从生物材料催化产生生物标记的利记博彩app

专利名称：：从生物材料催化产生生物标记的利记博彩app相关申请的交叉引用本申请要求2004年2月26日提交的美国临时专利申请60/547950的优先权。联邦研究声明本发明受到美国政府的支持，依照DefenseThreatReductionAgencyContractNumberDTRA01-03-C-0047，美国政府可以在本发明中具有某些权利。
背景技术：
：在包括医学诊断、法庭调查、微生物研究、民防和军事作业的许多不同领域中，都需要用于迅速鉴定未知生物样品的手提式方法和仪器。这种技术目前还没有。对于民防和军事防御的最重要应用之一是检测和鉴定生物战剂(biologicalwarfareagent)。这种应用对于美国的国家安全是很重要的。特别关注的是通常称为炭疽的细菌剂炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)的武器形式[1-3]。炭疽在非常小的剂量下就是致命的(8,000到10,000个芽胞，或者大约10纳克)，这使其成为一种非常有潜力的生物武器[3，4]。炭疽的毒性、易传播性和很长的大气滞留时间，使其成为一种非常危险的生物武器。近年来，几个平民由于与美国邮政寄出的炭疽内生孢子接触而导致死亡就说明了这一点[5，6]。发现令人怀疑的白色粉末后，经过几天的检测，最终结论是该物质是炭疽[6]。因此，更快速的检测和鉴定炭疽的方法是很重要的，目的是防止/防御炭疽的攻击并促使快速反应以减轻其影响[7]。美国军方对于能够迅速检测炭疽存在的技术特别感兴趣，以便(a)保护其军队免受生物攻击和(b)追捕和阻止恐怖分子和/或正在生产或开发生物战剂的国家[3]。检测和鉴定炭疽芽胞所需的技术是检测许多其他类型生物材料所需技术的代表。生物战剂的检测和鉴定历史上，选择用于鉴定未知生物来源样品的方法是从芽胞生长出菌落；在培养生长后，溶液检测、染色和显微镜观察被用来证实炭疽在原始样品中的存在[8]。当使用这种方法时，需要几天来完成，并需要大量的装置和人员。因此，在过去40年中已经进行了大量的努力来开发新的、更快速的方法。许多努力已经集中于在鉴定规则中使用细菌芽胞含有的许多不同的生物化学化合物的方法。用来从微生物中提取这些生物化学化合物并将其转化为可检测化学物质(生物标记)的方法在检测技术中扮演重要角色。典型的生物标记前体包括脂肪酸、蛋白质、碳水化合物和/或脱氧核糖核酸(DNA)；对于一些生物体，特异化学物质如钙配合的吡啶二羧酸(DPA)是很重要的(例如，在细菌芽胞中DPA大约占干重的5-15％)。在过去三十年中已经开发了几种从细菌芽胞中迅速和重复产生生物标记的方法和装置，尽管必须声明它们大体仍处在开发阶段。市售的检测系统很昂贵，并且实用性有限。它们包括利用点检测的分离技术(即，现场检测)、远程检测技术(现场回收样品，随后现场外分析)，和被动远程检测(全部检测的进行与样品没有任何物理相互作用，如光谱法)[8a]。可使用干湿点检测方法。湿法通常是基于生物相互作用(例如抗体鉴定)；而干检测法可用来物理分解样品，并检测释放的化学片段。湿法和干法都需要制备样品，然后进行检测。例如，从细胞提取物中收集的DNA的序列测定可用于细菌的特异鉴定，包括炭疽[9]。不幸的是，该法需要耗费几小时，并需要非常专业的设备，该设备不容易小型化，并不能应用于芽胞。但可以破坏生物标记前体和/或将其转化为挥发性更高的生物标记的分析性热解，已经成为迅速鉴定生物材料的一种可行方法，尽管其受到便携性的限制。分析性热解热解的定义是通过热能破坏化学键。已经发现其在聚合物和其他高分子量化合物分析中的应用[10-12]。在热解过程中，主要有两类化学反应发生，初级和次级。初级反应典型地涉及低分子量和高分子量化合物的热分解。理想情况下，这些化合物迅速被带入检测器中，不需要进一步反应。实际上，可能发生次级反应；例如，初级产物可与反应器壁或其他分子如氧或其他初级热解产物反应[10-13]。为避免这些问题，分解反应和分析装置必须紧密连接。分析性热解(AP)是热解与分析性化学技术的密切结合，可检测和鉴定热解过程中产生的化合物。有用的半便携式分析技术典型地是气相色谱(GC)和质谱(MS)。在大多数AP方法中，生物聚合物(蛋白质、肽聚糖和DNA)被破坏和/或转化为挥发性更高的化合物。在其天然状态下，生物标记前体的低挥发性足以妨碍标准分析技术的检测；但如果其被化学转化为更高的挥发状态，这些化合物，或生物标记，可更容易被检测。这可以通过将样品迅速加热至较高的温度来实现，即350-650℃[13，14]。将热解产生的生物标记用于细菌检测的第一次应用在30年前被报道；自此它就已经成为继续研究的主题，在今天仍然是研究的热点[15-18]。在革兰氏阳性细菌芽胞的热解过程中观察到的一个主要产物是吡啶二羧酸[19，20]。在AP过程中观察到的其他化合物包括蛋白质和肽聚糖的分解产物，包括二酮哌嗪类或其他环化的寡肽，其上许多氨基酸侧基已经被切断[21]。寡肽的环化是次级热解反应的例子[22，23]。有两种普通种类的AP已经用来从细菌芽胞中产生生物标记。首先，居里点热解利用了感应加热的细金属丝莱热解干燥的生物样品。这种方法已经成功用于在革兰氏分类水平上区分细菌。其次，热水解甲基化(THM)在热解器中使用甲基化试剂来衍生脂肪酸。氢氧化四甲铵已经广泛被选择作为甲基化试剂。