基因检查用微反应器的利记博彩app

专利名称：基因检查用微反应器的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种在将从待检样品收容部注入的待检样品或对该待检样品进行前处理了的处理液、和收容在扩增试剂收容部的试剂输送到反应部进行基因扩增反应后，在上述各部通过微细流路连通的芯片内进行用检测部检测该基因扩增反应的操作的基因检查用微反应器，尤其是适合于检测来自待检样品的菌体的微反应器。
背景技术：
近年来，通过驱动微反应器技术和超微细加工技术，开发了将用于进行现有的试样调制、化学分析、化学合成等的装置、元件(例如泵、阀、流路、传感器等)微细化，集成在1个芯片上的系统(专利文献1)。这也称为μ-TAS(Micro total Analysis System)、生物反应器、芯片上的实验室(Lab-on-chips)、生物芯片，希望能应用于医疗检查/诊断领域、环境测定领域、农产品制造领域。尤其如在基因检查时所见到的那样，在需要烦杂的工序、熟练的手法、器械类的操作的情况下，自动化、高速化以及简便化的微型化分析系统，不仅成本、需要的试样量、所需时间，而且时间以及场所不用加以选择就能分析，可以说好处极大。
例如，在人、家畜中所见的新型感染症突发性流行的过程中，确定致病原因的病毒、细菌，成为分秒必争的预防对策的最初障碍。对于往往菌的培养决定全反应速度的现有的检测法来说，不选择场所就能迅速地出结果的基因检查技术，是顺应这一当务之急的要求而产生的。再有，即使对于由于基因而引起的病的诊断、生活习惯病等的发病危险度预测、基因治疗来说，需求量也很大。
临床检查很重视这些分析用的芯片的分析的定量性、分析的精度、经济性等。因此，课题是用简单的结构确立高可靠性的送液系统。寻求精度高、可靠性优异的微型流体控制元件。本发明人已经提出了适合于该要求的微泵系统(专利文献2和3)。
另外，对于将大量的临床待检样品作为对象的芯片来说，最好是一次性的，再有，需要克服多用途对应性、制造成本等问题。
以高密度固定了多个DNA片段的DNA芯片，存在搭载的信息内容、增大的制作成本、还有检测精度、再现性等还并不充分的问题。不过，由于基因检查的目的和种类的不同，与在芯片基板上网络状配置多个DNA探针的方式相比，使用能适当变更的引物、实时跟踪DNA扩增反应的效率的方式，也能提供简便且迅速的检查方法。
专利文献1日本专利特开2004-28589号公报专利文献2日本专利特开2001-322099号公报专利文献3日本专利特开2004-108285号公报非专利文献1「DNA芯片技术及其应用」、「蛋白质核酸酶」43卷、13号(1998年)君冢房夫、加藤郁之进，共立出版(股份)发行

发明内容
本发明是鉴于这些实际情况而提出的，其目的在于提供一种适合于通过基因扩增反应检测来自待检样品的菌体的基因检查用微反应器。
即，其目的在于提供一种确保广泛应用性和高灵敏度，能进行适当地变更使用的引物、生物探针的方式的DNA扩增，实现为一次性的低成本性，而且，在检测时，能以简单的结构高精度地检测的、用于检测菌体的基因检查用微反应器。
用于解决问题的方法 本发明的基因检查用微反应器，是一种将从待检样品收容部注入的待检样品或对该待检样品进行前处理的处理液和收容在扩增试剂收容部的试剂输送到反应部，在进行基因扩增反应后，在上述各部通过微细流路连通的芯片内进行用检测部检测该基因扩增反应的操作的基因检查用微反应器，其特征是在上述芯片内设有收容溶解上述待检样品中的菌体的溶菌试剂的溶菌试剂的收容部；吸附由上述溶菌试剂溶解的菌体基因的微粒状载体填充在微细流路内的载体填充部；收容在将上述菌体基因吸附在上述载体上之后、向上述载体填充部输送的清洗液的清洗液收容部；收容提取吸附在上述载体上的上述菌体基因的提取基因试剂的提取试剂收容部，而且，设有切换输送到上述载体填充部的包含上述菌体基因的液体的送液方向、使上述液体在上述载体填充部反复前后运动的控制装置。
发明效果 在上述发明中，作为待检样品的前处理，是在溶解待检样品中的菌体、使其基因吸附在微粒状载体(珠子等)上的状态下进行清洗，接着在用提取试剂洗脱吸附基因后，输送到反应部使其进行基因扩增反应，所以，能高效且迅速地获得适合于扩增反应的前处理液。
特别是，由于使其沿流路的前后方向切换包含溶解的菌体基因的液体的送液方向，所以，能提高菌体基因和微粒状载体相遇的概率，能高效地使许多菌体基因吸附在微粒状载体上。


图1是表示本发明的基因检查用微反应器的实施方式的芯片的简要结构的平面图。
图2(a)是表示压电泵的一个例子的截面图，图2(b)是其平面图。图2(c)是表示压电泵的其它例子的截面图。
图3表示使压电泵与芯片不是一体的情况下的芯片的泵连接部周边的结构的图。
图4是用于说明使来自待检样品的通过溶菌放出的菌体基因吸附在载体填充部的载体上的结构的图。
图5是用于说明将来自待检样品的通过溶菌放出的菌体基因吸附在载体填充部的载体上的其他的结构的图。
图6用于说明反复切换载体填充部内的包含菌体基因的液体的送液的前后方向的控制系统的图。
图7是表示进行待检样品处理液和试剂的混合以及反应的流路结构的一个例子的图。
图8是用于说明反复切换导入到微细流路内的待检样品处理液和试剂的合流液的送液前后方向的控制系统的图。
