专利名称：通过酶促乙醇酸－乙醛酸循环反应测定髓过氧化物酶的方法和试剂盒的利记博彩app
技术领域：
本发明一般涉及髓过氧化物酶检测领域。特别地，本发明提供用于检测样品中的髓过氧化物酶的方法和试剂盒。
背景技术：
髓过氧化物酶(MPO；EC 1.11.1.7)是一种大约150kDa的四聚体的、大量糖基化的碱性血红素蛋白。它由两个相同的二硫键连接的原聚体组成，其每一个原聚体具有含有原卟啉的59-64kDa重链亚单位和14kDa的轻链亚单位。U.S.Pub.No.2002/0164662；Hoy等.，Clin.Chem.Lab.Med.402-8(2002)。在体内，MPO通过两电子过氧化反应步骤将Cl-转化成为次氯酸，HOCl，一种能够破坏微生物的强氧化剂。Marquez等.，J.Biol.Chem.2655666-5670(1990)。
MPO在针对侵入的微生物的宿主防御中起着重要的作用。MPO富含在嗜中性粒细胞和单核细胞中，分别占这些细胞干重的5％和1-2％。Marquez等.，J.Biol.Chem.2655666-5670(1990)；U.S.Pub.No.2002/0164662。
MPO参与广谱疾病。除了通过产生HOCl而参与针对微生物的防御，MPO在炎症状态下被释放，在所述状态中迁移的嗜中性粒细胞可以释放活性酶。Hoy等.，Clin.Chem.Lab.Med.402-8(2002)。在传染病中已报道了增加的MPO水平，和抗-MPO抗体在全身性脉管炎中累积。MPO还参与非传染性疾病，诸如动脉硬化症、癌症和前髓细胞白血病、包括阿尔茨海默疾病和多发性硬化病的神经退化型疾病。Hoy等.，Clin.Chem.Lab.Med.402-8(2002)。
在临床化学上，MPO mRNA被广泛地用作急性骨髓性白血病(AML)的标记。Bennett等.，Br.J.Haematol.33451-8(1976)。还报道，MPOG-463A多态性的更高表达基因型与AML相关。Reynolds等.，Blood 902730-7(1997)。以G/A转换为特征的MPO G-463A多态性位于含有激素应答元件的启动子区域的Alu序列。G/G基因型与白血病患者细胞中增加的MPO表达和蛋白水平相关。Reynolds等.，Blood 902730-7(1997)。也已经表明，对于A等位基因纯合的受试者处于降低的患肺癌的风险。London等.，Cancer Res.575001-3(1997)；Le Marchand等.，CancerEpidermiol.Biomarkers Prev.9181-4(2000)；Cascorb等.，Cancer Res.60644-9(2000)；Schabath等.，Carcinogenesis 211163-6(2000)。然而，最近的研究表明，A等位基因与老年男性子集中增加的肺癌危险相关。Misra等.，Cancer Lett.164161-7(2001)。
MPO在患有多发性硬化病(MS)的患者的脑的小神经胶质细胞中和在环绕阿尔茨海默疾病(AD)病例的大脑皮层的老年斑的小神经胶质细胞中存在。Jolivalt等.，Neurosci.Lett.21061-4(1996)；Nagra等.，J.Neuroimmunol.7897-107(1997)。MPO水平的变化还与动脉硬化症和脑梗塞相关。据报道MPO/H2O2/Cl-系统是参与起始动脉粥样硬化损伤的一种可能的机制。Dautherty等.，J.Clin.Invest.94437-44(1994).Heinecke等.Curr.Opinion Lip.8268-74(1997)；Hazell等.，J.Clin.Invest.971535-44(1996)；Malle等.，Eur.J.Biochem.2674495-503(2000)。动脉粥样硬化的主要后果之一是脑梗塞，并且MPO活性的测定被广泛地用作脑实质嗜中性粒细渗透的标记。Barone等.，J.Neuroscie.Res.29336-45(1991)。增加的MPO活性已经在缺血性脑梗塞后的患者的血清中观察到。Re等.，Eur.J.Emerg.Med.45-9(1997)。MPO的测定还被用于预测心脏血管危险。Brennan等.，N.Engl.J.Med.3491595-1601(2003)；U.S.Pub.No.2002/0164662。
MPO参与的广泛范围的疾病，以及将MPO用作临床标记和治疗靶点的可能性，使得用于正确测定MPO水平和活性的检测非常有价值。已经报道了一些检测方法。WO 02/090575，U.S.Pat.No.6,022,699。然而，对于检测MPO的可靠的和灵敏的方法仍存在一定的需要。
发明简述本发明提供用于检测样品中的髓过氧化物酶的方法，所述方法包括a)将怀疑含有髓过氧化物酶的样品与丝氨酸、过氧化氢、和氯接触，以产生乙醇醛；b)在乙醇醛转化酶和以其氧化形式的第一电子受体的存在下，将步骤a)中的所述乙醇醛转化成为乙醇酸(glycolate)；c)在以其氧化形式的第二电子受体和乙醇酸转化酶的存在下，将步骤b)的所述乙醇酸转化成为乙醛酸，由此产生还原形式的第二电子受体；在以其还原形式的第三电子受体和乙醛酸转化酶的存在下，所述乙醛酸被转化回到乙醇酸，以形成循环反应系统，由此产生氧化形式的第三电子受体；其中所述第二电子受体和第三电子受体是不同的；和d)评估所述循环反应系统中还原或氧化形式的第二电子受体或者还原或氧化形式的第三电子受体的浓度变化，由此确定样品中髓过氧化物酶的存在、不存在和/或量。