这种方法已经能够在种属，甚至菌株水平上区分细菌。在这两种方法中，分析时间均明显改善，有些少于15分钟。这些方法中的每一种都依次进行讨论。居里点热解Snyder等人已经开发了一种热解方法来从内生孢子的内部去除和挥发DPA[13，17，19，20，24，25]。在石英玻璃滤器上收集雾化的芽胞或在小的居里点金属丝上沉积芽胞悬液后，使用高温热解(350-600℃)从芽胞中游离DPA。热解产物中的通过气相色谱-质谱(GC-MS)进行分析，以分钟测量分析和检测时间。尽管这种分析相当快，但它需要高温，很大的能量消耗和非常专业的设备。而且，热解产生大量的副产品，即，如图1所示存在许多副反应，该图显示了吡啶二羧酸的热降解反应通路和电子轰击裂解通路[19]。副产品使热解图和数据分析复杂化。复杂的模式鉴定算法用来辅助数据的判读，增加了系统的复杂性，需要额外的计算机硬件和软件(即，使系统不易便携)。最近，Snyder等人已经对居里点热解产生的特异生物标记的微生物含义(化学分类学)进行了评价[17]。通过GC-IMS(离子迁移光谱)检测生物标记，并通过与NationalInstituteofStandardsandTechnology(NIST)数据库和分析用标准品比较进行鉴定。在表I中列举的化合物显示了Snyder等人检测和鉴定的生物标记。他们得出的结论是，一些生物标记可能产生，但由于加热效率低和其他装置的流道而没有被观察到。Snyder等人开发的居里点热解法已经证明在革兰氏分类水平上区分细菌和细菌芽胞的能力，但在不能成功地区分炭疽和其密切相关的种属。表ISnyder等人制备和检测的生物标记(2004)[17]表I.(续)热水解-甲基化很长时间就知道细菌芽胞的脂质内容物含有大量的分类学信息，可用来将炭疽芽胞与密切相关的种属进行区分[26，27]。但脂质是非常粘稠、不挥发性的化合物，它们本身不容易通过GC和/或MS进行分析。通常使用化学萃取法从芽胞中去除游离的脂质；然后脂质在体外被衍生(甲基化)以生成脂肪酸甲酯(FAME)，它的挥发性足够通过GC或MS进行检测[15，28]。这种应用已经被MIDI，Inc，125SandyDrive，Newark，DE19713(www.midi-inc.com)商业化，其特点是化学萃取和脂肪酸衍生的自动系统；热解单元被用来挥发FAME，通过GC-MS进行分析。最近，一种称为热水解-甲基化(THM)的方法被开发出来，它不仅能够用强有力的甲基化试剂，例如氢氧化四甲铵(TMAH)将游离脂肪酸甲基化，而且可将结合的脂肪酸发生酯基转移；这增加了可获得的脂质谱的信息量[29-44]。典型在类似分析性热解使用的热解器中在高温下原位进行THM。THM应该被理解为一种非催化法，因为甲基化试剂TMAH在过程中被消耗，该过程是通过热分解和化学键的重排来驱动的。Voorhees等人已经开发了从芽胞脂质通过THM产生脂肪酸甲酯(FAMEs)的方法[29-39，42，43]。FAME典型地通过GC/MS或直接MS进行分析以制作脂质谱。已经采用模式鉴定算法来判读这些图谱以证实炭疽的存在与否[38，39，41，45]。其显示FAME谱对于每个细菌种属都是独特的，因此有可能使鉴定更为明确[38]。最近Havey等人在SandiaNationalLaboratories与Voorhees等人协作开发了一种陶瓷膜加热系统，能够在几毫秒内加热至200℃以上，从而从细菌芽胞中产生FAME。该装置具有非常低的功率(毫瓦)要求，但仍然要现场实验或详细评估[43]。非常类似热水解甲基化的其他衍生方法已经被建议用作细菌中碳水化合物制谱的方法[46]。但对于这种方法还没有开发出野外便携式装置。分析性热解的限制在最近这些分析性热解的开发使生物标记的产生和检测时间更快的同时，要求的装置趋向于体积更庞大，并需要相对大的功率。还缺乏生物标记产生技术的可重复性和广泛的可应用性，在文献中并没有得到积极的支持。为了开发迅速检测炭疽的手提装置，该技术需要进一步的提高。在生物标记产生速度和可重复性方面的改进以及检测时间的减少、分析的复杂性、装置尺寸和功率消耗都是将技术提高至野外便携式，手提水平所必需的所有方面。引用的文献1.Inglesby，T.V.，etal.，AnthraxasaBiologicalWeapon，2002-UpdatedRecommendationsforManagement.Jama-JournaloftheAmericanMedicalAssociation，2002.287(17)p.2236-2252.2.Inglesby，T.V.，AnthraxasaBiologicalWeapon，2002UpdatedRecommendationsforManagement(vol287，pg2236，2002)Jama-JournaloftheAmericanMedicalAssociation，2002.288(15)p.1849-1849.3.Hawley，R.J.和E.M.EitzenJr，BiologicalWeapons-APrimerforMicrobiologists.AnnualReviewofMicrobiology，2001.55(1)p.235-253.4.Pepper，I.L.