专利名称：用于检测循环肿瘤和内皮细胞的血液测试样机和方法
相关申请本申请要求2003年10月31日提交的美国临时专利申请系列号60/516,571的优先权，其全文在此引入作为参考。
背景技术：
1.发明领域一般而论，本发明涉及改良的细胞粘附基质(“CAM”)和用于分离靶细胞的改良的细胞分离装置，所述靶细胞为例如来自血液或诸如腹水、刮片和涂片标本的其它组织液体样品的肿瘤、胎儿和生血管细胞。更具体地说，本发明涉及可用于选择性分离细胞的CAM系统，所述细胞例如为具有转移潜能的靶癌细胞和/或显示侵袭伪足(invadopodia)的内皮祖细胞。
2.相关技术的描述循环肿瘤细胞(CTC)和癌症检测上皮组织恶性肿瘤是癌症的最常见形式，是造成大多数癌症相关死亡的原因。由于这些肿瘤手术治疗的发展，因此死亡率更多地与早期转移和复发相关联，但这些早期转移和复发在初期诊断时经常被忽略(Racila等，1998；Pantel等，1999)。例如，胰腺和其他胃肠(GI)器官解剖学位置相距较远，在它们侵袭邻近结构并生长成大于1cm肿瘤之前不太可能检测到胰腺和其他GI癌症(Compton，2003；Flatmark等，2002；Koch等，2001；Liefers等，1998；Matsunami等，2003；Nomoto等，1998；Pantel等，1999；Walsh和Terdiman，2003；Weihrauch，2002)。甚至就乳癌而言，通过乳房造影术检测的12-37％乳癌小肿瘤(＜1cm)在诊断时就业已转移了(Chadha M等，1994；Wilhelm MC等，1991)。文献中累积的证据表明在循环中所发现的上皮肿瘤细胞代表了转移形成的最早病征，可考虑将循环肿瘤细胞(“CTC”)用作独立的癌症进展诊断法(Beitsch和Clifford，2000；Brandt等，2001；Feezor等，2002；Fehm等，2002；Ghossein等，1999；Glaves，1983；Karczewski等，1994；Koch等，2001；Liefers等，1998；Luzzi等，1998；Matsunami等，2003；Molnar等，2001；Wang等，2000；Weitz等，1999；Wharton等，1999；Racila等，1998；Pantel等，1999)。同样地，从血液中分离出癌细胞的可靠方法对癌症的临床诊断和治疗应用将产生有意义的影响(Racila等，1998；Pantel等，1999)。一个称为Mi期的新肿瘤期，业已被建议用于指示癌症患者循环中肿瘤细胞的存在。该期使得可以检测循环肿瘤细胞(CTC)的血液测试的发展有所依据。癌症研究领域期待着能增加检测灵敏性的相对于现有方法提高至少一个数量级的新肿瘤细胞富集方法的产生(Pantel等，1999)。
循环内皮祖细胞，血管发生和心血管危险内皮细胞损伤是动脉粥样硬化斑块发展的重要刺激因素(Ross，1993)。已鉴定可分离自外周血单核细胞级分、骨髓和脐带血的循环内皮祖细胞(“CEC”)为内皮细胞损伤之标志(Asahara等，1997；Hill等，2003)。实验室证据表明这些细胞表达多种内皮特异性细胞表面标记并具有众多内皮特性。已注意到当这些细胞注射入具有局部缺血的动物模型中时，它们迅速地与新血管形成位点结合。在初步研究中，Hill等，2003发现低CEC水平与心血管危险因素及臂丛(brachial)反应性相关。业已表明在缺乏足够的CEC下内皮损伤可能影响心血管疾病的进展。该初期研究指出了CEC在心血管疾病诊断和治疗中的潜在应用。CEC通过提供细胞循环富集以促进血管生成而有助于内皮修复(Szmitko等，2003)。因此，CEC可作为心血管疾病危险的阴性预测因子。所以，CEC有效富集的方法在心血管疾病的诊断前和治疗中将特别有用。
