,表示。这些不同的切割位点可用以设计具有希望的针对特定肽酶和/或肽酶家族特异性的肽酶底物部分。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>Xaa-指任何氨基酸可以将肽酶底物设计为与特定肽酶或一组肽酶有反应性,或者可以"i殳计其用于测定底物特异性和其他催化特征,例如测定kcat或Km值。所述肽酶底物部分除了具有一个或多个能够被水解的肽键外,还可以包括其他促进结合特异性、亲和力和/或经由肽酶的水解速率的氨基酸残基(或其类似物)。5.8方法本文描述的组合物在检测、定量和/或表征生物学、医学和工业应用中的酶和试剂中具有许多种用途。所述方法一般包括使用一种组合物检测、定量和/或表征样品中的酶,所述组合物包括(i)包含疏水部分、染料部分和任选的电荷部分的疏水分子;和(ii)一种或多种电荷平衡分子。在一些实施方案中,所述电荷平衡分子可以是相同的。在一些实施方案中,所述电荷平衡分子可以是不同的。在一些实施方案中,所述疏水分子和/物。在一些实施方案中,所述任选的电荷部分包含酶底物。在一些实施方案中,所述疏水分子和电荷平衡分子都包含相同的底物。在一些实施方案中,所述疏水分子和电荷平衡分子包含不同的底物。在一些实施方案中,所述方法包括以下步骤(i)在有效允许所述酶或试剂(当存在于所述样品中时)以导致所述染料部分生成的信号增加的方式作用于所述底物的条件下,将样品与本文描述的组合物接触;和(ii)检测所述信号,其中所述信号的增加指示了所述样品中所述酶的存在和/或量。被测试的样品可以是由使用者选择的任何适当的样品。所述样品可以是天然存在的或人工制备的。例如,所述样品可以是血液样品、组织样品、细胞样品、口腔样品、皮肤样品、尿样品、水样品或土壤样品。所述样品可来自活体,例如真核生物、原核生物、哺乳动物、人类、酵母或细菌。所述样品可在接触本发明教导内容的底物之前通过本领域已知的任何方法处理。例如,所述样品可经受裂解步骤、沉淀步骤、柱层析步骤、加热步骤等。在一些情况下,所述样品是纯化的或合成制备的酶,其用以筛选或表征酶底物、抑制剂、激活剂或调节剂。如果所述样品含有多种酶,例如同时含有激酶和磷酸酶,以致其中一种的活性可以千扰另外一种的活性,那么钝化剂(例如,活性位点导向的不可逆抑制剂)可被添加至所述样品以钝化任何不希望的活性。所述反应混合物通常包括緩沖剂,例如2000-2001的Sigma目录的"生物学緩冲剂(BiologicalBuffers),,部分中描述的緩沖剂。示例性緩冲剂包括MES、MOPS、HEPES、Tris(Trizma)、W-二(羟乙基)甘氨酸(bicine)、TAPS、CAPS等。所述緩冲剂以足够生成并维持希望的pH的量存在。根据待测酶的活性的pH依赖性和本文描述的各种部分的电荷来选择所述反应混合物的pH。例如,pH可以从2至12、从5至9或从6至8。所述反应混合物还可含有盐、还原剂例如二硫苏糖醇(DTT)和用于酶的任-f可必需辅助因子和/或协同底物(例如,用于蛋白激酶的ATP,用于钩依赖性激酶的Ca2、和用于蛋白激酶A的cAMP)。在一个实施方案中,所述反应混合物不含有去污剂或者基本不含去污剂。在一些实施方案中,可以希望稀释所述待测样品浓度低至非常可能帮助避免掩蔽本文描述的组合物的带电荷的基团。所述待测样品可被稀释至允许荧光的可测定的增加的任何浓度。在一些实施方案中,所述样品可被稀释l、2、5、10、20、30、40或50倍。在一些实施方案中,样品的大于50倍的稀释是希望的。在一些实施方案中,所述样品可以在测定反应混合物中被稀释。在一些实施方案中,可以希望保持离子强度低至非常可能帮助避免掩蔽所述反应产物的带电荷的基团,以使胶束形成保持不利和不稳定。