图9是表示扩增试剂收容部以及试剂混合部的结构的一个例子的图。
图10是表示在扩增试剂收容部以及试剂混合部的芯片的下面设置珀耳帖元件(Peltier device)的状态的截面图。
图11是表示用上述方法检测ICAN法的扩增反应的反应部和检测部周边的流路结构的图。
图12是表示在微反应器的流路中使用的单向阀的一个例子的截面图。
图13是用于说明利用单向阀的定量送液机构的图。
图14是用于说明疏水性阀的结构的图。
具体实施例方式本发明的基因检查用微反应器的特征是上述反应部由从对上述待检样品进行前处理的处理液和收容在上述扩增试剂收容部的试剂合流的合流部开始的前面的微细流路构成，具备切换输送到上述反应部的上述各液的合流液的送液方向、使上述合流液在上述反应部反复前后运动的控制装置。
在上述发明中，由于使在载体填充部进行前处理的处理液和试剂的合流液在反应部内切换送液方向、前后运动，同时进行扩增反应，所以提高了菌体基因和试剂相遇的概率，提高了反应速度。特别是，若使反应部为微细流路，则由于粘性从流路中央部到流路内壁侧产生流速梯度，所以，在该条件下，通过切换向流路前后方向的送液而实现的试剂的扩散是二维的，菌体基因和试剂相遇的概率变高了。
而且，最好是用微泵切换在载体填充部或反应部的送液方向，该微泵具备流路阻力根据压差的不同而变化的第1流路；与压差的变化相对应的流路阻力的变化比例比第1流路小的第2流路；与第1流路和第2流路连接的加压室；改变该加压室的内部压力的操作装置；和驱动该操作装置的驱动装置。
本发明的基因检查用微反应器，是在将从待检样品收容部注入的待检样品或对该待检样品进行前处理的处理液和收容在扩增试剂收容部的试剂输送到反应部进行基因扩增反应后，在上述各部通过微细流路连通的芯片内进行用检测部检测该基因扩增反应的操作的基因检查用微反应器，其特征是在上述芯片内设有收容溶解上述待检样品中的菌体的溶菌试剂的溶菌试剂收容部；吸附由上述溶菌试剂溶解的菌体基因的微粒状的载体填充在微细流路内的载体填充部；收容在将上述菌体基因吸附在上述载体上之后向上述载体填充部输送的清洗液的清洗液收容部；收容提取吸附在上述载体上的上述菌体基因的提取基因试剂的提取基因试剂收容部，而且，在连通上述各部的微细流路中的至少一个的微细流路中设有单向阀。
在上述的发明中，作为待检样品的前处理，是在溶解待检样品中的菌体、将该基因吸附在微粒状载体上的状态下进行清洗，接着，用提取液洗洗脱附基因，输送到反应部使其进行基因扩增反应，所以，能高效且迅速地获得适合于扩增反应的前处理液。
再有，由于在上述各收容部和载体填充部之间的流路的适当的位置设置单向阀，所以，能防止液体在该位置倒流，能可靠地进行规定的送液。
作为设置单向阀的理想的位置，在设置定量试剂或待检样品的处理液的后续结构的情况下，可以列举出该位置、还有由于在PCR法中被称为交叉污染的污染所产生的影响显著地变得严重，用于防止这些污染的适当的部位、除此之外，还有相对微泵和芯片的连接部的下游侧的附近位置。
本发明的基因检查用微反应器，是在将从待检样品收容部注入的待检样品或对该待检样品进行前处理的处理液和收容在扩增试剂收容部的试剂输送到反应部进行基因扩增反应后，在上述各部通过微细流路连通的芯片内进行用检测部检测该基因扩增反应的操作的基因检查用微反应器，其特征是在上述芯片内设有收容溶解上述待检样品中的菌体的溶菌试剂的溶菌试剂收容部；吸附由上述溶菌试剂溶解的菌体基因的微粒状的载体填充在微细流路内的载体填充部；收容在将上述菌体基因吸附在上述载体上之后向上述载体填充部输送的清洗液的清洗液收容部；收容提取吸附在上述载体上的上述菌体基因的提取基因试剂的提取基因试剂收容部，而且，设有冷却上述扩增试剂收容部、和/或混合来自多个上述扩增试剂收容部的各试剂的试剂混合部的冷却装置。
上述冷却装置最好是珀耳帖元件。
在上述发明中，作为待检样品的前处理，是在溶解待检样品中的菌体、将该基因吸附在微粒状载体上的状态下进行清洗，接着，用提取液洗脱附基因，输送到反应部使其进行基因扩增反应，所以，能高效且迅速地获得适合于扩增反应的前处理液。
再有，由于用珀耳帖元件等冷却装置冷却扩增试剂收容部和试剂混合部，所以，能防止因温度(高)造成的试剂变质。特别是，即使在其结构为需要控制温度、使其在PCR扩增过程中，温度在3个温度之间升降、将ICAN(Isothermal chimera primer initiated nucleicamplification)法应用于基因扩增的情况下，由于需要使反应部为50～65℃，所以虽然在反应部升温的过程中和混合试剂等时，试剂被加热容易变质，但由于在扩增试剂收容部和试剂混合部的芯片上面或下面、或者上下两面设有珀耳帖元件进行冷却，所以能防止其变质。
本发明的基因检查用微反应器，是在将从待检样品收容部注入的待检样品或对该待检样品进行前处理的处理液和收容在扩增试剂收容部的试剂输送到反应部进行基因扩增反应后，在上述各部通过微细流路连通的芯片内进行用检测部检测该基因扩增反应的操作的基因检查用微反应器，其特征在于在上述芯片内设有收容溶解上述待检样品中的菌体的溶菌试剂的溶菌试剂收容部；吸附由上述溶菌试剂溶解的菌体基因的微粒状的载体填充在微细流路内的载体填充部；收容在将上述菌体基因吸附在上述载体上之后向上述载体填充部输送的清洗液的清洗液收容部；收容提取吸附在上述载体上的上述菌体基因的提取基因试剂的提取基因试剂收容部，而且，在上述反应部同时使上述菌体基因和内部对照物扩增，在其它检测部对它们分别进行检测。