在一些实施方案中，步骤b)的第一电子受体不同于步骤c)的第二电子受体和/或第三电子受体。在其它实施方案中，步骤b)的第一电子受体和步骤c)的第二电子受体是相同的。在其它实施方案中，步骤b)的第一电子受体和步骤c)的第三电子受体是相同的。
在一些实施方案中，将怀疑含有髓过氧化物酶的样品与丝氨酸、过氧化氢、氯、乙醇醛转化酶、和以其氧化形式的第一电子受体相接触。在其它实施方案中，将怀疑含有髓过氧化物酶的样品与丝氨酸、过氧化氢、氯、乙醇醛转化酶、以其氧化形式的第一电子受体、乙醇酸转化酶、和以其氧化形式的第二电子受体相接触。
在一些实施方案中，步骤b)的乙醇醛转化酶是乙醇醛脱氢酶，并且所述第一电子受体选自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰-NAD+、和乙酰-NADP+组成的组。
在一些实施方案中，步骤c)的循环反应系统中的所述乙醇酸转化酶和所述乙醛酸转化酶是不同的。在一些实施方案中，所述乙醇酸转化酶不与第三电子受体反应，或者对于第三电子受体具有比第二电子受体更低的亲和力，并且所述乙醛酸转化酶不与第二电子受体反应，或者对于第二电子受体具有比第三电子受体更低的亲和力。在一些实施方案中，所述乙醇酸转化酶是乙醇酸还原酶或乙醇酸氧化酶。在一些实施方案中，所述乙醛酸转化酶是乙醛酸还原酶或D-甘油酸脱氢酶。
在一些实施方案中，所述乙醇酸转化酶是乙醇酸还原酶，并且所述乙醛酸转化酶是乙醛酸还原酶。对于这些实施方案，氧化形式的第二电子受体可以选自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰-NAD+、和乙酰-NADP+组成的组，并且还原形式的第三电子受体可以选自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰-NADH、乙酰-NADPH、(R)-乳酸、2，6-二氯靛酚和吩嗪硫酸二甲酯组成的组。
在其它实施方案中，所述乙醇酸转化酶是乙醇酸氧化酶，并且所述乙醛酸转化酶是D-甘油酸脱氢酶。对于这些实施方案，氧化形式的第二电子受体可以是O2，并且还原形式的第三电子受体可以是选自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰-NADH、乙酰-NADPH组成的组。
在一些实施方案中，步骤c)的循环反应系统中的乙醇酸转化酶和乙醛酸转化酶是相同的。例如，乙醇酸转化酶和乙醛酸转化酶都是乙醇酸还原酶或乙醛酸还原酶。氧化形式的第二电子受体可以选自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰-NAD+、和乙酰-NADP+组成的组，并且还原形式的第三电子受体选自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰-NADH、和乙酰-NADPH组成的组。
在所述循环反应系统中，还原或氧化形式的第二电子受体或者环氧或氧化形式的第三电子受体的浓度变化可以通过光度测定方法进行评估。
本发明的方法还包括在步骤d)后将氧化或还原形式的第二电子受体或者还原或氧化形式的第三电子受体偶联到生色剂上的步骤，其中氧化或还原形式的第二电子受体或者还原或氧化形式的第三电子受体的浓度变化通过比色方法进行评估。
可以通过本发明方法进行评估的样品包括生物流体。所述生物流体可以是血液、血清、血浆或尿液。
本发明的方法可以用于疾病的预后和/或诊断。这样的疾病的实例是动脉硬化症、中风、多发性硬化、阿尔茨海默疾病、肺癌、白血病和传染病。
本发明还提供用于检测髓过氧化物酶的试剂盒，其包括丝氨酸、过氧化氢、氯、催化乙醇醛转化为乙醇酸的乙醇醛转化酶和以其氧化形式的第一电子受体、催化乙醇酸转化成乙醛酸的乙醇酸转化酶和以其氧化形式的第二电子受体、以及催化乙醛酸转化成乙醇酸的乙醛酸转化酶和以其还原形式的第三电子受体，其中所述第二电子受体和第三电子受体是不同的。
在一些实施方案中，步骤b)的第一电子受体与步骤c)的第二电子受体和/或第三电子受体不同。在其它实施方案中，步骤b)的第一电子受体和步骤c)的第二电子受体是相同的。在其它实施方案中，步骤b)的第一电子受体和步骤c)的第三电子受体是相同的。
在一些实施方案中，所述乙醇醛转化酶是乙醇醛脱氢酶，并且所述第一电子受体选自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰-NAD+、和乙酰-NADP+组成的组。
在一些实施方案中，在步骤c)的循环反应系统中的乙醇酸转化酶和乙醛酸转化酶是不同的。在一些实施方案中，所述乙醇酸转化酶是乙醇酸还原酶，并且氧化形式的第二电子受体选自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰-NAD+、和乙酰-NADP+组成的组；和所述乙醛酸转化酶是乙醛酸还原酶，并且还原形式的第三电子受体是选自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰-NADH、和乙酰-NADPH(R)-乳酸、2，6-二氯靛酚和吩嗪硫酸二甲酯组成的组。
在其它实施方案中，所述乙醇酸转化酶是乙醇酸氧化酶，并且氧化形式的第二电子受体是O2，以及所述乙醛酸转化酶是D-甘油酸脱氢酶，并且还原形式的第二电子受体是选自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰-NADH、和乙酰-NADPH组成的组。