和T.J.Gentry，IncidenceofBacillusanthracisinSoil.SoilScience，2002.167(10)627-635页。5.Weis，C.P.，etal.，SecondaryAerosolizationofViableBacillusanthracisSporesinaContaminatedUSSenateOffice.Jama-JoumaloftheAmericanMedicalAssociation，2002.288(22)2853-2858页。6.Parker，J.S.，TerrorismThroughtheMailProtectingthePostalWorkersandthePublic，inReportSubmittedtotheCommitteeonGovernmentalAffairsandtheSubcommitteeonInternationalSecurity，Proliferation，andFederalService.2001，U.S.ArmyMedicalResearchandMaterielCommandandFortDetrick.7.Birenzwige，A.和C.Wick，USArmyReportECBC-TR-255.USArmyReport，2002。8.Jackson，P.J.，etal.，PCRAnalysisofTissueSamplesfromthe1979SverdlovskAnthraxVictimsThePresenceofMultipleBacillusanthracisStrainsinDifferentVictims.ProceedingsoftheN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生物标记。在某些应用中，使用某些催化剂系统的更高选择性和更高的反应速度可能比在低温下工作更重要，在这些情况下本发明的实施可能涉及在现有技术的热解系统中使用的温度下或接近该温度进行工作。但在本发明的实施中，生物标记主要的产生仍通过催化作用。生物材料是指生物来源的材料，可能含有或不含有用户希望检测到的危险成分，如生物芽胞或病毒，对于它们有被鉴定的或潜在可鉴定的生物标记。特别感兴趣的是炭疽芽孢杆菌、苏芸金芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌黑色变种的芽胞。也可考虑的是含有脂肪酸、蛋白质、碳水化合物、脱氧核糖核酸(DNA)、脂质、肽聚糖和吡啶二羧酸的材料，这些物质可产生允许进行鉴定的特征性生物标记。接触可发生在液相或气相中。被检测的生物材料，如果是固体，可溶解在液体或悬浮在液体或气体中，并与催化剂接触。催化剂，如下面所详细描述，可与溶解或悬浮的标本在相同的相中，或是与标本溶解或悬浮的液体接触的独立的催化活性表面。作为一个例子，挥发性生物标记可包括一种或多种成分，例如吡啶甲酸酯和脂肪酸甲酯，如在芽胞和细胞上发现的成分。在这种情况下，催化剂是衍生催化剂，如酸/碱催化剂，可将生物材料酯化(例如，甲基化或乙基化)或衍生为挥发性生物标记。这种类型的催化剂包括过酸催化剂和其他酸性或碱性固体。合适的酸催化剂的例子是磷钨酸(H3WP12O40)。固体酸催化剂，如合适的沸石也可考虑。上述类型的催化材料可制成任何能使生物材料与催化剂充分接触的形式。这些催化剂的形式在本领域中是公知的。催化剂也可以是分解催化剂。这种催化剂典型地是分散良好的多孔金属、金属氧化物和/或含有催化活性表面的硫化物，它们可通过破坏碳-碳、碳-氢或碳-氧键或分子中可能的其他键来分解有机化合物。预期能通过这些催化剂来产生的生物标记或生物标记前体包括热解法可检测到的那些或者能够用另一种类型催化剂催化处理为可检测到的生物标记的那些。分解催化剂可以是细碎的金属颗粒、分散在多孔支持物或载体上的金属颗粒和/或包被在固体表面或支持物上的金属。其构造应该能够保证与生物材料和不挥发生物标记前体的接触。任何合适的支持物(如陶瓷、碳或分子筛)都可以考虑，包括但不限于颗粒、小球、包被或实心固体形式的多孔陶瓷，具有通道的其他形状，和其他结构的催化材料。分解催化剂的金属成分包括一种或多种贵金属或碱金属，如Co、Fe、Pt、Ni、Pd或Rh。用于加热标本的系统可以在任何合适的加热技术中变换，可包括加热板、陶瓷膜、杆、金属丝或类似物，可以包括电阻金属、陶瓷和类似物制成的加热元件。可以和催化系统结合在一起，如下面所述的丝网系统，其构造为包绕催化剂，和/或置于催化剂的上部或下部以加热含有流动气体或蒸汽的标本。可以使用类似于热解系统中使用的加热器，但通常要小一些，因为本发明的方法的温度和功率消耗要求更低一些。一旦产生，生物标记就可被任何合适的检测系统(包括分析化学技术，如气相色谱和质谱)检测/分析到。本发明的另一个方面是促进生物标记从生物材料中产生的装置，它包括将生物材料与催化剂和衍生剂接触的反应区。反应区典型地含有催化剂和将生物材料加热至催化温度的加热系统。提供了收集区以收集生物标记进行随后的分析，或可选择地提供检测区以检测和鉴定产生的生物标记。装置被构造为在气体或液体中进行加热和催化反应，可包括衍生和分解催化剂中的任一种或两种。在本发明的装置的一个方面，加热系统可包括金属网，电流通过该网可对其进行电加热。该网也可提供催化活性表面。该网可以是扁平的、弯曲的或盘绕的，可以是单层、多层或被构造为金属泡沫。