专利名称：一种扩增NSCs并抑制其向神经胶质细胞分化的方法及其用途的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及生物医学领域，具体地说是涉及一种扩增神经干细胞(neuralstem cells，NSCs)并抑制其向神经胶质细胞分化的方法及其用途。
背景技术：
神经系统的疾病如帕金森氏病、癫痫、阿尔兹海默病、汉庭顿舞蹈病、LouGehrig氏病、脊索损伤、多发性侧索硬化、代谢混乱及视网膜主神经病(majorretinal diseases)等，包括神经轴突的损伤和神经细胞的损伤缺失，都是由于神经元的持续损失又无从替代导致的。对于神经系统的疾病，由于血脑屏障的存在，常规的治疗手段常难奏效。同时，由于神经系统的遗传、代谢及感染性疾病，常是广泛性甚至全脑性的病变，一般意义上的脑细胞或组织移植不能解决根本问题。补充神经干细胞就成为最有可能治愈这些疾病的手段之一。
神经干细胞是指神经系统中处于较早发育阶段的细胞群体，它们可以通过自身的对称性或不对称性分裂方式进行自我复制，产生神经组织中不同发育阶段不同分化方向的细胞，最终生成具有一定细胞数目和多种细胞类型的神经组织。神经干细胞的生物学特点包括多向分化潜能(向多种细胞表型分化的能力)、分裂增殖、长期自我更新维持自身数量稳定(保持未分化的特性)及对疾病、损伤的反应能力，其中最基本的属性为自我更新和多向分化潜能。神经巢蛋白-nestin在神经胚形成时即起始表达，但随着神经细胞分化的完成而停止表达，因此被广泛用做神经干细胞的标志。神经干细胞将是细胞替代疗法促进神经组织再生的重要种子细胞。随着干细胞技术的不断突破，人类有可能自主地在体内外培养、扩增NSCs，定向诱导其分化为所需要的各种神经细胞，或作为种子细胞用于组织工程以供临床所需，或使神经系统中的NSCs直接增殖、迁移和分化代偿受损组织，以此为目的的干细胞工程将成为神经系统损伤治疗的一种重要手段。
由于移植的NSCs可在不同的时间及空间环境下迁移并在不同的部位产生相应的神经元和胶质，与宿主细胞整合，表现与宿主细胞一致的功能特性，参与发育并替代死亡的神经细胞，而且自身NSCs大量增殖后的移植可解决棘手的免疫排斥反应，故NSCs移植对治疗脑损伤与神经退行性病变有重要意义。在病灶部位诱导NSCs迁移并大量增殖和分化，对损伤程度较轻的神经系统病变的治疗则更为便利。此外，NSCs还可作为基因转染的载体，将外源目的基因转导入神经组织并使其有效表达，一方面可用于研究脑的发育机制，神经系统疾病发生、发展的影响因素，另一方面可进行基因治疗，干扰神经退变，刺激修复以及对颅内肿瘤进行治疗。
体外培养扩增NSCs，常规使用无血清培养体系，而获得所需的特定神经细胞则通过添加血清和细胞因子诱导实现。目前NSCs移植治疗的动物实验暴露出该疗法的一个主要障碍，即大部分NSCs在诱导分化过程中大部分分化为神经胶质细胞，只有少量NSCs分化成能传递神经生物电的神经元细胞。因此诱导NSCs向神经元细胞分化，是干细胞替代疗法需要解决的关键问题。影响NSCs分化的细胞因子主要有成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)。它们一方面可以保持NSCs的未分化状态，另一方面在一定程度上影响NSCs的分化。bFGF主要起有丝分裂原的作用，诱导增殖时抑制NSCs的分化，改变其浓度也可促进细胞分化并决定分化方向。EGF可调节神经前体细胞分裂增殖，特别是刺激胶质前体细胞的增殖。bFGF和EGF的联合应用已成为NSCs培养扩增的常规方法。近年来的研究发现，添加其他细胞因子对NSCs的增殖和分化也能产生明显的影响。在人的NSCs培养基中除bFGF、EGF外再添加LIF就能明显地促进干细胞的增殖。