在一些实施方案中，在步骤c)的循环反应系统中的乙醇酸转化酶和乙醛酸转化酶是相同的。在一些实施方案中，乙醇酸转化酶和乙醛酸转化酶是乙醇酸还原酶或乙醛酸还原酶，并且其中所述氧化形式的第二电子受体是选自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰-NAD+、和乙酰-NADP+组成的组，并且还原形式的第三电子受体是选自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰-NADH、和乙酰-NADPH组成的组。
本发明的试剂盒还可以包括用于实行本申请所述的任何方法的用法说明，和/或对于疾病的预后和/或诊断的指示应用，所述疾病包括但不限于动脉硬化症、中风、多发性硬化病、阿尔茨海默疾病、肺癌、白血病和传染病。
发明详述本发明提供用于检测髓过氧化物酶活性的方法。在所述检测中，将含有髓过氧化物酶或怀疑含有髓过氧化物酶的样品与底物相接触，所述底物包括丝氨酸、过氧化氢和卤化物。如果样品中存在髓过氧化物酶，那么丝氨酸被转化为乙醇醛，乙醇醛进一步被glycoaldehyde转化酶转化成为乙醇酸。然后所述方法应用乙醇酸和乙醛酸之间的循环反应系统来产生可检测的信号，所述可检测的信号与髓过氧化物酶活性相对应。
为了本公开内容的清楚性，并且不是限制的方式，本发明详述被分成下列分部。
A.定义除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的相同的意思。本申请所参考的所有的专利、申请、公布的申请和其它出版物通过参考全文完全结合于此。如果在本部分提出的定义与通过参考结合于此的专利、申请、公布的申请和其它出版物中所提出的定义相反或者另外不相一致，那么在本部分提出的定义优于通过参考结合于此的定义。
当用于本文时，″a″或″an″意为“至少一个”或“一个或多个”。
当用于本文时，″髓过氧化物酶″(EC 1.11.1.7)是指一种从供体和H2O2催化氧化供体和H2O形成的酶。例如，髓过氧化物酶从Cl-和H2O2催化HOCl和H2O的形成。它意欲包括基本上不改变其活性的髓过氧化物酶的衍生物、变体和类似物。髓过氧化物酶可以从任何来源获得，诸如人、小鼠、牛、大鼠、果蝇等。
当用于本文时，“glycoaldehyde转化酶”是指一种在以其氧化形式的电子受体的存在下从glycoaldehyde催化乙醇酸的形成的酶。它意欲包括基本上不改变其活性的乙醇醛转化酶的衍生物、变体和类似物。
当用于本文时，“乙醇酸转化酶”是指在以其氧化形式的电子受体的存在下从乙醇酸催化乙醛酸的形成的酶。它意欲包括基本上不改变其活性的乙醇酸转化酶的衍生物、变体和类似物。
当用于本文时，“乙醛酸转化酶”是指在以其还原形式的电子受体的存在下从乙醛酸催化乙醇酸的形成的酶。它意欲包括基本上不改变其活性的乙醛酸转化酶的衍生物、变体和类似物。
当用于本文时，术语“评估”意欲包括在下列意义上的定量和定性确定，即，获得关于分析物在反应系统中存在的量或浓度的绝对值，以及还获得指示分析物在反应系统中的水平的指数、比例、百分数、光学值(visual)或其它值。评估可以是直接的或间接的，并且实际上检测的化学物种类不必当然是分析物本身，而是可以是，例如，其衍生物或一些其它的物质。
当用于本文时，“样品”是指可以包含需要对其进行分析物检测的分析物的任何事物。所述样品可以是生物样品，诸如生物流体或生物组织。生物流体的实例包括尿液、血液、血浆、血清、唾液、精液、粪便、痰液、脑脊液、泪液、黏液、羊水等。生物组织是细胞聚集体，通常是特殊种类的细胞与它们的细胞间物质一起，形成人、动物、植物、细菌、真菌或病毒结构的结构物质之一，包括结缔组织、上皮组织、肌肉组织和神经组织。生物组织的实例还包括器官、肿瘤、淋巴结、动脉和个体细胞。
当用于本文时，“血清”是指移除血纤维蛋白凝块和血细胞后获得的血液的流体部分，显著不同于循环血液中的血浆。
当用于本文时，“血浆”是指血液的流体、非细胞部分，显著不同于凝结后获得的血清。
当用于本文时，“流体”是指可以流动的任何组合物。因此，流体包括以半固体、糊状、溶液、水性混合物、凝胶、洗液、膏剂形式的组合物和其它这样的组合物。
当用于本文时，“疾病或紊乱(disorder)”是指，例如，由感染或遗传缺陷导致的生物体中的病理病况，并且以可确认的症状为特征。
当用于本文时，“接触”意指使得两种或多种成分在一起。“接触”可以通过将所有的成分在流体或半流体混合物中混合而实现。“接触”还可以这样实现，即，当使得一种或多种成分与一种或多种其它成分在固体表面诸如固体组织切片或底物上接触时而实现。
当用于本文时，“循环反应系统”是指将乙醇酸转化成为乙醛酸并且从乙醛酸转化回到乙醇酸的过程。
B.用于检测髓过氧化物酶的方法本发明提供用于检测髓过氧化物酶在样品中存在、不存在和/或其量的方法，所述方法包括a)将含有髓过氧化物酶或怀疑含有髓过氧化物酶的样品与丝氨酸、过氧化氢和卤化物(优选为氯)接触，以产生乙醇醛；b)在乙醇醛转化酶和以其氧化形式的第一电子受体的存在下，将步骤a)中产生的所述乙醇醛转化为乙醇酸；c)在以其氧化形式的第二电子受体和乙醇酸转化酶的存在下，将步骤b)的所述乙醇酸转化为乙醛酸，由此产生还原形式的第二电子受体；在以其还原形式的第三电子受体和乙醛酸转化酶的存在下，将所述乙醛酸转化回到乙醇酸，以形成循环反应系统，由此产生氧化形式的第三电子受体；其中所述第二电子受体和第三电子受体是不同的；和d)对在步骤c)中产生的至少一种可检测的信号进行评估。在一些实施方案中，步骤c)中产生的可检测信号是还原或氧化形式的第二电子受体或者还原或氧化形式的第三电子受体在所述循环反应系统中的浓度变化。