例如,高盐浓度(例如,1MNaCl)可能是不适当的。另外,可以希望避免所述反应混合物中某些其他组分的高浓度,其也可以不利地影响所述产品的荧光性质。关于离子种类例如金属离子的作用的指南可以参见SurfactantsandInterfacialPhenomena,第二版,MJ.Rosen,JohnWiley&Sons,NewYork(1989),特别是第3章。例如,下面提供的实施例中使用了浓度为5mM的Mg"离子,但较高浓度可产生较差的结果。可通过多种方式检测胶束的形成,包括去污剂中分子的荧光滴定法和动态激光散射。另外,通过水冻断裂电子显微镜检查可获得胶束形成和经由添加带电荷的基团的胶束破裂的直接的视觉证据。例如,图1A是包含疏水分子CnOOOK(tet)RQGSFRA-酰胺的胶束的电子显微镜照片。在所述疏水分子中,疏水部分包括碳链(C17),染料部分(tet)经由氨基酸赖氨酸(K)连接至所述疏水部分和任选的连接体。"Tet"是由2,,7,,4,7-四氯-5-羧基荧光素(2,,7,-二氯-5-羧基-4,7-二氯荧光素)提供的荧光部分。OOO代表任选的包含(二)乙烯乙二醇基团的O-间隔区。图1A显示,所述疏水分子能够形成圓柱状或管状胶束(长度200-1000nm且直径20-60nm)、球簇(5-20个胶束)和单个胶束。图1B是包含磷酸化疏水分子CnOOOK(tet)RQGS(p)FRA-酰胺的胶束的电子显微镜照片。所述疏水分子在丝氨酸残基的磷酸化导致增加两个负电荷,为飞电荷的净变化。与所述去磷酸化的疏水分子形成管状胶束相比,所述磷酸化的疏水分子仅形成小球和小球簇(最高达5个胶束)。这些结果显示,去磷酸化的疏水分子形成大的单体聚集物,而磷酸化的疏水分子形成具有少数单体的较小聚集物。因此,添加两个负电荷至所述疏水分子导致了胶束的破裂和解聚。图2是一示例性实施方案,显示了添加带正电荷的MBP(+18)能够淬灭包含CwOOOK(染料2)EEIYGEF-酰胺的疏水分子(-5)的荧光。所述疏水部分是(:16碳链,染料部分(染料2)是通过任选的氨基酸赖氨酸连接至所述疏水部分的5-羧基-2,,7,-联吡啶-砜荧光素,且只是示例性连接体。OOO代表任选的O-间隔区。疏水分子的净负电荷为-5,其中染料2的电荷为-2,且所述带电荷的基团的电荷为-3。当带正电荷的MBP在所述溶液中的浓度增加时,所述带负电荷的疏水分子的相对荧光减少。图2中,MPB以少于1:1的摩尔比添加至所述疏水分子,促进了胶束形成,并从而淬灭所述荧光染料的焚光。MPB以1:1或更高的摩尔比添加至所述疏水分子,促进了胶束形成,并导致所述荧光染料的荧光几乎完全淬灭。虽然无意受任何操作理论的束绰,但相信MPB包括足够促进或促使胶束形成的与所述疏水分子相反的电荷,从而淬灭所述染料部分的荧光。在实施所述方法的某些方面时,疏水分子(或疏水分子与电荷平衡分子)与样品混合,所述样品含有待测的或以底物、抑制剂、激活剂或调节剂活性用于筛选、检测、定量和/或表征一种化合物的酶。所述酶与所述底物的反应导致所述胶束净电荷的绝对幅值的增加(至更多带电荷的种类),以致反应的胶束的荧光强于未反应的胶束的荧光。在一些实施方案中,所述底物与所述酶的反应使所述底物(1)通过(1A)在所述底物上添加或生成新的带负电荷的基团或(1B)去除或封闭所述底物上带正电荷的基团而带净负电荷;或者(2)通过(2A)在所述底物上添加或生成新的带正电荷的基团或(2B)去除或封闭所述底物上带负电荷的基团而带净正电荷。