豆类凝集素FRIL(Flt3 receptor interact lectin)在1997年被发现，我们也于中国的眉豆种子中高效提取纯化到了这种特殊的凝集素。FRIL主要是通过作用于它的受体Flt3，随后影响一系列的信号通路而发挥作用，体外实验证实，FRIL能在不更换培养基的情况下维持造血干祖细胞的活存和多潜能性达一个月，是一种新型的、有效的细胞因子。Flt3受体不仅在造血干祖细胞表面表达，在NSCs的表面也有表达。在我们的研究中已证实，FRIL对NSCs有很高的亲和性，它也是NSCs增殖分化的调控因子之一。将FRIL与常规的NSCs培养扩增体系相结合，我们获得了一种新的、更为有效的神经干细胞扩增和向有功能的神经元优势分化的培养体系。
在胚胎发育过程中，很多部位，包括大脑皮层、纹状体、小脑等均存在一定数量的神经干细胞，这已由体外细胞培养所证实。目前的研究已分别从胎鼠的端脑半球、中脑、海马、皮层、纹状体、坐骨神经和脑室区分离培养出NSCs。Vescovi等(Trends Neurosci.1996，19(9)387-393.Review；Exp Neurol.1999，156(1)71-83.)也从胚胎期人脑皮层和纹状体中分离并克隆出NSCs，证实了它能自我更新，持续自发分化为神经元、星形和少突胶质细胞，这些长时间培养的NSCs通过移植可在大鼠损伤的纹状体中有效地生存。
目前，国内外对于神经干细胞的研究仅证实了它的存在，实现了它的体外扩增和一定程度的定向诱导分化，但将其真正应用于临床尚有待时日，特别还需要克服其数量不足和向有功能的神经元细胞方向分化不足的问题。
发明内容
本发明所要解决的关键技术问题是建立一种扩增神经干细胞并抑制其向神经胶质细胞分化的方法。
为解决上述技术问题，本发明利用NSCs具有自我增殖多向分化的潜能，采用新型培养体系扩增NSCs，为神经细胞移植及微囊化神经细胞制剂等的制备提供种子细胞，同时抑制NSCs向神经胶质细胞分化，为NSCs定向诱导分化为有功能的神经元细胞奠定了基础。
本发明中运用的新型培养体系，是联合应用细胞因子bFGF、EGF及豆类凝集素FRIL的培养体系，支持神经干细胞的增殖、维持神经干细胞的状态并抑制其向神经胶质细胞分化。
本发明中运用的体外增殖、诱导方法，是利用添加细胞因子bFGF、EGF及豆类凝集素FRIL的无血清培养体系，以B27作为血清替代品，体外支持神经干细胞的增殖、维持神经干细胞的状态并抑制其向神经胶质细胞分化。
本发明中运用的凝集素FRIL是由中国眉豆中提取纯化的糖蛋白。
本发明中的神经干细胞包括人或哺乳动物胚胎的端脑半球、中脑、海马、大脑皮层、纹状体、坐骨神经和脑室区以及成体的纹状体、海马、皮层和脑室室管膜或室管膜下层等来源的nestin+神经干细胞。
本发明利用添加细胞因子bFGF、EGF及豆类凝集素FRIL的无血清培养体系，可支持人和哺乳动物胚胎端脑半球、中脑来源的nestin+神经干细胞的增殖并向有功能的神经元细胞优势分化。
本发明利用神经干细胞扩增、维持其状态和抑制其向神经胶质细胞分化前后细胞表面表达蛋白的差异进行比较鉴定。
本发明中体外扩增并抑制分化的神经干细胞可作为种子细胞用于神经细胞移植及微囊化神经细胞制剂等的制备，还可作为体外的药代动力学模型用于细胞药物筛选或作为基因治疗的有效载体细胞。
本发明中的细胞因子组合不仅可以促进神经干细胞的增殖、抑制其向胶质细胞分化，而且为神经干细胞定向诱导分化为有功能的神经元细胞奠定了基础。
具体实施方案如下
1.神经干细胞的分离。取哺乳动物或人胚胎的端脑和中脑组织，剥离脑膜后剪碎，2～10ml胰酶消化组织块，通过筛网收集单细胞悬液，培养于含bFGF和EGF的常规培养基中，传代纯化神经干细胞。
2.凝集素FRIL的提取。将中国眉豆Dolichos lablab的干种子在缓冲液中匀浆，分别以酸、碱溶液抽提杂蛋白，再利用凝集素对特定糖基高亲和力的特性加以亲和层析纯化。
