专利名称：一种嗜酸性细菌的固定方法
技术领域：
本发明涉及一种生物固定化颗粒的制备技术，具体是指嗜酸性细菌球状载体的制备方法。
背景技术：
嗜酸性细菌，如氧化亚铁硫杆菌、脱氮硫杆菌、排硫硫杆菌、嗜酸硫杆菌等需要在酸度较强的环境下生长，通常具有很强的耐酸性，试验表明，采用一些常规的包埋固定方法，如琼脂包埋法、海藻酸钙包埋法、聚丙烯酰胺包埋法、卡拉胶包埋法、明胶-戊二醛包埋法等，细菌的生物活性并不是很高，限制了这类细菌在固定化中的应用。
相比之下，PVA具有强度高、化学稳定性好、抗微生物分解性能强、对微生物无毒、价格低廉等一系列优点，是一种具有实用潜力的包埋材料。目前应用的较为广泛PVA的固定化方法主要是硼酸法、冷冻法，硫酸盐法也有报道。冷冻法，需冷冻、解冻多次，最后再切块成形，操作过程比较复杂；硼酸法是一种制备容易且价格低廉的固定化方法，但是这种方法凝胶球容易发生粘联膨胀，并且硼酸对生物毒性大，细胞活性会受较大影响，尽管大量国内外学者对PVA-H3BO3法制备颗粒状载体进行了很多改进，然而这些方法并没有完全解决PVA-H3BO3法的上述局限性；应用硫酸盐法时，如果直接把PVA溶胶滴到硫酸盐溶液中，形成的颗粒粘联严重，Toshihiro(公开特许02-211872)等人将PVA与微生物细胞混合后滴入0.5mg/l的K2SO4溶液中，然后在低于-5℃条件下冷却，室温下解冻，制得的固定化颗粒。薛嵘[薛嵘，黄国兰，毛宇翔。改进的PVA-硫酸盐法固定蛋白核小球藻除磷研究。中国环境科学。2002，22(4)351-354]等首次报道采用改进后的PVA-硫酸盐固定化方法，包埋固定蛋白核小球藻，即先把含有10％～12％PVA及0.2％～0.5％海藻酸钠的含藻水凝胶，用注射器滴入2％CaCl2溶液，形成颗粒后再加入10％Na2SO4溶液，室温下搅拌7h后在蒸馏水中脱盐2h，最终得到固定藻细胞颗粒。但这些方法操作过程显得较为烦琐，不利于保持嗜酸性细菌的酸性生长环境，且形成的球形颗粒不够规则。为了克服现有的PVA球状载体制备的缺陷，本发明提供一种简便快速的嗜酸性细菌球状载体制备方法。
发明内容
本发明把一定浓度比例的PVA和海藻酸钠，加热溶解形成溶胶，以一定浓度的硫酸盐-硫酸缓冲溶液来交联上述混合溶胶，形成固定颗粒。
本发明解决其技术问题所采用的方法是(1).将PVA和海藻酸钠沸水浴加热共溶于水，冷却；(2).将嗜酸性细菌与上述溶液混合均匀，使PVA与海藻酸钠的最终浓度分别为6.0％～12％(w/v)，0.8％～1.5％(w/v)；(3).将上述混合液滴入到轻微搅拌的硫酸盐-硫酸缓冲溶液中，其中硫酸盐的浓度(w/v)为10％～70％，加入一定量的浓硫酸，使缓冲液最终PH为1.0～3.5，把颗粒放置0.5～2h，使之充分反应；(4).滤出颗粒，用去离子水冲洗、脱盐，备用。
上述固定化方法中，把细菌和一定浓度比例的PVA、海藻酸钠混合水凝胶混匀后，直接滴入到轻微搅拌的硫酸盐-硫酸缓冲溶液中，形成一种混合凝胶颗粒。
本发明的有益效果是，大大简化了传统的硫酸盐固定化操作过程，成球反应迅速、球形规则、有一定韧性、抗挤压、颗粒不粘联、毒性小，同时硫酸盐-硫酸缓冲溶液的使用，大大节约了硫酸盐的用量，降低了生产成本。以此方法来固定嗜酸性细菌，活性高，稳定性好。
