专利名称：抗衣原体感染的免疫接种的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及免疫学，特别是涉及使用核酸分子免疫宿主以提供抗衣原体感染的保护。
背景技术：
核酸免疫是一种产生抗传染性疾病的保护性免疫的方法(参考文献1-在整个申请中，圆括号中示出引用各种参考文献以便更充分地描述本发明所属领域的状态。(引用的全部著录信息列于本发明书的结尾处、权利要求之前。这些参考文献公开的内容在此引入本公开中作为参考)。与基于蛋白或肽的亚单位疫苗不同，核酸或DNA免疫接种通过宿主细胞表达外源蛋白而提供保护性免疫作用，因此允许以更类似于在病毒或细胞内病原体感染期间所发生的方式使抗原呈递到免疫系统(参考文献2)。尽管人们对该技术已经相当关注，但是由DNA免疫大多数还是诱导对病毒性疾病的成功免疫(参考文献3)。由非病毒性病原体导致的结果更多样，其可能反映病原体的性质、所选择的免疫抗原以及免疫接种途径方面的差异(参考文献4)。DNA接种的进一步发展将取决于阐明基础免疫学机理进而将其应用扩大到无法用现有的疫苗研制策略解决的其它传染性疾病。
衣原体属包括四个种，沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肺炎衣原体(C.pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(C.psittaci)和牲畜衣原体(C.pecorum)。沙眼衣原体是专性细胞内细菌病原体，其通常局限于人类宿主的粘膜上皮表面。衣原体是具有称作原生小体(EB)的细胞外孢子样传递细胞和称作网状体的细胞内复制细胞的双态性细菌(参考文献5)。沙眼衣原体是最常见的性传播病原体之一，并且是全世界防盲的主要目标(参考文献6)。从公共健康的角度来看，衣原体感染是非常重要的感染，因为它们是不育症、失明的重要原因，并且是便于人类免疫缺陷病毒1型传播的流行性辅因子(参考文献7)。沙眼衣原体有导致沙眼、生殖器、呼吸和眼感染的多种血清型。据认为由Th1样CD4淋巴细胞反应所释放的细胞因子以及粘膜分泌物中的局部抗体，通过T细胞介导的免疫影响对沙眼衣原体的保护性免疫，并且据认为对沙眼衣原体的保护性免疫是主要针对主要外膜蛋白(MOMP)，其是衣原体细菌细胞上在数量上占优势的表面蛋白，具有约40kDa的分子量(参考文献11)。CD8+T-细胞的作用似乎是次要的。
研制衣原体疫苗的最初努力是基于用整个细菌细胞的非肠道免疫。尽管这种方法在人类试验中获得了一些成功，但是其受到限制，因为保护是短暂的，部分的，并且可能是由于对某种衣原体抗原的病理学反应，在后来的感染事件期间接种可能使疾病恶化(参考文献8)。对衣原体疫苗设计的更近的尝试是基于使用MOMP蛋白或多肽的亚单位设计(参考文献9)。这些亚单位疫苗也普遍失败，可能是因为免疫原没有诱导由生物体上天然表位所唤起的保护性的细胞和体液免疫反应(参考文献10)。
在1997年7月11日申请的，转让给Manitoba大学的美国专利No.6,235,290中，其所公开的内容在此引入作为参考，描述了使用在质粒中编码沙眼衣原体MOMP的DNA序列，通过DNA免疫接种产生保护性免疫反应。
最近已经测定了沙眼衣原体(参考文献14)和鼠沙眼衣原体(C.muridium)(参考文献15)小鼠肺炎株(MoPn)的整个基因组序列。在2001年3月29日公开的PCT出版物WO01/21803中，公开了肺炎衣原体的mgp002基因。
衣原体感染可用抗生素，如四环素衍生物，尤其是强力霉素，以及大环内酯类或氮环内酯如红霉素和阿奇霉素治疗；然而，感染常常是无症状的，严重的并发症通常表现为感染的首发症状(参考文献6)。由于抗生素使用的增加已经导致抗生素抗性微生物的增加，因此化学治疗或抗生素治疗可能不是长期可行的策略。因此，仍然存在有效预防和治疗衣原体感染的需求。
发明概述本发明涉及核酸免疫，具体地是DNA免疫，在宿主中产生对衣原体菌株的Mgp002基因或其截短型的保护性免疫反应。
因此，在一个方面，本发明提供一种核酸分子，其包括编码选自下列任何一种多肽的核酸序列(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6(d)SEQ ID No8(e)包含来自(a)到(d)多肽的至少12个连续氨基酸的免疫原性片段；和(f)通过保守性氨基酸取代修饰且不丧失免疫原性的(a)、(b)(c)或(d)的多肽，其中所述经修饰的的多肽与对应的(a)、(b)(c)或(d)的多肽在氨基酸序列上至少75％相同。
在本发明的另一个方面，提供一种核酸分子，其包括编码选自下列任何一种多肽的核酸序列(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；(e)包含来自(a)到(d)多肽的至少12个连续氨基酸的免疫原性片段；和(f)通过保守性氨基酸取代修饰，不丧失免疫原性的(a)、(b)(c)或(d)的多肽，其中所述经修饰的的多肽与对应的(a)、(b)(c)或(d)的多肽在氨基酸序列上至少75％相同，其中所述核酸分子有效地结合到用于在施用了所述核酸分子的宿主中表达所述核酸分子的序列。
用于表达的序列可以是巨细胞病毒启动子，可能包含在人巨细胞病毒主要立即早期启动子-增强子区。其它合适的启动子可以是病毒启动子或者能在靶真核细胞中促进表达的其它哺乳动物启动子。载体可以是质粒载体，核苷酸序列可以是SEQ ID No1、3、5或7的核苷酸序列。
衣原体菌株可以是包括沙眼衣原体或肺炎衣原体的衣原体株或血清变型。非复制性载体可以是其中插入有核苷酸序列或其衍生物或其修饰的质粒pcDNA3.1。
在本发明的另一个方面，提供在体内施用给宿主用以在宿主中产生对衣原体株的Mgp002基因或其片段的保护性免疫反应的免疫原性组合物，其包括这里所提供的非复制性载体和药学上可接受的载体。
在本发明的另一个方面，提供从衣原体株中分离的多核苷酸，其选自包括SEQ ID NO1所示核苷酸序列的多核苷酸；包括SEQ IDNO3所示的核苷酸序列的多核苷酸；包括SEQ ID NO5所示的核苷酸序列的多核苷酸；包括SEQ ID NO7所示的核苷酸序列的多核苷酸；与SEQ ID NO1、3、5或7的核苷酸序列至少95％同源的多核苷酸；以及在42℃，在含有50％甲酰胺的6x SSC的严紧杂交条件下，与包括SEQ ID NO1、3、5或7所示的核苷酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸，其中向哺乳动物施用免疫原性有效量的所述分离的多核苷酸，在所述哺乳动物中诱导抗由所述衣原体株感染的免疫反应。
在本发明的另一个方面，提供一种包括载体的疫苗，其中载体包含编码选自下列任何一种多肽的核酸分子(a)SEQ ID No2；(b)SEQID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；(e)包含来自(a)到(d)中任何一种多肽的至少100个连续氨基酸的免疫原性片段；和(f)通过保守性氨基酸取代修饰的(a)到(e)中任何一种的多肽，其中所述经修饰的的多肽与对应的(a)到(e)中任何一种的多肽在氨基酸序列上至少90％相同；其中核酸分子与用于使多肽在哺乳动物或细菌细胞中表达的一种或多种调控序列有效地连接，其中疫苗提供抗衣原体所致疾病的保护性免疫反应。
在本发明的另一个方面，提供一种药物组合物，其包括适于在疫苗中使用的药学上可接受的载体或稀释剂，以及编码选自下列任何一种多肽的核酸分子(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ IDNo6；(d)SEQ ID No8；(e)包含来自(a)到(d)多肽的至少100个连续氨基酸的免疫原性片段；和(f)通过保守性氨基酸取代修饰，不丧失免疫原性的(a)到(e)中任何一种的多肽；其中所述经修饰的的多肽与对应的(a)到(e)中任何一种的多肽在氨基酸序列上至少90％相同；其中核酸分子与用于使多肽在哺乳动物中表达的一种或多种调控序列有效地连接。
在本发明的另一个方面，提供一种免疫宿主使其抗衣原体菌株感染所致疾病的方法，其包括向所述宿主施用如本发明所提供的有效量的非复制性载体。
可以任何方便的方式，如通过肌肉内或鼻内向宿主，其包括人类宿主施用核酸分子。
在本发明的另一个方面，提供一种预防或治疗衣原体感染的方法，其包括施用有效量的编码选自下列任何一种多肽的核酸分子的步骤(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)包含来自(a)到(c)多肽的至少100个连续氨基酸的免疫原性片段；和(d)通过保守性氨基酸取代修饰，不丧失免疫原性的(a)到(c)中任何一种的多肽，其中所述经修饰的的多肽与对应的(a)到(c)中任何一种的多肽在氨基酸序列上至少90％相同；其中核酸分子与用于多肽表达的一种或多种调控序列有效地连接。
可在本发明的这个方面中使用上述所讨论的各种选项和可供选择的选项。
那些本领域技术人员将很容易地理解，本发明不仅提供编码衣原体多肽的多核苷酸序列，也提供编码由这些多肽衍生的片段的多核苷酸。此外，本发明应当被理解为提供这些多肽和其衍生片段的突变体和衍生物，其是由于这里所述的非必需氨基酸的添加、缺失或取代所致。本领域的那些技术人员也将很容易地理解，本发明不仅提供编码衣原体多肽的多核苷酸序列，而且进一步提供特异性结合这些多肽的单特异性抗体。
本发明具有广泛的应用，并且包括表达盒、载体和用本发明的多核苷酸转化的或转染的细胞。
附图简述参考附图，将从下列描述中进一步理解本发明，其中
图1显示鼠衣原体(Chlamydia muridium)(Nigg株)的Mgp002基因的全长核苷酸序列(SEQ ID No1)和推定的全长Mgp002基因产物的氨基酸序列(SEQ ID No2)，以及缺失信号序列的核苷酸序列(在箭头处开始)(SEQ ID No5)和推定的氨基酸序列(SEQ ID No6)。
图2显示沙眼衣原体(血清变型D)的Mgp002基因的全长核苷酸序列(SEQ ID No3)和推定的全长Mgp002基因产物的氨基酸序列(SEQID No4)，以及缺失信号序列的核苷酸序列(在箭头处开始)(SEQ IDNo7)和推定的氨基酸序列(SEQ ID No8)。
图3显示一个用编码Mgp002基因或其截短型的核酸分子治疗衣原体感染的免疫方案的具体实施方式
的图示。IM指肌肉内免疫，而IN指鼻内免疫。
图4，包括图A和B，显示用克隆到质粒pcDNA3.1中的编码全长Mgp002基因(图A)和缺失信号序列的Mgp002基因(图B)的核酸分子的免疫，与在用传染性衣原体攻击免疫的Balb/c小鼠中体重丧失之间的关系。说明EB＝杀死宿主的原生小体，PCACTmgp002＝插入全长Mgp002基因的pcDNA3，PCACTmgp002δ＝缺失信号序列的Mgp002基因， ＝没有免疫，pAMycHis＝空载体。
图5，比较图A和B，显示用全长Mgp002基因(图A)和缺失信号序列的Mgp002基因(图B)免疫以及用传染性衣原体攻击的Balb/c小鼠的肺中提高的衣原体的清除率。图例EB＝杀死宿主的原生小体，PCACTmgp002＝插入全长Mgp002基因的pcDNA3，PCACTmgp002δ＝缺失信号序列的Mgp002基因， ＝没有免疫，pAMycHis＝空载体。
图6，图解说明质粒pET30b(+)mgp002+SP的构建，用于表达含有N末端His-Tag的重组Mgp002蛋白。
图7，用图说明在用纯化的重组Mgp002蛋白连同ISCOM佐剂免疫的CH3小鼠中，对沙眼衣原体血清变型D的生殖器攻击的保护。动物用盐水 Mgp002蛋白(mg002)或衣原体原生小体(EB)皮下免疫，然后用活的沙眼衣原体血清变型D随后通过阴道内攻击。测定感染后第3天和第5天的冲洗液中衣原体的感染单位。
发明详述为了阐明本发明，构建含有编码沙眼衣原体小鼠肺炎株(MoPn)Mgp002基因的核酸分子的质粒DNA，其是天然的鼠科病原体，在小鼠中进行实验。已知在小鼠模型中初次感染诱发对再次感染发生强烈的保护性免疫。对于人类免疫，可使用编码沙眼衣原体的Mgp002基因或其截短型的核酸分子。
可使用任何适当的质粒载体，如pcDNA3.1，真核II可选择的表达载体(Invitrogen，San Diego，CA，USA)，含有人类巨细胞病毒主要的立即早期启动子-增强子区或其衍生物，如pCAMycHis。可将编码Mgp002基因或其片段的核酸分子以任何适当的方式插入到载体中。可使用合适的引物从沙眼衣原体基因组DNA中通过PCR扩增基因，并将PCR产物克隆到载体中。可将携带编码Mgp002基因或其片段的核酸分子的质粒，如通过电穿孔转移到大肠杆菌或任何适当的宿主中进行复制。可以任何适当的方式从大肠杆菌中提取质粒。
根据本发明的第一个方面，提供编码衣原体多肽的分离的多核苷酸，在SEQ ID Nos2、4、6和8中显示其氨基酸序列。
将术语“分离的多核苷酸”定义为离开了其天然存在的环境的多核苷酸。例如，存在于活细菌的基因组中或者作为基因库一部分的天然存在的DNA分子是未经分离的，但是从细菌基因组的剩余部分中分离的同样分子，作为例如克隆事件(扩增)的结果，是分离的。通常，分离的DNA分子是不带有在天然存在的基因组中该DNA分子5′或3′端紧邻的DNA区(例如，编码区)的。这种分离的多核苷酸可以是载体或组合物的一部分，但其仍然被定义为“分离的”，因为这种载体或组合物不是这种多核苷酸的天然环境的一部分。
本发明的多核苷酸是RNA或DNA(cDNA、基因组DNA或合成的DNA)，或者其修饰形式、变体、同系物或片段。DNA是双链或单链的，如果是单链的，那么是编码链或非编码(反义)链。如在SEQ IDNo1、3、5和7中所示，任何一种编码本发明多肽的序列都是(a)编码序列，(b)从(a)的转录物中衍生的核糖核苷酸序列，或(c)利用遗传密码的冗余性或简并性编码同一多肽的编码序列。“多肽”或“蛋白质”意思是氨基酸的任何链，无论长度或翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)。两个术语可在本发明申请中交换使用。
相应于本发明的第一方面，提供与SEQ ID No2、4、6或8同源的氨基酸序列。如这里所使用的，“同源氨基酸序列”是全部或部分地由在低于临界解链温度(Tm)25-35℃下与SEQ ID No1、3、5或7所示的核苷酸序列的任何部分杂交的核酸序列所编码的任何多肽。同源氨基酸序列是由于一个或多个保守性氨基酸取代而与SEQ ID No2、4、6或8所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列。这种序列也包括血清型变体(下面所定义的)以及包含缺失或插入的序列，其保留多肽的内在特性如免疫原性。优选地，这种序列与SEQ ID No2、4、6或8至少75％，更优选地80％，最优选地90％到95％相同。
同源性氨基酸序列包括与SEQ ID No2、4、6或8相同或基本上相同的序列。“氨基酸序列基本上相同”意思是与参考的氨基酸序列至少90％，更优选地97％以及最优选地99％相同的序列，优选地由于大多数保守性氨基酸取代而与参考序列不同。
保守性氨基酸取代是在同一类型氨基酸之间的取代。这些类型包括，例如，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸，如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；具有碱性侧链的氨基酸，如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有酸性侧链的氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸；以及具有非极性侧链的氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸和半胱氨酸。
通过使用序列分析软件如威斯康星大学生物技术中心，大学大街1710号，Madison的遗传学计算机组的序列分析软件包，WI53705测量同源性。将氨基酸序列排列起来使相同性最大。可向序列中人工引入缺口以获得适当的序列对比。一旦建立最佳的序列对比，那么通过记录两个序列的氨基酸都相同的所有位置的数量相对于位置的总数，建立同源性的程度。
以类似的方式定义同源性多核苷酸序列。优选地，同源序列是与SEQ ID No1、3、5或7的编码序列至少45％，更优选地60％，最优选地85％相同。
相应于本发明的第一方面，具有与SEQ ID No2、4、6或8同源序列的多肽包括天然发生的等位基因变体，以及突变体或保留SEQ IDNo2、4、6或8多肽内在特性的任何其它非天然发生的变体。