3.采用细胞因子EGF 10～20ng/ml终浓度、bFGF10～20ng/ml终浓度、FRIL 40～1000ng/ml终浓度的不同组合分别培养扩增神经干细胞，细胞以相同密度接种于培养基中，定时换液及传代。
4.倒置显微镜下对体外培养的神经干细胞从形态学上进行比较鉴定。
5.培养的神经干细胞用胰酶消化成单细胞悬液，台盼蓝染色后计数台盼蓝拒染细胞数，计算细胞的增殖效率。
6.培养的神经干细胞分别用nestin、GFAP、NSE抗体检测表达相应蛋白的细胞，检测相应的神经干细胞、胶质细胞和神经元细胞的形态和比例。
本发明的有益效果是1.按照本发明提供的技术方法，可以将人或哺乳动物胚胎、成体不同来源的神经干细胞进行大量扩增并有助于向成熟的、有功能的神经元细胞优势诱导；2.按照本发明技术方法得到的体外扩增并抑制分化的神经干细胞，可作为种子细胞应用于神经细胞移植及微囊化神经细胞制剂的制备；3.按照本发明技术方法得到的体外扩增并抑制分化的神经干细胞诱导分化后，可作为体外的药代动力学模型用于细胞药物的筛选或作为基因治疗的有效载体细胞；4.按照本发明提供的技术方法，可在发生缺损的神经组织诱导神经干细胞的迁移、扩增并向有功能的神经元细胞优势分化，代偿损失的神经细胞。
5.本发明所建立的方法将在以基因工程、细胞工程乃至组织工程等为基础的再生医学中具有极佳的应用前景，并将产生巨大的社会效益和经济效益。
图1分离培养的大鼠神经干细胞A光镜下观察大鼠神经干细胞球；Bnestin抗体染色阳性神经干细胞图2 15％SDS-PAGE检测亲和层析纯化的凝集素FRIL。
MProtein molecular weight marker；F纯化后的多亚基FRIL蛋白。
①97.4Kd；②66.2kD；③43kD；④31kD；⑤20.1kD；⑥14.4kD。
1-4FRIL α亚基；5FRIL β亚基。
图3 HRP-FRIL检测神经干细胞、造血干细胞、骨髓基质细胞与FRIL的亲和性。
3a大鼠神经干细胞球呈FRIL反应强阳性；3b人CD34+造血干细胞部分呈FRIL反应阳性；3c人骨髓基质细胞HFCL呈FRIL反应阴性。
图4不同培养因子分组计数结果图5不同培养因子分组形态学观察结果图6神经元分化情况检测绿色nestin，神经干细胞表面标志蓝色DAPI，细胞核染色红色NSE(神经烯醇化酶)，神经元表面标志图7神经元分化比例图8神经胶质细胞分化情况检测绿色nestin，神经干细胞表面标志蓝色DAPI，细胞核染色红色GFAP(胶质纤维酸性蛋白)，神经胶质细胞表面标志图9神经胶质细胞分化比例具体实施方式
实施例1、大鼠神经干细胞的分离、培养取怀孕的Wistar大鼠，待仔鼠达到孕14±1d，用戊巴比妥肌注麻醉孕鼠，无菌条件下剖腹并剪开子宫，取出胎鼠，剥离胞膜，用D-Hanks液轻轻冲洗；乳鼠全身消毒后分层剪开头皮和颅骨，暴露两侧大脑半球，取出端脑和中脑，用D-Hanks液清洗脑组织块并去除血管等结缔组织后剪碎成糊状，离心吸弃上清，转入8ml 0.125％胰酶中，细口吸管轻轻吹打几次后置37℃消化30min，每5min振荡1次。加入100μl血清、10μl DNase I混匀，将细胞悬液过200目细胞筛，200g离心10min，弃上清液，沉淀用1ml无血清培养液重悬，培养。神经干细胞形态如图1。
实施例2、人脑神经干细胞的分离、培养取3～4月龄胚胎，并取出端脑和中脑，小心剥离脑膜，用D-Hanks清洗脑组织块并去除血管等结缔组织后剪碎成糊状，离心吸弃上清，转入8ml 0.125％胰酶中，细口吸管轻轻吹打几次后置37℃消化30min，每5min振荡1次。加入100μl血清、10μl DNase I混匀，将细胞悬液过200目细胞筛，200g离心10min，弃上清液，沉淀用1ml无血清培养液重悬，培养。