金属网的构造可提供一种将液体标本分布在加热(催化剂)表面上的很好的手段，为与催化和/或加热表面接触提供很高的表面积。也可提供一种将被测标本中需要的溶剂干燥的手段。催化功能可通过其构造的固有材料(例如，Ni)或催化活性金属的包被(例如，Pt等)来提供。在类似情况下，金属网可提供弹性的构造以提供最适的或最佳的网格方向、金属丝尺寸等。催化催化剂是能够降低在指定化学反应中形成所需产物需要的活化能的物质，可使反应以比其他方式下可能的速率快许多数量级的速率进行，同时具有更高的选择性。催化剂在反应中不消耗，但在反应中可循环地恢复至其初始状态(该过程被称为复原)；市售的催化剂在需要更换之前能够几百万次地复原。异质催化剂典型地是由分散在多孔陶瓷材料(称为支持物)上的金属微晶、金属氧化物或金属硫化物(活性相)组成。氧化物催化剂包括酸性固体(如沸石)和能够催化许多不同类型有机和生物化合物重排的过酸。发现催化剂在石油加工、化学物品制造和污染控制中有大量的用途。它们主要的益处有三层[47]。首先，它们可以促进在低温和低压下的反应，因此可大幅度降低化学反应和过程的能量需求。其次，它们极大地提高了所需反应或系列反应的选择性和速度。第三，它们减少了设备体积的要求(特别是反应器)。催化剂在产生生物标记中的应用根据对科学文献和专利的检索，相信目前没有异质催化剂用于从细菌芽胞中产生生物标记。催化剂破坏的键与热解过程中破坏的键相同，但其条件较为缓和。包括碳-碳、碳-氮和碳-氧键的破坏。用来破坏碳氢化合物中碳-碳键的催化剂包括催化裂化重质烃中的固体酸类、碳氢化合物蒸汽转化中使用的金属(Ni、Pt、Rh)催化剂、以及用于加氢裂化多核芳香烃的固体酸沸石/金属(Ni、Pt)催化剂的组合[47]。催化破坏碳-硫、碳-氧和碳-氮键的金属在文献中不容易发现；但金属硫化物是这些类型反应的有效催化剂。酸/碱催化剂已知可以催化与芽胞热解中观察到的甲基化反应类似的衍生、酯化和甲基化反应。例如，在同质(液体-液体)物中应用的过酸催化剂，已经用于DPA的酯基转移反应以破坏和转化碳-氧键[48-52]。关于对制药工业中常见的一种试剂，DPA进行酯基转移的催化剂的研究已有报道[48]。从生物材料(包括细菌芽胞)中产生生物标记的催化过程的应用，可降低热(能量)的需求，并增加生物标记的形成速度和选择性。广泛文献检索提供的数据显示(1)催化作用在破坏细菌芽胞中的应用以前没有被研究过，(2)镍和铂催化剂具有破坏碳-碳键的潜力，和(3)杂多酸(过酸)催化剂如磷钨酸(H3WP12O40)具有将脂肪酸酯基转移(甲基化)的潜力。本发明的一个方面是将催化剂用于从生物材料(包括细菌芽胞)中产生生物标记，其条件较以前使用的方法明显更加缓和，并具有更高的选择性。图1是显示吡啶二羧酸的热降解和电子轰击裂解通路的示意图[19]。图2是显示棕榈酸转化为其甲酯中温度作用的图表。图3是显示棕榈酸转化为其甲酯中反应时间的图表。图4是显示棕榈酸转化为其甲酯中甲醇摩尔比例的作用的图表。图5是显示吡啶甲酸甲酯存在的MS谱。图6是显示炭疽芽胞分解结果的MS谱。图7显示的是显示细菌芽胞标本分解结果的MS谱。图8显示的是显示细菌芽胞标本分解结果的MS谱。图9显示的是显示细菌芽胞标本分解结果的MS谱。图10显示的是显示细菌芽胞标本分解结果的MS谱。图11是本发明装置的实施方式的示意图。图12是本发明装置的另一个实施方式的示意图。图13是本发明装置的另一个实施方式的示意图。图14a和图14b是使用丝网的本发明装置的组件的(a)等距视图和(b)前平面剖视图。图15是本发明装置的实施方式的视图。图16是图15所示装置一部分的细节，显示安装在装置的上翼缘的金属丝网筛。
发明内容实验结果为证明从生物材料中催化产生了生物标记，进行实验，包括使用过酸(磷钨酸或TPA)催化剂酯化脂肪酸和吡啶二羧酸，使用TMAH和TPA分解芽胞(BA、BG、BT-见表2)。表2在催化剂实验中使用的杆菌芽胞脂肪酸和吡啶二羧酸的酯化脂肪酸是在生物材料分解过程中产生的典型化合物；脂肪酸和吡啶二羧酸是在细菌芽胞分解过程中产生的常见化合物。由于其挥发性低，这些酸类不容易被检测到。但在用磷钨酸(TPA)作为催化剂酯化后，其相应的甲酯类很容易被检测到。如上所述，生物材料可通过FAME谱被鉴定。TPA是脂肪酸酯化的一种有希望的候选物；它是Keggin结构的杂多酸(HPA或过酸)之一，具有H3PW12O40的化学成分。在实验室试验中，证明它对从月桂酸(C12酸)至硬脂酸(C18酸)范围内的脂肪酸的酯化具有高度的催化活性。这种催化剂也证明对吡啶二羧酸(DPA)的酯化有活性，后者是杆菌芽胞的另一个重要生物标记。接近单层的催化剂(如接近TPA的分子结构)通过将50wt％TPA浸渍在市售的硅基支持体(308m2/g)而制备。制备的催化剂表面积为110m2/g。发现用甲醇冲洗催化剂不影响催化剂活性，表明在催化剂中发生了TPA的单层覆盖(TPA在甲醇中溶解度很高)。这也提示单层活性成分在表面上是稳定的。纯脂肪酸化合物的甲基化被硅基负载的磷钨酸(TPA)催化。进行实验的步骤根据使用的溶剂会有轻微的变化(例如，温度和干燥时间变化)。大体的方案如下在一个小瓶中，模型化合物(通常是棕榈酸)溶解在溶剂中(通常为水)，向其中加入甲醇和硅基负载的TPA催化剂。