如在本领域中已知，等位基因变体是多肽的替代型，其特点是具有不改变多肽生物学功能的一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加。“生物学功能”意思是指多肽在细胞中自然发生的功能，即使该功能不是细胞生长或存活所必需的。例如，膜孔蛋白的生物学功能是允许细胞外介基中存在的化合物进入细胞。生物学功能与抗原性质不同。多肽可具有一个以上的生物学功能。不同的等位基因变体可具有相似的抗原性质。
等位基因变体在自然界中非常常见。例如，细菌物种如沙眼衣原体通常通过各种血清变型表示，其相互间仅有较小的等位基因变异的差异。事实上，在不同菌株中完成同一生物学功能的多肽可具有在每种菌株中都不同的氨基酸序列(和多核苷酸序列)。尽管有这种差异，但是已经证明了通常针对许多等位基因变体的免疫反应。在衣原体MOMP抗原的研究中，尽管存在菌株和菌株之间的MOMP的氨基酸序列变异，但是出现了交叉株抗体结合，以及传染性的中和，表明当MOMP用作免疫原时可接受的氨基酸变异。
通过对常规方法提取的细菌基因组DNA进行的聚合酶链反应(PCR)扩增，得到编码同源多肽或等位基因变体的多核苷酸。这涉及使用与编码区的5′和3′末端的上游和下游匹配的合成的寡核苷酸引物。根据在SEQ ID No1、3、5或7中所提供的核苷酸序列信息，设计合适的引物。方法如下选择由10到40，优选地15到25个核苷酸构成的引物。选择所含C和G核苷酸的比例足以确保有效杂交的引物是有利的，即，C和G核苷酸的量至少为总核苷酸含量的40％，优选地50％。标准PCR反应通常每100μL含有0.5到5单位的Taq DNA聚合酶，每种脱氧核苷酸20到200μM，优选地以相等的浓度，在总脱氧核苷酸浓度中0.5到2.5mM的镁，105到106个靶分子以及每种引物大约20pmol。进行大约25到50个PCR循环，退火温度低于引物的真正Tm 15℃到5℃。更严紧的退火温度提高了对不正确退火引物的排斥并降低了引物3’端不正确核苷酸的掺入。尽管对于富含G+C靶的变性来说，更高的温度可能是适当的，但是变性温度一般是95℃到97℃。所进行的循环数取决于靶分子的起始浓度，然而由于非特异性背景产物趋于累积，一般建议不超过40个循环。
获取编码同源多肽或等位基因变体的多核苷酸的可选择的方法是通过DNA或RNA文库的杂交筛选。杂交方法是本领域熟知的方法。在用于获得两个相互分离的互补DNA链的上述临界解链温度的公式中反映优化杂交条件的重要参数。对于大约600个或更多的核苷酸来说，该公式如下Tm 81.5+0.41×(％G+C)+16.6log(阳离子浓度)-0.63×(甲酰胺％)-600/碱基数。在适当的严紧条件下，杂交温度(Th)是大约低于所计算Tm的20到40℃，20到25℃，或者，优选地30到40℃。本领域的那些技术人员将会理解可很容易地确定最佳温度和盐条件。
对于本发明的多核苷酸，预杂交和杂交孵育的严紧条件是(i)在42℃，在含有50％甲酰胺的6x SSC中4-16小时，或者(ii)在65℃，在水性6x SSC溶液(1M NaCl、0.1M枸橼酸钠(pH 7.0))中4-16小时。通常，杂交实验在从60到68℃，例如65℃进行。在这种温度，可在6xSSC，优选地在2xSSC或1x SSC，更优选地在0.5xSSC，0.3xSSC或0.1x SSC(缺乏甲酰胺)中获得严紧杂交条件。1xSSC含有0.15M NaCl和0.015M枸橼酸钠。本领域的那些技术人员将会理解，探针核酸序列将与互补的靶核酸序列杂交。
使用已知方法设计非天然存在的有用的同系物和其片段，用于鉴定可能耐受氨基酸序列改变和/或缺失的抗原区。作为实例，比较不同物种的同源多肽；鉴定保守的序列。趋异的序列最有可能耐受序列改变。作为实例，可使用Altschul等(参考文献12)的BLAST同源性搜索算法，分析序列之间的同源性。可选择地，基于可能的T或B细胞表位的计算机辅助分析，对序列进行修饰使得它们对T和/或B细胞的反应性更强。然而另一种可选择的方法是在体外突变多肽内的特定氨基酸残基或序列，然后根据下面概述的方法筛选突变体多肽预防或治疗衣原体感染的能力。
本领域技术人员将会很容易地理解，通过本发明的筛选过程后，将不需要过度的实验便会确定SEQ ID No.2、4、6或8的特定同系物或免疫原性片段是否可用于预防或治疗衣原体感染。筛选方法包括下列步骤(i)用试验同系物或片段免疫动物，优选小鼠，(ii)用传染性衣原体接种免疫的动物；和(iii)选择那些赋予抗衣原体保护的同系物或片段。
“赋予保护”意思是与不用试验的同系物或片段免疫的对照动物相比，降低任何衣原体感染影响的严重性。
相应于本发明的第一方面，提供多肽衍生物，其是SEQ ID No.1、3、5或7的部分核酸序列，与SEQ ID No.2、4、6或8同源的多肽序列的部分序列，通过内部缺失由全长多肽衍生的多肽以及融合蛋白。在免疫学领域中使用蛋白免疫原的片段和变体作为疫苗是一种可接受的实践，因为所有对诱导对蛋白的免疫反应所必需的是蛋白的小(例如，8到10个氨基酸)免疫原性区。已经证明与在非衣原体病原体的表面所暴露的抗原相对应的各种短合成肽是抗它们各对应病原体的有效疫苗抗原，例如，鼠乳腺肿瘤病毒的11残基肽(Casey & Davidson，Nucl.Acid Res.(1977)41539)、Semliki Forest病毒的16残基肽(Snijders等，1991.J.Gen.Virol.72557-565)以及均来自狗细小病毒的两个15残基的重叠肽(Langeveld等，Vaccine 12(15)1473-1480，1994)。
因此，对于本领域技术人员来说将是显而易见的是，阅读本说明书后，SEQ ID No2、4、6或8的部分序列或者它们的同源氨基酸序列是全长序列固有的，并且是经由本发明的教导得出的。这些多肽片段的长度优选地至少为12个氨基酸。有利地是，它们的长度至少为20个氨基酸，优选地至少50个氨基酸，更优选地至少75个氨基酸，最优选地至少100个氨基酸。
使用上述参数以及使用与有待扩增片段的5’和3’端的上游和下游序列匹配的引物，通过PCR扩增获取编码与SEQ ID No2、4、6或8同源序列的部分序列的30到600个核苷酸的多核苷酸。这种扩增的模板多核苷酸是与SEQ ID No1、3、5或7同源的全长多核苷酸，或者多核苷酸的混合物，如DNA或RNA文库中所包含的多核苷酸。作为获取部分序列的可选择的方法，在上述条件下并且使用计算Tm的公式进行筛选杂交。
如果将要获取30到600个核苷酸的片段，通过减法修正所计算的Tm(600/多核苷酸碱基对大小)，通过低于Tm 5到10℃的杂交温度确定严紧条件。如果要获得比20-30个碱基更短的寡核苷酸，计算Tm的公式如下Tm＝4×(G+C)+2(A+T)。例如，50％G+C的18个核苷酸片段的Tm大约为54℃。对于是SEQ ID No2、4、6或8的片段或者其同源序列的短肽，通过化学合成法直接获得。
在整个长度的多肽中存在诱导保护性T细胞依赖性免疫反应的表位。然而，一些表位可能被多肽的二级和三级结构掩盖。为了显示这些被掩盖的表位，建立大量的除去了大部分原始蛋白结构、并暴露被掩盖表位的内部缺失体。这种内部缺失体有时影响除去菌株之间高度变异性的免疫显性区的额外优势。
使用本领域中已知的标准方法构建编码多肽片段的多核苷酸和具有大量内部缺失的多肽。这种方法包括标准PCR、反向PCR、所克隆DNA分子的限制酶处理。很容易地从各种商业来源如Stratagene中获得这些方法的成分和它们的使用说明。一旦构建缺失突变体，如上如上所述检验它们预防或治疗衣原体感染的能力。
如本文所使用的，融合多肽是含有在N或C末端融合了任何其它多肽(这里及下文称作肽尾)本发明的多肽或多肽衍生物的多肽。获得这种融合多肽的简单方式是通过多核苷酸序列的符合读框融合，即杂合基因的翻译。将编码融合多肽的杂合基因插入到用于转化或转染宿主细胞的表达载体中。可选择地，将编码多肽或多肽衍生物的多核苷酸序列插入到已存在编码肽尾的多核苷酸的表达载体中。可买到这种载体和它们的使用说明，例如，从New England Biolabs购买的pMal-c2或pMal-p2系统，其中肽尾是麦芽糖结合蛋白、Pharmacia的谷胱甘肽-S-转移酶系统或者可从Novagen获得的His-Tag系统。这些和其它表达系统提供了便于本发明的多肽和衍生物进一步纯化的手段。
融合多肽的有利的实例是将本发明的多肽或同系物或片段与具有佐剂活性的多肽融合，如霍乱毒素的B亚基或大肠杆菌热不稳定毒素的B亚基。另一个有利的融合是将多肽、同系物或片段与强T细胞表位或B-细胞表位融合。这种表位可以是本领域中已知的表位(例如，乙型肝炎病毒核心抗原，D.R.Millich等，“Antibody production to thenucleocapsid and envelope of the Hepatitis B virus primed by a singlesynthetic T cell site”，Nature.1987.329547-549)，或者基于可能的T或B细胞表位的计算机辅助分析，已在本发明的另一个多肽中被鉴定的表位。相应于本发明的该方面的是包括SEQ ID No2、4、6或8或其同系物或片段的T或B细胞表位的融合多肽，其中表位来自所述多肽或同系物或片段的多个变体，各变体之间因其表位在多肽内的位置和序列上不同而不同。这种融合在衣原体感染的预防和治疗中是有效的，因为其优化了对整个多肽、同系物或片段的T细胞和B细胞反应。
为了实现融合，将本发明的多肽融合到具有佐剂活性或者T或B细胞表位的多肽N末端，或者优选地融合到C末端。可选择地，将本发明的多肽片段内部地插入到具有佐剂活性的多肽的氨基酸序列内。也可将T或B细胞表位内部地插入到本发明多肽的氨基酸序列内。
相应于第一方面，本发明的多核苷酸也编码含有异源信号肽的杂前体多肽，其成熟成为本发明的多肽。“异源信号肽”意指不在本发明多肽的天然前体中存在的信号肽。
本发明的多核苷酸分子，其包括RNA、DNA或其修饰或其组合，具有各种应用。例如DNA分子用于，(i)在重组宿主系统中生产所编码多肽的方法中，(ii)构建疫苗载体如痘病毒，其进一步用于预防和/或治疗衣原体感染的方法和组合物，(iii)作为疫苗试剂(以及RNA分子)，以裸露的形式或与递送载体一起配制以及，(iv)构建减毒衣原体菌株，其可过量表达本发明的多核苷酸或者表达其非毒性，突变型蛋白。
因此，本发明的第二方面包括(i)含有本发明DNA分子的表达盒，其置于表达所需元件，也称作表达控制序列的控制下或者与其有效连接，特别是位于适当启动子的控制下；(ii)含有本发明表达盒的表达载体；(iii)用本发明的表达盒和/或载体转化或转染的原核或真核细胞，以及(iv)生产由本发明的多核苷酸所编码的多肽或多肽衍生物的方法，其涉及在可使本发明DNA分子表达的条件下，培养用本发明的表达盒和/或载体转化或转染的原核或真核细胞，以及从细胞培养物中回收所编码的多肽或多肽衍生物。
重组表达系统选自原核和真核宿主。真核宿主包括酵母细胞(例如，酿酒酵母(Saccharonzyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichiapastoris))、哺乳动物细胞(例如，COS1、NIH3T3或JEG3细胞)、节肢动物细胞(例如，草地贪夜蛾(Spodoptera fruglperda)(SF9)细胞)以及植物细胞。优选的表达系统是原核宿主如大肠杆菌。细菌和真核细胞可从许多不同来源中获得，其包括本领域那些技术人员已知的商业来源，例如，美国典型培养物保藏中心(ATCC；Rockville，Maryland)。用于重组蛋白表达的细胞的商业来源也提供细胞使用的说明。
表达系统的选择取决于所表达多肽的期望特征。例如，其可用于生产以特定脂质化(lipidated)型或任何其它型的本发明的多肽。
本领域技术人员将会很容易地理解，虽然并非所有载体和表达控制序列以及宿主都能同等地很好地表达本发明的多核苷酸。但可根据下述指导方针，不需要过度的实验以及不偏离本发明的范围选择载体、表达控制序列和宿主。
相对于选择载体，必需选择与将在其中存在和可能复制的载体相容的宿主。要考虑载体的拷贝数、控制拷贝数的能力、其它蛋白如抗生素抗性的表达。在选择表达控制序列时，要考虑许多变量。在这些重要的变量中要考虑序列的相对强度(例如，在各种条件下驱动表达的能力)、控制序列功能的能力、有待表达的多核苷酸和控制序列之间的相容性(例如，考虑二级结构以避免妨碍有效转录的发夹结构)。在选择宿主时，选择单细胞宿主，其与所选载体相容，耐受所表达产物的任何可能的毒性影响，如果这是期望的话，能够有效地分泌所表达的产物，能够表达期望构象的产物，能够很容易地按比例增加，以及能够很容易地纯化终产物。
表达盒的选择取决于所选的宿主系统以及所表达的多肽的期望特征。通常，表达盒包括在所选宿主系统中有功能可以是组成型或诱导型的启动子；核糖体结合位点；如果需要的话，起始密码子(ATG)；信号肽编码区，例如脂质化(lipidation)信号肽；本发明的DNA分子；终止密码子；以及任选地3′终止区(翻译和/或转录终止子)。信号肽编码区邻近本发明的多核苷酸并与正确的阅读框相符。信号肽编码区与编码成熟多肽的DNA分子同源或异源，并且与用于表达的宿主的分泌器相容。将由本发明的DNA分子，单独地或与信号肽一起构成的可读框置于启动子的控制下，以便在宿主系统中发生转录和翻译。启动子和信号肽编码区对于本领域的那些技术人员来说是广泛已知和可获得的，其包括，例如，可由阿拉伯糖诱导(启动子araB)并且在革兰氏阴性细菌如大肠杆菌中有功能的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)(和衍生物)的启动子(如描述于美国专利No.5,028,530)；编码噬菌体T7RNA聚合酶基因的启动子，其在许多表达T7聚合酶的大肠杆菌株中起作用(描述于美国专利No.4,952,496)；OspA脂化信号肽；以及RlpB脂质化信号肽(Takase等，J.Bact.(1987)1695692)。
表达盒一般是表达载体的一部分，选择能在所选表达系统中复制的表达载体。表达载体(例如，质粒或病毒载体)可选自，例如，在Pouwels等(Cloning VectorsA Laboratory Manual1985，Supp.1987)中所描述的那些。适当的表达载体可购自各种商业来源。
用表达载体转化/转染宿主细胞的方法是本领域中熟知的并且视所选宿主系统而定。
一旦表达，本发明的重组多肽(或多肽衍生物)在细胞内的区室中产生并保持，分泌/排泄到细胞外介质或壁膜间隙，或者被包埋在细胞膜中。重组细胞培养物离心后，从细胞提取物或从上清液中回收基本上为纯化型的多肽。一般地，重组多肽通过基于抗体的亲和纯化法或者通过可很容易地由本领域技术人员修改的其它熟知的方法进行纯化，如编码多肽或其衍生物的多核苷酸与低亲和结合区的融合。根据下述方法获得用于通过免疫亲和纯化本发明多肽的有用的抗体。
本发明的多核苷酸也可用作疫苗。有两个主要途径，或者使用病毒的或细菌的或合成的递送载体(即，活疫苗载体或微粒)或者施用游离型的基因，例如，插入到核酸载体中。根据下述方法评估本发明多核苷酸的治疗或预防效能。
本发明的另一个方面提供(i)含有置于表达所需元件的控制下的本发明的DNA分子的疫苗载体如痘病毒；(ii)物质组合物，其包括本发明的疫苗载体，以及稀释剂或载体；具体地(iii)含有治疗或预防有效量的本发明疫苗载体的药物组合物；(iv)在哺乳动物中诱导抗衣原体的免疫反应的方法(例如，人；可选择地，可在兽医应用中用于治疗或预防动物，例如，猫或鸟的衣原体感染的方法)，其涉及向哺乳动物施用免疫原性有效量的本发明的疫苗载体以引起对衣原体的保护性或治疗性免疫反应；以及特别地，(v)预防和/或治疗衣原体(例如，沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体、牲畜衣原体)感染的方法，其涉及向感染的个体施用预防或治疗量的本发明的疫苗载体。
另外，本发明的另一个方面包括本发明的疫苗载体在制备预防和/或治疗衣原体感染的药物中的用途。
如本文所使用的，疫苗载体表达一种或几种本发明的多肽或衍生物。疫苗载体可另外表达增强免疫反应(佐剂效应)的细胞因子，如白介素-2(IL-2)或白介素-12(IL-12)。应当理解的是，将有待表达的各成分置于在哺乳动物细胞中表达所必需元件的控制下。
相应于本发明另一方面的是包括几种疫苗载体的组合物，其中的每一种都能表达本发明的多肽或衍生物。组合物也可包括能表达另外的衣原体抗原，或者亚基、片段、同系物、突变体或其衍生物，任选地连同或者细胞因子如IL-2或IL-12的疫苗载体。
用于在哺乳动物中治疗或预防感染的接种方法包括通过任何常规途径施用本发明的疫苗载体的用途，特别是通过粘膜(例如，眼、鼻内、口、胃、肺、肠、直肠、阴道或泌尿道)表面或通过非肠道(例如，皮下、真皮内、肌内、静脉内或腹膜内)途径。优选的途径取决于疫苗载体的选择。治疗可以单剂量或每隔一段时间重复完成。适当的剂量取决于技术人员所理解的各种参数，如疫苗载体本身、给药途径或被接种的哺乳动物的情况(体重、年龄等)。