在上述发明中，由于作为待检样品的前处理，是溶解待检样品中的菌体、在将该基因吸附在微粒状载体上的状态下进行清洗，接着，用提取液洗洗脱附基因，输送到反应部使其进行基因扩增反应，所以，能高效且迅速地获得适合于扩增反应的前处理液。
再有，由于使用于判别抑制物质等引起的基因扩增反应的伪阴性的内部对照物与待检样品的前处理液一起进行扩增反应，在根据需要将反应后的溶液进行适当的处理后进行分割，向其它的检测部送液，在一方的检测部检测菌体基因的扩增，在另一方的检测部检测内部对照物的扩增，因此，结构简单，能迅速地进行高可靠性的检查。

根据本发明提供的适合于细菌或病毒检测的基因检查用微反应器，能确保广泛应用性和高灵敏性，能实现为一次性的低成本性，能用简单的结构进行高精度的检测，而且，能高效且迅速地对待检样品进行适合于扩增反应的前处理。
在本说明书中，“基因”指的是指携带表达某种功能的遗传信息的DNA或RNA，但有时也是指单独的作为化学实体的DNA、RNA。
以下参照附图对本发明的实施方式进行说明。图1是表示本发明的基因检查用微反应器的实施方式的芯片的简要结构的平面图。本实施方式的基因检查用微反应器可以由图示的芯片1和装置本体构成，装置本体具备送液用微泵；与该送液、温度、反应的各控制有关的控制系；光学检测系；负责数据的采集和处理的处理系。
芯片1以外的组成要素，可以制成使其为一体的装置本体，能将芯片1安装在该装置上或拆下。微泵虽然也可以设置在芯片1上，但通过组装在装置本体上，将芯片1安装在装置本体上，也能将芯片1的泵连接部连接到装置本体的微泵上。
芯片1是将例如树脂、玻璃、硅、陶瓷等作为材料，用精密加工技术形成流路等制成的，例如，具有长宽是几十mm、高度是几mm左右的尺寸。在芯片1上形成的微细流路，例如具有宽和高度大约是10μm～数百μm的尺寸。
溶菌试剂收容部3、清洗液收容部5、提取试剂收容部6、扩增试剂收容部7、检测试剂收容部8等各收容部内的液体，用与这些各收容部连通的微泵11进行送液。微泵11可以通过使由光刻技术等形成的芯片状的泵单元、和形成有图示那样的前处理、反应以及检测用的流路的芯片，面与面相互重合，将单个或多个微泵连接到各收容部上。
作为微泵11，虽然可以使用设有操作装置的、将单向阀设置在阀腔的流出流入孔中的单向阀型的泵等各种微泵，但最好是使用压电泵。图2(a)是表示压电泵的一个例子的截面图，图2(b)是其平面图。在该微泵上设有形成有第1液室48、第1流路46、加压室45、第2流路47以及第2第液室49的基板42；层叠在基板42上的上侧基板41；层叠在上侧基板41上的振动板43；层叠在振动板43的朝向加压室45的一侧的压电元件44；用于驱动压电元件44的驱动部(图未示)。
在该例子中，基板42使用厚度为500μm的感光性玻璃基板，通过进行蚀刻达至深100μm，形成第1液室48、第1流路46、加压室45、第2流路47以及第2第液室49。第1流路46，使其宽为25μm，长为20μm。另外，第2流路47，使其宽为25μm、长为150μm。
通过将是玻璃基板的上侧基板41层叠在基板42上，形成第1液室48、第1流路46、第2液室49以及第2流路47的上面。通过蚀刻等对上侧基板41的相当于加压室45的上面的部分进行加工，使其贯通。
在上侧基板41的上面层叠由厚度为50μm的薄玻璃构成的振动板43，在它的上面层叠由例如厚度是50μm的钛酸锆酸铅(PZT)陶瓷等构成的压电元件44。
由于来自驱动部的驱动电压，压电元件44和粘贴在它上面的振动板43振动，因此，加压室45的体积增加或减少。第1流路46和第2流路47，其宽度和深度相同，第2流路一方的长度比第1流路的长，在第1流路46，若压差变大，则在流路内形成旋涡，产生紊流，增加流路阻力。另一方面，在第2流路47，由于流路长，所以，即使压差变大了，也容易变成层流，与第1流路相比，相对压差变化的流路阻力的变化比例变小了。
例如，由对压电元件44的驱动电压，若使振动板43迅速地向加压室45的内侧变位，一边增大压差，一边使加压室45的体积减小，接着，慢慢地使振动板43从加压室45向外侧变位，一边减小压差，一边使加压室45的体积增大，则液体被送向该图的B方向。反之，若使振动板43迅速地向加压室45的外侧变位，一边增大压差，一边使加压室45的体积增大，接着慢慢地使振动板43从加压室45向内侧变位，一边减小压差，一边使加压室45的体积减小，则液体被送向该图的A方向。
而且，第1流路和第2流路的、相对压差变化的流路阻力的变化比例的不同，并不一定是由于流路的长度的不同，也可以是基于其它的形状的不同。
根据上述那样的结构的压电泵，通过改变泵的驱动电压和频率，能控制液体的输送方向和输送速度。在图2(c)中示出了该泵的其它例子。在该例子中，由硅基板71、压电元件44和未图示的挠性线构成泵。硅基板71是用光刻技术将硅片加工成规定的形状制成的，通过蚀刻形成加压室45、隔膜43、第1流路46、第1液室48、第2流路47、以及第2液室49。在第1液室48上设有孔72，在第2液室49上设有孔73，例如，在使该压电泵为与图1的芯片不是一体的情况下，通过该孔72、73与芯片1的泵连接部连通。例如，通过使穿有孔72、73的基板74与微反应器的泵连接部附近上下重合，能将泵连接到芯片1上。另外，如以上所述，也可以在一片硅基板上形成多个泵。在这种情况下，希望将驱动液罐连接到与芯片1连接的孔的相反一侧的孔上。在具有多个泵的情况下，这些孔也可以连接到共同的驱动液罐上。