将1到2微升混合物转移至热解器中，并在其中以很低的温度加热(例如，在混合物的沸点以下，在甲醇时为～60℃)以馏出溶剂，随后迅速将残渣加热至250-300℃之间的温度(发现超过400℃的温度会降解反应物)。检查GC/MS数据中的脂肪酸和脂肪酸甲酯峰。向混合物中加入十六烷作为定量分析的内参照。发现在甲醇存在的情况下在室温下棕榈酸甲基化的程度明显被TPA增强。这些结果是用水和辛烷作为溶剂获得的。结果-脂肪酸进行脂肪酸(C12-C18)的催化甲基化实验；发现使用甲醇TPA的甲基化活性和选择性对于在此范围内的所有脂肪酸都是相似的。作为例子，棕榈酸的结果在下面进行讨论。就图2而言，在95℃反应2分钟后棕榈酸催化转化为其甲酯的转化率为50％。就图3而言，当混合物在室温下超过5小时的时候，转化率增加至80％；但在相同的条件下没有催化剂反应一点也不会发生。这些结果表明催化剂对于所有类型脂肪酸的甲基化都是非常有活性的。就图4而言，显示在甲醇/棕榈酸的比例很高的情况下反应的转化率更高。当使用甲醇作为溶剂时，在密封管中防止溶剂损失，在95℃下2分钟反应几乎就可以结束。结果-吡啶二羧酸就图5而言，它显示了在相同的催化条件下，在25℃吡啶二羧酸转化为其甲酯或吡啶甲酸甲酯。BA、BASS、BG和BT芽胞的分解搅拌芽胞悬液的母液标本，将一份以及其他试剂和/或催化剂(例如，TMAH、TPA、甲醇等等)一起转移至小的eppendorf管中。使用大约2微升。适合对脂肪酸(和脂肪酸甲酯)制谱的GC法用来分析产生的FAME图谱。就图6而言，在TMAH和TPA的存在下BA分解的结果表明产生了显著量的生物标记。也可见反应是选择性的，即不产生大量的副产物，它们会产生杂带并干扰生物标记检测和鉴定。就图7而言，在TMAH和TPA中芽胞(高压灭菌的BT)分解的结果与独立实验相似，表明结果是可重复的。就图8而言，在TMAH和TPA的存在下BG和BA芽胞分解的结果表明根据每种芽胞通过催化产生的生物标记(脂肪酸甲酯或吡啶衍生物)的独特图谱可以区分每个种属。就图9而言，在使用TMAH和TPA的BT和BA光谱中发现了相似的结果(就峰的位置而言)。但峰的强度变化很显著，表明高压灭菌对结果有很大的影响。就图10而言，所有高压灭菌的芽胞(BA、BT、BASS、BG)的分解都明显不同，显示通过这种方法有可能区分种属。结果的总结和结论证明了通过过酸催化剂催化酯化了脂肪酸和吡啶二羧酸。因为脂肪酸和吡啶二羧酸是在细菌和细菌芽胞分解中产生的典型化合物，这就支持了权利要求中声明的催化作用可从生物材料中产生生物标记。在甲基化试剂(TMAH)和催化物质(TPA)的存在下在缓和条件下BA、BT、BG和BASS芽胞的分解显示可以产生能够区别和鉴定杆菌种属的生物标记。因为在以前的研究中已经显示金属如Pt、Ni和Pd可催化C-C、C-N和C-O键的断裂，说明它们能经芽胞分解催化产生碳氢化合物片段，这些片段可能是生物标记或生物标记前体。装置手提式生物标记发生器(HBG)是一种便携装置，需要有特殊的设计要求。这包括，例如标本采集方法、使用分解和衍生催化剂和试剂、装置几何形状和构造等等。HBG的主要目的是从标本中释放足够量的重要化学生物标记，该标本可以是，例如炭疽芽孢杆菌内生孢子，但也可以是任何生物或其他小的生物化学化合物(例如，蛋白质、DNA、糖类等等)，并为检测和鉴定系统沉积足够量的释放的生物标记，如要被GC/MS检测的固相微萃取(SPME)纤维上的沉淀物。可替代SPME纤维的是使用与GC/MS的直接连接。合适的HBG应该●是便携的，(大概的情况很小的容器，包括电池、电子控制装置等等，能容纳可抽取的、任意使用的药筒，这些药筒在使用后可被装进袋子并进行保存)●是手提式的，●可重复使用的，消耗的功率很低(即＜75瓦)，●协助收集标本(例如，使用布样拭接、拭子等等)，●包括任何必需的化学试剂和/或催化剂，●协助标本和必需试剂适当的分散、混合、加热等等，●结合标本收集装置如SPME(固相微萃取)纤维(包装在未使用的装置内或在使用过程中/之后被插入)以便将产生/挥发的生物标记转移至检测器。实施例A-装置实施本发明的HBG21的示意图在图11中显示。注入喷射器或喷雾嘴23将液体标本分散进入“催化区”25中，其中液体标本被通过多孔板24(图11a)的气流(由流动箭头显示)携带，该催化区包括两种催化剂第一催化剂是由裸露的镍或Pt包被的镍组成的丝网27(是指催化剂1或分解催化剂)，其作用是将芽胞热分解和催化分解，释放挥发性的芽胞成分(也见图11b)；第二催化剂29(是指催化剂2或衍生催化剂)酯化芽胞分解过程中产生的有机酸化合物，并包被在有凹纹的金属箔单块上(monolith)。(也见图11c&11d)电阻加热金属网可产生分解芽胞和加热金属单块所需要的热能(后者是高度导热的，因此能够被丝网加热)，以为酯化反应提供能量。空气(在进入装置过程中通过0.1微米过滤以去除潜在的干扰颗粒)从HBG的背侧或出口侧通过微型隔膜泵31抽成真空以便吸引芽胞和分解产物通过催化剂，并被排出至空气中。催化产生的有机化合物通过“有机物渗透膜”被吸收，所述膜是面向收集/检测部35，例如GC/MS(气相色谱仪/质谱仪，或VGC/ITMS-真空气相色谱仪/离子阱质谱仪)的界面33。实施例B-装置现在参考图12、12a、12b、12c和12d。这是在图11设计上的变化体，使用时使用相同的参照数字。最重要的变化是使用SPME纤维43来吸收和转移生物标记化合物至GC/MS。