本领域中可利用的活疫苗载体包括病毒载体如腺病毒、痘病毒和α病毒，以及细菌载体，例如，志贺氏菌属(Shigella)、沙门氏菌属(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、卡介苗(Bacille bilie de Calmette-Guerin)(BCG)以及链球菌属(Streptococcus)。
腺病毒载体的实例，以及构建能表达本发明DNA分子的腺病毒载体的方法描述于美国专利No.4,920,209。痘病毒载体包括牛痘和金丝雀痘病毒，分别描述于美国专利No.4,722,848和美国专利No.5,364,773。对于牛痘病毒载体(金丝雀疸)的描述见Taylor等(参考文献13)。金丝雀痘载体在哺乳动物细胞中具有有限的复制或者不复制。
通常，用于治疗或预防用途的疫苗病毒载体的剂量可从每公斤约1×104到约1×1011，有利地从约1×107到约1×1010，优选地从约1×107到约1×109蚀斑形成单位。优选地，通过非肠道途径施用病毒载体；例如，分3个剂量，相隔四周。优选地避免向含有本发明病毒载体的组合物中添加化学佐剂，因而将对病毒载体本身的免疫反应降到最低。
甲病毒(Alphavirus)载体可包括Simliki Forest病毒载体(参考文献16)、Sindbis病毒载体(参考文献17)或Venezuelan马脑炎病毒载体(参考文献18)。裸RNA或质粒DNA以及可含有复制缺陷甲病毒的重组颗粒可有效地用于免疫。
用作活的口服疫苗的非产毒霍乱弧菌突变体株是已知的。美国专利No.4,882,278描述了两个ctxA等位基因中均缺失了大量编码序列，结果不产生有功能的霍乱毒素的菌株。能表达由本发明DNA分子所编码的多肽或多肽衍生物的霍乱菌株的有效疫苗剂量在适于所选给药途径的体积中含有约1×105到约1×109，优选地约1×106到约1×108的活细菌。优选的给药途径包括所有粘膜途径；最优选地，这些载体通过鼻内或口服给药。
减毒的鼠伤寒沙门氏菌株，通过基因工程改造以重组表达或不表达异源抗原，以及它们作为口服疫苗的用途描述于1998年12月22日授权的美国专利5,851,519。优选的给药途径包括所有粘膜途径；最优选地，这些载体通过鼻内或口服给药。
在本发明的上下文中，用作疫苗载体的其它减毒细菌株描述于1997年7月1日授予的美国专利5,643,771。
在细菌载体中，将本发明的多核苷酸插入到细菌基因组中或者作为质粒的一部分保持游离状态。可使用细菌载体表达衣原体疫苗抗原或者将质粒DNA等表达载体如递送到宿主细胞中，其随后在宿主细胞中表达并引发对衣原体抗原的免疫反应。
包括本发明疫苗细菌载体的组合物可进一步含有佐剂。许多佐剂对于本领域的那些技术人员来说是已知的。优选的佐剂包括，但不限于铝盐(明矾)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝、水包油乳剂，皂苷佐剂如ISCOMs，细胞因子如白介素、干扰素、巨噬细胞集落刺激因子、肿瘤坏死因子。
根据本发明的疫苗或免疫原性组合物可以是预防性的(即，用于预防疾病)或治疗性的(即，在感染后用于治疗疾病)。用作疫苗的免疫原性组合物包括免疫学有效量的抗原或抗原的免疫原性片段。免疫学有效量意思是作为单剂量或作为系列剂量的一部分向个体施用的对预防或治疗有效的量。术语治疗有效量指使治疗以达到好转，或防止所关注的疾病或情况，或者显示可检测到的治疗或预防效果的治疗剂的量。对于本发明的目的，有效剂量将从1μg/kg到100μg/kg或者10μg/kg到50μg/kg。
免疫原性组合物和疫苗可通过非肠道施用，通过皮下注射、真皮内或肌内注射。可选择地，可配制根据本发明所配制的免疫原性组合物并以在粘膜表面引起免疫反应的方式递送。因此，可通过，例如鼻或口(intagastric)途径向粘膜表面施用免疫原性组合物。可选择地，包括栓剂和口服制剂的其它给药方式也是可行的。对于栓剂，粘合剂和载体可包括，例如，polyalkalene glycois或甘油三酯。这种栓剂可由含有大约10％，优选地大约1到2％的活性免疫原性成分的混合物组成。口服制剂可包括正常所使用的载体，如，药物级的糖精、纤维素和碳酸镁。这些组合物可采取溶液、悬液、片剂、丸剂、胶囊、缓释剂或粉剂的形式，含有大约1到95％的活性成分，优选地大约20到75％。
因此，本发明的另一个方面提供(i)一种物质组合物，其包括本发明的多核苷酸，连同稀释剂或载体；(ii)包括治疗或预防有效量的本发明多核苷酸的药物组合物；(iii)在哺乳动物中诱导抗衣原体的免疫反应的方法，通过施用免疫原性有效量的本发明的多核苷酸，引起对衣原体的保护性免疫反应；以及特别地，(iv)预防和/或治疗衣原体(例如，沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体或牲畜衣原体)感染的方法，通过向感染个体施用预防或治疗量的本发明的多核苷酸。另外，本发明的第四方面包括本发明的多核苷酸在制备用于预防和/或治疗衣原体感染的药物中的用途。优选的用途包括将DNA分子置于用于在哺乳动物细胞中表达的条件下，尤其在不能在哺乳动物细胞中复制并且基本上不能在哺乳动物基因组中整合的质粒中。
本发明的多核苷酸的用途包括它们作为疫苗施用给哺乳动物，用于治疗或预防性目的。这种多核苷酸以DNA的形式作为不能在哺乳动物细胞中复制并且不能整合到哺乳动物基因组中的质粒的一部分。一般地，将这种DNA分子置于适于在哺乳动物细胞中表达的启动子的控制下。启动子以普遍存在地或组织特异性方式起作用。非组织特异性启动子的实例包括早期巨细胞病毒(CMV)启动子(描述于美国专利No.4,168,062)和Rous肉瘤病毒启动子(描述于Norton & Coffin，Molec.Cell Biol.(1985)5281)。组织特异性启动子的实例是在肌肉细胞中驱动表达的结蛋白启动子(Li & Paulin，J.Biol.Chem.(1993)26810403)。启动子的使用对于本领域的那些技术人员来说是熟知的。有用的载体描述于许多出版物中，特别是WO 94/21797。
用作疫苗的本发明的多核苷酸编码对应多肽的前体或成熟型。在前体型中，信号肽可以是同源的或异源的。在后者的情况中，可使用真核前导序列。
如本文所使用的，本发明的组合物含有一种或几种多核苷酸，任选择地具有至少一个编码另一衣原体抗原、或其片段、衍生物、突变体或类似物的额外的多核苷酸。组合物也可含有编码细胞因子，如白介素-2(IL-2)或白介素-12(IL-12)的额外的多核苷酸以便提高免疫反应。将这些额外的多核苷酸置于用于表达的适当的控制下。有利地是，本发明的DNA分子和/或额外的DNA分子包含在同一组合物中，存在于同一质粒中。
在本发明多核苷酸治疗剂的制备中使用制备和纯化多核苷酸的标准分子生物学技术。对于作为疫苗的用途，根据下面所概述的各种方法配制本发明的多核苷酸。
一种方法利用裸露型的多核苷酸，无任何递送载体。将这种多核苷酸在生理学可接受的溶液，如无菌盐或无菌缓冲盐，有或没有载体的溶液中简单地稀释。当存在载体时，载体优选地是等渗、低渗或弱高渗的，并且具有相对低的离子强度，如由蔗糖溶液所提供的离子强度，例如，含有20％蔗糖的溶液。
可选择的方法利用与辅助细胞摄取的试剂结合的多核苷酸。这种试剂的实例是(i)修饰细胞渗透性的化学制剂，如布比卡因(见，例如，WO 94/16737)，(ii)用于包封多核苷酸的脂质体，或(iii)与多核苷酸结合的阳离子脂质或二氧化硅，金或钨微粒。
阴离子和中性脂质体是本领域中熟知的(见，例如，LiposomesAPractical Approach，RPC New Ed，IRL press(1990)，详细描述了制备脂质体的方法)并可用于传递大范围的产物，包括多核苷酸。
阳离子脂质在本领域中也是熟知的，通常用于基因传递。这种脂质包括也称为DOTMA(N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵)的LipofectinTM、DOTAP(1，2-双(油酰氧)-3-(三甲铵)丙烷)、DDAB(二甲基双十八烷基溴化铵)、DOGS(双十八烷基酰胺甘氨酰精胺)以及胆固醇衍生物如DC-Chol(3β-(N-(N′，N′-二甲基氨基乙基)氨甲酰基-胆固醇)。可在EP 187,702、WO 90/11092、美国专利No.5,283,185、WO91/15501、WO95/26356以及美国专利No.5,527,928中发现这些阳离子脂质的描述。优选地与中性脂质如DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)结合使用的用于基因传递的阳离子脂质，如在WO 90/11092中所描述的作为实例。
含有阳离子脂质体的制剂可任选地含有其它便于转染的化合物。
如在WO 91/00359、WO 93/17706和Tang等(参考文献19)中所描述的，使用金或钨微粒进行基因传递。使用无针注射装置(“基因枪”)通过真皮内或表皮内途径注射微颗粒包被的多核苷酸，如在美国专利No.4,945,050、美国专利No.5,015,580和WO 94/24263中所描述的那些。
在疫苗接受者中所用的DNA的量取决于，例如，DNA构建体中所用启动子的强度、所表达的基因产物的免疫原性、有待给药的哺乳动物的情况(例如，体重、年龄以及哺乳动物的总的健康)、给药方式以及制剂的类型。一般地，可向成年人施用从大约1μg到大约1mg，优选地，从大约10μg到大约800μg，以及更优选地，从大约25μg到大约250μg的治疗或预防有效量。可以单剂量或每隔一段时间重复给药。
给药的途径是疫苗领域中所用的任何常规途径。作为总的指导，通过粘膜表面施用本发明的多核苷酸，例如，眼、鼻内、肺、口、肠、直肠、阴道以及泌尿道表面；或者通过非肠道途径，例如，通过静脉内、皮下、腹膜内、真皮内、表皮内或者肌内途径。给药途径的选择取决于所选的制剂。将与布比卡因结合配制的多核苷酸有利地施用到肌肉内。当使用中性或阴离子脂质体或阳离子脂质，如DOTMA或DC-Chol时，可通过静脉内、鼻内(喷雾)、肌内、真皮内以及皮下途径有利地注射该制剂。可通过肌内、真皮内或皮下途径有利地施用裸露型的多核苷酸。
尽管不是绝对必需的，但是这种组合物也可含有佐剂。假如这样的话，为了显示佐剂的效果，优选不需要伴随给药的全身佐剂，如，例如，QS21，其描述于美国专利No.5,057,546。
在本申请中所提供的序列信息能够设计用于诊断目的的特异性核苷酸探针和引物。因此，本发明的第五方面提供核苷酸探针或引物，其具有在SEQ ID No1或3所示序列中所发现的序列或者具有从SEQID No1或3所示序列的遗传密码子的简并性衍生的序列。
在本申请中所使用的术语“探针”指DNA(优选地单链)或RNA分子(或其修饰或其组合)，其在上述所定义的严紧条件下与具有SEQID No1的核苷酸分子，或者与SEQ ID No1或3同源的序列，或者与其互补或反义序列杂交。通常，探针显著短于全长序列。这种探针含有从大约5到大约100个，优选地从大约10到大约80个核苷酸。特别是，探针具有与SEQ ID No1的一部分至少75％，优选地至少85％，更优选地至少95％同源，或者与这些序列互补的序列。探针可含有修饰的碱基，如肌苷、甲基-5-脱氧胞苷、脱氧尿苷、二甲基氨基-5-脱氧尿苷或者二氨基-2，6-嘌呤。也可修饰或取代糖或磷酸残基。例如，可用聚酰胺取代脱氧核糖残基，可用酯基取代磷酸残基，如二磷酸、烷基、芳基膦酸酯以及硫代磷酸酯。另外，可通过包括烷基的这些基团修饰核糖核苷酸上的2′-羟基。
可在诊断试验中使用本发明的探针，作为捕获或检测探针通过共价方法或者通过被动吸附，直接地或间接地将这种捕获探针常规地固定到固体支持物上。检测探针通过选自下列的检测标记进行标记放射性同位素，酶如过氧化物酶、碱性磷酸酶以及能水解产色的、荧光的或发光底物的酶，产色的、荧光的或发光的化合物，核苷酸碱基类似物以及生物素。
本发明的探针用于任何常规的杂交技术，如点印迹、Southern印迹(Southern，J.Mol.Biol.(1975)98503)、northern印迹(除了RNA用作靶外，与Southern印迹相同)、或者夹心技术(Dunn等，Cell(1977)1223)。后者的技术涉及使用相互之间核苷酸序列至少部分不同的特异性捕获探针和/或特异性检测探针。
引物是通常大约10到大约40个核苷酸的探针，其用于在扩增过程(例如，PCR)中，在延伸过程中，或者在反转录方法中引发DNA的酶促聚合。通过本领域中已知的方法标记在涉及PCR的诊断方法中所用的引物。
如本文所描述的，本发明也包括(i)包括本发明的用于检测和/或鉴定生物材料中是否存在衣原体的探针的试剂；(ii)用于检测和/或鉴定生物材料中是否存在衣原体的方法，其中(a)样本回收自或来自生物材料，(b)从材料中提取DNA或RNA并变性，和(c)在严紧杂交条件下暴露于本发明的探针，例如，捕获、检测探针或两者，以便检测杂交；以及(iii)用于检测和/或鉴定生物材料中是否存在衣原体的方法，其中(a)样本回收自或来自生物材料，(b)从其中提取DNA，(c)将所提取的DNA用至少一条，优选地两条本发明的引物引发并通过聚合酶链反应扩增，以及(d)产生所扩增的DNA片段。
很显然，SEQ ID No1、3、5或7的多核苷酸序列、其同系物和部分序列的公开能够获得它们对应的氨基酸序列。因此，本发明的第六方面特征是具有由本发明多核苷酸编码的氨基酸序列的基本上纯化的多肽或多肽衍生物。
本文所使用的“基本上纯化的多肽”定义为从其天然存在的环境中分离的多肽和/或不存在其合成环境中所存在的大多数多肽的多肽。例如，基本上纯化的多肽是无胞质多肽。本领域的那些技术人员将很容易地理解，本发明的多肽可从自然来源，即，从衣原体菌株中纯化，或者通过重组方法生产。
相应于本发明的第六方面的是经过修饰或处理以提高它们在靶动物中的免疫原性的多肽、同系物或片段，其中多肽、同系物或片段旨在赋予抗衣原体的保护。这种修饰或处理包括用氨基酸衍生物如3-甲基组氨酸、4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸等的氨基酸取代，在多肽、同系物或片段的制备后进行的修饰或缺失，如氨基酸的游离氨基、羧基或羟基侧链基团的修饰。
通过筛选与引起抗具有SEQ ID No1、3、5或7氨基酸序列的参考多肽的抗血清的交叉反应性，鉴定了具有特异抗原性的由本发明多核苷酸所编码的同源多肽或多肽衍生物。该方法如下制备抗纯化的参考多肽、融合多肽(例如，MBP、GST或His-tag系统的表达产物，在Invitrogen产品手册中包含pcDNA3.1/Myc-His(+)A、B和C以及XpressTm系统蛋白纯化的描述和使用说明)，或预计具有抗原性的合成肽的单特异性超免疫抗血清。对于制备抗融合多肽的抗血清，那么使用两个不同的融合系统。可根据许多方法测定特异性抗原性，包括下述Western印迹、点印迹和ELISA。
在Western印迹试验中，根据Laemmli(Nature(1970)227680)所描述的方法将作为纯化制剂或大肠杆菌总提取物的筛选产物进行SDS-Page电泳。转移到硝酸纤维素膜后，将材料进一步与在从大约1∶5到大约1∶5000，优选地从大约1∶100到大约1∶500的稀释范围内稀释的单特异性超免疫抗血清孵育。一旦与产物对应的条带在上述范围内的任何稀释液中显示反应性，则表明特异抗原性。
在ELISA试验中，将要筛选的产物优选地用作包被抗原。尽管也可使用整个细胞提取物，但是优选使用纯化的制剂。简要地，将约10μg蛋白/ml的约100μl制剂分配到96孔聚碳酸酯ELISA平板的孔内。将平板在37℃孵育2小时，然后在4℃过夜。将平板用含0.05％Tween 20的磷酸缓冲盐(PBS/Tween缓冲液)冲洗。将孔用250μl含有1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS饱和以防止非特异性抗体结合。在37℃孵育1小时后，将平板用PBS/Tween缓冲液冲洗。将抗血清在含有0.5％BSA的PBS/Tween缓冲液中连续稀释。每个孔中加入100μl稀释液。将平板在37℃孵育90分钟，冲洗并根据标准方法进行评估。例如，当在兔中引起特异性抗体时，向孔中加入山羊抗兔过氧化物酶缀合物。孵育是在37℃进行90分钟并冲洗平板。反应用适当的底物显色并通过比色法测量反应(通过分光光度法测量吸光度)。在上述试验条件下，高于非免疫对照血清的O.D.值，显示阳性反应。