实施例3、凝集素FRIL的亲和层析纯化将眉豆研磨成粉，以5倍体积Tris缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，1mmol/LMgCl2，1mmol/L CaCl2，pH8.0)匀浆，4℃平衡4小时以上；4℃20000g离心20min，取上清；以冰醋酸调pH至4.0，4℃20000g高速离心20min，取上清；40％NaOH调pH至8.0，4℃ 20000g高速离心20min，取上清得到凝集素粗提液。粗提液与Tris缓冲液平衡后的亲和层析介质(mannose-Sepharose matrix，Pharmacia公司)结合，4℃反应4小时以上，接着用Tris缓冲液洗涤至没有蛋白流出，再以200mmol/Lα-甲基α-D-甘露糖苷洗脱得到凝集素FRIL纯溶液。15％SDS-PAGE结果如图2所示，从图中可以看出在10kD～25kD范围内有5条明显的条带，是所分离的植物凝集素的5个亚基。凝集素FRIL的提取方法在我们已申请的国家发明专利200410074027.1中已有详细描述。
实施例4、FRIL对神经干细胞的亲和能力检测将纯化获得的FRIL以常规方法用辣根过氧化物酶HRP标记，作为组织化学检测的探针。对黏附于玻片上的神经球用HRP-FRIL孵育反应室温2h，再加入DAB底物显色。分别设造血干细胞和人骨髓基质细胞HFCL为阳性、阴性对照。结果如图3所示。图3显示出，FRIL对神经干细胞有很强的结合能力，能特异性针对神经干细胞发挥作用。
实施例5、大鼠神经干细胞的体外分组培养以不同的细胞因子组合分别扩增培养神经干细胞，培养分组包括含2％B27的无血清DMEM/F12(1∶1)基本培养基，A组基本培养基添加20ng/ml bFGF和20ng/ml EGF，B组基本培养基添加20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF和300ng/mlFRIL。细胞以2×105/ml接种于各组培养基中，每隔3d半量换液，5～7d以1∶2的比例传代。
实施例6、培养神经干细胞的增殖计数以不同的细胞因子组合分别扩增培养神经干细胞，各组细胞每次传代前以胰酶消化成单细胞悬液，重悬在生理盐水中，按9∶1的比例加入0.4％的台盼蓝染液，5min内计数拒染的活细胞数。多次传代后，绘制细胞的增殖曲线，如图4所示，基本培养基添加20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF和300ng/ml FRIL的培养体系可令神经干细胞获得最大的增殖率，平均每代增殖3.1倍。
实施例7、培养神经干细胞的形态观察倒置显微镜下观察各组培养的神经干细胞，7d后基本培养基添加20ng/mlbFGF和20ng/ml EGF的神经球内含50～200个细胞，球边缘出现放射形生长的长梭状贴壁细胞，基本培养基添加20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF和300ng/ml FRIL出现大量贴壁生长的神经球，每球含细胞少，细胞的突触明显。如图5。
实施例8、各组培养细胞的免疫荧光检测将各组培养达1周、2周、3周后的神经细胞吹打成均匀悬液，加到包被了多聚赖氨酸的玻片上，过夜细胞黏附后取出玻片，用PBS冲洗后，4％多聚甲醛固定20min、0.3％Triton X-100透膜20min、10％山羊血清封闭30min，再分别加入抗大鼠nestin、GFAP、NSE的一抗37℃反应2h，荧光二抗37℃反应30min，在荧光显微镜下观察各类神经细胞的形态并计数，计算出各类细胞所占的比例。其中nestin阳性的是神经干细胞，GFAP阳性代表胶质细胞，NSE则是神经元细胞的特异标志。基本培养基添加20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF和300ng/ml FRIL的培养体系与常规培养使用的基本培养基添加20ng/ml bFGF和20ng/ml EGF培养体系的结果比较，神经元细胞的比例基本不变，神经胶质细胞的比例下降，神经干细胞的比例无显著性差异，如图6、7、8、9。可见新的培养体系维持了较多的神经干细胞和神经元细胞。