在图示的设计中，SPME缩进注射器样针41中，所述的针可伸出通过隔膜37，但该装置不是传统意义上的注射器。实施例C-装置现在参考图13a、13b、13c和13d，这是图12和图11的变化体，当使用时使用相同的参照。主要的区别是在两个多孔板之间使用了陶瓷拭接45或金属网24来收集固体标本。这个拭接(wipe)可加入分解和/或衍生催化剂，以及必需的试剂。在标本采集后，拭接夹在两个加热的金属网之间以促进生物标记的催化和产生。实施例D-装置HBG的原型(经常是指“丝网检测单元”或WMTU)被建造用来评估本发明的方法。图14a和图14b显示了该装置的主要部件。图15和图16是装置的透视图。该装置由图14a、14b和15中所指示的三个区组成●1区(101)衍生催化剂或丝网/加热器的位置●2区(102)分解催化剂、甲基化催化剂的位置●3区(103)转移至SPME纤维(被插入进端口131中(图14b))上的化学产物的位置。1区使用非常细的镍丝网111(图14和16)来收集和用电阻加热芽胞、催化剂和/或用来促进芽胞分解和生物标记产生的试剂。被插入进WMTU中的丝网支撑装置113的设置，在图16中显示。可考虑任何合适的系统来进行电连接，以便进行加热，将丝网固定在适当的位置，将标本导入进装置中，并使液流引入装置中。2区2区的设计是结合圆柱形的单块或粉末状的催化剂。显示121室(图14a)含有单块或催化剂。为了加热2区的小室，玻璃绝缘的镍铬合金丝123(图15)缠绕在外面，尽管可使用铝加热块。可考虑任何合适的系统来进行电连接，以通过任何合适的方法加热，并控制温度(例如，使用温度控制器的温度控制系统，具有适当的调整参数)。3区这个部分是化学产物转移至SPME纤维上的位置，(见端口131)，如果WMTU安装在GC注射端口的顶部时，该部分将被加热。最终小型化的HBG就设想完成了。实施例E-液基反应在上述本发明的装置和方法的实施例中，生物标本、试剂和产物是裸露的，即由空气或其他气体包绕。可选的是，反应可以是具有溶解的化合物/试剂、以及悬浮的多种种属的杆菌内生孢子的液基反映。下面的描述总结了基于液体的步骤。首先，纯脂肪酸化合物(芽胞分解产物的代表)是通过硅基负载的磷钨酸(YPA)催化的。尽管用来证明此的步骤根据使用的溶剂稍有变化(例如，温度和干燥时间的变化)，但大体的方案如下在一个小瓶中，模型化合物(通常是棕榈酸)溶解在溶剂中(通常为水)，向其中加入甲醇和硅基负载的TPA催化剂。将1-2微升混合物转移至热解器中，并在其中以很低的温度加热(例如，在混合物的沸点以下，在甲醇的情况下为～60℃)以馏出溶剂，随后迅速将残渣加热至250-300℃之间的温度(发现超过400℃的温度会降解反应物)。GC/MS数据表明在甲醇的存在下，即使在室温下棕榈酸的甲基化也明显被TPA增强。这些结果与使用水和辛烷作为溶剂的结果是相同的。搅拌芽胞悬液的母液标本，将一份以及其他试剂和/或催化剂(例如，TMAH、TPA、甲醇等等)一起转移至小的eppendorf管中。使用大约2微升。一种适合对脂肪酸(和脂肪酸甲酯)制谱的GC法用来分析产生的FAME图谱。其次，进行检测鉴定芽胞在多种液基处理下产生的产物。搅拌芽胞悬液母液，将一份以及其他试剂和/或催化剂(例如，TMAH、TPA、甲醇等等)一起转移至小的eppendorf管中进行混合。大约10微升得到的混合物被转移至小玻璃毛细管中，该管的一端已经被热封。在转移后，玻璃毛细管的另一端被密封，芽胞被加热到至少200℃。在热处理后，毛细管破坏，移出大约2微升，并加入至热解器中。适合用于酯肪酸(和脂肪酸甲酯)制谱的GC法用来分析得到的化学物质的图谱。装置设计的变化体HBG设计的许多合适的变化体适合实施本发明。合适的HBF的例子将具有下面的特征，每一特征都在下面详述。1.从来源中采集标本(污染的表面、粉末和/或液体)2.标本获取/导入进HBG3.经加热和催化标本初步分解4.来自上面3的化学产物转化为挥发性更高、更稳定的种类(例如脂肪和其他有机酸的酯化)5.将来自上面4的产物收集至SPME纤维上6.缩回和取出SPME纤维通过GC/MS进行分析标本采集未知标本有两种期望的主要形式粉末(例如，武器化的炭疽芽胞)和液体悬液。采集粉末状的标本可采用拭子或拭接来完成。拭接可附着在装置上或被插入其中，由两部分组成，在标本采集后在拭接周围拧(screw)在一起或扣(snap)在一起。液体标本可收集在注射器中，并被注入或喷雾进入装置中，或装置本身用来吸取或吸收液体。拭子或拭接也可以相似的方式用于液体标本(即，将液体喷在拭接上或使用拭接吸收液体)。标本获取拭接被夹在装置的丝网加热器之间，直接被加热，或被插入进含有试剂和催化剂的液体容器中。在足够的气流和/加热条件下，芽胞和芽胞产物从拭接中被移出，在加热的(可选择催化的)金属网上经过和/或通过系统。可选的是，液体标本可被注入、喷洒或喷射进装置中，该装置有适当的通道和几何形状以引导液体，这样可以迅速地混合、加热和干燥(如果需要)，颗粒/芽胞仅存在于所需的加热或催化表面(如丝网)上的液体沉积物中。可使用任何表面积很大的材料(金属网、泡沫等)来采集、分散和干燥(如需要)液体。初步标本分解加热和催化可组合使用。分解催化剂可采取任何形式的材料辅助热或化学降解生物材料成为生物标记，例如芽胞降解释放/挥发脂肪酸、吡啶二羧酸、蛋白质片段和其他独特的化学生物标记化合物。