例如,可通过添加磷酸基至所述底物上的羟基(例如使用蛋白激酶,改变中性带电荷的基团成电荷为-2的基团),通过切割羧酸酯或酰胺以生成羧基(例如使用酯酶或酰胺酶,改变中性带电荷的基团成电荷为-1的基团)实现反应(1A)。例如,可通过切割带正电荷的氨基酸,或可通过将所述酶识别部分中的氨基或肼基与乙酰化酶反应以生成中性乙酰酯基团、与N-氧化酶反应以生成中性N-氧化物、与氨裂解酶反应以去除氨或与导致氧化脱氨的氧化酶反应,实现反应(1B)。例如,可通过用酰胺反应(2A)。例如,可通过切割带负电荷的氨基酸,或可通过使用脱羧酶以去除羧酸或通过将羧基与曱基转移酶反应以生成羧酸酯,实现反应(2B)。能够进行这类转化的多种酶是文献已知的(例如,参见C.Walsh,EnzymaticReactionMechanisms,WHFreemanandCo"NewYork,(1979),theWorthington产品目录(Worthington酶),SigmaLifeSciences目录,和其他商品酶供应商的产品目录)。虽然增加的荧光的基础不是确定的,且本发明的发明人不想受特定理论的束缚,但预期本发明教导内容的荧光底物分子和/或电荷平衡分子能够由于所迷疏水部分而在所述反应混合物中形成胶束,以致所述荧光染料由于其紧密接近而相互淬灭。当所述底物分子上的电荷被所述电荷平衡分子上的电荷抵消以致胶束形成不受相互电荷排斥妨碍时,可特别有利于胶束形成。虽然不想受任何操作理论的束缚,但相信在生理pH下的水溶液中,带相反电荷的电荷平衡分子和底物分子之间可形成离子键,且所述离子键促进或促使胶束形成。例如,图2显示,不同浓度的电荷平衡分子MBP的添加,淬灭了25mMTris(pH7.6)中疏水分子d6000K(染料2)EEIYGEF(10pM)的荧光。虽然不想受任何操作理论的束缚,但预期所述荧光疏水分子和电荷平衡分子能够形成胶束,以致所迷荧光染料由于其紧密接近而相互淬灭。在一些实施方案中,所述电荷部分包括肽E-E-I-Y-G-E-F-(SEQIDNO:l),且在约pH7.6下的净电荷为约-3。在一些实施方案中,所述疏水分子包括结构d6000K(染料2)EEIYGEF-酰胺,其中所述疏水部分是C16碳链,OOO代表任选的O-间隔区,且染料2是5-羧基-2,,7,-联吡啶-砜焚光素。在该示例性实施方案中,所述焚光部分5-羧基-2,,7,-联吡咬-砜荧光素通过氨基酸赖氨酸(K)连接至所述疏水部分和任选的连接体。本领域技术人员应理解,所描述的赖氨酸只是示例性连接体。在一些实施方案中,所述电荷部分包括肽K-K-A-A-G-K-L(SEQIDNO:2),且在约pH7.6下的净电荷为约+3。在一些实施方案中,所述疏水分子包括结构d6000K(染料2)KKKKAAGKL-酰胺,其中所述疏水部分是(:16碳链,OOO代表任选的O-间隔区,且染料2是5-羧基-2,,7,-联吡啶-砜荧光素。在该示例性实施方案中,所述焚光部分5-羧基-2,,7,-联吡啶-砜荧光素通过氨基酸赖氨酸(K)连接至所述疏水部分和4壬选的连4矣体。本领域技术人员应理解,所描述的赖氨酸只是示例性连接体。为了有效,不仅要包含疏水分子和电荷平衡分子的复合物与所述酶反应以生成希望的修饰产物,而且所述产物应比包含所述疏水分子和电荷平衡分子的所述化合物荧光性更强,以便可以观察到焚光的可测定的增加。一般,较大的焚光变化提供较大的测定灵敏度,条件是达到足够低的信噪比。因此,可希望测试多个疏水分子和电荷平衡分子,以寻找具有最合适的荧光性质的复合物。本文描述的组合物用于检测酶。图3A-C显示了使用疏水分子CwOOOK(染料2)EEIYGEF-酰胺和电荷平衡分子、髓磷脂碱性蛋白以及0或100pMATP,对PKCpiI、MAP激酶1/Erkl和MAP激酶2/Erk2的实时激酶测定。