步骤a)在过氧化氢和卤化物的存在下，通过髓过氧化物酶将丝氨酸转化为glycoaldehyde本发明中用于检测髓过氧化物酶的方法是基于测定髓过氧化物酶催化的酶促活性。在过氧化氢和卤化物存在下，髓过氧化物酶催化将丝氨酸转化为乙醇醛的反应。因此，样品中髓过氧化物酶的存在或不存在和其量可以通过确定在这些反应中产生的glycoaldehyde而确定。在这些反应中的卤化物可以是Cl-、Br-或I-。优选地，所述卤化物为Cl-。因此，本发明步骤a)的一种示例性反应式为丝氨酸+H2O2+Cl-+H+→乙醇醛+HOCl+H2O (1)步骤a)中的丝氨酸、过氧化氢和氯(或其它卤化物)可以是任何浓度，所述浓度适于髓过氧化物酶反应，并且取决于样品中髓过氧化物酶的活性。例如，丝氨酸的浓度为大约0.05mM-大约100mM；大约0.1mM-大约0.5mM，大约1mM-大约50mM，或大约5mM-大约10mM；过氧化氢为大约5μM-大约10mM，大约10μM-大约1mM，或大约50μM-大约500μM；氯(或其它卤化物)为大约1mM-500mM，大约10mM-200mM，或大约100mM-大约150mM。氯化钠或其它盐可以用作适宜的氯来源。
应用本发明，可以对任何含有或者怀疑含有髓过氧化物酶的样品进行评估。在一些实施方案中，所述样品是血液、血清、血浆、或尿液。在一些实施方案中，所述样品包括白细胞，诸如嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、和/或单核细胞。在一些实施方案中，所述样品是组织样品。在一些实施方案中，将所述组织样品进行匀浆，以在进行所述检测之前获得粗组织匀浆物。
在一些实施方案中，在进行检测前，将所述样品进行预处理。示例性的处理步骤包括离心、提取/洗涤、细胞裂解、冷冻/解冻、和超声。在检测前，还可以将样品稀释。
步骤b)通过乙醇醛转化酶催化，将乙醇醛转化为乙醇酸在以其氧化形式的电子受体存在下，本发明的步骤b)通过乙醇醛转化酶的作用将乙醇醛转化为乙醇酸。在以其氧化形式的电子受体的存在下，将glycoaldehyde转化为乙醇酸的任何乙醇醛转化酶都可以应用。在一些实施方案中，所述乙醇醛转化酶是乙醇醛脱氢酶。因此，由乙醇醛脱氢酶催化的一种一种示例性反应式为乙醇醛+NAD++H2O→乙醇酸+NADH+H+(2)可以应用任何乙醇醛脱氢酶。例如，可以应用具有下列GenBank登记号的氨基酸序列的乙醇醛脱氢酶(EC 1.1.1.21)A39763(智人)，A35452(牛)，A60603(大鼠)，A34406(兔)，I49484(小鼠)，A59021(猪)，C85505(大肠杆菌(E.coli))，A97465(根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens))，S46020(酿酒酵母菌(S.cerevisiae))，和JQ2253(雀麦草)。
可以应用与所选的乙醇醛转化酶相容的任何电子受体。例如，当应用乙醇醛脱氢酶时，所述电子受体(氧化形式)可以是NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰-NAD+、或乙酰-NADP+。
步骤c)乙醇酸-乙醛酸循环反应系统在第二电子受体(以其氧化形式)存在下，本发明的步骤c)通过乙醇酸转化酶的作用将乙醇酸转化为乙醛酸，并且然后在第三电子受体(以其还原形式)的存在下，通过乙醛酸转化酶的作用从乙醛酸转化回到乙醇酸。所述第二电子受体和第三电子受体是不同的电子受体。因此，步骤c)形成循环反应系统，其产生以其还原形式的第二电子受体的增加和以其氧化形式的第二电子受体的减少，以及以其氧化形式的第三电子受体的增加和以其还原形式的第三电子受体的减少。可以测定以具体形式的电子受体的增加或者以具体形式的电子受体的减少。在一些实施方案中，积累了一种以具体形式的电子受体，并且评估所述积累。
在一些实施方案中，所述乙醇酸转化酶和乙醛酸转化酶是不同的。在一些实施方案中，所述乙醇酸转化酶不与第三电子受体交叉反应，或者以比对于第二电子受体更低的亲和力同第三电子受体结合，并且所述乙醛酸转化酶不与第二电子受体交叉反应，或者以比对于第三电子受体更低的亲和力同第二电子受体相结合。
可以应用在以其氧化形式的电子受体存在下从乙醇酸催化乙醛酸形成的任何乙醇酸转化酶。
在一些实施方案中，所述乙醇酸转化酶是乙醇酸还原酶。例如，可以应用由下列GenBank登记号的核苷酸序列编码的任何乙醇酸还原酶(EC1.1.1.79)NC_000913(大肠杆菌)，U00096(大肠杆菌)，NC_004722(蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus))，和AE017002(蜡状芽孢杆菌)。
在其它实施方案中，所述乙醇酸转化酶是乙醇酸氧化酶。例如，可以应用具有下列GenBank登记号的氨基酸序列的乙醇酸氧化酶(EC1.1.3.15)S33322(大鼠)，NP_105534(Mesorhizobium loti)，AE3642(马尔他布鲁氏菌(Brucella melitensis))，T17471(东方拟无枝酸菌(Amycolatopsisorientalis))，S74706(集胞蓝细菌属(Synechocystis sp))，T10242((葫芦科cucurbit))，T02150(稻属)，S75231(集胞蓝细菌属)，和OXSPH(菠菜属)。