如果催化剂包括金属如Ni和Pt(其功能是破坏C-C键)，催化剂可单独使用或镀在丝网上或其他表面积大的材料(如镍或其他金属泡沫)上。可选的是，这些材料的纳米团簇可分散在芽胞的外面，实质上将催化剂带给芽胞中(而不是芽胞带给催化剂中)。将催化剂分散在芽胞上的过程可构建在装置中。钠米团簇或其他催化剂/试剂可包括在上述的拭接中，其目的是促进催化剂对芽胞的包被，或被结合进金属网或最终的装置中。初步的标本分解可在液体混合物中完成，或通过干燥芽胞分解。装置的加热器部分可以是任何合适的系统。合适的系统发现是细的电铸镍丝网，每英寸有200和1500孔(来自PrecisionEforming公司)。几块具有每英寸200孔的金属网可通过电阻加热至炽热。正常这些金属网材料用来电屏蔽，用于敏感电子仪器应用以及筛网材料。相信这些金属网材料过去一直没有被用作加热器，在此电铸丝网用作微型加热器或微型热解器，用于从生物材料中产生生物标记。丝网已经用作热解器和催化装置，但没有用来产生生物标记。加热的丝网装置在二十世纪五十年代由Loison和Chauvin发明[53]，并随后得到应用，特别是在煤颗粒热解/挥发领域。研究工作不仅针对媒的热解反应(例如，见[54，55])，而且针对丝网加热速率对热解产物产量的影响[56]，电加热镍网[57，58]对空气中甲烷氧化的催化作用，和聚乙烯和聚丙烯的热解动力学[59]。因为金属网是由非常细的金属丝制成的(直径10-200微米)，因此它与大规模热解器相比，可以在更低的功率消耗水平更迅速地被加热。这是热解领域的一个优势；文献报道快速加热是热解器设计非常需要的[60-62]。而且，根据金属丝的尺寸和孔的大小，细金属网与单独扁平的固体(这是申请人已知的所有市售热解器装置的流行设计，例如居里点、电阻加热丝、加热金属箔和加热坩埚式热解器)相比能提供更大的总表面积，改善了在干燥中可能团聚的细颗粒物质(包括细菌营养细胞和内生孢子)的分散和加热。最后，在标本导入/采集过程中使用一层或多层细金属网作为滤器是值得的。对于加热器可考虑任何合适的电源，它可包括多种方式来驱动电流，例如，与一组金属丝平行、和另一组垂直或同时斜向通过两组金属丝。也可考虑不同的金属网几何图形(例如，六角形)或多层设计。可考虑多层设计和使用金属“海绵”而不是金属网。金属网的表面也可包括特殊的涂层(例如，纳米晶粒)或树枝状晶体辅助芽胞降解。金属网可以是扁平的，或将金属网以圆柱形卷起来，沿其轴施加电流。这样可能提高产物的转运性，将使更多表面积的金属网更靠近SPME纤维(见下)，可能有助于初步的标本沉积(例如，拭子可能通过其重心，使标本原料沿其内部沉积)。分解产物的转化通过分解催化剂产生的生物标记产物(可包括脂肪酸、吡啶二羧酸和/或其他生物标记)，随后可能在衍生催化剂如二氧化硅上负载的磷钨酸上发生反应[63]，尽管可以使用其他形式。这些反应的产物期望是酯类，但可以是其他的化合物。装置将包含这些反应必需的试剂(或产生它们的工具)(例如，甲醇、TMAH等等)。这种催化剂及其试剂可被掺入采集拭接、分解金属网或单独的单块或金属网中。它们也可被掺入专门的SPME纤维(以消除死体积)中。将产物收集至SPME纤维上SPME是固相微萃取的缩写，是一种在收集过程中可使标本吸收至被修饰的固体支持物上的技术(在液体溶液中浸渍或与含有目的挥发性化合物的气体接触)，随后用溶剂或通过热力方法将标本脱附[64]。SPME纤维(从针中缩回，该针被插在分析装置如GC/MS内部)开始存在于采集/反应装置中，在反应的过程中伸出，或在标本导入和/或初步处理后伸出或插入。SPME纤维可被保护性外鞘保护以免吸收较大的化学片段(或比所需化合物扩散性小的片段)。最后，SPME纤维有可能注入或装入催化剂材料。SPME纤维的缩回和撤出纤维可回缩进其保护针鞘和撤出的注射器中，以便将产物转移至分析仪器。其他过程注解为了将生物标记从催化剂运输至SPME纤维，可使用微型隔膜泵。该装置可以生产，并可在商业渠道中获得(e.g.www.virtualpumps.com)。在不涉及液流的过程，反应发生在液体悬液中，或在很小的简单反应室中时不使用泵。另外，与芽胞、试剂、生物标记等接触的装置任何部分的表面可以接受特殊的处理(例如，化学、热等等)或涂层。如需要，这种处理用来尽量减小/尽量增大芽孢和存在的化学物种的物理吸引、化学吸附或电荷吸引/排斥以提高装置的效率。本发明已经参照某些具体实施方式和实施例进行说明，应当意识到本领域技术人员在不背离本发明的范围和精神的情况下可以做出许多改变，权利要求所述的本发明意味着包括不背离本发明精神的本发明的所有变化和修改。权利要求1.一种鉴定含有挥发性和/或不挥发性生物标记前体的生物材料的方法，该方法包括将所述生物材料与催化剂接触；加热至催化温度，形成挥发性生物标记；检测和鉴定所述生物标记。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物材料含有细菌芽胞。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物材料含有一种或多种芽胞、细菌、病毒和毒素。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物材料含有一种或多种选自炭疽芽孢杆菌、苏芸金芽胞杆菌和枯草芽孢杆菌黑色变种的芽胞。