添加所述酶至包含所述疏水分子和电荷平衡分子的胶束,致使一段时间后焚光增加4倍。本7>开内容不仅涉及4企测酶,而且涉及包括以下的方法(1)筛选和/或定量样品中的酶活性,(2)测定关于选定的底物的酶或酶混合物的kcat和/或Km,(3)检测、筛选和/或表征酶的底物,(4)检测、筛选和/或表征酶活性的抑制剂、激活剂和/或调节剂,和(5)测定选定的酶的底物特异性和/或底物共有序列或底物共有结构。例如,在筛选酶活性中,将含有或可含有特定酶活性的样品与本发明教导内容的底物混合,并测定荧光以确定是否发生了荧光增加。可在多孔或多反应板或装置中对多个样品同时进行筛选,以提高处理速率。可通过例如Fersht,EnzymeStructureandMechanism.第二版,W.H.FreemanandCo.,NewYork,(1985)中所述的标准方法测定kcat和Km。在一些实施方案中,所述反应混合物可包含两种或更多种不同的酶。这可以用于例如同时筛选多种酶,以确定酶是否具有特定酶活性。可通过将酶与具有不同底物部分的不同底物分子反应测定酶的底物特异性,并可根据焚光的增加测定所述酶对所述底物的活性。例如,通过将酶与具有几种不同的蛋白激酶识别部分的几种不同底物分子反应,可制备激酶的优选底物的共有序列。在一些实施方案中,本文描述的组合物可用于表征酶的KmATP。图4A-C显示了使用疏水分子d6000K(染料2)EEIYGEF-酰胺和电荷平衡分子、髓磷脂碱性蛋白以及增加浓度的0-500ATP,PKCPII、MAP激酶1/Erkl和MAP激酶2/Erk2的KmATP。添加增加浓度的ATP至包含所述疏水分子和电荷平衡分子的胶束,致使荧光增加。图4A-C分别显示了PKCPII、MAP激酶1/Erkl和MAP激酶2/Erk2的表观KmATP。尽管所述测定混合物对所述方法的操作而言不是必需的,但其可任选包括一种或多种淬灭部分或淬灭分子,所述淬灭部分或淬灭分子祐二没计用于淬灭所述疏水分子和/或电荷平衡分子的荧光部分的荧光。检测、筛选和/或表征酶活性的抑制剂、激活剂和/或调节剂可通过以下方法进行形成含有这些已知或潜在的抑制剂、激活剂和/或调节剂的反应混合物,并测定相对于没有所述抑制剂、激活剂或调节剂时观察到的信号,荧光信号的增加或减少(如果有)的程度。可以测试不同量的这些物质以测定例如Ki(抑制常数)、KH(Hill系数)、Kd(离解常数)等参数,以表征这些物质对酶活性作用的浓度依赖性。在一些实施方案中,本文描述的组合物可用于表征酶抑制剂。图5A-B显示了使用疏水分子d6000K(染料2)EEIYGEF-酰胺和电荷平衡分子、髓磷脂碱性蛋白,十字孢碱和H98对PKCpII的IC5。。添加增加浓度的酶抑制剂至包含所述疏水分子和电荷平衡分子的胶束,致使荧光减少。图5A-B分别显示了十字孢碱和H98对PKCJ3II的表观IC50。荧光信号的检测可通过任何适当的方式进行。有利地,本发明教导内容的底物分子/电荷平衡分子可用于实时连续监测相,以使得使用者快速测定所述样品中是否存在酶活性,和任选地,所述酶的量或具体活性。从至少两个不同的时间点测定所述焚光信号,通常直至可测定初始速度(速率)。可连续地或者在几个选定时间点监测所述信号。或者,可在终点实施方案中检测所述荧光信号,其中在一定量的时间后检测信号,并且将所述信号与对照信号(所述反应开始之前)、阈值信号或标准曲线相比较。5.9试剂盒还提供了用于实施本发明教导内容方法的试剂盒。在一些实施方案一种或多种电荷平衡分子。所^疏水分子和/或电4平衡分子包括染料部分。在一些实施方案中,所述疏水分子和/或电荷平衡分子可以各自独立地包含感兴趣的酶或试剂的底物或推定底物。