在其它实施方案中，所述乙醇酸转化酶是乙醛酸还原酶。例如，可以应用具有下列GenBank登记号的氨基酸序列的任何乙醛酸还原酶(EC1.1.1.26)AB033995(thermococcus litoralis)和AF134895(人)。
可以应用在以其还原形式的电子受体的存在下，从乙醛酸催化乙醇酸形成的任何乙醛酸转化酶。
在一些实施方案中，所述乙醛酸转化酶是甘油酸脱氢酶。例如，可以应用具有下列GenBank登记号的氨基酸序列的甘油酸脱氢酶(E.G.1.1.1.29)NP_283114(脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis))，CAB83582(脑膜炎奈瑟氏球菌)，F82022(脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitis))，S68165(Cucurbita)，S68164(南瓜属(Cucurbita))，DEKVG(黄瓜)。
在其它实施方案中，所述乙醛酸转化酶是乙醛酸还原酶。本文描述了乙醛酸还原酶。
在其它实施方案中，所述乙醛酸转化酶是乙醇酸还原酶。本文描述了乙醇酸还原酶。
在一些实施方案中，所述乙醇酸转化酶和乙醛酸转化酶是相同的。在一些实施方案中，乙醇酸转化酶和乙醛酸转化酶都是乙醇酸还原酶。在其它实施方案中，乙醇酸转化酶和乙醛酸转化酶都是乙醛酸还原酶。可以应用本领域已知的和本文所述的任何乙醇酸还原酶和乙醛酸还原酶。
所述第二和第三电子受体可以是与反应的不同步骤所选的酶相容的任何电子受体，条件是第二电子受体和第三电子受体是不同的。
在一些实施方案中，所述乙醇酸转化酶是乙醇酸还原酶，并且第二电子受体选自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰-NAD+、和乙酰-NADP+、乳酸、2，6-二氯靛酚和吩嗪硫酸二甲酯组成的组。在一些实施方案中，所述乙醇酸转化酶是乙醇酸氧化酶，并且第二电子受体是O2。在一些实施方案中，所述乙醇酸转化酶是乙醛酸还原酶，并且第二电子受体选自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰-NAD+、和乙酰-NADP+、乳酸、2，6-二氯靛酚和吩嗪硫酸二甲酯组成的组。
在一些实施方案中，所述乙醛酸转化酶是乙醛酸还原酶，并且第三电子受体是选自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰-NADH和乙酰-NADPH组成的组。在一些实施方案中，所述乙醛酸转化酶是D-甘油酸脱氢酶，并且第三电子受体是选自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰-NADH和乙酰-NADPH组成的组。在一些实施方案中，所述乙醛酸转化酶是乙醇酸还原酶，并且第三电子受体是选自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰-NADH和乙酰-NADPH组成的组。
在一些实施方案中，所述乙醇酸转化酶和乙醛酸转化酶可以选择性地催化乙醇酸和乙醛酸之间的循环反应，所述循环反应放大了在检测中产生的信号。所述乙醇酸转化酶和乙醛酸转化酶可以应用不同的电子受体，并且不与另一种酶所用的电子受体交叉反应，或者以低亲和力反应。备选地，这两种酶可以识别相同的电子受体。可以将足够量的氧化形式的第二电子受体和还原形式的第三电子受体添加到所述循环反应中，以推进反应，并且允许所述循环继续进行，直到产生充分的信号。
在步骤c)的下列两种示例性反应式中，所述乙醇酸转化酶和乙醛酸转化酶是不同的。例如，所述乙醇酸转化酶是乙醇酸还原酶，并且所述乙醛酸转化酶是乙醛酸还原酶。因此，步骤c)的一种示例性反应式为乙醇酸+硫代-NAD++H2O→乙醛酸+硫代-NADH+H+(4a)乙醛酸+NADH+H+→乙醇酸+NAD++H2O (4b)反应(4a)代表由乙醇酸还原酶催化的反应，和反应(4b)代表由乙醛酸还原酶催化的反应。可以将足够的硫代-NAD+和NADH添加到反应中，以产生循环反应，其引起硫代-NADH的累积。
在另一实例中，在循环反应中，乙醇酸氧化酶被用作乙醇酸转化酶，并且D-甘油酸脱氢酶被用作乙醛酸转化酶。一种示例性的反应式为乙醇酸+O2→乙醛酸+H2O2(5a)乙醛酸+硫代-NADH→乙醇酸+硫代-NAD+(5b)反应(5a)代表由乙醇酸氧化酶催化的反应，和反应(5b)代表由D-甘油酸脱氢酶催化的反应。可以将足够量的O2和硫代-NADH添加到反应中，以产生循环反应，其引起硫代-NAD+和H2O2的累积。
下述是一种示例性反应式，其中乙醇酸转化酶和乙醛酸转化酶是相同的。一种这样的示例性反应式为乙醇酸+硫代-NAD++H2O→乙醛酸+硫代-NADH+H+(3a)
乙醛酸+NADH+H+→乙醛酸+NAD++H2O (3b)反应(3a)和(3b)都是由相同的酶催化，所述酶为乙醇酸还原酶或乙醛酸还原酶。可以将足够的硫代-NAD+和NADH添加到反应混合物中，以推进循环反应中的这两个反应，其引起硫代-NADH的累积。
可以应用任何其它的乙醇酸转化酶和乙醛酸转化酶的组合，来获得相同的循环效果。