实施实例一按下列比例称量三组混合凝胶PVA(聚合度，1750±50)6g，海藻酸钠(化学纯)1.5g；PVA(聚合度，1750±50)8g，海藻酸钠(化学纯)1g；PVA(聚合度，1750±50)12g，海藻酸钠(化学纯)0.8g；将三组凝胶分别放入90ml的去离子水中沸水浴加热溶解，冷却后分别加入氧化亚铁硫杆菌细胞悬液10ml，最终细胞浓度1.5×109个/ml，1～3组PVA的浓度分别为6％、8％、12％，1～3组海藻酸钠的浓度分别为1.5％、1.0％、0.8％。将上述混合溶胶滴加到(NH4)2SO4-H2SO4缓冲溶液中，其中(NH4)2SO4的浓度(w/v)为25％，加入一定量的浓硫酸，使缓冲液最终pH为1.5，边滴加边用磁力搅拌器轻缓搅拌缓冲液，颗粒溶液中浸泡40min成形(颗粒平均直径3.5mm)，用去离子水多次冲洗后，备用。
按上述三组浓度比例制备的固定颗粒强度较高，都有较好的韧性，且球形规则，其中第三组因PVA凝胶浓度高，滴定时，成球性稍差。把上述三组颗粒经过一系列的摇瓶活化后，填充在固定床生物反应器中，31？下连续培养，并测量在不同稀释率下固定化细胞对Fe2+氧化的影响。实验结果表明，当稀释率达到0.5时，三组颗粒对Fe2+氧化速率可以分别达到2.10gl-1h-1、2.93gl-1h-1、2.95gl-1h-1，而游离的氧化亚铁硫杆菌对Fe2+氧化速率最高约为0.60gl-1h-1，连续运行10天，活力几乎没有下降。
实施实例二称量PVA(聚合度，1750±50)7.5g，海藻酸钠(化学纯)1g，放入90ml的去离子水中沸水浴加热溶解，冷却后分别加入氧化亚铁硫杆菌细胞悬液10ml，最终细胞浓度1.5×109个/ml，PVA的浓度7.5％，海藻酸钠的浓度分别为1.0％。将上述混合溶胶分别滴加到两种(NH4)2SO4-H2SO4缓冲溶液中，两种缓冲液(NH4)2SO4的浓度(w/v)分别为10％和70％，各加入一定量的浓硫酸，使缓冲液最终pH为1.5，边滴加边用磁力搅拌器轻缓搅拌缓冲液，颗粒溶液中浸泡40min成形(颗粒平均直径3.5mm)，用去离子水多次冲洗后，备用。
把上述两种颗粒经过一系列的摇瓶活化后，填充在固定床生物反应器中，31℃下连续培养，并测量在不同稀释率下固定化细胞对Fe2+氧化的影响。实验结果表明，当稀释率达到0.5时，两组颗粒对Fe2+氧化速率可以分别达到2.44gl-1h-1、2.96gl-1h-1，连续运行10天，稳定性良好。
实施实例三称量PVA(聚合度，1750±50)9g，海藻酸钠(化学纯)0.9g，放入90ml的去离子水中沸水浴加热溶解，冷却后分别加入氧化亚铁硫杆菌细胞悬液10ml，最终细胞浓度1.5×109个/ml，PVA的浓度9％，海藻酸钠的浓度分别为0.9％。将上述混合溶胶分别滴加到两种K2SO4-H2SO4缓冲溶液中，K2SO4的浓度(w/v)为40％，各加入一定量的浓硫酸，使两种缓冲液最终pH分别是为1.0和3.5，边滴加边用磁力搅拌器轻缓搅拌缓冲液，颗粒溶液中浸泡1.5h成形(颗粒平均直径3.5mm)，用去离子水多次冲洗后，备用。
