专利名称：OsMDP1基因用于调节植物油菜素内酯敏感性的应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于基因工程领域，涉及到一种转录因子MADS编码基因OsMDP1在转基因植物中的应用，更具体的讲，是关于OsMDP1基因用于调节植物对油菜素内酯(brassinosteroids，BR)敏感性的应用。
背景技术：
水稻是重要的经济作物，它提供了世界上、特别是亚太地区大部分人口的食品和营养来源。在中国，水稻种植面积约占全国粮食作物面积的30％，产量接近粮食总产量的一半。认识水稻生长发育的分子基础，研究水稻基因的表达调控机制以提高水稻单产，改良其种植结构，是我国科学工作者长期以来研究的目标和动力。
油菜素内酯(BR)是一种天然植物激素，广泛存在于植物的花粉、种子、茎和叶等器官中。由于其生理活性大大超过现有的五种激素，已被国际上誉为第六激素，属新型广谱植物生长调节剂，并在农业生产上广泛应用。在田间，BR可以施加于谷物(例如水稻)，瓜果(例如番茄)，蔬菜(例如甘蓝)以及其它重要经济作物(例如烟草)用于提高单产，壮苗及抵抗不良环境。
MADS类基因代表真核生物中一个很大的基因家族。对植物来说，目前已知MADS基因涉及到植物整个生命周期中各种组织的发育，还涉及环境因子响应等过程(Alvarez-Buylla ER.et.al.Plant J.2000，24457-466)。就发育相关的MADS基因来说，已知的多数MADS基因涉及花果种子发育，少数MADS基因仅与营养生长调节有关，其余的MADS基因与营养生长和生殖发育都有关。在高等植物中，通过调控功能基因在特定时期的表达，从而影响植物主根发育、开花时序等过程。其余的MADS基因与营养生长和生殖发育都有关。模式植物拟南芥基因组中共已发现107个MADS基因，已知功能的MADS基因多数与花发育各阶段密切相关，另外一些基因既在营养组织又在花中表达，还有一些基因仅在营养组织表达(Parenicova L.et al.Plant Cell.2003，151538-1551)。
发明人根据一个长约为500bp，可能编码MADS基因的cDNA片断，通过原位杂交法筛选水稻分蘖期噬菌体文库，发现了一个编码MADS转录因子的新的基因，在www.gramene.org网站做BLAST分析，找到了该基因在水稻染色体上的位置和序列。命名为OsMDP1(Oryza sativaMADSDomain containingProtein)，该基因并已递交到EMBL基因库，登录号为AJ 536158。OsMDP1(EMBL accession numberAJ 536158)基因，其核苷酸序列如SED ID NO1所示，该基因全长1045bp。到目前为止，对于OsMDP1基因的功能研究及其应用尚未见文献报道。
发明内容
本申请的发明人通过克隆OsMDP1基因，用包含OsMDP1基因的非保守区的DNA片段构建反义表达载体，然后将OsMDP1基因反义表达载体转入农杆菌，并用农杆菌介导法感染水稻幼胚，建立了转基因水稻株系。通过将转基因水稻株系与野生型植株的比较研究，发现OsMDP1基因在油菜素内酯(BR)控制的水稻叶节弯曲、胚芽鞘伸长等过程中起着负调节因子的作用。
因此，本发明的主要目的就在于提供一种OsMDP1基因用于调节植物油菜素内酯敏感性的应用。
利用OsMDP1基因调节植物对于油菜素内酯的敏感性，可以使转基因植株对于外源施加的油菜素内酯非常敏感。该转基因植株应用于生产，可以大大降低田间油菜素内酯的施用量，从而降低农业成本。这一发现不仅具有理论意义，同时也显示了OsMDP1基因在现代农业中的应用前景。
图1为野生型植株与反义转基因植株表型比较图，左图是水稻幼苗的示意图，标明了叶片、叶节、胚芽鞘及主根的部位，白色箭头所示为叶倾角量取部位；右图是转基因株系与野生型水稻植株光下生长绿苗对于外加0.2ng/mL的BR处理后的表型，其中，WT为野生型，A1，A19-3，A18-6是三个转基因株系。