在一些实施方案中,所述任选的电荷部分包含酶底物。在一些实施方案中,所述疏水分子和电荷平衡分子都包含相同的底物。在一些实施方案中,所述疏水分子和电荷平衡分子包舍不同的底物。在一些实施方案中,所述试剂盒包括包含疏水部分和染料部分的疏水分子。在一些实施方案中,所述试剂盒包括包含疏水部分、电荷部分和染料部分的疏水分子。在一些实施方案中,所述疏水分子包括酶底物。在一些实施方案中,所述电荷部分包含酶底物。在一些实施方案中,所述试剂盒进一步包括电荷平衡分子。在一些实施方案中,所述电荷平衡分子包括金属离子、带电荷的寡核苷酸、带电荷的寡核苦酸类似物、寡核苷酸才莫拟物、带电荷的氨基酸、带电荷的肽或带电荷的蛋白质。在一些实施方案中,所述试剂盒包括包含酶底物的电荷平衡分子。在一些实施方案中,所述疏水分子和电荷平衡分子都包含相同的底物。在一些实施方案中,所述疏水分子和电荷平衡分子包含不同的底物。所述试剂盒可任选包括淬灭部分和/或淬灭分子。所述试剂盒可任选包括其他用于制备胶束的组分。在一些实施方案中,所述试剂盒进一步包括用于制备促进酶反应的反应混合物的緩冲剂。所述緩冲剂可以以千燥形式或液体形式在容器中提供。特定緩冲剂的选择可根据各种因素,例如用于待测酶的最适pH,所述底物分子和/或电荷平衡分子中荧光部分的溶解性和荧光性质,和从中获得目标酶的样品的pH。所述緩沖剂通常以足以在所述混合物中产生特定pH的量添加至所述反应混合物。在一些实施方案中,所述緩冲剂作为具有预选pH和緩冲剂浓度的原液而被提供。如上所述,当与所述样品混合时,所述緩沖剂产生适合于所述酶测定的最终pH。所述反应混备物的pH还可通过酸或碱滴定以达到最终希望的pH。所述试剂盒可另外包括有益于酶活性的其他组分,例如盐(例如KC1、NaCl或NaOAc),金属盐(例如,Ca"盐,例如CaCl2,MgCl2、MnCl2、ZnCl2或Zn(OAc),去污剂(例如,吐温20),和/或可用于特定酶的其他组分。这些其他组分可彼此分开提供或者以干燥或液体形式混合在一起。所述疏水分子和/或电荷平衡分子可以以干燥或液体形式提供,与所述緩冲剂一起或分开。为促进所述反应混合物中的溶解,所述疏水分子和/或电荷平衡分子可以以水溶液形式提供,特别是可与所述反应混合物中其他组分混溶的水溶液或非水原液形式。例如,除了水以外,底物溶液还可含有通常范围为1。/。-10。/。(v:v)的辅助溶剂,例如二甲基曱酰胺、二曱基磺酸酯、甲醇或乙醇。所述试剂盒还可含有用于检测、定量和/或表征酶的其他化学物质。例如,为检测蛋白激酶活性,所述试剂盒还可含有供磷酸的基团,例如ATP、GTP、ITP(三磷酸肌苷),或其他可被激酶用以磷酸化所述底物部分的其他三磷酸核苷酸或三磷酸核苷酸类似物。参考下面描述本发明教导内容各个方面的非限制性实施例,可进一步理解所述各种组合物和方法的操作,所述实施例不应解释为以任何方式限制本发明教导内容的范围。6.1胶束的冷冻电子显孩t镜才企查(CryodectronMicrosopy)关于冷冻断裂电子显微镜检查,疏水分子C17OOOK(tet)RQG§FRA-酰胺、磷酸化的疏水分子C17OOOK(tet)RQGS(p)FRA-酰胺各自溶解于25mMTris(pH7.6)、5mMMgCl和5mMDTT。所述样品冷冻于液氮冷却的丙烷中。达到10,000K/秒的冷却速率以避免可能由冷冻固定过程引起的冰晶体形成和人为产物。所述冷冻固定的样品在处理前保存于液氮中少于2小时。断裂过程在JEOLJED-9000冷冻蚀刻机中进行,且暴露的断裂面用Pt在25-35C角度遮掩30秒并用碳遮掩35秒(2kV/60-70mA,lxl(T5Torr)。