专利名称：：莰非醇的制备方法
技术领域：
：本发明涉及莰非醇的制备方法，其中使用酸、碱、酶或者产生上述酶的微生物从莰非醇糖苷分离莰非醇。莰非醇，具有如下化学式l，是黄酮醇(一种类黄酮)的代表性成分，其广泛分布于植物的花或叶中。已知有ioo或ioo余种黄酮醇，并且已知其中莰非醇、五羟黄酮以及杨梅黄酮存在最多。具体而言，莰非醇是一种抗氧化活性和抗炎活性等生理活性优良的物质。因此，进行了莰非醇各种功效的研究，并将莰非醇应用于各种领域。但是，当前所使用的莰非醇大部分都是植物提取物，其含有莰非醇的量仅为数ppm至数十ppm，因此，难以揭示莰非醇的实质功效。另外，由于难以发现包含大量莰非醇的植物，而且用于制备大量莰非醇的分离和纯化没有经济价值，因此，几乎没有开展有关莰非醇的大量生产的研究。绿茶是世界上历史最悠久的饮料。近年来，随着对于绿茶的关注的不断增加，对茶的成分及其药理效果也进行了大量的研究。与其他食品相比，绿茶含有大量的异丙醇胺(threamine)和多酚。已知绿茶的功能成分为属
背景技术：
：化学式l于多叶多酚类的基于黄酮-3-醇(flavan-3-ol)的儿茶素(catechin)，且儿茶素的主要成分为(+)-儿茶素、(-)-表儿茶素(epicatechin)、(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate)禾Q(-)-没食子儿茶素(gallocatechin)等。特别地，有报道称，绿茶中所含的多酚类降低了血液中的胆固醇，并具有抗氧化作用、抗癌、解毒、抗菌功能、预防蛀牙、抑制老化作用、美白效果及芳香成分等。另外还报道了，绿茶中所含的多酚类预防痛风、抑制脂类过氧化物和中性脂质的产生并延缓衰老，由此防止肥胖、增进毛细血管的抵抗力。但是，具有各种功效的绿茶大多数以叶子的形式使用，包含相似的有效成分的绿茶种子除了用于栽培之外，就没有得到利用。另外，几乎所有的关注和研究都集中在绿茶的儿茶素类，特别是表没食子儿茶素没食子酸酯(印igallocatechingallate，EGCG)上。
发明内容技术问题本发明人发现未用于特殊用途的绿茶种子以及关注EGCG的绿茶叶含有大量的具有莰非醇母核的莰非醇糖苷，特别是在莰非醇上连接有3个糖的山茶苷A(camelliasideA)、山茶苷B等糖苷。由此发现，本发明人完成了大量生产生理活性优良的葡糖苷配基(aglycone)型的莰非醇的方法。因此，本发明的目的为提供一种使用酸、碱、酶或者产生上述酶的微生物从莰非醇糖苷分离莰非醇的方法。换言之，本发明的目的为提供一种从绿茶种子或绿茶叶中大量含有的莰非醇糖苷，特别是山茶苷A、山茶苷B等糖苷分离制备莰非醇的方法。技术方案为了实现所述目的，本发明提供了一种莰非醇的制备方法，该方法包括使用酸、碱、酶或者产生上述酶的微生物从莰非醇糖苷分离莰非醇。更具体地说，上述莰非醇的制备方法包括第一阶段，使用水或有机溶剂从植物中获得含有莰非醇糖苷的植物提取物；以及第二阶段，使用酸、碱、酶或者产生上述酶的微生物水解上述植物提取物，以分离莰非醇。所述莰非醇糖苷包括山茶苷A或者山茶苷B。根据本发明的实施方式，在所述第一阶段中，所述植物提取物可来源于绿茶种子或者绿茶叶。另夕卜，根据本发明的实施方式，所述有机溶剂可以为选自乙醇、甲醇、丁醇、醚、乙酸乙酯及氯仿中的至少一种有机溶剂，或者这些有机溶剂与水的混合溶剂，优选使用80%的乙醇。根据本发明的实施方式，所述酸可以为选自盐酸、硫酸及硝酸中的至少一种，酸或者这些酸与选自乙醇、甲醇及丁醇中的至少一种醇的混合溶剂。