具体实施例方式
以下结合附图，以具体实施例对本发明作进一步详细的描述。需要指出的是，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。
为研究OsMDP1基因的功能，发明人克隆了OsMDP1基因，用包含OsMDP1基因的非保守区的DNA片段构建反义表达载体，然后将OsMDP1基因反义表达载体转入农杆菌，并用农杆菌介导法感染水稻幼胚，建立了转基因水稻株系。通过光照条件下叶倾角弯曲实验、黑暗下主根和胚芽鞘延伸实验研究该基因与植物的油菜素内酯(BR)之间的关系，结果表明OsMDP1基因在BR控制的水稻叶节弯曲和胚芽鞘伸长过程中起着负调节因子的作用。
因此，OsMDP1基因可以用于调节植物对于油菜素内酯的敏感性。这一特性应用于生产，可以大大降低田间油菜素内酯的施用量，从而降低农业成本。
实施例1、OsMDP1基因的克隆参照《分子克隆》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)，以水稻叶片为原料，采用RNA提取试剂盒(Trizol IV，上海顺华生物工程公司)，按照产品说明书操作提取水稻RNA。
采用RNA反转录试剂盒(FSK101，TaKaRa(大连)公司)，按照产品说明书操作将获得的RNA反转录为cDNA。
以反转录得到的cDNA为模板，采用以下引物对进行PCR扩增P0(反向)5’-AGTCCATCGATCTCATCCAGA-3’；和P11(正向)5’-CTGTTCAAGAAGGCCGAGGA-3’。
扩增条件如下94℃，2min，1次循环；94℃，1min，55℃，1min，72℃，30sec，40次循环；72℃，5min，1次循环。
扩增产物经测序验证，其序列如SEQ ID NO1所示，包含3’端polyA共1045bp长，与EMBL基因库登录号为gi|57283092|emb|AJ536158.1|OSA536158的基因序列相同，表明克隆产物为OsMDP1基因。
实施例2、OsMDP1反义表达载体的构建2.1设计以下引物对P11(正向)5’-CTGTTCAAGAAGGCCGAGGA-3’；和P4(反向)5’-CAGGTAACATCCAAGAACAG-3’。
以pfu聚合酶扩增实施例1所述的cDNA，PCR反应条件为30℃，10min；42℃，90min；95℃，5min；4℃，60min。
得到长度为814bp平末端的DNA片段(核苷酸序列表SED ID NO1中第139-952位)，该片段包含了OsMDP1基因的非保守区，并经测序予以确认。
用限制性内切酶Sma I酶切扩增得到的DNA片段，以平末端反向插入p35S-1301表达载体(CAMBIA公司，双元载体，Km抗性，含CaMV-35S启动子和GUS基因编码区)Sma I位点(位于35S启动子之后)，从而构建出OsMDP1基因的反义表达载体。
2.2以常规的CaCl2处理法(参见《分子生物学实验技术》.郝福英 等 编著，北京大学出版社，北京，1998)制备大肠杆菌DH5α(STRATAGENE公司)感受态，通过电击转化法将实施例2.1所构建的反义表达载体转化大肠杆菌。挑取阳性克隆，按照《分子克隆》提供的方案，采用A012质粒小样快速提取试剂盒(上海鼎国公司)，用SDS裂解法(参见《分子克隆》P45)提取质粒DNA。
以质粒DNA为模板，以35SP(正向5’-AGACTTCGCGCTGATACCAG-3’)和P11(反向)为引物进行PCR，PCR条件为30℃，10min；42℃，90min；95℃，5min；4℃，60min得到的DNA片段经测序证实，p35S-1301表达载体上已插入了814bp的OsMDP1基因的第139-952位核苷酸序列。命名为OsMDP1反义表达载体。