图3所示是使压电泵为与图1的芯片1不是一体的情况下的芯片1的泵连接部周边的结构。该图(a)表示输送驱动液的泵部的结构，该图(b)表示输送扩增试剂的泵部的结构。在此，24是驱动液的收容部，驱动液可以是矿物油等油类，或者水类的任何一种液体。25是密封预先收容的扩增试剂的密封液的收容部。该密封液是用于防止由于试剂向微细流路泄漏而起反应了等情况的，在使用前，在保存微反应器(μ-TAS)芯片的冷藏条件下，固定或凝胶化，在使用时，若在室温下则融化，变成能流动的状态。虽然空气介于密封液和扩增试剂之间也没关系，但出于定量送液的考虑，最好是介入的空气的量(相对试剂量)要充分地少。另外，密封液可以填充在微细流路中，或者也可以填充在为密封液用而设置的收容部中。
抽除空气用的流路26设置在泵连接部12和扩增试剂收容部7之间的流路上。该抽除空气用的流路26从泵连接部12和扩增试剂收容部7之间的流路上分出来，其末端敞开。例如在连接泵等时，使其从该抽除空气用的流路26除去存在于流路内的气泡。
出于防止例如水等水性液体泄漏的考虑，该抽除空气用的流路26，其流路直径最好在10μm以下，且与流路里面的水的接触角在30°以上。
13是具有图14所示的结构的疏水性阀，该疏水性阀13，切断通过的液体，一直到向正方向输送的液体压力达到规定压力，通过对输送液体施加规定压力以上的压力，允许液体通过。如图所示，疏水性阀13由截流流路直径的部分构成，由此限制从一端侧到达了该截流流路51的图14(b)的液体27向另一端侧通过。该截流流路51制成相对两侧串联连接的长宽为200μm×200μm的流路，长宽为200μm×30μm左右。

在将液体27从小直径的截流流路51的端部挤向大直径的流路50时，由于表面张力，需要规定的送液压力。因此，由于能由来自微泵的泵压力控制液体的停止和通过，所以，例如，能够在流路的规定的部位，使液体暂时停止移动，以规定的配时，恢复从该部位向原先的流路送液。
根据需要，也可以在截流流路51的内面实施疏水性涂敷，例如实施氟类涂敷。
<待检样品的前处理>
从待检样品收容部2注入例如全血、血清、血沉棕黄层、尿、粪便、唾液、喀痰或其它的体液等待检样品。对于包含在这些待检样品中的、或者具有这种可能性的可能被检测的细菌、病毒，并不进行特别的限定。细菌、病毒的基因，最好是如果固有的DNA序列是已知的，则用于检测的PCR引物可以用公知的技术制作，所以，任何东西都可以检测。作为具体的例子，可以举出结核菌、MRSA、流感病毒、新型感染病原菌等。所需要的待检样品量，例如，作为DNA是0.001～100ng。
如图4所示，注入到待检样品收容部2中的待检样品，用与溶菌试剂收容部3连接的压电泵1进行输送，与例如包含溶菌酶(lysozyme)的水溶液那样的溶菌试剂混合，待检样品中的菌体被溶解。作为溶菌试剂可以使用任意的公知的。被溶解到菌体处的菌体基因，吸附在填充在载体填充部4的微细流路4a内的微粒状的载体55上。
作为载体55，可以使用例如由玻璃、硅胶、羟磷灰石、硅藻土等构成的空心颗粒、粉末等。作为一个例子，颗粒直径为0.05～1000μm的玻璃空心颗粒以0.05g/ml～1.3g/ml的密度填充在微细流路4a内。
最好是，输送到载体填充部4的、包含菌体基因的液体，如该图的箭头所示，切换其前后送液方向，驱动微泵，使液体在载体填充部4内向流路方向反复前后运动。因此，菌体基因56与微粒状载体55相遇的概率提高了，能使多个菌体基因56在短时间内吸附在微粒状载体55上，能提高效率。虽然由于情况下的不同而有所不同，但最好是使其做往复运动，振幅是5mm、周期是5秒左右。
图6是表示使在载体填充部4内的包含菌体基因的液体前后运动的送液用微泵11的控制系统的图。如图所示，送液用微泵11通过放大器32、D/A转换器33与微型计算机34连接。微型计算机34搭载有定时器35，以预先计划的配时控制送液用微泵11的送液。而且，控制微泵11的32～35系统虽然可以在芯片内，但也可以组装在微反应器装置本体上，通过将芯片1安装在装置本体上，也能将芯片1的泵连接部连接到装置本体的微泵上，控制其动作。
图5是表示待检样品收容部、溶菌试剂收容部以及载体填充部上的送液系的其它例子的图。如图所示，在待检样品收容部2上也连接有微泵11，也可以分别控制来自待检样品收容部2的待检样品送液、和来自溶菌试剂收容部3的溶菌试剂的送液。在这种情况下，例如在待检样品收容部2一侧的微细流路上设置单向阀等阀57，在使导入到载体填充部4内的包含菌体基因的液体前后运动时，关闭阀57、用与溶菌试剂收容部3连接的微泵11进行送液的切换。
在使菌体基因吸附在载体填充部4的微粒状载体上之后，从图1的清洗液收容部4输送例如Tris-EDTA-NaCl/乙醇混合液等清洗液，使其穿过载体填充部4，充分地进行清洗。接着，切换设置在分支部31附近的有源阀等阀(图未示)，从提取试剂收容部6向载体填充部4输送例如Tris-EDTA缓冲液等提取试剂，洗提吸附在微粒状载体上的菌体基因，作为前处理液向反应部9送液。