生成的复制品用浓缩的氯仿/甲醇(按体积l:l)清洗至少5次。清洗后的复制品用JEOL1000CX或PhilipsCM10电子显樣i镜检查。6.2添加电荷平衡分子淬灭疏水分子的荧光制备含有10^iM疏水分子C,6000K(染料2)EEIYGEF-酰胺和25mMTris(pH7.6)、5mMMgCl和5mMDTT的反应溶液。添加各种浓度的电荷平衡分子、髓磷脂碱性蛋白(UpstateUSA,Inc.cat.no:13-104)(终浓度0、2.5、5、10、20和50^M),并测定焚光。结果在图2中显示。6.3蛋白激酶活性的检测制备下述反应溶液(IOnl):该反应溶液在20mMTris緩沖剂,pH7.6,MgCl2(5mM),DTT(5mM)和PKCpn(0.15ng/p1,UpstateUSA,Inc.)、MAP激酶1/Erkl(1.5ng4d,UpstateUSA,Inc.)或MAP激酶2/Erk2(1.5ng4U,UpstateUSA,Inc.)中含有疏水分子d6000K(染料2)EEIYGEF-酰胺(10pM)和10实施例jiM电荷平衡分子髓磷脂碱性蛋白(Upstatecat.no:13-104)。将所述溶液移入384孔板(Corning384孑L,黑色,非结合表面(NBS),微孔板)的孔中(每孑LIOjiL)。添加ATP(O或500nM)以启动激酶反应。寸吏用MolecularDevices(Sunnyvale,CA)的AnalystGT在室温下每2分钟实时读取焚光,持续2小时,激发和发射分别设为485和535nm。图3A-C分别显示了PKC卩II、MAP激酶1/Erkl和MAP激酶2/Erk2的结果。6.4蛋白激酶的KmA^使用实时激酶测定以检测几种蛋白激酶的表观KmATP。制备下述反应溶液(IOpi):该反应溶液在20mMTris緩沖剂,pH7.6,MgCl2(5mM),DTT(5mM),10%LipidActivator(UpstateUSA,Inc.)和PKCpiI(0.15ng/^il,UpstateUSA,Inc.),MAP激酶1/Erkl(1.5ng/pl,UpstateUSA,Inc.)或MAP激酶2/Erk2(1.5ng/nl,UpstateUSA,Inc.)中含有疏水分子d6000K(染料2)EEIYGEF-酰胺(10^iM)和10pM电荷平衡分子髓磷脂碱性蛋白(UpstateInc.cat.no:13-104)。将所述溶液移入384孔板(Corning384孔,黑色,非结合表面(NBS),微孔板)的孔中(每孔9pL)。添加八种不同浓度(O、5、10、20、50、100、200或500)的ATP(lpL)以启动激酶反应。使用MolecularDevices(Sunnyvale,CA)的AnalystGT在室温下每2分钟实时读取荧光,持续2小时,激发和发射分别设为485和535nm。使用非线性拟合程序Origin6.1(OriginLab,MA)将初速度拟合Michaelis-Menton方程。图4A-C分别显示了PKCpII、MAP激酶1/Erkl和MAP激酶2/Erk2的结果。6.5十字孢碱和H89对PKCpiI的IC50制备下述反应溶液(10nl):该反应溶液在20mMTris緩冲剂,pH7.6,MgCl2(5mM),DTT(5mM),10%LipidActivator(UpstateUSA,Inc)和PKC卩II(0.15ng4U,UpstateUSA,Inc.)中含有疏水分子d6000K(染料2)EEIYGEF-酰胺(10nM)和lO^iM电荷平衡分子髓磷脂碱性蛋白(UpstateInc.catno:13-104)。