在点印迹试验中，尽管也可使用整个细胞提取物，但是优选纯化的产物。简要地，将大约100μg/ml的产物溶液在50mM Tris-HCl(pH7.5)中连续稀释两倍。将每种稀释液100μl应用到装在96孔点印迹装置(Biorad)中的0.45μm硝酸纤维素膜上。通过向系统中应用真空除去缓冲液。通过添加50mM Tris-HCl(pH 7.5)冲洗孔并将膜进行风干。将膜在封闭缓冲液(50mM Tris-HCl(pH7.5)0.15M NaCl，10g/L脱脂乳)中饱和并与从大约1∶50到大约1∶5000，优选地大约1∶500的抗血清稀释液孵育。根据标准方法显示反应。例如，当使用兔抗体时，向孔中加入山羊抗兔过氧化物酶缀合物。在37℃孵育90分钟，并冲洗印迹。反应用适当的底物显色并终止。通过有色点的外观目测反应，例如，通过比色法。在上述试验条件下，一旦有色点与至少约1∶5，优选地至少约1∶500的稀释液相关，则显示为阳性反应。
可根据下述方法评估本发明的多肽或衍生物的治疗或预防效能。本发明的第七方面提供(i)一种组合物，其包括本发明的多肽，连同稀释剂或载体；具体地(ii)含有治疗或预防有效量的本发明多肽的药物组合物；(iii)在哺乳动物中诱导抗衣原体的免疫反应的方法，即通过向哺乳动物施用免疫原性有效量的本发明的多肽以引起对衣原体的保护性免疫反应；特别是，(iv)预防和/或治疗衣原体(例如，沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体或牲畜衣原体)的方法，即通过向感染的个体施用预防或治疗量的本发明的多肽。另外，本发明的第七方面包括本发明的多肽在制备用于预防和/或治疗衣原体感染的药物中的用途。
如在本文所使用的，通过疫苗领域中已知的常规途径施用本发明的免疫原性组合物，特别是通过粘膜(例如，眼、鼻内、肺、口、胃、肠、直肠、阴道或泌尿道)表面或通过非肠道(例如，皮下、真皮内、肌内、静脉内或腹膜内)途径。给药途径的选择取决于许多参数，如与多肽结合的佐剂。如果使用粘膜佐剂，那么优选鼻内或口服途径。如果使用脂质制剂或铝化合物，那么优选非肠道途径，最优选皮下或肌内途径。该选择也取决于疫苗试剂的性质。例如，最好向粘膜表面施用与CTB或LTB融合的本发明的多肽。
如本文所使用的，本发明的组合物包含一种或几种本发明的多肽或衍生物。组合物可任选地含有至少一种另外的衣原体抗原，或者其亚基、片段、同系物、突变体或衍生物。
对于在本发明组合物中的用途，将多肽或其衍生物配制成或具有脂质体，优选地中性或阴离子脂质体、微球体、ISCOMS、病毒样颗粒(VLPs)或细菌菌蜕(EP 1158 966B1)以便于传递和/或提高免疫反应。这些化合物对于本领域技术人员来说很容易获得。
以单剂量或者如果需要，每隔一段时间重复完成治疗，这可由本领域技术人员很容易地确定。例如，给予引发剂量后以每周一次或每月一次的时间间隔强化三次。适当的剂量取决于各种参数，包括受体(例如，成体或幼体)、特定的疫苗抗原、给药的途径和频率、佐剂存在/缺乏或者佐剂的类型、以及期望的效果(例如，保护和/或治疗)，这可由本领域技术人员决定。一般地，通过粘膜途径以从大约10μg到大约500μg，优选地从大约1μg到大约200μg的量施用本发明的疫苗抗原。对于非肠道给药途径，剂量通常不超过大约1mg，优选地大约100μg。
当用作疫苗试剂时，可将本发明的多核苷酸和多肽按顺序地用作多步免疫过程的一部分。例如，哺乳动物最初用本发明的疫苗载体如痘病毒引发，例如，通过非肠道途径，然后用由疫苗载体所编码的多肽强化两次，例如，通过粘膜途径。在另一个实例中，也使用与本发明的多肽或衍生物结合的脂质体用于引发，使用本发明的可溶的多肽或衍生物，联合粘膜佐剂(例如，LT)，通过粘膜进行强化。
根据第七方面，本发明的多肽衍生物也用作检测，例如血液样本中是否存在抗衣原体抗体的诊断剂。这种多肽长大约5到大约80，优选地大约10到大约50个氨基酸。它们被标记或未被标记，视诊断方法而定。下面描述包括这种试剂的诊断方法。
一旦本发明的DNA分子表达，即可使用已知的实验室技术生产并纯化多肽或多肽衍生物。如上所述，可产生多肽或多肽衍生物，作为含有便于纯化的融合尾的融合蛋白。融合产物用于免疫小哺乳动物，例如，小鼠或兔子，以便产生抗多肽或多肽衍生物的抗体(单特异性抗体)。因此，本发明的第八方面提供结合本发明多肽或多肽衍生物的单特异性抗体。
“单特异性抗体”意指能与唯一的天然存在的衣原体多肽反应的抗体。本发明的抗体是多克隆或单克隆抗体。单特异性抗体可以是重组的，例如，嵌合的(例如，由与人恒定区结合的鼠源的可变区构成)、人源化的(人免疫球蛋白恒定区主链连同小鼠等动物源的高变异区)、和/或单链。多克隆和单特异性抗体也都可以是免疫球蛋白片段的形式，例如F(ab)2或Fab片段。本发明的抗体是任何同种型的抗体，例如，IgG或IgA，多克隆抗体是单同种型抗体或同种型抗体的混合物。
通过用包括所述多肽、同系物或片段的组合物免疫动物产生抗本发明的多肽、同系物或片段的抗体。这种抗体可以是多克隆或单克隆抗体。生产多克隆或单克隆抗体的方法是本领域熟知的。
本发明的抗体，其由本发明的多肽或多肽衍生物引起，并使用标准免疫学试验进行鉴定，例如，Western印迹分析、点印迹试验或ELISA。该抗体用于诊断方法中以检测样本，如生物样本中是否存在衣原体抗原。该抗体也用于亲和层析中以纯化本发明的多肽或多肽衍生物。如在下面进一步讨论的，这种抗体可用于预防性和治疗性被动免疫方法。
因此，本发明的另一个方面提供(i)用于检测生物样本中是否存在衣原体的试剂，其含有本发明的抗体、多肽或多肽衍生物；和(ii)用于检测生物样本中是否存在衣原体的诊断方法，即通过将生物样本与本发明的抗体、多肽或多肽衍生物接触，以便形成免疫复合体，以及通过检测这种复合体以表明在样本或样本来源的生物体中是否存在衣原体。
本领域的那些技术人员将很容易地理解，无论使用哪一种，在样本的成分和抗体、多肽或多肽衍生物之间都能形成免疫复合体，并在检测复合体之前除去任何未结合的材料。应当理解的是，多肽试剂可用于检测样本，例如血液样本中是否存在抗衣原体抗体，而本发明的抗体用于筛选样本，如胃提取物或活检中是否存在衣原体多肽。
对于诊断应用，试剂(即，本发明的抗体、多肽或多肽衍生物)以游离状态或被固定在固体支持物上，如试管、珠或本领域中任何其它常规所用的支持物。使用直接的或间接的方法实现固定。直接的方法包括支持物和试剂之间的被动吸附(非共价结合)或共价结合。“间接方法”意指首先将与试剂相互作用的抗试剂化合物附着到固体支持物上。例如，如果使用多肽试剂，那么与其结合的抗体可作为抗试剂，只要其结合不参与生物样本中抗体识别的表位即可。间接方法也可使用配体-受体系统，例如，将分子如维生素移植到多肽试剂上和将对应的受体固定到固相上。这通过生物素-链霉抗生物素系统举例说明。可选择地，通过化学方法或者通过基因工程方法向试剂添加肽尾，并且通过被动吸附或肽尾的共价键固定移植的或融合的产物。
试剂盒中可包括这种诊断试剂，也包括使用说明。用检测手段标记试剂，当其与靶结合时允许实施试剂的检测。检测工具可以是荧光剂，如荧光素异氰酸酯或荧光素异硫氰酸盐，或者是酶，如辣根过氧化物酶或荧光素酶或碱性磷酸酶，或者是放射性元素，如125I或51Cr。
因此，本发明的另一个方面提供从生物样本中纯化本发明的多肽或多肽衍生物的方法，其涉及对生物样本进行基于抗体的亲和层析，其中抗体是本发明的单特异性抗体。
对于在本发明纯化方法中的用途，抗体是多克隆或单克隆抗体，优选地是IgG型抗体。使用标准方法从抗血清中制备纯化的IgG。常规层析支持物以及移植抗体的标准方法描述于，例如，AntibodiesALaboratory Manual，D.Lane，E.Harlow，编(1988)和下面所概述的方法。
简要地，将生物样本，如优选地溶于缓冲液中的沙眼衣源体提取物，应用到层析材料上，优选地用稀释生物样本所用的缓冲液平衡以便使本发明的多肽或多肽衍生物(即，抗原)吸附到材料上。层析材料，如结合本发明抗体的凝胶或树脂，是以束或柱的形状。洗去未结合的成分，然后将抗原用适当的洗脱缓冲液洗脱，如甘氨酸缓冲液或含有离液剂的缓冲液，例如，盐酸胍或高浓度盐(例如，3M MgCl2)。回收洗脱的馏分并检测是否存在抗原，例如，通过在280nm测定吸光度进行检测。
本发明的另一个方面提供(i)组合物，其包括本发明的单特异性抗体，连同稀释剂或载体；(ii)包括治疗或预防有效量的本发明的单特异性抗体的药物组合物，以及(iii)治疗或预防衣原体(例如，沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体或牲畜衣原体)感染的方法，即通过向感染的个体施用治疗或预防量的本发明的单特异性抗体。另外，本发明的第十一方面包括本发明的单特异性抗体在制备用于治疗或预防衣原体感染的药物中的用途。
单特异性抗体是多克隆抗体或单克隆抗体，优选地是IgA同种型抗体(主要地)。在被动免疫中，向哺乳动物的粘膜表面施用抗体，例如，胃粘膜，例如通过口服或通过胃内，有利地，在存在碳酸氢盐缓冲液时。可选择地，进行全身给药时，不需要碳酸氢盐缓冲液。本发明的单特异性抗体作为单一活性成分或者作为与至少一种对不同的衣原体多肽特异的单特异性抗体的混合物施用。本领域技术人员很容易地确定所用抗体的量和具体的给药方案。例如，一周内每日施用大约100到1,000μg抗体。
使用本领域中的标准方法评估治疗或预防效能，例如，通过测量诱导的粘膜免疫反应或诱导的保护性和/或治疗免疫，使用，例如本文所公开的衣原体小鼠模型。本领域的那些技术人员将很容易地认识到，模型中所用的衣原体菌株可用另一种衣原体菌株或血清变型替代。例如，优选地在小鼠模型中使用沙眼衣原体菌株评估沙眼衣原体的DNA分子和多肽的效能。通过将衣原体感染的程度与对照组的程度进行比较，确定保护作用。当与对照组相比感染降低时，证明有保护作用。可使用统计学分析证明与对照组的差异。对本发明的多核苷酸、疫苗载体、多肽及其衍生物以及抗体进行这种评估。
在上述任何一种疫苗组合物中有用的佐剂如下。
用于非肠道施用的佐剂包括铝化合物，如氢氧化铝、磷酸铝以及磷酸氢氧化铝。根据标准方案将抗原用铝化合物沉淀或吸附到铝化合物上。在非肠道施用中使用其它佐剂，如RIBI(ImmunoChem，Hamilton，MT)。
用于粘膜施用的佐剂包括细菌毒素，例如，霍乱毒素(CT)、大肠杆菌热不稳定毒素(LT)、难辨梭菌(Clostridium difficile)毒素A和百日咳(pertussis)毒素(PT)、或者它们的组合，亚基，类毒素或突变体，如天然霍乱毒素亚单位B(CTB)的纯化制剂。片段、同系物、衍生物和与这些毒素中的任何一种的融合也是合适的，只要它们保留佐剂活性即可。优选地，使用毒性降低的突变体。在粘膜施用中也使用其它佐剂，如细菌单磷酰脂质A(MPLA)，例如，大肠杆菌、明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、或者弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)的MPLA；皂苷或聚交酯乙交酯(PLGA)微球体。
既可用于粘膜施用也可用于非肠道施用的佐剂包括聚磷腈(WO95/02415)、DC-chol(3b-(N-(N-N′-二甲基氨基甲烷)-氨基甲酰基)胆固醇)；美国专利No.5,283,185和WO96/14831)和QS-21(WO 88/09336)。
以常规方式生产含有本发明多核苷酸、多肽、多肽衍生物或抗体的本发明的任何药物组合物。特别是，将其与药学上可接受的稀释剂或载体一起配制，例如，水或盐溶液如磷酸缓冲盐。一般地说，根据施用的方式和途径以及标准的药学实践，选择稀释剂或载体。
这里所显示的和下面所详细描述的数据证明，用编码Mgp002基因的衣原体核酸分子的核酸免疫引起免疫反应，并且产生对沙眼衣原体MoPn的肺攻击感染的显著的保护性免疫。
对于本领域的技术人员来说很显而易见，本发明的各种实施方案在衣原体感染的接种、诊断和治疗领域中具有许多应用。下面进一步介绍这些用途的非限制性讨论。
实施例上述公开的内容概括地描述了本发明。通过参考下列具体实施例可获得更全面的理解。描述这些实施例仅用于说明的目的，并不是为了限制本发明的范围。认为形式的改变和等同替换如同可建议或提供便于操作的方式的情况也应该包含在本发明的范围之内。尽管这里一直使用具体术语，但是这些术语旨在描述性的意思而不用于限制的目的。
实施例1本实施例举例说明用于免疫的质粒载体的制备。
在含有10％胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的Eagle MEM中的Hela229细胞中培养沙眼衣原体小鼠肺炎(MoPn)分离物。收获MoPn EBs并通过在4℃以43,000g，梯度密度离心60分钟的步骤进行纯化。将纯化的EBs用PBS冲洗两次，以30,000g离心30分钟，在蔗糖-磷酸盐-谷氨酸(SPG)缓冲液中重悬并冷冻在-70℃备用。
将编码Mgp002基因的核酸分子框内克隆到真核表达质粒pCAMycHis中，Myc-His标签存在于载体中。该载体是由pcDNA3.1(-)Myc-His C(Invitrogen，San Diego)和质粒VR1012(Vical)构建的。在2000年9月21日公开的PCT公开WO 00/55326中公开了构建的细节。简要地，质粒pcDNA3.1(-)Myc-His C(Invitrogen)用Spe I和Bam HI消化以除去CMV启动子并分离剩余的载体片段。由Spe I/Bam HI片段分离来自质粒VR-1012(Vical)的CMV启动子和内含子A。将片段连接起来产生质粒pCA/Myc-His。
通过聚合酶链反应(PCR)，使用包括NotI位点(有下划线的)、起始密码子(粗体)和MoPn的成熟Mgp002基因产物的N末端序列的5′引物(5′ATAAGAATGCGGCCGCCACC ATG GGA TTA TCTCGC CTA ATT 3′-SEQ ID No9)以及包括Kpn I位点(有下划线的)的3′反向引物(5′GTTGGTACCGAGCTCGCTCCACTATTCTCATTAATAATCC 3′-SEQ 1D No10)从MoPn基因组DNA中扩增全长mgp002基因。反向引物与Mgp002基因的3′端互补，但是不含有终止密码子。而是插入另外的核苷酸，导致与pCAMycHis的Myc-和His-tags的符合读框的基因融合。琼脂糖凝胶电泳后分离PCR产物，用Kpn I和Not I限制性消化并连接到载体pCAMycHis的Kpn I和NotI位点。在氨苄青霉素选择下，将连接混合物转化到大肠杆菌DHlOb中。为了证明正确的扩增和克隆，对整个插入片段的DNA进行测序。将所得的质粒命名为pCACTMgp002。PCR产物具有图1中所示的核酸序列(SEQ ID No1)以及代表全长Mgp002基因的推定的氨基酸序列(SEQ ID No2)。
如上所述，用正向引物5′ATAAGAATGCGGCCGCCACCATGTGCGACTTCCCCCCCAGT 3′-SEQ ID No11和mgp002反向引物5′GTTGGTACCGAGCTCGCTCCACTATTCTCATTAATAATCC3′SEQ ID No12，也通过聚合酶链反应(PCR)从MoPn基因组DNA中扩增缺失信号序列的mgp002基因。将克隆到pCAMycHis中的所得质粒鉴定为pCACTMgp002delta。缺失的推定的信号序列在图1中用下划线显示，缺失信号序列的Mgp002基因具有在图1中指出的在箭头处开始的核酸序列(SEQ ID No5)和推定的氨基酸序列(SEQ ID No6)。
类似地，在图2中显示沙眼衣原体血清变型D的Mgp002基因的核酸序列(SEQ ID No3)和推定的全长Mgp002基因的蛋白质序列(SEQ ID No4)，或者在图2箭头处显示缺失信号序列的基因的核酸序列(SEQ ID No7)和推定的蛋白质序列(SEQ ID No8)。本领域技术人员能意识到，可使用上面所概述的类似技术获得任何其它血清变型的任何其它序列。
实施例2本实施例显示使用核酸载体的免疫研究的结果。
为了研究由核酸免疫所引起的免疫反应是否在功能上有效，根据以前所描述的方法(参考文献20)评估体内保护效能。简要地说，雌性Balb/c小鼠(4到5周龄)购自Charles River Canada(St.Constant，Canada)。用根据实施例1中所描述的方法制备的质粒DNA通过肌内和鼻内对小鼠进行免疫，见图3在0、2和4周的三个时间进行免疫。对于每次免疫，使用27号针将200μl的总计200μg DNA注射到两个四头肌内(每个注射部位100μg DNA)。在同一时间，用微量加液器将50μl的50μg DNA输送到小鼠的鼻孔。液滴随后被小鼠吸入。
如上所述，最后一次免疫后14天，通过鼻内用2×103IFU的沙眼衣原体MoPn EB攻击小鼠。简要地，乙醚麻醉后用微量加液器将25μl含有2×103IFU MoPn接种物的SPG递送到小鼠的鼻孔上。液滴随后被小鼠吸入。攻击感染后每日测量体重，持续10天，作为衣原体诱导的发病率的测量值，见图4。使用注射盐水 或空载体(pCAMycHis)的小鼠作为阴性对照。感染后第3天，用Mgp002基因产物或截短型免疫的小鼠，丧失的体重显著低于阴性对照组(图4)。