步骤a)到c)的酶促反应通常在适于完成所述酶促反应的条件(诸如缓冲液和温度)下进行。用于本文所述的步骤a)、b)和c)的缓冲液可以是相同的或者可以是不同的。可以应用本领域已知的适用于特殊的酶促反应的任何缓冲液。例如，所述缓冲液可以是具有大约6-大约8的pH的磷酸缓冲液；具有大约7-大约9的pH的Tris-HCl缓冲液，或具有大约6-大约9的pH的Good′s缓冲液。
对于每一步骤的温度可以是相同的或不同的。温度优选地在约25-约37℃之间。
在一些实施方案中，本文所述的一个或多个步骤在独立的反应混合物中进行。例如，在添加用于下一步骤的试剂之前，反应中一步或多个步骤的终产物可以部分或者完全地从所述反应混合物中分离。
在一些实施方案中，本文所述的步骤a)-c)在单一反应混合物中进行。
在一些实施方案中，在前一步骤的末期，将用于下一步骤的酶、底物、或电子受体顺序添加到同一反应混合物中。在一些实施方案中，在加入用于下一步骤的试剂之前，将前一步骤的反应终止。在一些实施方案中，将用于多于一步的一些或全部试剂同时添加到反应混合物中。在一些实施方案中，用于步骤a)和b)的试剂与样品同时混合。在这些实施方案中，将怀疑含有髓过氧化物酶的样品与丝氨酸、过氧化氢、氯、乙醇醛转化酶、和以其氧化形式的第一电子受体接触。在一些实施方案中，将用于步骤a)、b)的试剂和用于步骤c)的一些试剂与样品同时混合。在这些实施方案中，将怀疑含有髓过氧化物酶的样品与丝氨酸、过氧化氢、氯、乙醇醛转化酶、以其氧化形式的第一电子受体、乙醇酸转化酶、和以其氧化形式的第二电子受体相接触。在其它实施方案中，用于步骤a)、b)和c)的试剂与样品同时混合。在这些实施方案中，将怀疑含有髓过氧化物酶的样品与丝氨酸、过氧化氢、氯、乙醇醛转化酶、以其氧化形式的第一电子受体、乙醇酸转化酶、以其氧化形式的第二电子受体、乙醛酸转化酶、和以其还原形式的第三电子受体相接触。
在一些实施方案中，所述第一电子受体不同于第二电子受体和/或第三电子受体。在其它实施方案中，第一电子受体与第二电子受体相同。在其它实施方案中，第一电子受体与第三电子受体相同。
步骤d)评估步骤c)产生的信号样品中髓过氧化物酶的定量可以通过监测步骤c)中产生的信号的减少或增加的不同而获得。评估可以在连续地进行或者在不同时间点进行。
在一些实施方案中，评估还原或氧化形式的第二电子受体的浓度变化。在一些实施方案中，通过评估还原形式的第二电子受体的浓度的增加而确定髓过氧化物酶的活性。在一些实施方案中，通过评估氧化形式的第二电子受体的浓度的减少而确定髓过氧化物酶的活性。
在一些实施方案中，评估还原或氧化形式的第三电子受体的浓度变化。在一些实施方案中，通过评估还原形式的第三电子受体的浓度的减少而确定髓过氧化物酶的活性。在一些实施方案中，通过评估氧化形式的第三电子受体的浓度的增加而确定髓过氧化物酶的活性。
本文所述的电子受体的浓度变化可以应用本领域已知的方法进行评估。例如，可以通过测定340nm的吸收而分光光度性地确定NADH或NADPH的浓度变化。可以通过测定405nm的吸收而分光光度性地确定硫代-NADH的浓度变化。
在一些实施方案中，应用电子转运发色团，其包括但不限于，3-(对碘苯基)-2-(对硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑氯化物、3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-联苯-2H-四唑溴化物、3，3′-(4，4′-亚联苯基)-双(2，5-联苯-2H-四唑氯化物)、3，3′-(3，3′-二甲氧基-4，4′-亚联苯基)-双[2-(对硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑氯化物](＝硝基-四唑NTB)、3，3′-(3，3′-二甲氧基-4，4′-亚联苯基)-双[2，5-双(对硝基苯基)-2H-四唑氯化物]、3，3′-(3，3′-二甲氧基-4，4′-亚联苯基)-双(2，5-联苯-2H-四唑氯化物)和2，6-二氯苯酚-靛酚，可以通过比色方法测定NADH或NADPH的浓度变化。优选的实例是水溶性四唑盐和硫辛酰胺脱氢酶或吩嗪硫酸二甲酯的组合。这些电子转运发色团是用于NADP或NADPH的电子受体，以形成有色的甲色素，并且在其最大吸收比色测定所形成的色素。
用于NADH或NADPH的其它检测方法是荧光光度法，其中在荧光剂诸如resazulin的存在下，将NAD或NADPH用硫辛酰胺脱氢酶处理。
本文所述的还原和/或氧化形式的电子受体的浓度的测定在本领域内是已知的。例如，消耗的O2量或形成的H2O2的量可以通过应用电子传感器而进行检测。各种还原-氧化指示剂可以用于这一目的，并且在文献中描述了用于检测溶液中H2O2和O2的广泛范围的方法。通过将一种指示剂与H2O2反应，产生的H2O2还可以作为可检测的产物进行测定。指示剂的实例是可以通过分光光度方法、颜色指示剂、荧光剂或发光剂而进行测定的试剂。例如，H2O2可以应用peroxioxalate和吖啶鎓酯的非酶促化学发光反应来评估。
检测可以重复进行，具有阳性和背景对照。通过应用已知量的已知活性的髓过氧化物酶而获得标准曲线。在每份样品中髓过氧化物酶的水平可以通过将测定的每种信号和所述标准曲线进行比较而确定。