实施例3、水稻转基因株系的建立将实施例2构建的OsMDP1反义表达载体转入农杆菌，通过农杆菌介导法感染水稻的幼胚，构建出A1，A19-3和A18-6三个转基因株系。具体实验方法及步骤如下3.1、菌种构建以常规的CaCl2处理法(参见《分子生物学实验技术》.郝福英 等 编著，北京大学出版社，北京，1998)制备根癌农杆菌EHA105(CAMBIA公司)感受态，通过电击转化法将OsMDP1反义表达载体转入农杆菌中，在含卡那霉素(Km)的LB培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH调pH至7.5)上，于28℃下培养2天。
挑取单菌落，在含卡那霉素的YEP酵母培养基(蛋白胨10g/L，酵母浸膏10g/L，NaCl 5g/L，卡那霉素50mg/L，pH 7.0)中28℃培养约24小时至对数期。按1％的量接种到相同的培养基中，28℃下培养24小时。将培养液于4℃、3000rpm下离心10min，取沉淀(菌体)，用等体积AAM-As培养基(AA培养基无机盐和氨基酸MS维他命，干酪素500mg/L，蔗糖68.5g/L，葡萄糖36g/L，乙酰丁香酮，pH 5.2)悬浮，静置2小时。
3.2、共培养外植体(幼胚)的准备取粳稻(中花11)未成熟种子，经75％的乙醇漂洗1min后用无菌水漂洗3遍，之后用0.1％升汞浸泡15min，再用无菌水漂洗3遍；然后取幼胚接种于ND2培养基(N6大量元素，N6微量元素和N6维他命，脯氨酸500mg/L，干酪素300mg/L，蔗糖30g/L，2，4-D2mg/L，琼脂8g/L，pH 5.8)上，在25℃、黑暗条件下培养三天。
3.3、转化外植体将经培养后的外植体浸入上述3.1所得菌体悬液，静置20min，用无菌滤纸吸干后转移到ND2-As培养基(ND2培养基加入乙酰丁香酮(30μmol/L))上，25℃、黑暗条件下共培养3天。
用无菌水将培养后的外植体洗涤5次以除去表面吸附的农杆菌，然后用含羧苄青霉素250mg/L和头孢霉素100mg/L的无菌水浸泡2小时。用无菌滤纸吸干后转移至ND2CH(ND2培养基加入水解酪蛋白500mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸2mg/L)培养基，25℃下培养，筛选抗性愈伤，每两周继代一次。
3.4、再生筛选得到的抗性愈伤转移到NN1B2H分化培养基(N6大量元素、N6微量元素、N6维他命，干酪素300mg/L，蔗糖30g/L、6-苄基腺嘌呤2mg/L，潮霉素50mg/L，琼脂10g/L，pH 5.8)上，25℃下培养分化。分化出来的小苗转移到含50mg/L潮霉素的MS分化培养基(DUCHEFA BIOCHEMIE公司)上，25℃下培养至约10cm高，移至人工气候室培养至成熟。
水稻在人工气候室，每天于26℃下培养12小时；再于18℃下培养12小时。
实施例4、转基因植物BR敏感性的研究4.1、水稻幼苗光照条件下的叶节实验(lamina joint test)取粳稻(中花11)、三个转基因株系的种子，经75％的乙醇漂洗1min后用无菌水漂洗3遍，之后用0.1％升汞浸泡15min，再用无菌水漂洗3遍。消毒处理后的种子在无菌水中25℃下萌发，2天后筛选萌发较一致的种子接种在1％琼脂培养基(无菌水中加入1％琼脂)上，并于25℃光照条件下生长7天。整株苗移到含有或不含BR的水溶液中25℃下培养2天(每个株系20棵幼苗)，后移至MS培养基(DUCHEFA BIOCHEMIE公司)中继续生长三天，量取叶倾角(第二叶片和叶鞘间的倾角)，并拍照，表型如图1所示。叶节实验结果见以下表1表1、野生型和反义转基因水稻幼苗的叶倾角对比结果(单位度)
叶节的弯曲程度，表现为叶倾角大小。由表1的结果可见，转基因各株系在没有BR时，叶倾角都不同程度地比野生型大；当BR为0.2ng/ml时，野生型弯曲情况和没有BR处理时无明显差异，而反义材料的叶倾角进一步加大；当BR为1.5ng/ml时，野生型和反义材料都有明显的反应，但反义材料的叶倾角总是大于野生型(未列出)。