在感染后第10天，处死小鼠并通过无菌方法分离它们的肺，在SPG缓冲液中用研磨机匀浆。将组织悬液在4℃以500g离心10分钟，除去粗糙的组织和碎屑。将上清液冷冻到-70℃直到组织培养物用于检验生物体的定量生长。
对于DNA接种效率的更直接的测量，亚致死性肺感染后评估限制衣原体在体内生长的能力。在该感染模型系统中，攻击后第10天是高峰生长时间并选作用于比较各组小鼠间的肺滴度。如在图5中所示，用Mgp002全长基因产物DNA免疫的小鼠，其肺滴度(每200x视野的IFU)显著低于(p＜0.001)阴性对照组(单独用pCAMycHis和 盐水组)。令人惊奇地，用Mgp002基因的截短型免疫的小鼠(图5，图B)显示甚至比全长基因更低的IFUs。
这些数据证明用Mgp002以及甚至该基因的截短型的核酸免疫能引起对沙眼衣原体MoPn的肺攻击感染的保护性免疫反应。这些数据也证明Mgp002基因中的保护性序列位于该基因的截短型中。
实施例3本实施例举例说明用于重组mgp002在大肠杆菌中表达的核酸载体的制备。
PCR扩增所需的步骤、通过核酸内切酶和核酸外切酶修饰DNA产生用于DNA克隆的期望末端、连接以及细菌转化都是本领域熟知的。所使用的标准的分子克隆技术是本领域中熟知的并由Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版；Cold Spring Harbor LaboratoryCold Spring Harbo，New York以及由Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing and Wiley-Interscience；1987描述。
细菌在McCoy细胞中传代后，从沙眼衣原体小鼠肺炎株(MoPn，也称作鼠衣原体(Chlamydia muridarum))中制备衣原体基因组DNA。
为了表达，从沙眼衣原体MoPn感染的McCoy细胞中收获的总DNA中，扩增具有其天然信号肽(由前18个密码子编码)的mgp002编码序列，其中使用正向引物MoPn mgp002-F/+SP(5′-GAATTCGGATCCGATGGGATTATCTCGCCTA-3′)SEQ ID No13，以及反向引物MoPn mgp002-R(5′-ATTAAGAATGCGGCCGCTTTATCACTCCACTATTCT-3′)SEQ ID No14以及Advantage-HF2聚合酶混合物(Clontech)。正向引物引入编码BamHI限制性位点(斜体字)的序列。反向引物引入NotI限制性位点(斜体字)和双终止密码子(互补链上有下划线的)。将所得的PCR产物按顺序地用BamHI和NotI限制性消化，并插入到pET30b(+)质粒中，其也已经用BamHI和NotI切割。将新的质粒称作pET30b(+)mgp002+SP。在该构建体中，表达具有N-末端His-Tag的mgp002+SP，其源自pET30b(+)载体内编码序列的上游。图6显示上述克隆步骤的示意图。可利用类似的步骤制备沙眼衣原体血清变型D或任何其它血清变型株的MgpO02。除了添加的便于纯化的N末端的组氨酸标签外，氨基酸序列具有与图1中所示的相同序列(SEQ ID No2)。
为了重组mgp002蛋白的表达，使用含有表达载体pET30b(+)mgpO02+SP#l的大肠杆菌BL21(DE3)的过夜培养物(85ml)接种各含有500ml Luria-Bertani肉汤培养基的烧瓶，在37℃培养到A595达到0.8。通过添加IPTG到终浓度1mM，诱导mgp002表达为组氨酸标记的蛋白，将培养物再培养4小时。然后将过夜表达的重组蛋白在考马斯蓝染色的SDS-PAGE上进行分析，并使用标准条件通过用抗组氨酸标签的单克隆抗体的免疫染色以证明表达。
实施例4本实施例举例说明使用固定的金属亲和层析(IMAC)从大肠杆菌中纯化组氨酸标记的重组Mgp002蛋白。
将实施例3的表达重组Mgp002的细菌细胞培养物离心以沉淀细胞并与含有0.5％v/v Triton X-100的磷酸缓冲盐(PBS；10mM磷酸缓冲液，pH 7.5，150mM NaCl)，以大约1g湿重/mL的比例(一般地20-30g/30mL)混合。将含有混合物的试管在冰上冷却并用Branson超声波仪以20-30％的输出功率超声3次，每次间隔1分钟，中间冷却1-2分钟。将得到的溶液转移到40mL Beckman离心管中并在BeckmanAvanti J30i离心机上在4℃，以10,000rpm离心15分钟。将上清液轻轻倒出，将经离心的沉淀在等体积的含有6M盐酸胍的同一缓冲液中重悬。将混合物如上所述进行超声并离心，保留含有溶解的mgp002蛋白的上清液作为原料材料。
用于IMAC纯化的柱是Amersham XK 50/20型，半径2.5cm。将其用Amersham Pharmacia鳌合剂琼脂糖凝胶速流(Fast Flow)填充到10cm高，柱体积(CV)为200ml。如果以前使用过，根据生产商的使用说明使柱再生并消毒；通过7CV的去离子水后，用1CV的0.1MNiCl2使柱带电荷并用4CV PBS，pH 6.8平衡。
将柱以25mL/分的流速用4CV含有胍的上述缓冲液平衡。将500ml的样本原料以25mL/分速度上样，随后3CV含有50mM咪唑的PBS洗涤。mgp002蛋白的洗脱受流经柱的3CV含有300mM咪唑的PBS影响。保留洗脱馏分用于渗滤。
最后，使用截留10kDa标称分子量的滤器，将洗脱液用Pall Minum切向流过滤装置浓缩大约6倍。为了确保产品的可溶性，用大约10体积的含有10mM Tris-HCl，pH 8.5、150mM NaCl、0.8M L-精氨酸以及10mM二硫苏糖醇的缓冲液将浓缩物在同一装置中渗滤。这产生了适于配制到含或不含佐剂的免疫原性组合物或疫苗中的纯化的重组Mgp002蛋白。
实施例5本实施例举例说明在免疫的CH3小鼠中对沙眼衣原体血清变型D生殖器攻击的保护。
将实施例4的纯化的重组Mgp002蛋白(20ug/剂量)与2.5ug/免疫剂量的ISCOM佐剂ISCOMATRIX(IMX)一起配制。用血清变型D沙眼衣原体的阴道内攻击后，通过测定生殖器冲洗液中的细菌负载来测量保护。
简要地，用每种溶于IMX的试验抗原免疫CH3雌性小鼠两次。然后使用孕酮(狄波-普维拉)将动物诱导到动情期样状态，接着用沙眼衣原体血清变型D通过阴道内进行攻击。在感染后的时间点进行冲洗和擦洗并评估培养物中的内含物形成单位(IFU)。任何时间点的阳性培养物表明认为正在研究的动物受到了感染。评估5个时间点以确定发生感染的水平。免疫方案显示于下列表1中。
表1免疫方案
在第3、5、7、11和14天用2×50μl SPG缓冲液冲洗阴道腔，随后用试子擦拭。将冲洗液和试子加到含有400μl SPG的试管中并置于冰上，将其冷冻用于后来的检验或者立即检验。在第34天，采集所有组小鼠的血，并将血清样本送到Ausra Raudonikiene/KiristinBoehlke(Bld 17，rm 124)，在那里将样本旋转，除去血清并冷冻，直到检验。
图7显示Mgp002蛋白免疫在第3天能显著降低生殖道内的细菌负荷，在第5天更少。这些结果证明mgp002的重组型能在攻击后通过降低细菌负荷提供保护。原生小体(EB)是阳性对照并且也能降低生殖道内的细菌负荷。当与仅给予佐剂和安慰剂的对照组比较时，这些结果具有统计学意义(Wilcoxonp＜0.05)。
实施例6本实施例举例说明在Mgp002免疫的Balb/c小鼠中对沙眼衣原体MoPn肺攻击的保护。
根据上述实施例2中所描述的方法进行肺攻击。同实施例4中所描述的一样，使用Mgp002蛋白免疫小鼠。简要地，通过肌内(i.m)三次免疫小鼠(见图3)，使用与200μg/免疫剂量的DC-Chol佐剂一起配制的实施例4的纯化的重组Mgp002蛋白(25ug/剂量)。根据实施例2中所描述的方法，最后一次免疫后14天用2×103IFU的沙眼衣原体MoPn EB通过鼻内攻击小鼠。
在感染后第10天，处死小鼠并用无菌方法分离它们的肺，用研磨机在SPG缓冲液中匀浆。将组织悬液在4℃以500g离心10分钟，除去粗糙的组织和碎屑。将上清液在-70℃冷冻，直到组织培养物用于检验生物体的定量生长。图8证明当与非免疫的小鼠相比时，用与另一种佐剂，DC-Chol一起配制的Mgp002重组蛋白免疫的小鼠也显示显著降低肺内的衣原体负荷。这些结果在p＜0.05时具有统计学意义。
公开概述在本公开内容的概述中，本发明提供一种用核酸，其包括DNA，免疫宿主，包括人类，抗衣原体菌株，特别是沙眼衣原体感染所致疾病的方法，包括使用含有编码衣原体菌株Mgp002基因产物的全长或截短型的核苷酸序列以及影响Mgp002基因和截短型在宿主中表达的启动子的核酸载体，具体地是质粒载体。Mgp002基因的全长和截短型两者都能在宿主中引起抗活衣原体攻击的保护性免疫反应。截短型引起甚至高于全长型的保护性反应。在本发明的范围内可进行修饰。
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<221>CDS<222>(1)..(1698)<400>1atg gga tta tct cgc cta att tta ttt ggc tta ctt tct tta ccg ctc 48Met Gly Leu Ser Arg Leu Ile Leu Phe Gly Leu Leu Ser Leu Pro Leu1 5 10 15tca gca agc tgc gac ttc ccc ccc agt gtt tcc cag aag ata tta ttc 96Ser Ala Ser Cys Asp Phe Pro Pro Ser Val Ser Gln Lys Ile Leu Phe20 25 30ttg tgt caa aaa tct att cct caa gct ctg gag tcc tat ctt gag gca144Leu Cys Gln Lys Ser Ile Pro Gln Ala Leu Glu Ser Tyr Leu Glu Ala35 40 45tct aca acc tat caa caa cat aac ttt tct ata ttg cgc tta ata gct192Ser Thr Thr Tyr Gln Gln His Asn Phe Ser Ile Leu Arg Leu Ile Ala
50 55 60aag tca tac tta caa caa agt ctc ttt tct gaa gat gct tac gta cgc240Lys Ser Tyr Leu Gln Gln Ser Leu Phe Ser Glu Asp Ala Tyr Val Arg65 70 75 80aaa agc gca att att gga gcg ggg ctt tct ggc tca tct gag act cta288Lys Ser Ala Ile Ile Gly Ala Gly Leu Ser Gly Ser Ser Glu Thr Leu85 90 95gat cta ctg tct gaa tcc ata gaa aca cag gat ctt tat gag cag cta336Asp Leu Leu Ser Glu Ser Ile Glu Thr Gln Asp Leu Tyr Glu Gln Leu100 105 110ctt att tta aat gct gca ggc aat caa tta ggc aaa act tcc gat cgt384Leu Ile Leu Asn Ala Ala Gly Asn Gln Leu Gly Lys Thr Ser Asp Arg115 120 125ctt tta ttc aaa gga tta aca gca cct cat cct att att cgc ttg gaa432Leu Leu Phe Lys Gly Leu Thr Ala Pro His Pro Ile Ile Arg Leu Glu130 135 140gct gct tac cgt ctg gcc tgt atg aaa aac agt aaa gta agt gac tac480Ala Ala Tyr Arg Leu Ala Cys Met Lys Asn Ser Lys Val Ser Asp Tyr145 150 155 160ctc tat tct ttt atc cac cag ctt cca gaa gaa atc caa aac tta gca528Leu Tyr Ser Phe Ile His Gln Leu Pro Glu Glu Ile Gln Asn Leu Ala165 170 175gca acg att ttt ttg cag ctc gaa acg gaa gaa gca gat gct tat gtt576Ala Thr Ile Phe Leu Gln Leu Glu Thr Glu Glu Ala Asp Ala Tyr Val180 185 190cat aga ctc ctg tct tct cct aat agt cta aca aga aac tat atg gct624His Arg Leu Leu Ser Ser Pro Asn Ser Leu Thr Arg Asn Tyr Met Ala195 200 205tat cta att gga gaa tat caa cag agg aga ttt ctt cca acg ctc cgc672Tyr Leu Ile Gly Glu Tyr Gln Gln Arg Arg Phe Leu Pro Thr Leu Arg210 215 220tcg ttg ctt acc agc gca gct cct tta gac caa gaa gga tct ttg tat720Ser Leu Leu Thr Ser Ala Ala Pro Leu Asp Gln Glu Gly Ser Leu Tyr
225 230 235 240gct ata gga aaa tta gaa gat gcc agc agc tat cct aaa atc aaa gca 768Ala Ile Gly Lys Leu Glu Asp Ala Ser Ser Tyr Pro Lys Ile Lys Ala245 250 255tta agc tcc aaa tct aac cct gaa gtg gct ctt gct gct gct cag aca 816Leu Ser Ser Lys Ser Asn Pro Glu Val Ala Leu Ala Ala Ala Gln Thr260 265 270tta tta ttc ttg ggt aaa gaa gat gag gct ctt cct atc cta act act 864Leu Leu Phe Leu Gly Lys Glu Asp Glu Ala Leu Pro Ile Leu Thr Thr275 280 285ttt tgc cag caa gag ctt cct cga gct att tat acc tct cgt ttc ctt 912Phe Cys Gln Gln Glu Leu Pro Arg Ala Ile Tyr Thr Ser Arg Phe Leu290 295 300tca tta gaa aaa gga gaa gag ctt ctt tta ccc atc ttt tgt aaa gct 960Ser Leu Glu Lys Gly Glu Glu Leu Leu Leu Pro Ile Phe Cys Lys Ala305 310 315 320att aaa gaa gaa att aaa ctg aat gct gct ttg gct ctt gtc cac ttg1008Ile Lys Glu Glu Ile Lys Leu Asn Ala Ala Leu Ala Leu Val His Leu325 330 335gga agc gtt aat cac cta gtg ctt agt tat tta aca gaa ttt tta gaa1056Gly Ser Val Asn His Leu Val Leu Ser Tyr Leu Thr Glu Phe Leu Glu340 345 350aat aaa att ctc cac cgc ata ttt tta ccc acc cat tcg ata gga aaa1104Asn Lys Ile Leu His Arg Ile Phe Leu Pro Thr His Ser Ile Gly Lys355 360 365gcc acg cag ttt tgg aaa gag tgt acg gca ctc cct ctt cta agc cca1152Ala Thr Gln Phe Trp Lys Glu Cys Thr Ala Leu Pro Leu Leu Ser Pro370 375 380gaa gaa aaa gca aga gct ttg gca atg tat cgc gca gca gaa gat acg1200Glu Glu Lys Ala Arg Ala Leu Ala Met Tyr Arg Ala Ala Glu Asp Thr385 390 395 400atc ctc tct agt tta tta aaa tta cct aac aat gcc tat ctg cct tat1248Ile Leu Ser Ser Leu Leu Lys Leu Pro Asn Asn Ala Tyr Leu Pro Tyr