这时，根据本发明的实施方式，所述酸的优选浓度范围为0.1N2N，混合溶剂的醇含量可为1050%,反应温度可为5010(TC，且反应时间可为0.58小时。根据本发明的实施方式，所述碱可以是选自氢氧化钠及氢氧化钾中的至少一种碱，或者这些碱与选自乙醇、甲醇及丁醇中的至少一种醇的混合溶剂。这时，根据本发明的实施方式，所述碱的浓度可为0.1N2N，混合溶剂的醇含量可为1050%，反应温度可为5010(TC，反应时间可为0.524小日寸。根据本发明的实施方式，所述酶或者产生上述酶的微生物可为分解糖键的酶或者产生上述分解糖键的酶的微生物，并且所酶可从莰非醇糖苷除去糖部分而分离莰非醇。优选地，所述莰非醇糖苷可包括山茶苷A或者山茶苷B。另外，根据本发明的实施方式，更优选地，所述酶可为选自葡糖苷酶(glucosidase)、阿拉伯糖苷酶(arabinosidase)、鼠李糖苷酶(rhamnosidase)、木糖苷酶(Xylosidase)、纤维素酶(cellulase)、橙皮苷酶(hesperidinase)、柚苷酶(naringinase)、葡萄糖醛酸酶(glucuronidase)、果胶酶(pectinase)、半乳糖苷酶(galactosidase)、及淀粉葡糖苷酶(amyloglucosidase)中的至少一禾中酶。另外，根据本发明的实施方式，所述产生上述酶的微生物可为选自曲霉属(aspergillussp.)、芽胞杆菌属(bacillussp.)、青霉菌属(penicilliumsp.)、根霉菌属(rhizopussp.)、根毛霉属(rhizomucorsp.)、踝节菌属(talaromycessp.)、双歧杆菌属(bifidobacteriumsp.)、被孢霉属(mortierellasp.)、隐球菌属(cryptococcussp.)、及微杆菌属(microbacteriumsp.)中的至少一种微生物。有益效果根据本发明，当使用酸、碱、酶或者产生上述酶的微生物从莰非醇糖苷分离莰非醇的方法时，能够从植物，特别是从绿茶种子或者绿茶叶得到含有莰非醇糖苷、特别是山茶苷A或者山茶苷B的植物提取物，然后通过使用酸、碱、酶或者产生上述酶的微生物进行水解，大量制备作为主要的生理活性成分之一的莰非醇。图1及图2显示通过高效液相色谱法测量使用酶按照实施例3的方法对实施例1的绿茶种子提取物进行水解前后的变化的结果；图1表示测量水解前的绿茶提取物中的山茶苷A及山茶苷B的含量的图，图2表示测量水解后的绿茶提取物中的莰非醇的含量的图。最佳实施方式根据本发明的莰非醇的制备方法包括第一阶段，使用水或有机溶剂从植物中获得含有莰非醇糖苷的植物提取物；以及第二阶段，使用酸、碱、酶或者产生上述酶的微生物水解上述植物提取物以分离莰非醇。在上述第一阶段中，为了使用水或有机溶剂得到含有作为莰非醇糖苷的山茶苷A或者山茶苷B的植物提取物，向植物倾注大约16倍、优选大约3倍的水或者选自乙醇、甲醇、丁醇、醚、乙酸乙酯及氯仿中的至少一种有机溶剂，或者倾注这些有机溶剂与水的混合溶剂。然后，在常温下搅拌15次的同时提取植物以脱脂。向脱脂的植物倾注大约18倍、优选大约4倍的水或者有机溶剂。在回流条件下萃取混合物15次，并在1020'C的温度下沉淀13天。其后，通过过滤和离心分离，分离残留物与滤液，并将通过对所分离的滤液进行减压浓縮得到的提取物悬浮于水中，然后使用醚等除去色素。接着，使用丁醇等除去水层15次。