4.2、黑暗下水稻幼苗主根和胚芽鞘延伸实验取粳稻(中花11)、三个转基因株系的种子，经75％的乙醇漂洗1min后用无菌水漂洗3遍，之后用0.1％升汞浸泡15min，再用无菌水漂洗3遍。消毒处理后的种子接种在含有或不含0.1μM的BR的1％琼脂培养基平板(直径＝15cm)中间一直径线上，胚的方向一致，平板竖放在架上使胚朝下。于25℃黑暗下生长7天，量取主根和胚芽鞘长度(未图示)。结果见以下表2和表3表2、野生型和反义转基因水稻幼苗的主根对比结果(单位cm) 表3、野生型和反义转基因水稻幼苗的胚芽鞘对比结果(单位cm) 由表2和表3的结果可见，转基因株系和野生型种子在黑暗下萌发生长的水稻幼苗，在不添加激素处理时就存在差异，而这种差异在BR处理的情况下更为明显。当没有添加BR时，反义转基因水稻三个株系主根都比野生型短，而胚芽鞘长度差异与主根长度差异相反；当BR为0.1μM时，野生型植株胚芽鞘伸长，主根生长受到抑制，而反义植株表现为主根进一步缩短和胚芽鞘进一步伸长的表型。
4.3、OsMDP1基因与水稻叶节弯曲的关系水稻叶片和叶鞘之间弯曲的程度显示出植株对油菜素内酯BR及其类似物浓度的敏感性，弯曲的角度越大，表明敏感性越强。这一特征甚至是BR及类似物生物定量分析的基础，参见文献(Wada，K，et al.Plant Cell Physiol.1981，22323-325)。
叶节实验中，OsMDP1基因显然参与了外源激素BR控制的水稻叶节弯曲反应和叶颈处近轴面细胞的延伸生长过程，参与并构成了BR在该反应中的信号转导网络。在没有外源激素BR存在下，反义转基因水稻叶片弯曲角度比野生型大，说明该基因是叶颈近轴表面细胞延伸生长的一个负调因子，在功能缺失下此处细胞的生长就受到促进，以至叶片弯曲角度加大。
4.4、OsMDP1基因与水稻胚芽鞘和主根生长的关系从野生型和反义转基因水稻胚芽鞘和主根发育存在的差异可以看出，OsMDP1基因显然参与控制了主根和胚芽鞘在黑暗下的延伸生长，它所编码的转录因子MADS是主根延伸的促进因子、胚芽鞘伸长的抑制因子；在外源BR存在下，反义转基因水稻和野生型在胚芽鞘和主根上的差异变得更为明显。当该基因功能缺失时，BR在调节胚芽鞘和主根生长中的作用得到增强，进一步表明OsMDP1基因在BR控制的水稻胚芽鞘伸长过程中起着负调节因子的作用。
4.5、转基因水稻与BR的关系上述研究表明，相比野生型水稻，转基因水稻对于BR引起的生长效应更加敏感，说明OsMDP1基因在油菜素内酯(BR)控制的水稻叶节弯曲、胚芽鞘伸长等过程中起着负调节因子的作用，因而OsMDP1反义转基因水稻对于外源施加的油菜素内酯非常敏感，基于这一特性，OsMDP1基因可以用于调节植物对于油菜素内酯的敏感性，应用于生产，可以大大降低田间油菜素内酯的施用量，降低农业成本。
在水稻基因OsMDP1功能研究及转基因株系的建立过程中，所采用技术较为成熟，转基因植株表型明显，性征可以遗传。该技术还可用于其它经济作物例如烟草、瓜果、蔬菜、油菜等的品质改良及生产。
虽然以上仅以水稻为实验材料、以p35S-1301质粒为表达载体、并以为农杆菌介导法构建转基因株系为例，对本发明的技术方案进行了阐述，但是根据本发明的公开，采用其他表达载体和转基因方法同样可以方便地构建出OsMDP1反义转基因株系，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。因此，采用其他表达载体和转基因方法构建出其他种类植物的OsMDP1反义转基因株系，同样应属于本发明的范围。
序列表<110>中国科学院上海生命科学研究院<120>OsMDP1基因用于调节植物油菜素内酯敏感性的应用<130>051315N<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1045<212>DNA<213>Oryza sativa<220>