把上述两种颗粒经过一系列的摇瓶活化后，填充在固定床生物反应器中，31℃下连续培养，并测量在不同稀释率下固定化细胞对Fe2+氧化的影响。实验结果表明，当稀释率达到0.6时，两组颗粒对Fe2+氧化速率可以分别达到2.10gl-1h-1、2.02gl-1h-1，连续运行10天，稳定性良好。
实施实例四称量PVA(聚合度，1750±50)9g，海藻酸钠(化学纯)0.9g，放入90ml的去离子水中沸水浴加热溶解，冷却后分别加入氧化亚铁硫杆菌细胞悬液10ml，最终细胞浓度1.5×109个/ml，PVA的浓度9％，海藻酸钠的浓度分别为0.9％。将上述混合溶胶分别滴加到Na2SO4-H2SO4缓冲溶液和FeSO4-H2SO4缓冲溶液中，Na2SO4和FeSO4的浓度(w/v)为30％，各加入一定量的浓硫酸，使两种缓冲液最终pH分别是为1.8，边滴加边用磁力搅拌器轻缓搅拌缓冲液，颗粒溶液中浸泡2h成形(颗粒平均直径3.5mm)，用去离子水多次冲洗后，备用。
滴定到上述缓冲液中制备的固定颗粒强度都较高，都有较好的韧性，且球形规则，其中滴加到Na2SO4-H2SO4缓冲溶液需要反应的时间稍长。把上述两种颗粒经过一系列的摇瓶活化后，填充在固定床生物反应器中，31℃下连续培养，并测量在不同稀释率下固定化细胞对Fe2+氧化的影响。实验结果表明，当稀释率达到0.5时，两组颗粒对Fe2+氧化速率可以分别达到1.91gl-1h-1、2.42gl-1h-1，连续运行10天，稳定性良好。
权利要求
1.一种嗜酸性细菌的固定方法，其特征是将嗜酸性细菌与聚乙烯醇(PVA)、海藻酸钠混合溶胶混匀，将上述细菌混合溶胶滴入到轻缓搅拌的缓冲溶液中，反应0.5～2小时后，用去离子水脱盐，得到颗粒载体。
2.根据权利要求1所述的一种嗜酸性细菌的固定方法，其特征是PVA的浓度为6.0％～12％(w/v)，海藻酸钠的浓度为0.8％～1.5％(w/v)。
3.根据权利要求1所述的一种嗜酸性细菌的固定方法，其特征是硫酸盐-硫酸缓冲溶液可以是(NH4)2SO4-H2SO4，K2SO4-H2SO4，Na2SO4-H2SO4，FeSO4-H2SO4，CuSO4-H2SO4。
4.根据权利要求3所述的硫酸盐-硫酸缓冲溶液缓冲溶液，其特征是硫酸盐的浓度(w/v)为10％～70％，加入一定量的浓硫酸，使缓冲液最终pH为1.0～3.5。
5.根据权利要求1所述的一种嗜酸性细菌的固定方法，其特征是混合溶胶滴入到轻缓搅拌的硫酸盐-硫酸缓冲溶液，而不是静止的硫酸盐-硫酸缓冲溶液。
全文摘要
本发明涉及一种嗜酸性细菌的固定方法。该方法是将一定浓度比例的聚乙烯醇(PVA)和海藻酸钠加热共溶于水，冷却后，与嗜酸性细菌混合，将上述混合液直接滴入到硫酸盐－硫酸缓冲溶液中，使二者反应形成颗粒，用去离子水脱盐后，得到颗粒载体。此种制备球状载体新方法可以广泛应用于嗜酸性微生物的固定化中。
文档编号C12N1/20GK1884511SQ200510200348
公开日2006年12月27日 申请日期2005年6月23日 优先权日2005年6月23日
发明者李红玉, 王玉建, 支德娟 申请人:兰州大学