而且，在菌体基因是RNA的情况下，在利用恰当的反转录酶转变成cDNA之后，进行基因扩增反应。
<基因扩增反应以及检测>
将对待检样品进行前处理的待检样品处理液和来自扩增试剂收容部7的扩增试剂输送到反应部9，进行基因扩增反应。反应部9，根据情况下的不同，既可以是宽的集液槽状，也可以是微细流路。
与多个试剂相对应，设置多个扩增试剂收容部7，试剂与试剂的混合、以及待检样品处理液与试剂的混合，既可以在单一的混合部以所希望的比例进行混合，或者也可以将哪个或双方进行分割，设置多个合流部进行混合，使其最终为所希望的混合比例。
图9所示是扩增试剂收容部以及试剂混合部结构的一个例子。这样一来，在各扩增试剂收容部7a、7b、7c上连接有微泵(在该例子是压电泵)11，在来自这些各收容部的流路合流的前方设有试剂混合部14。而且，这些各部由珀耳帖元件冷却。即，在图9中，在设置扩增试剂收容部7a、7b、7c的区域A1，如图10(a)所示，珀耳帖元件59设置在芯片的下面，在图9中，在设置试剂混合部14的区域A2，如图10(b)所示，珀耳帖元件59也设置在芯片的下面。
珀耳帖元件59也可以设置在这些各部的芯片的上面，或也可以设置在上下两面上。这样一来，通过冷却扩增试剂收容部7和试剂混合部4，能防止试剂由于加热而变质。特别是，在PCR扩增，需要对温度进行控制，使其在3个温度之间升降。另外，即使在为基因扩增应用ICAN(Isothermal chimera primer initiated nucleic acidamplification)法的结构的情况下，由于需要使扩增反应部为50～65℃，所以，虽然在反应部的升温过程中、或试剂混合等时，试剂被加热容易变质，但如图10所示，通过设置珀耳帖元件进行冷却能防止其变质。通常，如果能将扩增试剂收容部7和试剂混合部14保持在4℃以下的程度，则能充分地防止试样变质。
最好是预先将试剂收容在扩增试剂收容部7，以使其不分场所或时间都能迅速地进行检查。为了防止内藏在芯片内的试剂类等，蒸发、漏失、混入气泡、污染、变性等，其试剂部的表面进行密封处理，用密封材料(密封液)密封。这些密封材料(在图3中收容在密封液收容部25)，在使用前，在保存微反应器(μ-TAS)芯片的冷藏条件下，固定或凝胶化，在使用时，若在室温下则融化，变成能流动的状态。作为这样的密封材料，可以使用对水难溶性的可塑性物质，最好是对水的溶解度在1％以下，且融点是8℃～室温(25℃)的油脂、以及明胶的水溶液。明胶的水溶液，可以通过改变明胶的浓度调整凝胶化温度，例如，为了使其在10℃左右凝胶化，可以使其为大约为1％的水溶液。
以下对在反应部进行的基因扩增反应进行说明。
●扩增法本发明的微反应器并不限定扩增方法。例如，作为DNA扩增技术，可以使用在许多方面广泛利用的PCR扩增法。人们详细地研究了用于实施该扩增技术的各种条件，也包含各种变化方法、改良点，记载于各种文献等中。虽然PCR扩增需要控制温度，使其在3个温度之间升降，但能对微型芯片进行恰当的温度控制的流路器件已经由本发明人提出了(日本专利公报特开2004-108285号)。可以将该流路器件应用于本发明的芯片的扩增用流路。因此，热循环能被高速切换，由于将微细流路作为热容量小的微型反应单元，所以，与通过手工作业、用微管、微小玻璃瓶等进行的现有的方式相比，DNA能在短时间内进行扩增。
像PCR反应那样，不需要复杂的温度控制的、最近开发的ICAN(Isothermal chimera primer initiated nucleic acidamplification)法，具有在50～65℃的任意一定的温度下，能在短时间内实施DNA扩增的特征(国际专利第3433929号)。因此，ICAN法在本发明的微反应器，由于以简便的温度控制就可以了，所以，是恰当的扩增技术。用手作业需要1小时的本法，在本发明的微反应器，用10～20分钟，最好是用15分钟就连分析都完成了。
DNA扩增反应，也可以是其它的PCR变化方法，本发明的微反应器具有通过流路设计变更等使之能与任何变化相对应的弹性。即使在使用任意的DNA扩增反应的情况下，其技术的详细情况也公开了，本行业人员能很容易地引入。
●试剂类(i)引物PCR引物是在想要扩增的特定部位的DNA链的两端互补的2种寡核苷酸。该设计已经开发了专用的用途，如果是本行业人员的话，通过用DNA合成仪、化学合成等能很容易地制成。ICAN法用的引物虽然是DNA和RNA的嵌合体引物，但它的制备法在技术方面也已经确定(国际专利第3433929号)。引物的设计、选择，决定了扩增反应的成败、效率，所以使用最恰当的是很重要的。
另外，若使生物素与PCR引物结合，通过与基板上的链霉亲合素蛋白的结合，能将扩增产物的DNA固定在基板上，可供于扩增产物的定量。作为其它的引物标记物质，可以例举出地高辛、各种荧光色素等。
(ii)扩增反应用试剂类以扩增反应所使用的酶为首的试剂类，PCR用、ICAN法的任意一种试剂都能很容易地得到。