405 410 415ttg gaa cgt att cta act tca caa aaa acc cct cta gca gct aaa gct1296Leu Glu Arg Ile Leu Thr Ser Gln Lys Thr Pro Leu Ala Ala Lys Ala420 425 430att gct ttt tta tca gta aca gct cat cct cag gca ctt tct tta gtc1344Ile Ala Phe Leu Ser Val Thr Ala His Pro Gln Ala Leu Ser Leu Val435 440 445tcg aaa gca gca cta act cca gga gac cct atc att cgc gct tat gcg1392Ser Lys Ala Ala Leu Thr Pro Gly Asp Pro Ile Ile Arg Ala Tyr Ala450 455 460aat tta gct tta tat aca atg acg caa gat cct gaa aag aaa gcc tta1440Asn Leu Ala Leu Tyr Thr Met Thr Gln Asp Pro Glu Lys Lys Ala Leu465 470 475 480tta tat caa tat gcc gaa cag tta ata gga gac acg att ttg ttt aca1488Leu Tyr Gln Tyr Ala Glu Gln Leu Ile Gly Asp Thr Ile Leu Phe Thr485 490 495gat gag gag aat ccc ctg cct tct ccc cat tct tcc tac ctg cga tat1536Asp Glu Glu Asn Pro Leu Pro Ser Pro His Ser Ser Tyr Leu Arg Tyr500 505 510caa gtg tcc cca gaa act cgt tct caa ctc atg cta act att tta gaa1584Gln Val Ser Pro Glu Thr Arg Ser Gln Leu Met Leu Thr Ile Leu Glu515 520 525acc cta gtt tct tct aaa act gat gaa gac atc cga gtt ttt ctt tcg1632Thr Leu Val Ser Ser Lys Thr Asp Glu Asp Ile Arg Val Phe Leu Ser530 535 540cta atg aaa aaa acc cat tac aaa aat atc ccc atc tta tct gga tta1680Leu Met Lys Lys Thr His Tyr Lys Asn Ile Pro Ile Leu Ser Gly Leu545 550 555 560tta atg aga ata gtg gag1698Leu Met Arg Ile Val Glu565<210>2
<211>566<212>PRT<213>鼠衣原体<400>2Met Gly Leu Ser Arg Leu Ile Leu Phe Gly Leu Leu Ser Leu Pro Leu1 5 10 15Ser Ala Ser Cys Asp Phe Pro Pro Ser Val Ser Gln Lys Ile Leu Phe20 25 30Leu Cys Gln Lys Ser Ile Pro Gln Ala Leu Glu Ser Tyr Leu Glu Ala35 40 45Ser Thr Thr Tyr Gln Gln His Asn Phe Ser Ile Leu Arg Leu Ile Ala50 55 60Lys Ser Tyr Leu Gln Gln Ser Leu Phe Ser Glu Asp Ala Tyr Val Arg65 70 75 80Lys Ser Ala Ile Ile Gly Ala Gly Leu Ser Gly Ser Ser Glu Thr Leu85 90 95Asp Leu Leu Ser Glu Ser Ile Glu Thr Gln Asp Leu Tyr Glu Gln Leu100 105 110Leu Ile Leu Asn Ala Ala Gly Asn Gln Leu Gly Lys Thr Ser Asp Arg115 120 125Leu Leu Phe Lys Gly Leu Thr Ala Pro His Pro Ile Ile Arg Leu Glu130 135 140Ala Ala Tyr Arg Leu Ala Cys Met Lys Asn Ser Lys Val Ser Asp Tyr145 150 155 160
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Gly Ser Val Asn His Leu Val Leu Ser Tyr Leu Thr Glu Phe Leu Glu340 345 350Asn Lys Ile Leu His Arg Ile Phe Leu Pro Thr His Ser Ile Gly Lys355 360 365Ala Thr Gln Phe Trp Lys Glu Cys Thr Ala Leu Pro Leu Leu Ser Pro370 375 380Glu Glu Lys Ala Arg Ala Leu Ala Met Tyr Arg Ala Ala Glu Asp Thr385 390 395 400Ile Leu Ser Ser Leu Leu Lys Leu Pro Asn Asn Ala Tyr Leu Pro Tyr405 410 415Leu Glu Arg Ile Leu Thr Ser Gln Lys Thr Pro Leu Ala Ala Lys Ala420 425 430Ile Ala Phe Leu Ser Val Thr Ala His Pro Gln Ala Leu Ser Leu Val435 440 445Ser Lys Ala Ala Leu Thr Pro Gly Asp Pro Ile Ile Arg Ala Tyr Ala450 455 460Asn Leu Ala Leu Tyr Thr Met Thr Gln Asp Pro Glu Lys Lys Ala Leu465 470 475 480Leu Tyr Gln Tyr Ala Glu Gln Leu Ile Gly Asp Thr Ile Leu Phe Thr485 490 495Asp Glu Glu Asn Pro Leu Pro Ser Pro His Ser Ser Tyr Leu Arg Tyr500 505 510
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gaa tcg tat tta caa caa agc ttt ctc tct gag gac acc tac ata cgt240Glu Ser Tyr Leu Gln Gln Ser Phe Leu Ser Glu Asp Thr Tyr Ile Arg65 70 75 80aaa agt gca att att gga gca ggg cta tct ggt tca tca gaa gct tta288Lys Ser Ala Ile Ile Gly Ala Gly Leu Ser Gly Ser Ser Glu Ala Leu85 90 95gag tta ctg tct gag gct ata gaa acg caa gat ctc tat gag caa cta336Glu Leu Leu Ser Glu Ala Ile Glu Thr Gln Asp Leu Tyr Glu Gln Leu100 105 110ctc att tta aat gct gca acc agc caa tta agc aaa act tct gac aaa384Leu Ile Leu Asn Ala Ala Thr Ser Gln Leu Ser Lys Thr Ser Asp Lys115 120 125ctt tta ttc aag gga tta aca gct tct cat cct gtc atc cgc tta gaa432Leu Leu Phe Lys Gly Leu Thr Ala Ser His Pro Val Ile Arg Leu Glu130 135 140gct gct tat cgt ctt gcc tgt atg aaa aat agc aag gta agt gat tac480Ala Ala Tyr Arg Leu Ala Cys Met Lys Asn Ser Lys Val Ser Asp Tyr145 150 155 160ctt tat tct ttt atc tac aag tta cca gaa gaa att caa aac cta gcg528Leu Tyr Ser Phe Ile Tyr Lys Leu Pro Glu Glu Ile Gln Asn Leu Ala165 170 175gca act att ttc tta caa ctc gaa aca gaa gaa gct gat gct tat att576Ala Thr Ile Phe Leu Gln Leu Glu Thr Glu Glu Ala Asp Ala Tyr Ile180 185 190cat cat ttg ctc tct tct ccc aat aac ctg aca aga aae tat gtt gcc624His His Leu Leu Ser Ser Pro Asn Asn Leu Thr Arg Asn Tyr Val Ala195 200 205tat tta att gga gag tac aaa caa aaa aga ttt ctt cca aca cta cgc672Tyr Leu Ile Gly Glu Tyr Lys Gln Lys Arg Phe Leu Pro Thr Leu Arg210 215 220tct tta ctt aca agt gcc tct cct tta gat caa gaa ggc gct ttg tat720Ser Leu Leu Thr Ser Ala Ser Pro Leu Asp Gln Glu Gly Ala Leu Tyr225 230 235 240
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gca att att gga gcg ggg ctt tct ggc tca tct gag act cta gat cta240Ala Ile Ile Gly Ala Gly Leu Ser Gly Ser Ser Glu Thr Leu Asp Leu65 70 75 80ctg tct gaa tcc ata gaa aca cag gat ctt tat gag cag cta ctt att288Leu Ser Glu Ser Ile Glu Thr Gln Asp Leu Tyr Glu Gln Leu Leu Ile85 90 95tta aat gct gca ggc aat caa tta ggc aaa act tcc gat cgt ctt tta336Leu Asn Ala Ala Gly Asn Gln Leu Gly Lys Thr Ser Asp Arg Leu Leu100 105 110ttc aaa gga tta aca gca cct cat cct att att cgc ttg gaa gct gct384Phe Lys Gly Leu Thr Ala Pro His Pro Ile Ile Arg Leu Glu Ala Ala115 120 125tac cgt ctg gcc tgt atg aaa aac agt aaa gta agt gac tac ctc tat432Tyr Arg Leu Ala Cys Met Lys Asn Ser Lys Val Ser Asp Tyr Leu Tyr130 135 140tct ttt atc cac cag ctt cca gaa gaa atc caa aac tta gca gca acg480Ser Phe Ile His Gln Leu Pro Glu Glu Ile Gln Asn Leu Ala Ala Thr145 150 155 160att ttt ttg cag ctc gaa acg gaa gaa gca gat gct tat gtt cat aga528Ile Phe Leu Gln Leu Glu Thr Glu Glu Ala Asp Ala Tyr Val His Arg165 170 175ctc ctg tct tct cct aat agt cta aca aga aac tat atg gct tat cta576Leu Leu Ser Ser Pro Asn Ser Leu Thr Arg Asn Tyr Met Ala Tyr Leu180 185 190att gga gaa tat caa cag agg aga ttt ctt cca acg ctc cgc tcg ttg624Ile Gly Glu Tyr Gln Gln Arg Arg Phe Leu Pro Thr Leu Arg Ser Leu195 200 205ctt acc agc gca gct cct tta gac caa gaa gga tct ttg tat gct ata672Leu Thr Ser Ala Ala Pro Leu Asp Gln Glu Gly Ser Leu Tyr Ala Ile210 215 220gga aaa tta gaa gat gcc agc agc tat cct aaa atc aaa gca tta agc720Gly Lys Leu Glu Asp Ala Ser Ser Tyr Pro Lys Ile Lys Ala Leu Ser225 230 235 240