<221>gene<222>(1)..(1045)<400>1atggctggcg gcggcggtgg cgggggaagg ggggaggggg aggggagggc ggccacgggg 60aagagggaga ggatagcaat acggaggatc gacaacctgg cggcgaggca ggtgaccttc 120tcgaagcgga ggagggggct gttcaagaag gccgaggagc tctccatcct ctgcgacgcc 180gaggtcgggc tcgtcgtctt ctccgccacc ggcaagctct tccaattcgc cagcaccagc 240atggaacaga ttattgaccg gtacaactcg cattccaaga cacttcagag agcagaacct 300tctcaactcg acttacaagg ggaggacagc agtacttgtg ccagactaaa ggaggagctt 360gcagaaacta gccttaggct gaggcagatg agaggagagg agctgcacag gctgaatgtg 420gaacagctgc aggagctaga gaagagcctc gagtccggtc taggctctgt tctcaagacc 480aagagcaaga aaattctgga tgagatcgat ggactggaac gaaagaggat gcaattgata 540gaggagaatt taaggctgaa ggagcaagtg tccaggatgt caagaatgga ggagatgcag 600cctgggcctg attcagaaat cgtgtacgag gaagggcagt cgtctgaatc tgtcaccaat 660
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1.一种OsMDP1基因用于调节植物油菜素内酯敏感性的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，用所述OsMDP1基因构建反义转基因植物。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述构建OsMDP1基因的反义转基因植物包括(a)构建OsMDP1基因的反义表达载体；(b)将OsMDP1反义表达载体转入农杆菌；(c)用农杆菌介导法转化植物组织，经培养获得转基因植物。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述构建OsMDP1基因的反义表达载体包括克隆包含OsMDP1基因非保守区的核苷酸序列，并将克隆的核苷酸序列反向插入表达载体。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的表达载体为p35S-1301表达载体。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的包含OsMDP1基因非保守区的核苷酸序列是SEQ ID NO1所示序列中第139-952位的序列。
7.如权利要求1至3中任一项所述的应用，其特征在于，所述植物是水稻。
全文摘要
本发明公开了一种OsMDP1基因用于调节植物油菜素内酯敏感性的应用。OsMDP1基因用于构建反义转基因植物的方法包括构建OsMDP1基因的反义表达载体；将反义表达载体转入农杆菌，并用农杆菌介导法感染水稻幼胚，建立转基因水稻株系。本发明建立的转基因植株对于外源施加的油菜素内酯非常敏感。该转基因植物应用于生产，可以大大降低田间油菜素内酯的施用量，降低农业成本。
文档编号C12N15/82GK1772893SQ20051003006
公开日2006年5月17日 申请日期2005年9月28日 优先权日2005年9月28日
发明者薛红卫, 段可, 李李 申请人:中国科学院上海生命科学研究院