其后，通过对所得到的有机溶剂层进行减压浓缩得到提取物，并将提取物溶于少量的甲醇等。接着，干燥通过向混合物加入大量的乙酸乙酯等产生的沉淀物，以得到本发明的植物提取物。在上述第二阶段中，通过使用酸、碱、酶或者产生上述酶的微生物水解上述植物提取物，制备莰非醇。这时，当使用酸时，在植物提取物中加入0.1N2N、优选1N的酸、或者酸及醇的混合溶剂(优选50%的乙醇混合溶剂)，然后通过在50100°C、优选8(TC的水浴中加热148小时、优选8小时进行水解，得到反应溶液。当使用碱时，溶解植物提取物，然后加入0.1N2N、优选1N的碱、或者碱及醇的混合溶剂(优选50%的丁醇混合溶剂)，并通过在50100°C、优选100'C的水浴中加热回流148小时、优选8小时进行水解，得到反应溶液。当使用酶时，将植物提取物溶解于520倍、优选大约10倍的酸性缓冲溶液中，加入酶，然后在大约37'C的水浴中搅拌大约4055小时、优选大约48小时。同时，通过薄层色谱法检测底物的去除率。当底物完全去除吋，通过在热水(80100°C)中加热混合物515分钟，终止水解反应，得到反应溶液。当使用产生上述酶的微生物时，将植物提取物溶解于510倍、优选大约10倍的离子水中，然后在大约12rC的温度下灭菌30分钟，并冷却至大约3(TC。其后，使用基于液体量510%的预先培养的微生物接种混合物，然后在30'C的温度下培养25天、优选5天。然后，通过薄层色谱法检测底物的去除率。当底物完全去除时，终止水解反应，以500010000rpm离心分离培养液，用蒸馏水将回收的沉淀物洗涤3次，然后离心，得到沉淀物形式的反应溶液。如上所述，在使用酸、碱、酶、或者产生上述酶的微生物进行水解反应。之后，通过减压浓縮所得到的反应溶液除去溶剂，在残留物中加入醇，并搅拌混合物15次。过滤除去所沉淀的盐，减压浓縮所过滤的滤液，得到粗产物。然后使用硅胶柱色谱法(氯仿甲醇=8:14:1)纯化所得到的粗产物，得到莰非醇。具体实施方式下面，通过实施例和实验例对本发明进行更具体的说明，但是本发明并不受到这些实施例的限制。绿茶种子提取物的制备在2kg绿茶种子中加入6L己垸，然后在常温下搅拌混合物3次进行脱脂。然后在lkg经过脱脂的种子中加入4L80X的甲醇，回流萃取混合物3次，接着，在15匸下沉淀1天。然后，通过使用滤布的过滤和离心分离残留物和滤液，减压浓縮所分离的滤液，得到提取物，将该提取物悬浮于水中，然后使用1L醚萃取5次以除去色素。用500mLl—丁醇萃取水层3次，对这样得到的整个l一丁醇层进行减压浓縮得到l一丁醇提取物，将其溶于少量的甲醇中，然后加入大量的乙酸乙酯，得到沉淀物。干燥所生成的沉淀物，得到250g绿茶种子提取物。绿茶叶提取物的制备在2kg绿茶叶中加入6L己烷，然后在常温下搅拌混合物3次进行脱脂。然后在lkg经过脱脂的叶中加入4L80%的甲醇，回流萃取混合物3次，接着，在15-C下沉淀1天。然后，通过使用滤布的过滤或者离心分离残留物和滤液，减压浓缩所分离的滤液，得到提取物，将该提取物悬浮于水中，然后使用1L醚萃取5次以除去色素。加入用500mLl—丁醇萃取水层3次。对这样得到的整个l一丁醇层进行减压浓縮得到l一丁醇提取物，将其溶于少量的甲醇中，然后加入大量的乙酸乙酯。干燥所生成的沉淀物，得到150g绿茶叶提取物。利用酸解法制备莰非醇在10g按照上述实施例1得到的绿茶种子提取物中加入20倍(v/w)的1NHC1—50X的甲醇溶液(v/v)，然后在8(TC的水浴中回流加热8小时，水解与山茶苷A与山茶苷B结合的糖。