tcc aaa tct aac cct gaa gtg gct ctt gct gct gct cag aca tta tta 768Ser Lys Ser Asn Pro Glu Val Ala Leu Ala Ala Ala Gln Thr Leu Leu245 250 255ttc ttg ggt aaa gaa gat gag gct ctt cct atc cta act act ttt tgc 816Phe Leu Gly Lys Glu Asp Glu Ala Leu Pro Ile Leu Thr Thr Phe Cys260 265 270cag caa gag ctt cct cga gct att tat acc tct cgt ttc ctt tca tta 864Gln Gln Glu Leu Pro Arg Ala Ile Tyr Thr Ser Arg Phe Leu Ser Leu275 280 285gaa aaa gga gaa gag ctt ctt tta ccc atc ttt tgt aaa gct att aaa 912Glu Lys Gly Glu Glu Leu Leu Leu Pro Ile Phe Cys Lys Ala Ile Lys290 295 300gaa gaa att aaa ctg aat gct gct ttg gct ctt gtc cac ttg gga agc 960Glu Glu Ile Lys Leu Asn Ala Ala Leu Ala Leu Val His Leu Gly Ser305 310 315 320gtt aat cac cta gtg ctt agt tat tta aca gaa ttt tta gaa aat aaa1008Val Asn His Leu Val Leu Ser Tyr Leu Thr Glu Phe Leu Glu Asn Lys325 330 335att ctc cac cgc ata ttt tta ccc acc cat tcg ata gga aaa gcc acg1056Ile Leu His Arg Ile Phe Leu Pro Thr His Ser Ile Gly Lys Ala Thr340 345 350cag ttt tgg aaa gag tgt acg gca ctc cct ctt cta agc cca gaa gaa1104Gln Phe Trp Lys Glu Cys Thr Ala Leu Pro Leu Leu Ser Pro Glu Glu355 360 365aaa gca aga gct ttg gca atg tat cgc gca gca gaa gat acg atc ctc1152Lys Ala Arg Ala Leu Ala Met Tyr Arg Ala Ala Glu Asp Thr Ile Leu370 375 380tct agt tta tta aaa tta cct aac aat gcc tat ctg cct tat ttg gaa1200Ser Ser Leu Leu Lys Leu Pro Asn Asn Ala Tyr Leu Pro Tyr Leu Glu385 390 395 400cgt att cta act tca caa aaa acc cct cta gca gct aaa gct att gct1248Arg Ile Leu Thr Ser Gln Lys Thr Pro Leu Ala Ala Lys Ala Ile Ala405 410 415
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<213>鼠衣原体<400>6Met Cys Asp Phe Pro Pro Ser Val Ser Gln Lys Ile Leu Phe Leu Cys1 5 10 15Gln Lys Ser Ile Pro Gln Ala Leu Glu Ser Tyr Leu Glu Ala Ser Thr20 25 30Thr Tyr Gln Gln His Asn Phe Ser Ile Leu Arg Leu Ile Ala Lys Ser35 40 45Tyr Leu Gln Gln Ser Leu Phe Ser Glu Asp Ala Tyr Val Arg Lys Ser50 55 60Ala Ile Ile Gly Ala Gly Leu Ser Gly Ser Ser Glu Thr Leu Asp Leu65 70 75 80Leu Ser Glu Ser Ile Glu Thr Gln Asp Leu Tyr Glu Gln Leu Leu Ile85 90 95Leu Asn Ala Ala Gly Asn Gln Leu Gly Lys Thr Ser Asp Arg Leu Leu100 105 110Phe Lys Gly Leu Thr Ala Pro His Pro Ile Ile Arg Leu Glu Ala Ala115 120 125Tyr Arg Leu Ala Cys Met Lys Asn Ser Lys Val Ser Asp Tyr Leu Tyr130 135 140Ser Phe Ile His Gln Leu Pro Glu Glu Ile Gln Asn Leu Ala Ala Thr145 150 155 160
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Ile Leu His Arg Ile Phe Leu Pro Thr His Ser Ile Gly Lys Ala Thr340 345 350Gln Phe Trp Lys Glu Cys Thr Ala Leu Pro Leu Leu Ser Pro Glu Glu355 360 365Lys Ala Arg Ala Leu Ala Met Tyr Arg Ala Ala Glu Asp Thr Ile Leu370 375 380Ser Ser Leu Leu Lys Leu Pro Asn Asn Ala Tyr Leu Pro Tyr Leu Glu385 390 395 400Arg Ile Leu Thr Ser Gln Lys Thr Pro Leu Ala Ala Lys Ala Ile Ala405 410 415Phe Leu Ser Val Thr Ala His Pro Gln Ala Leu Ser Leu Val Ser Lys420 425 430Ala Ala Leu Thr Pro Gly Asp Pro Ile Ile Arg Ala Tyr Ala Asn Leu435 440 445Ala Leu Tyr Thr Met Thr Gln Asp Pro Glu Lys Lys Ala Leu Leu Tyr450 455 460Gln Tyr Ala Glu Gln Leu Ile Gly Asp Thr Ile Leu Phe Thr Asp Glu465 470 475 480Glu Asn Pro Leu Pro Ser Pro His Ser Ser Tyr Leu Arg Tyr Gln Val485 490 495Ser Pro Glu Thr Arg Ser Gln Leu Met Leu Thr Ile Leu Glu Thr Leu500 505 510
Val Ser Ser Lys Thr Asp Glu Asp Ile Arg Val Phe Leu Ser Leu Met515 520 525Lys Lys Thr His Tyr Lys Asn Ile Pro Ile Leu Ser Gly Leu Leu Met530 535 540Arg Ile Val Glu Arg Ala Arg Tyr Gln Ala Tyr Val Glu Gln Lys Leu545 550 555 560Ile Ser Glu Glu Asp565<210>7<211>1644<212>DNA<213>沙眼衣原体<220>
<221>CDS<222>(1)..(1644)<400>7atg tgt gat ttt cct tcc tca gtt tct cag aga atc ttg ttt tct tgc 48Met Cys Asp Phe Pro Ser Ser Val Ser Gln Arg Ile Leu Phe Ser Cys1 5 10 15cga aaa tca gtc cct caa gct cta gaa gcc tat ctc gaa gct tca gca 96Arg Lys Ser Val Pro Gln Ala Leu Glu Ala Tyr Leu Glu Ala Ser Ala20 25 30act tat caa caa cac gat ttc tcc gta tta cgc gta ata gca gaa tcg144Thr Tyr Gln Gln His Asp Phe Ser Val Leu Arg Val Ile Ala Glu Ser35 40 45tat tta caa caa agc ttt ctc tct gag gac acc tac ata cgt aaa agt192Tyr Leu Gln Gln Ser Phe Leu Ser Glu Asp Thr Tyr Ile Arg Lys Ser50 55 60gca att att gga gca ggg cta tct ggt tca tca gaa gct tta gag tta240
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Ser Arg Ser Asn Pro Glu Val Val Leu Ala Ala Ala Gln Thr Leu Leu245 250 255ttc tta gag aaa gaa gaa gaa gct cta ccg atc cta acc aac ctt tgc 816Phe Leu Glu Lys Glu Glu Glu Ala Leu Pro Ile Leu Thr Asn Leu Cys260 265 270caa caa aaa ctt ctt cga gcc ctg tat acc gca cgt ttc ctc tcg caa 864Gln Gln Lys Leu Leu Arg Ala Leu Tyr Thr Ala Arg Phe Leu Ser Gln275 280 285gag aag ggt gaa gag ctt ctt ctt cca atc ttt tat aac gca aca caa 912Glu Lys Gly Glu Glu Leu Leu Leu Pro Ile Phe Tyr Asn Ala Thr Gln290 295 300gaa gaa att aga ctg aat act gct tta gca ctt gtt cat caa ggg tgt 960Glu Glu Ile Arg Leu Asn Thr Ala Leu Ala Leu Val His Gln Gly Cys305 310 315 320aca gat cct caa gtc ctc cac tat cta aca gaa atc tta gaa agt aaa1008Thr Asp Pro Gln Val Leu His Tyr Leu Thr Glu Ile Leu Glu Ser Lys325 330 335gtt ctc cat cgc ata ttt tta cct act cac tcg aca gga aaa gct ata1056Val Leu His Arg Ile Phe Leu Pro Thr His Ser Thr Gly Lys Ala Ile340 345 350cag ttc tgg aaa gaa tgc acc act ttt cct ctc atg agc caa gaa gac1104Gln Phe Trp Lys Glu Cys Thr Thr Phe Pro Leu Met Ser Gln Glu Asp355 360 365aaa atg aga acg ttg gct atg tat cgg gta gcg gaa gat acc atc ctc1152Lys Met Arg Thr Leu Ala Met Tyr Arg Val Ala Glu Asp Thr Ile Leu370 375 380tca gcg tta cta aaa tta ccc aat gac gcc tat ctt cct tac cta gag1200Ser Ala Leu Leu Lys Leu Pro Asn Asp Ala Tyr Leu Pro Tyr Leu Glu385 390 395 400cgc atc ctc gcc tca caa aaa act ata cta gca gct aaa gct att gct1248Arg Ile Leu Ala Ser Gln Lys Thr Ile Leu Ala Ala Lys Ala Ile Ala405 410 415ttt tta tcg gta aca gct cat cct cag gca ctt tct tta gtc tcg aaa1296
Phe Leu Ser Val Thr Ala His Pro Gln Ala Leu Ser Leu Val Ser Lys420 425 430gct gca tta act cct gga gac cct atc att cgc gct tac gct aat cta1344Ala Ala Leu Thr Pro Gly Asp Pro Ile Ile Arg Ala Tyr Ala Ash Leu435 440 445gct tta tat aca atg acc aaa gat cct gag aaa aaa gct gtg cta tac1392Ala Leu Tyr Thr Met Thr Lys Asp Pro Glu Lys Lys Ala Val Leu Tyr450 455 460cga tat gct gaa caa tta ata gag gat acc att tta ttc aca gat gct1440Arg Tyr Ala Glu Gln Leu Ile Glu Asp Thr Ile Leu Phe Thr Asp Ala465 470 475 480gaa aat ccg ctt ccc tct cca agc tct tct tat tta cgc tac caa gta1488Glu Asn Pro Leu Pro Ser Pro Ser Ser Ser Tyr Leu Arg Tyr Gln Val485 490 495tcc cct gag acc cgc aca caa ctt atg cta gct att ttg gaa acc tta1536Ser Pro Glu Thr Arg Thr Gln Leu Met Leu Ala Ile Leu Glu Thr Leu500 505 510gtt tct tcc aaa acg gat gaa gat atc cgc gtt ttt ctt tcc cta atg1584Val Ser Ser Lys Thr Asp Glu Asp Ile Arg Val Phe Leu Ser Leu Met515 520 525aaa aaa acc cat tac aaa aat atc ccg atc tta tca gga ttg tta atg1632Lys Lys Thr His Tyr Lys Ash Ile Pro Ile Leu Ser Gly Leu Leu Met530 535 540aga ata gtg gag1644Arg Ile Val Glu545<210>8<211>548<212>PRT<213>沙眼衣原体<400>8Met Cys Asp Phe Pro Ser Ser Val Ser Gln Arg Ile Leu Phe Ser Cys
1 5 10 15Arg Lys Ser Val Pro Gln Ala Leu Glu Ala Tyr Leu Glu Ala Ser Ala20 25 30Thr Tyr Gln Gln His Asp Phe Ser Val Leu Arg Val Ile Ala Glu Ser35 40 45Tyr Leu Gln Gln Ser Phe Leu Ser Glu Asp Thr Tyr Ile Arg Lys Ser50 55 60Ala Ile Ile Gly Ala Gly Leu Ser Gly Ser Ser Glu Ala Leu Glu Leu65 70 75 80Leu Ser Glu Ala Ile Glu Thr Gln Asp Leu Tyr Glu Gln Leu Leu Ile85 90 95Leu Asn Ala Ala Thr Ser Gln Leu Ser Lys Thr Ser Asp Lys Leu Leu100 105 110Phe Lys Gly Leu Thr Ala Ser His Pro Val Ile Arg Leu Glu Ala Ala115 120 125Tyr Arg Leu Ala Cys Met Lys Asn Ser Lys Val Ser Asp Tyr Leu Tyr130 135 140Ser Phe Ile Tyr Lys Leu Pro Glu Glu Ile Gln Asn Leu Ala Ala Thr145 150 155 160Ile Phe Leu Gln Leu Glu Thr Glu Glu Ala Asp Ala Tyr Ile His His165 170 175Leu Leu Ser Ser Pro Asn Asn Leu Thr Arg Asn Tyr Val Ala Tyr Leu