将所述溶液移入384孔板(Corning384孑L,黑色,非结合表面(NBS),微孔板)的孔中(每孔9nL)。添加终浓度l%DMSO中的八种不同浓度(O.l、1、10、20、100、1000、5000或20000nM)的酶抑制剂十字孢碱(Sigma)或八种不同浓度(O.OOl、0.01、1、5、10、50或100pM)的H89。添加ATP(10^M)以启动激酶反应。使用MolecularDevices(Sunnyvale,CA)的AnalystGT在室温下每2分钟实时读取荧光,持续2小时,激发和发射分别设为485和535nm。图4A-C分别显示了十字孢碱和H89的结果。本文提到的所有公布和专利申请都通过引用并入本文,如同特别并单独指明每篇公布或专利申请通过引用并入本文。本文使用的章节标题仅为组织目的,并不解释为以任何方式限制所描述的主题。虽然结合各种实施方案描述了本发明教导内容,但非意于本发明教导内容受这些实施方案限制。相反,本发明教导内容包括本领域技术人员应理解的各种替代、修改和等同。虽然已经说明并描述了各种具体实施方案,但应理解,在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以做出各种改变。权利要求1.一种胶束,其包括(i)包含疏水部分、染料部分和任选的电荷部分的疏水分子,所述疏水部分能够将所述疏水分子聚集成所述胶束;和(ii)能够在生理pH下促进胶束形成的一种或多种电荷平衡分子;其中所述疏水分子和/或电荷平衡分子包含酶底物。2.权利要求1所述的胶束,其中所述疏水分子带负电荷,且所述电荷平衡分子带正电荷。3.权利要求1所述的胶束,其中所述疏水分子带正电荷,且所述电荷平衡分子带负电荷。4.权利要求l所述的胶束,其中所述电荷部分包括带电荷的氨基酸。5.权利要求l所述的胶束,其中所述电荷部分包括带电荷的肽。6.权利要求1所述的胶束,其中所述电荷部分包括带电荷的寡核苷酸。7.权利要求6所述的胶束,其中所述带电荷的寡核苷酸选自DNA、RNA及它们的任何组合。8.权利要求1所述的胶束,其中所述电荷部分包括带电荷的寡核苦酸类似物。9.权利要求1所述的胶束,其中所述电荷部分包括带电荷的寡核苷酸模拟物。10.权利要求9所述的胶束,其中所述寡核苷酸模拟物是PNA。11.权利要求l所述的胶束,其中所述电荷平衡分子是金属离子。12.权利要求l所述的胶束,其中所述电荷平衡分子选自镁、锰、镧及它们的任何组合。13.权利要求l所述的胶束,其中所述电荷平衡分子包括带电荷的寡核苷酸。14.权利要求13所述的胶束,其中所述带电荷的寡核苷酸选自DNA、RNA及它们的^f壬^jta合。15.权利要求l所述的胶束,其中所述电荷平衡分子包括带电荷的寡核苷酸类似物。16.权利要求l所述的胶束,其中所述电荷平衡分子包括带电荷的寡核苷酸模拟物。17.权利要求16所述的胶束,其中所述寡核苦酸模拟物是PNA。18.权利要求l所述的胶束,其中所述电荷平衡分子是带电荷的氨基酸。19.权利要求l所述的胶束,其中所述电荷平衡分子是带电荷的肽。20.权利要求l所述的胶束,其中所述电荷平衡分子是带电荷的蛋白质,其中所述带电荷的蛋白质的浓度比样品中内源性带电荷的蛋白质的浓度高约2倍。21.权利要求20所述的胶束,其中所述带电荷的蛋白质和所述内源性带电荷的蛋白质是相同的蛋白质。22.权利要求20所述的胶束,其中所述带电荷的蛋白质和所述内源性带电荷的蛋白质是不同的蛋白质。23.权利要求20所述的胶束,其中所述带电荷的蛋白质选自髓磷脂碱性蛋白、髓磷脂P2蛋白、酪蛋白及它们的任何组合。24.权利要求20所述的胶束,其中所述带电荷的蛋白质是髓磷脂碱性蛋白。