细胞异质性及现有的细胞分离技术在血液(细胞异质来源)中循环的肿瘤和内皮祖细胞非常稀少。这些细胞很难被纯化用于分析。在癌症患者中，与非赘生细胞的数量相比，血液中的CTC或剥落的异常细胞(赘生细胞)数量通常较少。因此，通过常规细胞病理学进行的剥落的异常细胞检测经常受限于之。此外，剥落的细胞常常是高度异质性，由多种不同细胞类型组成(有趣的是许多基因最初报道在剥落的细胞中差异表达，而实际上是在非肿瘤细胞中表达的)。由于增加了这种异质性问题，所以存在于每一临床标本中的赘生细胞频率易变，使得在随机混合群体中不同基因表达的量化产生偏差并变复杂。在较大的肿瘤、外周血和腹水中常见凋亡和坏死的细胞。这些细胞不含高质量的RNA，因此对于分子分析来说存在着技术困难(Karczewski等，1994)。业已描述了多种循环肿瘤和内皮祖细胞的细胞富集方法a)显微切割可用于逐一分离稀少的肿瘤细胞(Suarez-Quian等，1999)。该方法通常具有一些限制(1)后继样品处理过程复杂，(2)很难确定细胞生存力，以及(3)选择要被切割的细胞主要是基于形态学上的标准，会造成高频率的假阳性结果。b)也可以利用肿瘤细胞的物理特性，例如形状、大小、密度或电荷(Vona等，2000)。已经发展了几种密度梯度离心方法用于富集有核血细胞(不含成熟红细胞)中的肿瘤细胞。密度梯度离心方法可获得500到1000倍的细胞富集。富集的肿瘤细胞可接着用于分子分析，使用了高灵敏的测定方法，例如免疫细胞化学和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，该逆转录聚合酶链式反应可用于扩增推定的肿瘤标记或内皮标记，例如胰腺特异性抗原(PSA)mRNA或细胞角蛋白19mRNA(Peck等，1998)。但是，这些方法不能有效地从正常细胞中富集有活力的肿瘤细胞。也就是说，500-1000倍的细胞富集通常认为是相对适度的富集，其实质上所产生背景噪声对进一步的分子分析产生了不利影响。另外，基于物理分离技术的富集方法通常是麻烦、冗长的，且包括可导致细胞损害的步骤(如，超过2-3轮的离心)。c)基于抗体的技术是新近才发展的。免疫亲合方法包括将抗体固定到物理载体或荧光标记上。在抗体与感兴趣细胞表面上存在的其靶标结合后，接着进行分选步骤用于阳性或阴性富集期望的细胞类型。上述方法包括亲合色谱法、粒子磁分离、离心或过滤，以及流式细胞术(包括荧光激活细胞分选术；FACS)。
(1)流式细胞术或荧光激活细胞分选术(“FACS”)从背景细胞中逐一检测并分离单个细胞。在模式试验中，该方法可检测单核细胞级分中的乳癌细胞(Gross等，1995)和内皮祖细胞(Hill等，2003)，该单核细胞级分业已通过密度梯度离心富集自外周血。此外，在使用抗体涂覆的磁性微珠富集步骤后，FACS可检测血液中天然存在的乳癌和胰腺癌细胞(Racila等，1998；Beitsch和Clifford，2000)。但是，在FACS方法中，舍弃了以簇或块存在的细胞，且在某些情况下，例如，在卵巢癌中，大多数细胞都以团聚体存在，使得FACS CTC或CEC检测基本无效。