180 185 190Ile Gly Glu Tyr Lys Gln Lys Arg Phe Leu Pro Thr Leu Arg Ser Leu195 200 205Leu Thr Ser Ala Ser Pro Leu Asp Gln Glu Gly Ala Leu Tyr Ala Leu210 215 220Gly Lys Leu Glu Asp Ser Gly Ser Tyr Pro Arg Ile Lys Ala Leu Ser225 230 235 240Ser Arg Ser Asn Pro Glu Val Val Leu Ala Ala Ala Gln Thr Leu Leu245 250 255Phe Leu Glu Lys Glu Glu Glu Ala Leu Pro Ile Leu Thr Asn Leu Cys260 265 270Gln Gln Lys Leu Leu Arg Ala Leu Tyr Thr Ala Arg Phe Leu Ser Gln275 280 285Glu Lys Gly Glu Glu Leu Leu Leu Pro Ile Phe Tyr Asn Ala Thr Gln290 295 300Glu Glu Ile Arg Leu Asn Thr Ala Leu Ala Leu Val His Gln Gly Cys305 310 315 320Thr Asp Pro Gln Val Leu His Tyr Leu Thr Glu Ile Leu Glu Ser Lys325 330 335Val Leu His Arg Ile Phe Leu Pro Thr His Ser Thr Gly Lys Ala Ile340 345 350Gln Phe Trp Lys Glu Cys Thr Thr Phe Pro Leu Met Ser Gln Glu Asp
355 360 365Lys Met Arg Thr Leu Ala Met Tyr Arg Val Ala Glu Asp Thr Ile Leu370 375 380Ser Ala Leu Leu Lys Leu Pro Asn Asp Ala Tyr Leu Pro Tyr Leu Glu385 390 395 400Arg Ile Leu Ala Ser Gln Lys Thr Ile Leu Ala Ala Lys Ala Ile Ala405 410 415Phe Leu Ser Val Thr Ala His Pro Gln Ala Leu Ser Leu Val Ser Lys420 425 430Ala Ala Leu Thr Pro Gly Asp Pro Ile Ile Arg Ala Tyr Ala Asn Leu435 440 445Ala Leu Tyr Thr Met Thr Lys Asp Pro Glu Lys Lys Ala Val Leu Tyr450 455 460Arg Tyr Ala Glu Gln Leu Ile Glu Asp Thr Ile Leu Phe Thr Asp Ala465 470 475 480Glu Asn Pro Leu Pro Ser Pro Ser Ser Ser Tyr Leu Arg Tyr Gln Val485 490 495Ser Pro Glu Thr Arg Thr Gln Leu Met Leu Ala Ile Leu Glu Thr Leu500 505 510Val Ser Ser Lys Thr Asp Glu Asp Ile Arg Val Phe Leu Ser Leu Met515 520 525Lys Lys Thr His Tyr Lys Asn Ile Pro Ile Leu Ser Gly Leu Leu Met
530 535 540Arg Ile Val Glu545<210>9<211>41<212>DNA<213>沙眼衣原体<400>9ataagaatgc ggccgccacc atgtgcgact tcccccccag t 41<210>10<211>40<212>DNA<213>沙眼衣原体<400>10gttggtaccg agctcgctcc actattctca ttaataatcc 40<210>11<211>41<212>DNA<213>沙眼衣原体<400>11ataagaatgc ggccgccacc atgtgcgact tcccccccag t 41<210>12<211>40<212>DNA<213>沙眼衣原体<400>12gttggtaccg agctcgctcc actattctca ttaataatcc 40<210>13
<211>31<212>DNA<213>沙眼衣原体<400>13gaattcggat ccgatgggat tatctcgcct a31<210>14<211>36<212>DNA<213>沙眼衣原体<400>14attaagaatg cggccgcttt atcactccac tattct 361030
权利要求
1.经分离并纯化的核酸分子，其包括编码选自下列任何一种多肽的核酸序列(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；(e)包含来自(a)到(d)多肽的至少12个连续氨基酸的免疫原性片段；和(f)通过保守性氨基酸取代修饰而不丧失免疫原性的(a)、(b)、(c)或(d)的多肽，其中所述经修饰的的多肽与对应的(a)、(b)、(c)或(d)多肽在氨基酸序列上至少75％相同。
2.经分离并纯化的核酸分子，其包括选自下列任何一种的核酸序列(a)SEQ ID No1；(b)SEQ ID No3；(c)SEQ ID No5；(d)SEQ ID No7；(e)包含来自(a)到(d)任何一种核酸序列中的至少38个连续核苷酸的序列；和(f)编码通过保守氨基酸取代修饰而不丧失免疫原性，并且其与SEQ ID No1、3、5或7所编码的多肽在氨基酸序列上至少75％相同的多肽的序列。
3.经分离并纯化的核酸分子，其包括与权利要求1核酸分子中的任何一种互补的核酸序列。
4.核酸分子，其包括编码融合蛋白的核酸序列，所述的融合蛋白包括根据权利要求1的核酸分子所编码的多肽以及另外的多肽。
5.权利要求4的核酸分子，其中所述另外的多肽是异源信号肽。
6.权利要求4的核酸分子，其中所述另外的多肽具有佐剂活性。
7.根据权利要求1到6中任何一项的核酸分子，其与一个或多个表达控制序列有效地连接。
8.一种包括载体的疫苗，其中所述载体包含编码选自下列任何一种多肽的核酸分子(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；(e)包含来自(a)到(d)中任何一项多肽的至少100个连续氨基酸的免疫原性片段；和(f)通过保守性氨基酸取代修饰的(a)到(e)中任何一种的多肽；其中所述经修饰的的多肽与对应的(a)到(e)中任何一种的多肽在氨基酸序列上至少90％相同；其中核酸分子与用于使多肽在哺乳动物或细菌细胞中表达的一种或多种控制序列有效地连接；其中疫苗提供抗衣原体所致疾病的保护性免疫反应。
9.权利要求8的疫苗，其中疫苗可任选地包括编码另外多肽的额外核酸，其可提高对选自(a)到(f)中任何一种多肽的免疫反应。
10.一种药物组合物，其包括适于在疫苗中使用的药学上可接受的载体或稀释剂，以及编码选自下列任何一种多肽的核酸分子(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；(e)包含来自(a)到(d)中任何一项多肽的至少100个连续氨基酸的免疫原性片段；和(f)通过保守性氨基酸取代修饰而不丧失免疫原性的(a)到(e)中任何一种的多肽；其中所述经修饰的的多肽与对应的(a)到(e)中任何一种的多肽在氨基酸序列上至少90％相同；其中核酸分子与用于使多肽在哺乳动物细胞中表达的一种或多种控制序列有效地连接。
11.权利要求10的药物组合物，其包括适于在疫苗中使用的药学上可接受的载体或稀释剂，以及编码选自下列任何一种多肽的核酸分子(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；和(e)包含来自(a)到(d)多肽的至少100个连续氨基酸的免疫原性片段。
12.权利要求10的药物组合物，其包括适于在疫苗中使用的药学上可接受的载体或稀释剂，以及编码选自下列任何一种多肽的核酸分子(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；和(e)通过保守性氨基酸取代修饰而不丧失免疫原性的(a)到(d)中任何一种的多肽，其中所述经修饰的的多肽与对应的(a)或(d)中任何一种的多肽在氨基酸序列上至少90％相同。
13.权利要求8的包括疫苗载体的疫苗，其中疫苗载体包括编码选自下列任何一种多肽的核酸分子(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；和(d)SEQ ID No8。
14.权利要求8的包括疫苗载体的疫苗，其中疫苗载体包括编码选自下列任何一种多肽的核酸分子(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；和(e)包含来自(a)到(d)多肽的至少100个连续氨基酸的免疫原性片段。
15.权利要求8的包括疫苗载体的疫苗，其中疫苗载体包括编码选自下列任何一种多肽的核酸分子(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；和(e)通过保守性氨基酸取代修饰而不丧失免疫原性的(a)到(d)中任何一种的多肽，其中所述经修饰的的多肽与对应的(a)到(d)中任何一种的多肽在氨基酸序列上至少90％相同。
16.预防或治疗衣原体感染的方法，其包括施用有效量的核酸分子的步骤，所述核酸分子编码选自下列任何一种的多肽(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；(e)包含来自(a)到(d)多肽的至少100个连续氨基酸的免疫原性片段；和(f)通过保守性氨基酸取代修饰而不丧失免疫原性的(a)到(e)中任何一种的多肽，其中所述经修饰的的多肽与对应的(a)到(e)中任何一种的多肽在氨基酸序列上至少90％相同；其中核酸分子与用于多肽表达的一种或多种控制序列有效地连接。
17.权利要求16的用于预防或治疗衣原体感染的方法，其包括施用有效量的核酸分子的步骤，所述核酸分子编码选自下列任何一种多肽(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；和(d)SEQ ID No8。
18.权利要求17的用于预防或治疗衣原体感染的方法，其包括施用有效量的核酸分子的步骤，所述核酸分子编码选自下列任何一种多肽(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；和(e)包含来自(a)到(d)多肽的至少100个连续氨基酸的免疫原性片段。
19.权利要求17的用于预防或治疗衣原体感染的方法，其包括施用有效量的核酸分子的步骤，所述核酸分子编码选自下列任何一种多肽(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；和(e)通过保守性氨基酸取代修饰的(a)到(d)中任何一种的多肽，其中所述经修饰的的多肽与对应的(a)或(d)中任何一种的多肽在氨基酸序列上至少90％相同。
20.用权利要求7的核酸分子转化的单细胞宿主。
21.5到100个核苷酸的核酸探针，其在严紧条件下与SEQ IDNo1、3、5或7的核酸分子，或者其同系物或互补序列或反义序列杂交。
22.10到40个核苷酸的引物，其在严紧条件下与SEQ ID No1或3的核酸分子，或者其同系物或互补序列或反义序列杂交。
23.由权利要求1、2和4到7中任何一项的核酸序列所编码的多肽。
24.生产权利要求7多肽的方法，其包括培养根据权利要求21的单细胞宿主的步骤。
25.抗权利要求24中任何一种多肽的抗体。
26.一种疫苗，其包括至少一种根据权利要求1、4到7中任何一项的第一多肽，以及药学上可接受的载体，任选地包括提高对第一多肽的免疫反应的第二多肽。
27.权利要求27的疫苗，其中第二多肽包括另外的衣原体多肽。
28.一种药物组合物，其包括根据权利要求1、4到7中任何一项的多肽以及药学上可接受的载体。
29.一种药物组合物，其包括根据权利要求27或28的疫苗以及药学上可接受的载体。
30.从衣原体菌株中分离的多核苷酸，选自(a)包括SEQ ID NO1的核苷酸序列的多核苷酸；(b)包括SEQ ID NO3所示的核苷酸序列的多核苷酸；(c)包括SEQ ID NO5所示的核苷酸序列的多核苷酸；(d)包括SEQ ID NO7的核苷酸序列的多核苷酸；(e)与SEQ ID NO1、3、5或7的核苷酸序列至少95％同源的多核苷酸；和(f)在42℃，含有50％甲酰胺的6xSSC的严紧条件下，与包括SEQ ID NO1、3、5或7所示的核苷酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸；其中向哺乳动物施用免疫原性有效量的所述分离的多核苷酸，在所述哺乳动物中诱导抗所述衣原体菌株感染的免疫反应。
31.经分离并纯化的多肽分子，其包括选自下列任何一种的多肽(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；(e)包含来自(a)到(d)多肽的至少12个连续氨基酸的免疫原性片段；和(f)通过保守性氨基酸取代修饰而不丧失免疫原性的(a)、(b)、(c)或(d)的多肽；其中所述经修饰的的多肽与对应的(a)、(b)、(c)或(d)的多肽在氨基酸序列上至少75％相同。
32.权利要求31的多肽分子，进一步包括异源信号肽。
33.一种疫苗，其包括选自下列任何一种的多肽(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；(e)包含来自(a)到(d)中任何一种多肽的至少100个连续氨基酸的免疫原性片段；和(f)通过保守性氨基酸取代修饰的(a)到(e)中任何一种的多肽，其中所述经修饰的的多肽与对应的(a)到(e)中任何一种的多肽在氨基酸序列上至少90％相同；其中核酸分子与用于使多肽在哺乳动物或细菌细胞中表达的一种或多种控制序列有效地连接，其中疫苗提供抗衣原体所致疾病的保护性免疫反应。
34.一种药物组合物，其包括适于在疫苗中使用的药学上可接受的载体或稀释剂，以及选自下列任何一种的多肽(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；(e)包含来自(a)到(d)多肽的至少100个连续氨基酸的免疫原性片段；和；(f)通过保守性氨基酸取代修饰而不丧失免疫原性的(a)到(e)中任何一种的多肽；其中所述经修饰的的多肽与对应的(a)到(e)中任何一种的多肽在氨基酸序列上至少90％相同。
35.权利要求33的疫苗，进一步包括佐剂。
36.权利要求35的疫苗，其中所述佐剂是ISCOM佐剂。
37.权利要求34的药物组合物，其包括适于在疫苗中使用的药学上可接受的载体或稀释剂，以及编码选自下列任何一种多肽的核酸分子(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；和(e)包含来自(a)到(d)多肽的至少100个连续氨基酸的免疫原性片段。
38.一种预防或治疗衣原体感染的方法，其包括施用有效量的选自下列任何一种多肽的步骤(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；(e)包含来自(a)到(d)多肽的至少100个连续氨基酸的免疫原性片段；和；(f)通过保守性氨基酸取代修饰而不丧失免疫原性的(a)到(e)中任何一种的多肽；其中所述经修饰的的多肽与对应的(a)到(e)中任何一种的多肽在氨基酸序列上至少90％相同。
全文摘要
本发明提供用于一种用核酸，其包括DNA，免疫宿主，包括人类抗由衣原体菌株，特别是沙眼衣原体感染所致疾病方法的核酸、蛋白质和载体。该方法使用含有编码衣原体菌株Mgp002多肽的核苷酸序列的载体，该核苷酸序列与影响基因产物在宿主中表达的启动子有效地连接。全长Mgp002基因的截短型是有用的免疫原，用于保护抗衣原体感染所致疾病。本发明进一步提供可用于保护抗由衣原体感染所致疾病的重组Mgp002蛋白。
文档编号C12P21/02GK1906299SQ200480040817
公开日2007年1月31日 申请日期2004年11月19日 优先权日2003年11月21日
发明者R·C·布伦哈姆, A·劳多尼基尼, S·加利钱, A·穆尔丁 申请人:圣诺菲·帕斯图尔有限公司