PCR法的试剂类，至少除了2′-脱氧核糖核苷-5′-三磷酸之外，包含Taq DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶或Pfu DNA聚合酶。

ICAN法的试剂类，至少包含2′-脱氧核糖核苷-5′-三磷酸、能特异地与要检测的基因杂交的嵌合体引物、具有链置换活性的DNA聚合酶、核酸内切酶的RNase。
(iii)对照物内部对照物，对于目标核酸(DNA、RNA)来说，作为扩增的监控或者定量时的内部标准物质使用。由于在与待检样品不同的序列的两侧具有与待检样品用引物相同的引物能使其杂交的序列，所以，内部对照物的序列能与待检样品同样地扩增。
阳性对照物的序列，是检测待检样品的特异性序列，引物杂交的部分和它们之间的序列是与待检样品相同的。对照物所使用的核酸(DNA、RNA)最好是使用公知的技术文献所记载的对照物。阴性对照物包含所有的核酸(DNA、RNA)以外的试剂等，用于有无污染的检查、本底修正。
(iv)反转录用试剂在是RNA的试样的情况下，是用于由RNA合成cDNA的反转录酶、反转录引物等，这些也是市场上销售的，能很容易地得到。
图7是表示待检样品处理液和试剂的混合以及进行反应的流路结构的一个例子的图。如图所示，由微泵(图未示)从待检样品处理液侧的流路54输送的待检样品处理液和由微泵11从试剂收容部7输送的试剂，在Y字流路的合流部58合流，送液到后续的微细流路9a。
微细流路9a，例如宽为0.2mm，深为0.2mm，在该微细流路9a内进行ICAN反应。
在将待检样品处理液和试剂填充到微细流路9a内后，驱动输送试剂的微泵11，使其反复切换送液方向，使微细流路9a内的合流液在微细流路9a内前后运动，进行ICAN反应。例如，在微细流路9a的宽是0.2mm、深是0.2mm、液量是25μl的情况下，最好是使其以振幅是25mm、周期是5秒左右往复运动。
由于该前后运动，微细流路9a内的试剂和待检样品快速地扩散混合，而且，由于流路的中心部分和壁面附近的液体的流速梯度，DNA和试剂相遇的概率变高了，提高了反应速度。
另外，在待检样品处理液侧的流路54上设有单向阀、有源阀等阀57，在混合时若将关闭，而且，由输送试剂的微泵11使微细流路9a内的合流液前后运动，则没有必要将混合用的其它的微泵配置在流路中。该微泵11，最好是图2所示的压电泵。
在图7中，虽然仅用一方的微泵11使合流液往复运动，但也可以不设置阀57，通过驱动待检样品处理液侧的微泵和试剂收容部7侧的微泵11使微细流路9a内的合流液往复运动。
图8是表示送液用微泵11和阀57的控制系统的图。如图所示，送液用微泵11通过放大器32、D/A转换器33与微型计算机34连接。
再有，用于开关阀57的气缸36通过D/A转换器33与微型计算机34连接。
微型计算机34搭载有定时器35，以预先计划的配时控制送液用微泵11的送液。而且，控制送液用微泵11的送液以及阀57的开关。即使对于这些控制部来说，在如以上所述组装在微反应器装置本体上，将芯片1的泵连接部连接到装置本体的微泵上的情况下，也可以控制其动作。
当在反应部进行基因扩增反应后，用检测部检测扩增反应。该检测部10虽然根据情况的不同也可以兼为反应部9，但在用后述的金属胶体的检测，是用吸附链霉亲合素蛋白的其它的检测部检测。另外，在使内部对照物与菌体基因同时扩增反应后，最好是分割扩增反应液，用其它的检测部进行菌体基因的扩增检测和内部对照物的扩增检测。来自检测试剂收容部8的检测试剂(例如金属胶体溶液，发光试剂等)被输送向检测部10、或者反应部9和检测部10之间的流路，使其与反应扩增液或其处理物混合，或接触。
在本发明，检测扩增的目标基因的DNA的方法并没有特别的限定，可以根据需要使用恰当的方法。作为这样的方法，称为可视分光测光法、荧光测定法、发光冷光法的检测方法是主流。再有，也可以举出电化学方法、表面等离子体共振、石英晶体微天平等方法。检测扩增反应，最终能用可见光以高灵敏度测定的方式较为理想。与荧光测光相比，器械是广泛使用的，妨碍因素少，且能简单地测定，数据处理也容易。
可以举出作为本发明应用的恰当的反应、检测方法包含(1)使来自待检样品的菌体基因的DNA和生物素修饰了的引物在反应部9反应，进行基因扩增的工序；(2)混合包含扩增了的基因的扩增反应液和变性液，对扩增了的基因进行变性处理，使其为单链的工序；(3)将对扩增了的基因进行变性处理使其为单链的处理液输送到吸附了链霉亲合素蛋白的微细流路内，固定上述扩增了的基因的工序；(4)使由FITC(fluorescein isothio cyanate)标记末端的探针DNA在固定了扩增的基因的微细流路内流动，使其与能将其固定的基因杂交的工序；(5)使最好是由与FITC特异性结合的抗FITC抗体修饰了表面的金属胶体液在上述微细流路内流动，由此使该金属胶体吸附在与固定了的基因杂交的FITC修饰探针上的工序；(6)光学测定上述微细流路的金属胶体的浓度的工序。
在上述方法中，生物素化DNA、用生物素-链霉亲合素蛋白结合的固定、FITC荧光标记、FITC抗体等是公知技术。另外，也可以是在使FITC标记探针DNA与扩增基因杂交之后，使其固定在吸附了链霉亲合素蛋白的微细流路上的顺序方式。在本发明，最好是上述(3)接着是(4)的顺序的结构。