C.方法应用本发明提供具有增加的灵敏性的检测，其用于检测样品中存在的即使少量的髓过氧化物酶。因此，本发明的方法提供用于检测与髓过氧化物酶改变的水平相关的疾病并且监测患者中髓过氧化物酶的水平的实用方法。所述方法可以用于与受试者中不适当量或者与存在的髓过氧化物酶反应的、或者所述髓过氧化物酶的作用或活性相关的任何疾病的预后或诊断。这样的疾病的实例包括，但不限于，急性骨髓性白血病、全身性红斑狼疮、桥本甲状腺炎、重症肌无力、风湿性关节炎、多发性硬化病、急性热病性多神经炎、肾小球肾炎、动脉硬化症、中风、多发性硬化病、阿尔茨海默疾病、白血病、传染病、哮喘、癌症诸如肺癌、囊肿性纤维化、慢性阻塞性肺病、炎症性肠病和神经炎症疾病。
本发明的酶促检测还提供用于研究髓过氧化物酶在生物过程和各种病理疾病中的作用的研究工具。
D.检测髓过氧化物酶的试剂盒本发明还提供用于检测髓过氧化物酶活性的试剂盒，诸如诊断试剂盒。这样的试剂盒包括本文所述的一种或多种底物、酶促试剂和电子受体，以用于实行本发明的方法，例如，丝氨酸、过氧化氢、氯(或其它卤化物)、乙醇醛转化酶、以其氧化形式的第一电子受体、乙醇酸转化酶、以其氧化形式的第二电子受体、乙醛酸转化酶、以其还原形式的第三电子受体，其中所述第二电子受体和第三电子受体是不同的。本文所述的任何底物、酶和电子受体可以包含在所述试剂盒中。所述试剂盒还可以包括阳性和/或阴性对照标准物，以及对于检测步骤c)产生的信号的必需试剂，例如，可以包括用于进行比色检测的试剂。所述试剂盒还可以包括这样的器械或容器，其用于实行本发明的方法和/和将样品转移到诊断实验室以进行处理，以及适用于实行本发明方法的用法说明。
本发明的试剂盒可以是任何适宜的包装。例如，本文所讨论的与诊断系统相关的包装是通常用在诊断系统中的那些。这样的包括包括适用于自动分析器的容器。
E.实施例包括下列实施例仅仅是用于举例说明的目的而不是意欲限制本发明的范围。
实施例1.应用乙醇酸还原酶和乙醛酸还原酶进行髓过氧化物酶检测在本研究中，所述乙醇醛转化酶是乙醇醛脱氢酶，所述乙醇酸转化酶是乙醇酸还原酶，并且所述乙醛酸转化酶是乙醛酸还原酶。在本研究中所用的试剂在下述表1和2中列出。
表1.试剂1的组成
表2.试剂2的组成
在本研究中，将250μl试剂1与20μl要检测的样品混合，并且将混合物在37℃温育5分钟。然后将50μl试剂2添加到混合物中，并且在37℃再温育1分钟。温育后，连续2分钟测定405nm处吸收的变化。
实施例2.应用乙醇酸氧化酶和D-甘油酸脱氢酶进行髓过氧化物酶检测在本研究，所述乙醇醛转化酶是乙醇醛脱氢酶，所述乙醇酸转化酶是乙醇酸氧化酶，并且所述乙醛酸转化酶是D-甘油酸脱氢酶。本研究所用的试剂在下述表3和4中列出。
表3.试剂1的组成
表4.试剂2的组成
在本研究中，将280μl试剂1与30μl要检测的样品混合，并且将混合物在37℃温育5分钟。然后将60μl试剂2添加到混合物中，并且在37℃再温育2分钟。温育后，连续2分钟测定405nm处吸收的变化。
实施例3.应用乙醇酸还原酶进行髓过氧化物酶检测在本研究中，所述乙醇醛转化酶是乙醇醛脱氢酶，所述乙醇酸转化酶和所述乙醛酸转化酶都是乙醇酸还原酶。本研究所用的试剂在下述表5和6中列出。
表5.试剂1的组成
表6.试剂2的组成
在本研究中，将240μl试剂1与20μl要检测的样品混合，并且将混合物在37℃温育5分钟。然后将60μl试剂2添加到混合物中，并且在37℃再温育1分钟。温育后，连续2分钟测定405nm处吸收的变化。
上述实施例仅出于举例说明的目的包含于此，并不意欲限制本发明的范围。对上文所描述的那些的许多变化是可能的。由于对上述实施例的改进和改变对于本领域的技术人员是显而易见的，所以，它的目的是本发明只应该受到附上的权利要求的范围的限制。
权利要求
1.一种用于检测样品中的髓过氧化物酶的方法，所述方法包括a)将怀疑含有髓过氧化物酶的样品与丝氨酸、过氧化氢、和氯接触，以产生乙醇醛；b)在乙醇醛转化酶和以其氧化形式的第一电子受体的存在下，将步骤a)中产生的所述乙醇醛转化成为乙醇酸；c)在以其氧化形式的第二电子受体和乙醇酸转化酶的存在下，将步骤b)的所述乙醇酸转化成为乙醛酸，由此产生还原形式的第二电子受体；在以其还原形式的第三电子受体和乙醛酸转化酶的存在下，所述乙醛酸被转化回到乙醇酸，以形成循环反应系统，由此产生氧化形式的第三电子受体；其中所述第二电子受体和第三电子受体是不同的；和d)评估所述循环反应系统中还原或氧化形式的第二电子受体或者还原或氧化形式的第三电子受体的浓度变化，由此确定样品中髓过氧化物酶的存在、不存在和/或量。
2.权利要求1的方法，其中所述第一电子受体和第二电子受体是相同的。
3.权利要求1的方法，其中将所述怀疑含有髓过氧化物酶的样品与丝氨酸、过氧化氢、氯、乙醇醛转化酶和以其氧化形式的第一电子受体相接触。
4.权利要求1的方法，其中将所述怀疑含有髓过氧化物酶的样品与丝氨酸、过氧化氢、氯、乙醇醛转化酶、以其氧化形式的第一电子受体、乙醇酸转化酶和以其氧化形式的第二电子受体相接触。
5.权利要求1的方法，其中步骤b)的所述乙醇醛转化酶是乙醇醛脱氢酶，并且所述第一电子受体选自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰-NAD+、和乙酰-NADP+组成的组。
6.权利要求1的方法，其中在步骤c)的循环反应系统中的所述乙醇酸转化酶和乙醛酸转化酶是不同的。
7.权利要求6的方法，其中所述乙醇酸转化酶是乙醇酸还原酶或乙醇酸氧化酶。
8.权利要求6的方法，其中所述乙醛酸转化酶是乙醛酸还原酶或D-甘油酸脱氢酶。
9.权利要求6的方法，其中所述乙醇酸转化酶是乙醇酸还原酶，并且所述乙醛酸转化酶是乙醛酸还原酶。