25.权利要求24所述的胶束,其中所述电荷部分包括序列E-E-I-Y画G國E画F(SEQIDNO:l)。26.权利要求l所述的胶束,其中所述疏水分子包含所述酶底物。27.权利要求1所述的胶束,其中所述电荷平衡分子包含所述酶底物。28.权利要求l所述的胶束,其中所述疏水分子和所述电荷平衡分子各自独立地包含酶底物。29.权利要求28所述的胶束,其中所述酶底物是相同的。30.权利要求28所述的胶束,其中所述酶底物是不同的。31.权利要求1-30所述的胶束,其中所述酶选自激酶、磷酸酶、硫酸酯酶、肽酶、羧化酶及它们的任何组合。32.权利要求31所述的胶束,其中所述酶是激酶。33.权利要求32所述的胶束,其中所述激酶选自PKA、PKC、MAPK、钙调节素依赖性蛋白激酶、磷酸化酶激酶、Rafl、MEK、MEKK及它们的任何组合。34.权利要求1所述的胶束,其中所述疏水部分包括含有6至30个碳原子的烃。35.权利要求34所述的胶束,其中所述烃是饱和的或不饱和的烷基。36.权利要求l所述的胶束,其中所述染料部分是荧光部分。37.权利要求36所述的胶束,其中所述荧光部分能够自淬灭。38.权利要求37所述的胶束,其中所述荧光部分包括夹氧杂蒽染料。39.权利要求38所述的胶束,其中所述夹氧杂蒽染料选自荧光素染料和若丹明染料。40.权利要求l所述的胶束,其进一步包括包含疏水部分的淬灭部分和能够淬灭荧光部分的荧光的淬灭部分。41.权利要求l所述的胶束,其中所述电荷平衡分子进一步包括淬灭部分。42.权利要求l所述的胶束,其中所述疏水分子和所述电荷平衡分子的电荷比为约1:1。43.权利要求l所述的胶束,其中所述疏水分子和所述电荷平衡分子的电荷比为约1:2、1:3、1:4或1:5。44.一种检测和/或表征样品中酶活性的方法,其包括如下步骤(i)当所述酶存在于所述样品中时,在有效允许所述酶以导致所述染料部分产生的信号增加的方式作用于所述底物的条件下,将所述样品与^^据权利要求l-43任一项的胶束相接触;和(ii)检测所述信号,其中所述信号的增加指示了所述样品中所述酶的存在和/或量。45.—种用于检测和/或表征样品中酶活性的试剂盒,其包括(i)包含疏水部分、染料部分和任选的电荷部分的疏水分子,所述疏水部分能够将所述疏水分子聚集成所述胶束;和(ii)一种或多种电荷平衡分子;其中所述疏水分子和/电荷平衡分子包含酶底物。46.权利要求45所述的试剂盒,其进一步包括电荷平衡分子。47.权利要求45所述的试剂盒,其中所述电荷平衡分子是金属离子。48.权利要求45所述的试剂盒,其中所述电荷平衡分子包括带电荷的寡核苷酸。49.权利要求45所述的试剂盒,其中所述带电荷的寡核苷酸选自DNA、RNA及它们的任何组合。50.权利要求45所述的试剂盒,其中所述电荷平衡分子包括带电荷的寡核苷酸类似物。51.权利要求45所述的试剂盒,其中所述电荷平衡分子包括带电荷的寡核苷酸;f莫拟物。52.权利要求51所述的试剂盒,其中所述寡核苷酸模拟物是PNA。53.权利要求45所述的试剂盒,其中所述电荷平衡分子是带电荷的氨基酸。54.权利要求45所述的试剂盒,其中所述电荷平衡分子是带电荷的肽。55.权利要求45所述的试剂盒,其中所述电荷平衡分子是带电荷的蛋白质。56.—种用于检测和/或表征样品中酶活性的试剂盒,其包括根据权利要求l-43任一项的胶束。全文摘要特别用于检测、定量和/或表征酶的组合物、方法和试剂盒。文档编号C12Q1/00GK101151375SQ200580046879公开日2008年3月26日申请日期2005年12月29日优先权日2004年12月30日发明者孙红烨申请人:阿普尔拉股份有限公司