最好是包含在上述各工序之间，根据需要将清洗液输送到吸附了链霉亲合素蛋白的上述流路内的工序。作为这样的清洗液，最好是例如各种缓冲液、盐类水溶液、有机溶剂等。
在上述工序中，变性液是用于使基因DNA为单链的试剂，可以举出例如氢氧化钠、氢氧化钾等。探针可以举出寡聚脱氧核苷酸等。另外，除了FITC之外，可以举出RITC(罗丹明异硫氰酸盐)等荧光物质。
上述前处理、扩增以及检测，是在将芯片安装在装置本体上的状态下开始的，而该装置本体，是预先将与送液顺序、容量、配时等相关设定的各种条件与微泵以及温度的控制一起作为程序的内容所具有的软件、上述微泵、检测装置以及温度控制装置是一体的。在注入试样后开始分析，基于试样以及试剂类的送液、前处理、混合的基因扩增反应、基因检测反应以及光学测定，作为一连串的连续工序自动地实施，测定数据与必要条件、记录事项一起存储在外存储器内。
图11是表示用上述方法检测依据ICAN法的扩增反应的反应部以及检测部周边的流路结构的图。特异性地与检测对象——基因杂交的、生物素修饰的嵌合体引物、具有链置换活性的DNA聚合酶、以及核酸内切酶等试剂，收容在图9的扩增试剂收容部7a、7b、7c中，由各试剂收容部的上游侧的微泵11，将试剂从各试剂收容部输送到下游侧的流路14进行混合。
在各试剂收容部7a、7b、7c中，例如收容有总共超过7.5μl的试剂，切掉前端的计7.5μl的试剂混合液，各2.5μl输送到分成3条的流路，其中一个流路，与图11的B的位置连通，连向用于与待检样品处理液反应以及其检测的系统。虽然图未示出，但另一流路与用于和阳性对照物的反应以及其检测的系统连通，剩下的一个流路，与用于阴性对照物的反应以及其检测的系统连通。
从图11的B位置输送的混合试剂填充在贮留部17a。待检样品处理液从图11的A位置送出、定量地填充在贮留部17b(2.5μl)，定量输送到后续的流路。填充在各贮留部17a、17b的待检样品处理液和试剂混合液通过Y字形流路输送到流路15a(容积5μl)，在该流路15a内进行混合以及ICAN-PCR反应。
将5μl的反应液和收容在停止液收容部21a中的1μl的反应停止液输送到容积为6μl的流路15b，通过将它们混合，扩增反应停止。接着，将收容在变性液收容部21b中的变性液(1μl)和反应液与停止液的混合液(0.5μl)输送到容积为1.5μl的流路15c进行混合，使扩增了的基因变性成1条链。
将该处理液输送到使链霉亲合素蛋白吸附在流路内的链霉亲合素蛋白吸附部10a、10b，将扩增基因固定在该流路内，接着，使清洗液从清洗液收容部向链霉亲合素蛋白吸附部10a、10b流动，进行清洗。
接着，将收容在杂交缓冲剂收容部21c中的杂交缓冲剂收容在链霉亲合素蛋白吸附部10a、10b。接着，用单一的泵11，将收容在各收容部21f、21d、21e、21d的、用FITC荧光标记末端的菌体基因的探针DNA溶液、清洗液、以及用FITC抗体标记的金属胶体的溶液，以该图所示的顺序向流路10a内输送。同样，用单一的泵11，将收容在各收容部21g、21d、21e、21d的、内部对照物探针DNA溶液、清洗液、以及用FITC抗体标记的金属胶体的溶液，以该图所示的顺序向固定了扩增基因的流路10b内输送。
而且，最好是构成流路，以使在将1条链的扩增基因固定在链霉亲合素蛋白吸附部10a、10b上之前的阶段，使探针DNA与1条链的扩增基因杂交。
通过输送金属胶体溶液，金属胶体通过FITC与固定了的扩增基因结合、固定。通过用光学技术检测该固定了的金属胶体，测定有没有扩增或扩增效率。
这样一来，使内部对照物与待检样品的前处理液一起进行扩增反应，分割扩增反应液，将其输送到其它的检测部10a、10b，由于用一方的检测部10a检测菌体基因的扩增，用另一方的检测部10b检测内部对照物的扩增，所以能用简单的结构，迅速地进行高可靠性的检查。
如图11所示，在试剂收容部、反应部以及检测部之间的流路上的适当的位置，设有单向阀16。除此之外，最好是像上述那样，在用于防止称为交叉污染的适当的位置(例如图11的泵连接部12的下游侧的附近位置)也设置单向阀。
图12(a)、(b)是表示本实施方式的微反应器的流路所使用的单向阀的一个例子的截面图。图12(a)的单向阀，将微小球67作为阀芯，通过该微小球67的移动开关在基板62上形成的开口68，由此允许液体通过以及将切断。即，在从A方向输送液体时，由于液压，微小球67离开基板62，打开开口68，因此，允许液体通过。另一方面，在液体从B方向反向流动的情况下，微小球67坐在基板62上，关闭开口68，因此，液体的流路被切断。
图12(b)的单向阀，层叠在基板62上、其端部向开口68的上侧延伸的挠性基板69，由于液压在开口68的上侧上下运动，由此开关开口68。即，在从A方向输送液体时，由于液压，挠性基板69的端部离开基板62，打开开口68，因此，允许液体通过。另一方面，在液体从B方向反向流动的情况下，挠性基板69紧贴在基板62上，关闭开口68，因此，液体的流路被切断。
这样一来，虽然为了防止液体倒流、正确地进行规定的送液，最好是配设单向阀，但作为利用单向阀的适当的机构，可以举出图13所示的定量送液机构。该机构，如图所示，在单向阀16和疏水性阀13a之间的流路(试剂填充流路15A)上填充有规定量的试剂。另外，设有从该试剂填充流路15A分出的、与输送驱动液的微泵11连通的分支流路15B。