(2)基于抗体涂覆的微珠方法可使用磁场(Racila等，1998)、柱层析、离心、过滤或FACS以获得分离。尽管富集效率很高，但仍存在与所有基于抗体的细胞分离方法相关的内在限制。最重要的一个限制是癌细胞通常表达推定的肿瘤特异性抗原的程度不定(Sabile等，1999)；因此在收集过程中容易丢失大量和潜在的肿瘤细胞非随机亚类。抗体也倾向于以有效的非特异性亲和力结合损害的细胞，导致它们与感兴趣细胞一起分离。总之，该基于抗体的细胞分离方法具有较预期更高的假阴性率。当前，抗体-启动的磁性分离方法检测到很低水平的CTC，即，每毫升乳癌和胰腺癌患者血液1-100个CTC(Racila等，1998)，或每毫升处于心血管疾病危险中个体血液小于50个CEC(Hill等，2003；Beitsch和Clifford，2000)。在一毫升(mL)或一克血液中大约存在5×109个红细胞和5×106个有核白细胞。因此，要在一毫升的血液中检测存在的数千个的癌或内皮细胞仍是一个具挑战性的工作(Gulati和Acaba，1993)。在过去的20年中，已鉴定了在侵袭性肿瘤细胞表面发现的特殊复合物，该复合物促进了这些细胞从原发性肿瘤到转移位点的运动(Aoyama和Chen，1990；Chen和Chen，1987；Chen等，1994a；Chen等，1984；Chen等，1994b；Chen，1996；Chen，1989；Chen和Wang，1999；Ghersi等，2002；Goldstein和Chen，2000；Goldstein等，1997；Kelly等，1994；Monsky等，1994；Monsky等，1993；Mueller等，1999；Mueller和Chen，1991；Mueller等，1992；Nakahara等，1996；Nakaliara等，1998；Nakahara等，1997；Pavlaki等，2002；Pineiro-Sanchez等，1997；Saga等，1988；Zucker等，2000；Zukowska-Grojec等，1998)。我们命名为“侵袭伪足”的这些复合物，结合并降解多种类型的上皮细胞基质(ECM)成分。在分化的正常血细胞或原发性肿瘤细胞上没有发现侵袭伪足，且它们在死亡或垂死细胞中也无法起有效作用。侵袭伪足存在于循环内皮祖细胞中，但在超过99.999％的血细胞中不存在，也存在于孕妇外周血中发现的胎儿细胞中。本发明人已意识到基于侵袭伪足作用的富集步骤可有效地用于从发现于腹水、血液和许多其他体液的大多数细胞类型中分离有活力的转移性肿瘤细胞和内皮细胞，并将克服上述其他技术所具之限制。
发明概述
在一个实施方案中，提供了用于分离血样或其他组织液体样品中有活力的特异性靶细胞的CAM，所述样品用于疾病的筛选、诊断评估、预后和治疗。本发明的CAM使用处在芯材周围的细胞粘附材料以有效地促进包括CTC和CEC在内的靶细胞的粘附。有用的细胞粘附材料包括血源性粘附化合物，其包括，不限于，纤连蛋白、血纤蛋白、肝素、层粘连蛋白、生腱蛋白或玻连蛋白，以及合成的化合物，例如合成的纤连蛋白和层粘连蛋白肽，额外的细胞基质化合物，或其片段，它们的组合等等。CAM中有用的细胞粘附材料应具有能单独或与其他材料结合有效地涂覆基质芯材的能力。所述芯优选包含化学非反应性的材料例如，但不限于，明胶颗粒、骨碎片、胶原、玻璃珠、惰性聚合材料(例如磁性胶体、聚苯乙烯、诸如尼龙的聚酰胺材料、聚酯材料、纤维素醚类和诸如纤维素醋酸酯的纤维素酯类)、氨基甲酸酯DEAE-葡聚糖以及其他天然和合成的材料，例如泡沫颗粒、棉花、羊毛、涤纶、人造丝、丙烯酸酯等等。CAM可用于形成涂层，例如形成约1.0-1.5mm厚的涂层。例如，CAM可包含涂覆有I型胶原溶液的明胶颗粒或玻璃珠芯材，所述胶原溶液随后聚合形成膜。