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物标记前体包括一种或多种脂肪酸、蛋白质、碳水化合物、脱氧核糖核酸(DNA)、脂类和吡啶二羧酸。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述接触是在液相或气相中。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述挥发性生物标记包括一种或多种吡啶甲酸和脂肪酸的甲酯，所述催化剂是酸/碱催化剂。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述催化剂是酯化生物标记前体的衍生催化剂。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述催化剂是过酸催化剂，所述挥发性生物标记是通过脂肪酸的衍生而形成的。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述催化剂是过酸催化剂，所述挥发性生物标记是通过脂肪酸的甲基化而形成的。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述催化温度低于所述生物材料热解所需的温度。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述催化温度低于300摄氏度。13.一种鉴定含有不挥发性和挥发性生物标记前体的生物材料的方法，该方法包括将所述生物材料与过酸催化剂在液相中接触；加热至催化剂温度，将所述不挥发性生物标记前体甲基化形成甲醇酯生物标记；检测和鉴定所述甲醇酯生物标记。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述不挥发性生物标记前体包括脂肪酸，所述甲基化的挥发性生物标记包括脂肪酸甲酯。15.根据权利要求13所述的方法，其中所述不挥发性生物标记前体包括吡啶二羧酸，所述甲基化的挥发性生物标记包括吡啶二羧酸的甲酯。16.根据权利要求13所述的方法，其中所述催化剂是磷钨酸(H3WP12O40)。17.根据权利要求13所述的方法，其中所述生物材料包括一种或多种选自炭疽芽孢杆菌、苏芸金芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌黑色变种的芽胞。18.根据权利要求1所述的方法，其中所述催化剂是破坏生物标记前体的分解催化剂。19.根据权利要求1所述的方法，其中所述催化剂是金属分解催化剂，挥发性生物标记通过破坏碳-碳键而形成。20.一种鉴定含有不挥发性生物标记前体的生物材料的方法，该方法包括将所述生物材料和固体金属分解催化剂在液相中接触；加热至催化温度，将不挥发性生物标记前体降解形成挥发性降解产物；检测和鉴定所述挥发性降解产物。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述不挥发性生物标记前体包括一种或多种脂肪酸、蛋白质、肽聚糖和DNA。22.根据权利要求20所述的方法，其中所述催化剂包括一种或多种贵金属或碱金属。23.根据权利要求20所述的方法，其中所述催化剂包括Pt、Ni、Pd和Rh中的一种或多种。24.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测和鉴定生物标记包括选自气相色谱、质谱和离子阱质谱的分析化学技术。25.根据权利要求1所述的方法，其中与所述催化剂的接触包括与破坏所述生物标记前体的分解催化剂接触和与酯化所述生物标记前体的衍生催化剂接触。26.根据权利要求1所述的方法，其中所述加热包括与加热的金属网接触。27.根据权利要求1所述的方法，其中所述加热和所述与催化剂的接触都是通过与具有催化活性表面的加热金属网接触而完成的。28.一种鉴定含有不挥发性和挥发性生物标记前体的生物材料的装置，该装置包括带有催化剂的反应区，其构造和配置为将所述生物材料与催化剂接触，并将所述生物材料加热至催化温度，形成挥发性生物标记；收集区，其收集用于检测和鉴定的生物标记。29.根据权利要求28所述的装置，其中所述反应区包括第一和第二接触加热区，所述第一区包括破坏所述生物标记前体的分解催化剂；所述第二区包括酯化所述生物标记的衍生催化剂。30.根据权利要求28所述的装置，其中所述收集区包括一个或多个气相色谱系统和质谱系统。31.根据权利要求28所述的装置，其中所述反应区包括用作加热器的金属网。32.根据权利要求31所述的装置，其中所述金属网具有催化活性表面，并且起催化剂的作用。33.根据权利要求31所述的装置，其中所述金属网是单层或多层的或是泡沫状的。34.根据权利要求31所述的装置，其中所述金属网的构造是将液体样品分布在所述加热表面上。全文摘要一种用于检测生物材料如细菌芽胞(例如，炭疽)的装置和方法，其通过在催化剂的存在下加热生物材料，将不挥发性生物标记前体反应为挥发性前体。文档编号C12Q1/68GK1973050SQ200580013034公开日2007年5月30日申请日期2005年2月25日优先权日2004年2月26日发明者C·H·巴塞洛缪,Z·贾,P·R·史密斯,A·N·N·纳克斯,M·L·L·李,E·D·李申请人:杨伯翰大学