像以下那样定量输送试剂。最初，由从疏水性阀13a向前方未通过的试剂液60的送液压力将试剂液60供给到试剂填充流路15A，由此从单向阀16一侧填充试剂液60。接着，由允许试剂液60从疏水性阀13a向前方通过的送液压力，由微泵11通过疏水性阀13b从分支流路15B向朝向试剂填充流路15A的方向输送驱动液70，由此将填充在试剂填充流路15A中的试剂液60从送液控制部15A向前方挤出，由此定量地输送试剂液60。虽然有时在分支流路15B存在有空气、密封液等，但即使在这种情况下，由于用微泵11输送驱动液70，将空气、密封液等送入到试剂填充流路15A，所以能挤出试剂。而且，由于在试剂填充流路15A上设有大容积的贮留部17a，所以能减小定量的偏差。
而且，将该定量送液机构用于图11的试剂混合液的定量(该图的X2的位置)、以及待检样品处理液的定量(该图的X1的位置)。
以上虽然对本发明的实施方式进行了说明，但本发明并不限定于这些实施方式，在不脱离其主要意思的范围内能作各种各样的变形、变更。
权利要求
1.基因检查用微反应器，其特征在于，其具备载体填充部，填充有微粒状载体，待检样品或对上述待检样品进行了前处理的处理液、和溶菌试剂混合，所述微粒状载体从包含用上述溶菌试剂溶解的菌体基因的液体吸附上述菌体基因；微泵连接部，与上述载体填充部的上游连通、连接向双向进行液体送液的微泵；以及控制装置，控制微泵，使其切换输送到上述载体填充部的上述菌体基因的液体的送液方向、使上述液体在上述载体填充部反复前后运动。
2.根据权利要求1所记载的基因检查用微反应器，其特征在于，其具有扩增试剂收容部，收容扩增试剂；溶菌试剂收容部，收容溶解注入的待检样品或对上述待检样品进行了前处理的处理液中的菌体的溶菌试剂；提取试剂收容部，与上述载体填充部的上游连通、收容提取吸附在上述载体上的上述基因的提取基因试剂；扩增试剂收容部，与上述载体填充部的下游连通、收容进行基因扩增反应的扩增试剂；反应部，设置在上述载体填充部的下游、由从上述提取试剂收容部输送的上述提取基因试剂从上述载体提取的基因、和从上述扩增试剂收容部输送的上述扩增试剂混合，使该混合的液体反应、进行基因扩增；以及第1检测部，设置在上述反应部的下游、输送进行了上述基因扩增的上述扩增试剂，对基因进行检测，上述载体填充部设置在上述溶菌试剂收容部的下游，混合上述注入了的待检样品或对上述待检样品进行前处理的处理液、和收容在上述溶菌试剂收容部的溶菌试剂，输送包含由上述溶菌试剂溶解了的菌体基因的液体。
3.根据权利要求2所记载的基因检查用微反应器，其特征在于，其具有微泵连接部，连接与上述反应部的上游连通的向双向进行送液的微泵；控制装置，控制与上述反应部的上游连通的微泵、切换送液方向，使混合上述基因和从上述扩增试剂收容部输送的上述扩增试剂的液体在上述反应部反复前后运动。
4.根据权利要求2所记载的基因检查用微反应器，其特征在于，上述微泵具备流路阻力根据压差的不同而变化的第1流路；相对压差的变化流路阻力的变化比例比第1流路小的第2流路；连接第1流路和第2流路的加压室；改变该加压室的内部压力的操作装置；驱动该操作装置的驱动装置。
5.根据权利要求3所记载的基因检查用微反应器，其特征在于，上述微泵具备流路阻力根据压差的不同变化的第1流路；相对压差的变化流路阻力的变化比例比第1流路小的第2流路；连接第1流路和第2流路的加压室；改变该加压室的内部压力的操作装置；驱动该操作装置的驱动装置。
6.根据权利要求2所记载的基因检查用微反应器，其特征在于，在上述扩增试剂收容部、溶菌试剂收容部、载体填充部、提取试剂收容部、反应部、第1检测部、以及微泵连接部之间，设有至少1个阻止液体倒流的单向阀。
7.根据权利要求2所记载的基因检查用微反应器，其特征在于，上述扩增试剂收容部设有冷却混合的试剂混合部的冷却装置。
8.根据权利要求7所记载的基因检查用微反应器，其特征在于，上述冷却装置是珀耳帖元件。
9.根据权利要求2所记载的基因检查用微反应器，其特征在于，具有送液分割装置，将液体分割为2个流路；和第2检测部，进行基因检测；在上述2个流路的各自的下游设置上述第1检测部和第2检测部，用上述送液分割装置，将包含在上述反应部同时扩增了的上述菌体基因和内部对照物的扩增试剂分割成2部分，输送到第1和第2检测部，分别在检测部检测上述菌体基因和内部对照物。
全文摘要
本申请提供一种确保广泛应用性和高灵敏度，实现一次性的低成本性，能以简单的结构高精度地检测，而且，能高效且迅速地对待检样品进行适合于扩增反应的前处理的、用于检测菌体的基因检查用微反应器。在该反应器中，由收容在溶菌试剂收容部3中的溶菌试剂溶解待检样品中的菌体，在使菌体基因吸附在填充在载体填充部4内的载体上之后，进行清洗和提取菌体基因的前处理。还设有切换包含输送到载体填充部4的菌体基因的液体的送液方向使其反复前后运动的控制装置、单向阀、冷却扩增试剂收容部7和试剂混合部的珀耳帖元件等冷却装置。
文档编号C12M1/34GK101048490SQ20058003641
公开日2007年10月3日 申请日期2005年10月18日 优先权日2004年10月27日
发明者中岛彰久, 上田荣一, 山东康博, 东野楠, 石田畅久 申请人:柯尼卡美能达医疗印刷器材株式会社