接着将该含有上述多孔的胶原涂覆珠子的膜暴露于样品，例如含有一种或多种血源性粘附成分的血清或全血，该粘附成分促进诸如CTC和CEC的靶细胞的粘附。促进诸如CTC和CEC的细胞粘附的血源性粘附材料可包括，例如，基底膜成分例如纤连蛋白、血纤蛋白、层粘连蛋白、肝素，和玻连蛋白，其片段或它们的组合，或这些化合物的生物学模拟物，及其修饰形式，如外渗或内皮损伤所见的，以及可通过从天然来源纯化或通过人工方法合成制备的。CAM可进一步包括特异性配体，其也识别并结合靶细胞，具有高灵敏性和高特异性。所述CAM膜可包括微珠，例如I型胶原涂覆的明胶微珠或玻璃微珠，覆盖着血源性细胞粘附分子，例如存在于血液或体液中的那些，以及结合材料。例如，微珠可包含(但不限于)脱水的明胶颗粒或玻璃珠，直径在200-2000微米范围内。在一个实施方案中，所述微珠是成形的，或具有这样的形状和大小以便产生网格(anastomosic)通道使得血液流入膜中。在实施方案中，其中所述靶细胞是CTC和CEC，本发明的CAM膜优选对靶细胞CTC和CEC具有亲和力和特异性，对诸如造血细胞小级分的其他细胞具有最小的亲和力。CAM膜可设计来模拟动静脉吻合处血管壁或转移位置或心血管斑处的位点，在此细胞外基质(ECM)成分，包括胶原、蛋白聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白、血纤蛋白、肝素、生腱蛋白和玻连蛋白等等，在外渗或内皮损伤过程中业已得到修饰。实质上，使用在此提供的信息可以设计CAM组合物和供分析的表面结构，以改善对细胞微环境的模拟以便能最大程度地从全血中回收有活力的靶细胞，例如CTC和CEC。通过本发明方法分离的包括CTC和CEC的靶细胞一般都是有活力的，离体可具有生长能力，并具有对胞外基质成分ECM的粘附活性。从血液中分离的CTC和CEC可用于建立CTC和CEC的表达谱。本发明公开的CAM可用于，例如，癌症的检测、诊断和治疗。CAM可用于高亲和力和特异性地识别并结合有活力的癌细胞，因此，该基质可用于从诸如获得自癌症患者的血样和/或腹水的液体样品中分离癌细胞。CAM可用来捕获患者样品中转移的癌细胞，用于诊断和监测上述癌症患者中的疾病。CAMs可用于检测及分离有活力的循环转移肿瘤细胞，其来自各种类型的癌症，包括，卵巢癌、诸如非小细胞肺癌和小细胞肺癌的肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳癌、黑色素瘤、肝癌、胃癌，宫颈癌、肾癌，肾上腺癌、甲状腺癌和诸如结肠直肠癌的腺癌。或者，所述基质可用于捕获血样中的内皮细胞，用于检测、诊断和治疗患者心血管疾病。当来自心血管疾病患者的血样与基质接触时，CAM具有以高亲和力和选择性结合血样中存在的有活力的内皮细胞的能力。不同发育阶段的内皮细胞，包括祖内皮细胞，在心血管疾病诊断中可以使用，例如在该疾病患者的血管发生诊断中。本发明也提供了一种细胞分离装置，使用本发明的CAM从诸如血液的液体样品中分离靶细胞。上述装置可提供，例如，一种能有效富集并鉴别靶细胞的“内皮细胞陷阱”，其中所述靶细胞是，例如，具有癌症和/或心血管疾病危险的患者外周血中有活力的内皮祖细胞。CAM启动的细胞分离装置可被设计以提供血液中有活力的循环肿瘤细胞和循环内皮细胞的100万倍富集。在另一个实施方案中，CAM可用于捕获和分离靶细胞，例如存在于孕妇母体循环中的胎儿细胞。然后，使用标准方法可将粘附在CAM上的分离细胞用于疾病产前诊断的分析，所述疾病例如唐氏综合征、马凡氏综合征、Taysach氏病和其他疾病。使用本发明基质分离胎儿细胞使得用于疾病产前诊断的方法更加安全，因为胎儿细胞可直接分离自血样，且孕妇无需侵入性操作。