接着，减压浓縮反应溶液，除去溶剂，在残留物中加入乙醇(200mL)并搅拌混合物(3次)，通过过滤除去所得的沉淀的盐，减压浓缩过滤的滤液，得到粗产物，通过硅胶柱色谱法(氯仿甲醇=8:14:1)纯化所得到的粗产物，得到0.95g莰非醇。利用碱水解法制备莰非醇将10g按照上述实施例1得到的绿茶种子提取物溶解于干燥批啶(500mL)中，向其中加入甲醇钠(粉末、10g)，并在水浴中回流加热8小时，水解与山茶苷A与山茶苷B结合的糖。接着，通过减压浓縮反应溶液除去溶剂，在残留物中加入乙醇(200mL)，并搅拌混合物(3次)。通过过滤除去所得的沉淀的盐。减压浓縮过滤得到的滤液得到粗产物。通过硅胶柱色谱法(氯仿甲醇=8:14:1)纯化所得到的粗产物，得到0.25g莰非醇。通过酶解法制备莰非醇将10g按照上述实施例1得到的绿茶种子提取物溶解于lOOmL的O.IM醋酸缓冲液(pH4.5)中。向混合物加入2.5g酶(橙皮苷酶0.5g、柚苷酶0.5g、纤维素酶0.5g、|3—葡萄糖醛酸酶0.2g、卩一半乳糖苷酶0.5g、淀粉葡糖苷酶0.3g;Sigma公司制造)，并在37。C的水浴中搅拌48小时，同时通过薄层色谱法周期性地进行检查。当底物(山茶苷A和山茶苷B)完全去除时，通过在热水(80100°C)中加热10分钟终止反应，然后通过减压浓缩反应溶液除去溶剂。将残留物加入乙醇(200mL)，并搅拌(3次)。通过过滤除去所得的沉淀物。然后，减压浓縮过滤得到的滤液，得到粗产物。通过硅胶柱色谱法(氯仿一甲醇=8:14:1)纯化所得到的粗产物，得到1.02g莰非醇。使用微生物制备莰非醇将10g按照上述实施例2得到的绿茶叶提取物溶解于100mL的离子水中，在12rC下灭菌30分钟，冷却至3(TC，使用基于液体量510%的预培养的黑曲霉(^;^g///^w'gw)KCCM11885进行接种，并在30'C下培养5天。通过薄层色谱法检査底物的去除率。当底物完全去除时终止反应，以500010000rpm离心分离培养液，通过蒸馏水洗涤回收的沉淀物3次，然后离心，得到沉淀物形式的反应溶液。在上述沉淀物中加入乙醇(200mL)，然后搅拌混合物(3次)。然后通过过滤除去沉淀物，减压浓縮过滤得到的滤液，以得到粗产物。通过硅胶柱色谱法(氯仿一甲醇二8:14:1)纯化所得到的粗产物，得到0.62g莰非醇。山茶苷A及山茶苷B的鉴定通过硅胶柱色谱法(填充100g硅胶)纯化10g按照上述实施例1得到的绿茶种子提取物。这时，使用氯仿和甲醇作为展开剂，将氯仿与甲醇之比从10:l提高到2:1，从而提高浓度梯度，得到馏分。从这些馏分获得0.82g山茶苷A和1.24g山茶苷B。对这样得到的产物进行鉴定(VarianGemini2000,300MHz，Varian公司)。结果，由于产物显示出如下表1所示的特性，因而鉴定为山茶苷A及山茶苷B。<山茶苷人的物理化学性质>性状浅绿黄色微晶正离子FAB—MS:756.9[M+H]<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>[实验例2]莰非醇的鉴定由于按照上述实施例36所制备的产物显示出如下特性，因此被鉴定为莰非醇(VarianGemini2000，300MHz，Varian公司制造)。