10.权利要求9的方法，其中所述氧化形式的第二电子受体选自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰-NAD+、和乙酰-NADP+组成的组，并且还原形式的第三电子受体选自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰-NADH、乙酰-NADPH、(R)-乳酸、2，6-二氯靛酚和吩嗪硫酸二甲酯组成的组。
11.权利要求6的方法，其中所述乙醇酸转化酶是乙醇酸氧化酶，并且所述乙醛酸转化酶是D-甘油酸脱氢酶。
12.权利要求11的方法，其中所述氧化形式的第二电子受体是O2，并且所述还原形式的第三电子受体选自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰-NADH、乙酰-NADPH组成的组。
13.权利要求1的方法，其中步骤c)的循环反应系统中的所述乙醇酸转化酶和乙醛酸转化酶是相同的。
14.权利要求13的方法，其中所述乙醇酸转化酶和乙醛酸转化酶都是乙醇酸还原酶或乙醛酸还原酶。
15.权利要求14的方法，其中所述氧化形式的第二电子受体选自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰-NAD+、和乙酰-NADP+组成的组，并且所述还原形式的第三电子受体选自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰-NADH、和乙酰-NADPH组成的组。
16.权利要求1的方法，其中所述浓度变化通过光度方法进行评估。
17.权利要求1的方法，所述方法还包括在步骤d)后，将所述氧化或还原形式的第二电子受体或者所述还原或氧化形式的第三电子受体偶联到生色剂上的步骤，其中氧化或还原形式的第二电子受体或者还原或氧化形式的第三电子受体的浓度变化通过比色方法进行评估。
18.权利要求1的方法，其中所述样品是生物流体。
19.权利要求18的方法，其中所述生物流体选自由血液、血清、血浆和尿液组成的组。
20.权利要求1的方法，所述方法用于疾病的预后和/或诊断。
21.权利要求20的方法，其中所述疾病选自由动脉硬化症、中风、多发性硬化病、阿尔茨海默疾病、肺癌、白血病和传染病组成的组。
22.一种用于检测髓过氧化物酶的试剂盒，所述试剂盒包括丝氨酸、过氧化氢、氯、催化乙醇醛到乙醇酸的转化的乙醇醛转化酶和以其氧化形式的第一电子受体、催化乙醇酸到乙醛酸转化的乙醇酸转化酶和以其氧化形式的第二电子受体、以及催化乙醛酸到乙醇酸转化的乙醛酸转化酶和以其还原形式的第三电子受体，其中所述第二电子受体和所述第三电子受体是不同的。
23.权利要求22的试剂盒，其中所述乙醇醛转化酶是乙醇醛脱氢酶，并且所述第一电子受体选自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰-NAD+、和乙酰-NADP+组成的组。
24.权利要求22的试剂盒，其中所述乙醇酸转化酶是乙醇酸还原酶，并且所述氧化形式的第二电子受体选自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰-NAD+、和乙酰-NADP+组成的组，其中所述乙醛酸转化酶是乙醛酸还原酶，并且所述还原形式的第三电子受体选自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰-NADH、和乙酰-NADPH(R)-乳酸、2，6-二氯靛酚和吩嗪硫酸二甲酯组成的组。
25.权利要求22的试剂盒，其中所述乙醇酸转化酶是乙醇酸氧化酶，和所述氧化形式的第二电子受体是O2，并且所述乙醛酸转化酶是D-甘油酸脱氢酶，和所述还原形式的第二电子受体选自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰-NADH、和乙酰-NADPH组成的组。
26.权利要求22的试剂盒，其中所述乙醇酸转化酶和乙醛酸转化酶都是乙醇酸还原酶或乙醛酸还原酶，并且其中所述氧化形式的第二电子受体选自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰-NAD+、和乙酰-NADP+组成的组，以及所述还原形式的第三电子受体选自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰-NADH、和乙酰-NADPH组成的组。
27.权利要求22的试剂盒，所述试剂盒还包括指示疾病的预后和/或诊断的应用的用法说明。
28.权利要求27的试剂盒，其中所述疾病选自由动脉硬化症、中风、多发性硬化病、阿尔茨海默疾病、肺癌、白血病和传染病组成的组。
全文摘要
本发明提供用于检测髓过氧化物酶活性的方法。在所述检测中，将含有髓过氧化物酶或者怀疑含有髓过氧化物酶的样品与包括丝氨酸、过氧化氢和卤化物的底物相接触。如果样品中存在髓过氧化物酶，那么丝氨酸被转化成为乙醇醛，其进一步被glycoaldehyde转化酶(例如，乙醇醛脱氢酶)(1.2.1.21)转化为乙醇酸。然后，所述方法应用乙醇酸和乙醛酸之间的循环反应系统来产生与所述髓过氧化物酶活性相对应的可检测的信号。本发明还提供了基于相同的原理用于检测髓过氧化物酶的试剂盒。
文档编号C12Q1/28GK101044246SQ200580027184
公开日2007年9月26日 申请日期2005年8月10日 优先权日2004年8月11日
发明者袁崇生, 窦超 申请人:通用原子公司