在本发明的该实施方案和其它实施方案中，使用标准的细胞分离技术，CAM富集或增加了对于血样分析的正常可采用的细胞数量。利用本发明所公开的内容，CAM细胞富集可设计具有如下一个或多个特征(a)以对疾病诊断必需的靶细胞具有高灵敏性和高特异性，从全血中100万倍富集有活力的靶细胞，包括CTC和CEC；(b)同时存在的与其他正常血细胞和组织细胞的功能性和形态学鉴别，例如，包括CTC和CEC在内的靶细胞的细胞大小和密度；(c)全血可用于作为起始样品或通过常用的密度梯度离心方法制备的细胞级分。CAM细胞富集可以是单步骤或多步骤方法。进一步披露的是CAM-启动的细胞分离装置，允许从单核细胞群中有效的捕获有活力的靶细胞，包括CTC和CEC。可对来自患有诸如心血管疾病或癌症的疾病的患者的血液或组织液体样品中的靶细胞进行分级，如共同未决的PCT专利申请PCT/US01/26735中所讨论的，其要求了美国临时申请号60/231,517的优先权(其全文所公开的内容在此引入作为参考)。这样的装置可包括，例如，优选固定于容器表面的CAM涂层，例如，但不限于，试管的内底表面、载玻片的表面，或培养皿的内底表面。当样品放入该容器中时，CAM启动的细胞分离容器的基质涂覆的表面优选被设计使得与样品的接触最大化。CAM启动的细胞分离装置可使用多种现有的实验室诊断用容器，例如，细胞培养室载玻片、培养用微量滴定板、培养瓶等。CAM启动的细胞分离装置可旋转以最佳地模仿血液流动，从而增加了细胞和CAM之间的接触，因此促进了更有效的富集(例如，有活力的CTC和CEC的富集)。可基于本发明所公开的内容构造CAM启动的细胞分离装置，较共同未决的PCT专利申请PCT/US01/26735(要求美国临时申请号60/231,517的优先权)中所描述的，其能更有效地从患有例如CTC相关疾病的患者的外周血中分离包括CTC的有活力的靶细胞。上述富集肿瘤细胞的方法和CAM膜也可容易地用作为阴性过滤步骤，用于收集的自体血液或骨髓以除去癌细胞。本发明公开的CAM启动的血液过滤装置可用于去除污染性的癌细胞，例如，涉及癌症手术过程中进行血液再利用的自体输血、治疗性骨髓移植、外周血干细胞移植和血浆分离置换，其中进行了自体输血，此外，所述的CAM启动的血液过滤装置通过去除血液循环中能转移的细胞，可用于预防由此产生的癌症全面扩散。同样地，CAM启动的血液过滤可用于制备无癌自体骨髓细胞，用于癌症患者中侵入性骨髓化疗-放射后的置换。癌细胞检测可通过分子扩增技术来改善，CAM-富集的细胞可用于多重分子分析中，例如DNA试验、蛋白质试验、以及免疫试验中(例如，对来自患者的CTC和CEC具有特异性)。CAM-富集的细胞及其DNAs、RNAs、蛋白质或抗原可用于癌症诊断目的的多重检测测定。在该多重CTC检测测定中使用的细胞标记包括，但不限于，CTC侵袭性表型[胶原消化和通过细胞摄取的乙酰基LDL]、上皮抗原[细胞角蛋白、上皮特异性抗原(EpCAM、HEA、Muc-1、EMA、GA733-1、GA733-2、E-钙粘蛋白、EGFR、TAGI2、脂笼蛋白2(癌基因24p3)]、内皮抗原[CD31/PECAM1、vanWillebrand因子(vWF)、Flt-1(VEGF受体)、VE-钙粘蛋白]和其他肿瘤相关抗原[包括，但并不限于，癌胚抗原(CEA)、表皮生长因子受体(EGFR)、人激肽释放酶-2(HK2)、粘蛋白(MUC)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PMA)、人绒毛膜促性腺激素的13亚基(13-hCG)等]。