权利要求
1.一种培养扩增神经干细胞并抑制其向神经胶质细胞分化的方法，其特征在于利用神经干细胞具有自我增殖和多向分化的潜能，通过诱导体系扩增神经干细胞的数量并抑制其向神经胶质细胞分化，其用途在于扩增并抑制分化的神经干细胞可为神经细胞移植、微囊化神经细胞制剂等的制备提供种子细胞，或者运用本方法在体内辅助发生神经退行性病变的组织补充神经元细胞，扩增并抑制分化的细胞还可作为体外药物代谢动力学模型用于细胞药物的筛选。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于利用组合的细胞因子支持神经干细胞扩增的同时可抑制神经干细胞向神经胶质细胞分化。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于用于扩增并抑制神经干细胞分化的培养基可以含有豆类凝集素FRIL、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子及其组合物。
4.根据权利要求1或2、3所述的方法，其特征在于所述神经干细胞具有自我增殖和多向分化潜能，包括人或哺乳动物胚胎、神经系统以及其它组织来源的神经干细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于利用无血清培养基添加包括但不限于碱性成纤维生长因子、表皮生长因子、豆类凝集素FRIL及其组合的培养系统，体外支持神经干细胞在增殖同时向成熟的神经元细胞优势分化。
6.根据权利要求1或2、3所述的方法，其特征在于利用神经干细胞在不同的培养体系中扩增、状态的维持以及分化前后细胞表面蛋白表达的差异进行比较鉴定。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于扩增和抑制分化后的神经干细胞可作为种子细胞用于神经细胞移植、微囊化神经细胞制剂等的制备。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于神经干细胞向神经胶质细胞分化的抑制有利于神经干细胞的体外大量扩增以及后期向神经元的定向诱导分化。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征还在于扩增和诱导分化后的神经细胞还可作为体外药物代谢动力学模型用于细胞药物的筛选或作为基因治疗的有效载体细胞。
全文摘要
本发明涉及生物医学领域，具体地说是涉及一种诱导神经干细胞扩增并抑制其向神经胶质细胞分化的方法及其用途。本发明利用含有一种新型豆类凝集素的无血清培养体系，诱导神经干细胞扩增并抑制其向神经胶质细胞分化。该扩增和抑制分化体系的建立不仅为“神经细胞可再生”的理论提供佐证，而且可为神经细胞移植、微囊化神经细胞制剂等的制备提供种子细胞，同时该细胞因子组合能直接用于体内，对神经退行性病变的组织进行细胞代偿补充，诱导分化的神经细胞还可作为体外的药代动力学模型用于细胞药物筛选。此方法的建立将在以基因工程、细胞工程乃至组织工程等为基础的再生医学中具有极佳的应用前景，并将产生巨大的社会效益和经济效益。
文档编号C12N5/06GK1891817SQ20051008049
公开日2007年1月10日 申请日期2005年7月6日 优先权日2005年7月6日
发明者裴雪涛, 谢小燕, 李艳华, 陈琳, 师伟, 姚海雷 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所