<莰非醇的物理化学性质〉性状浅绿黄色微晶正离子FAB—MS:287[M+H]+!H-NMR:6.1(1H，d，1.8Hz)，6.3(1H,d，1.8Hz)，6.8(2H,dd,9Hz),8.0(2H，dd，9Hz)13C-NMR:94.467，99.248,104.518,116.265,123.710,130.649,137.069,147.970,158.200,160.480，162.446，165,519,177.285水解(酶消化)后莰非醇的含量变化按照上述实施例1的方法制备绿茶种子提取物，然后通过上述实施例3的方法进行酶解反应。然后通过高效液相色谱法测量酶解反应前后的变化。这时，酶解反应前的绿茶种子提取物中所含的山茶苷A及山茶苷B的含量的测量结果如图1所示，酶解反应后的莰非醇的含量的测量结果如图2所示。如图l及图2所示，山茶苷A及山茶苷B几乎都转化为莰非醇。工业实用性根据本发明，当使用酸、碱、酶或者产生上述酶的微生物从莰非醇糖苷分离莰非醇的方法时，能够从植物，特别是绿茶种子或者绿茶叶得到含有莰非醇糖苷、特别是包含山茶苷A或者山茶苷B的植物提取物，然后通过使用酸、碱、酶或者产生上述酶的微生物的水解法，大量生产作为主要的生理活性成分之一的莰非醇。权利要求1、莰非醇的制备方法，该方法包括使用酸、碱、酶或者产生所述酶的微生物从莰非醇糖苷分离莰非醇。2、权利要求1所述的方法，其包括使用水或有机溶剂从植物获得含有莰非醇糖苷的植物提取物；以及使用酸、碱、酶或者产生所述酶的微生物水解所述植物提取物以分离莰非醇。3、权利要求1或2所述的方法，其中所述莰非醇糖苷包括山茶苷A或者山茶苷B。4、权利要求2所述的方法，其中所述植物提取物来源于绿茶种子或者绿茶叶。5、权利要求2所述的方法，其中所述有机溶剂为选自乙醇、甲醇、丁醇、醚、乙酸乙酯及氯仿中的至少一种有机溶剂，或者这些有机溶剂与水的混合溶剂。6、权利要求1或2所述的方法，其中所述酸为选自盐酸、硫酸及硝酸中的至少一种酸，或者是这些酸与选自乙醇、甲醇及丁醇中的至少一种醇的混合溶剂。7、权利要求1或2所述的方法，其中所述碱为选自氢氧化钠及氢氧化钾中的至少一种碱，或者是这些碱与选自乙醇、甲醇及丁醇中的至少一种醇的混合溶剂。8、权利要求1或2所述的方法，其中所述酶从莰非醇糖苷除去糖部分以分离莰非醇。9、权利要求8所述的方法，其中所述莰非醇糖苷包含山茶苷A或者山茶苷B。10、权利要求8所述的方法，其中所述酶为选自葡糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、鼠李糖苷酶、木糖苷酶、纤维素酶、橙皮苷酶、柚苷酶、葡萄糖醛酸酶、果胶酶、半乳糖苷酶、及淀粉葡糖苷酶中的至少一种酶。11、权利要求1或2所述的方法，其中所述产生所述酶的微生物为选自曲霉属、芽胞杆菌属、青霉菌属、根霉菌属、根毛霉属、踝节菌属、双歧杆菌属、被孢霉属、隐球菌属、及微杆菌属中的至少一种微生物。全文摘要本发明涉及一种莰非醇的制备方法，该方法包括使用酸、碱、酶或者产生上述酶的微生物从莰非醇糖苷分离莰非醇。更具体地说，所述方法包括使用水或有机溶剂从植物获得含有莰非醇糖苷的植物提取物；以及使用酸、碱、酶或者产生上述酶的微生物水解上述植物提取物，以分离莰非醇。上述莰非醇糖苷包括山茶苷A或者山茶苷B。上述植物提取物来源于绿茶种子或者绿茶叶。当使用本发明的方法时，能够从植物、特别是绿茶种子和绿茶叶大量生产作为主要的生理活性成分的莰非醇。文档编号C12P17/06GK101103119SQ200580046808公开日2008年1月9日申请日期2005年5月30日优先权日2005年1月18日发明者庐浩植,廉明勳,张利燮,朱璟美,朴元锡,朴葰星,李玉燮,金德姬申请人:株式会社太平洋