标记可单独或联合使用以获得对来自患者给定体积的血液或体液中有活力的肿瘤细胞进行鉴别和计数的结果。用于数据读出的方法包括，但不限于，流式细胞术、荧光显微术、酶联免疫吸附测定(ELISA)和定量实时RT-PCR等。CAM-富集的CTC细胞提供了用于癌症遗传测试的来源。在CTC细胞中可对基因结构和功能的改变进行遗传测试，包括，但不限于，癌基因(例如，ERBB2、RAS、MYC、BCL2等)、肿瘤抑制基因(例如，p53、APC、BRCA]、BRCA2、CDKN2A、CCND1、CDC2SA、CDC25B、KIP]、RB]等)、与肿瘤进展相关的基因[例如，癌胚抗原(CEA)、表皮生长因子受体(EGFR)、人激肽释放酶-2(HK2)、粘蛋白(MUC)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PMA)、人体绒毛膜促性腺激素的13亚基(13-hCG)等]、以及与转移级联相关的基因[例如，核苷二磷酸激酶的nm23家族(HJ-6)(细胞迁移)、PTEN/MMAC](细胞迁移和病灶性粘附)、CADJ/E-钙粘素(细胞-细胞粘附)、MKK4/SEKi(对应激的细胞响应)、KISS-i(调节MIIMLP9表达)、BR/VISi(细胞运动性)等]。例如，非整倍性和CKi9、ERB2、CEA、MUG]、EGF受体、J3-hCG改变被用于乳癌的诊断；pS3、Ki-ras突变CDKN2A、LOH 3p、FHIP用于肺癌的诊断；p53、APC、CEA、CKi9、CK2O、ERBB2、Ki-ras突变用于结肠直肠癌、胃癌和胰腺癌的诊断；PSA、PSM、HK2用于前列腺癌的诊断；p53突变和小随体(microsatellite)改变用于头颈癌的诊断。遗传标记可单独或联合使用以获得对患者遗传改变的有效检测。用于数据读出的方法包括，但不限于，流式细胞术、萤光显微术、基于荧光或发色的聚合酶链式反应读出术等。CAM-富集的CEC细胞及其DNAs、RNAs、蛋白质或在特定肿瘤中当前已知的抗原也可用于多重CEC检测测定，用于检测具有心血管疾病危险的患者。多重CEC检测测定中使用的细胞标记包括，但不限于，CEC功能性表型[通过细胞摄取的乙酰基LDL]和内皮抗原[CD31/PECAM-1、van Willebrand因子(vWF)、Flk-1(VEGF受体)、VE-钙粘蛋白]。标记可单独或联合使用以获得对来自患者给定体积的血液或体液中有活力的内皮细胞进行鉴别和计数的结果。用于数据读出的方法包括，但不限于，流式细胞术、萤光显微术、酶联免疫吸附测定(ELISA)和定量实时RT-PCR等。CAM-富集的CEC细胞可进一步提供癌症遗传测试的来源。换句话说，使用通过CAM富集的CTC细胞可对患者基因结构和功能的改变进行遗传测试。遗传标记可单独或联合使用以获得对患者遗传改变的有效检测。在一个实施方案中，通过选择合适的芯材和细胞粘附涂层，使用消化酶可容易地从装置表面释放CAM上捕获的有活力的细胞，所述消化酶包括，但不限于，胶原酶、胰蛋白酶/EDTA溶液(购自GIBCO)以及透明质酸酶。例如，CAM膜的细胞粘附分子和胶原或明胶可对消化是敏感的。酶将剪切细胞和基质之间的结合，将有活力的细胞从CAM膜上释放到悬浮液中。例如，当I型胶原作为支撑细胞粘附分子的骨架时，使用胶原酶可有效地将CAM-捕获的细胞释放到悬浮液中。本发明的检测方法可用于癌症诊断目的，例如，早期检测、监测治疗和手术响应以及癌症进展的预测。CAM-富集的CTC可用于，例如，在使用当前分离肿瘤细胞的手术方法之前检测癌症、监测治疗和手术响应、改善癌症分期的准确性、以及确定患者肿瘤的转移潜能。使用本领域技术人员公知的额外的多重分子测定法，这些应用可得到进一步增强，所述方法例如测定患者的遗传改变、校验循环肿瘤细胞的组织来源、测定所述癌症类型的分子标记、以及确定肿瘤细胞毒性白细胞计数或相关补体减少的程度。预后和治疗效果也可以通过本发明的检测方法来判定。例如，在治疗性介入过程中及之后有活力的CTC计数可用于确定治疗效果。结合使用显微成像术和流式细胞术可以检测并定量CAM-富集的CTC及相关的抗肿瘤宿主的免疫性。通过确定那些没有不适当副作用的最有效地减少血样中有活力的CTC数量的治疗方案，可以优化对化疗治疗方案的选择。也可通过让CAM-富集的CTC进行一组离体化疗治疗方案，进行对化疗治疗方案选择的优化。接着可给予同一患者有效剂量或药物组合。在给予所述化合物或试剂之前及之后测定有活力的CTC的数量。在给药后明显减少有活力的CTC数量的化合物或试剂可选择作为有希望的抗癌剂。具有疗效的试剂是其能减少CTC数量、增加细胞毒性白细胞和补体系统(宿主免疫性)以及抑制肿瘤细胞增殖的那些。本发明的检测方法也可用于检测新的化合物或试剂能否抗心血管疾病，或具有其他活性。应当指出在循环中，由于对肿瘤的宿主免疫性存在，所以大多数CTC是死亡或凋亡的，正如共同未决的PCT专利申请PCT/US01/26735中所述的。CTC和肿瘤相关细胞毒性白细胞的活力、以及对来自个体供体自体补体系统的测定相结合成为一种测定抗肿瘤宿主免疫性的有效方法。当通过CAM富集的有活力的CTC数量在缺少自体血浆时高但在存在自体血浆时低时，可以认为患者具有抗肿瘤免疫性。另一方面，在存在和不存在抵御免疫杀伤的自体血浆下，失去抗肿瘤免疫性的患者将具有高水平有活力的CTC。通过CAM方法从癌症患者血液中富集的有活力的CTC也可用于与树突细胞融合，用于抗癌疫苗的开发。例如，可将患不同癌症单个患者的CTC进行离体培养和扩增，细胞可完全利用，或针对特定的膜结构或特定的抗原进行纯化，以与树突细胞相互作用用于开发有效的肿瘤疫苗。通过CAM方法从癌症患者血液中富集的细胞毒性淋巴细胞就其自身而言是有价值的与非肿瘤相关的淋巴细胞相比，仔细比较它们的基因表达谱，可产生涉及正在发生的免疫反应和炎症类型的有价值信息，该免疫反应和炎症被发动对抗转移性肿瘤细胞。此外，其他有用的治疗方法可以体内扩展这些细胞，例如，使用IL-2，接着再将它们导入到患者体内以增加它们的抗肿瘤免疫响应。在治疗黑色素瘤和其他肿瘤中该方法具有惊人的效力。本发明的实施方案可用于诊断和治疗目的，提供分离例如患者体内大量的其他循环细胞与转移的小级分CTC的能力。本发明的实施方案(1)能特异性地分离有活力的靶细胞，例如肿瘤和内皮细胞，而不涉及无关或损伤的细胞；(2)从全血的超过五十亿个细胞中，能获得超过一百个诸如肿瘤或内皮细胞的靶细胞的富集；(3)在相同的测试条件下，能容易地从正常血细胞中鉴定出诸如“癌细胞”或“内皮祖细胞”的靶细胞；(4)能从背景正常血细胞中富集用于诊断和治疗患有诸如转移性癌症和心血管疾病的疾病患者的细胞。
附图简述
图1A描绘了CAM 16孔室载玻片的前视图，其底部表面涂覆有CAM膜，例如荧光标记的胶原薄膜，能富集用于癌症和心血管疾病诊断的循环肿瘤细胞和内皮祖细胞；
图1B描绘了CAM 96孔室载玻片的前视图，其底部表面涂覆有CAM膜，例如荧光标记的CAM膜，该膜包含能富集用于癌症和心血管疾病诊断的循环肿瘤细胞和内皮祖细胞的胶原；图2A、2B和2C描绘了直立的7ml、15ml和30ml可在疾病诊断中使用的真空血液收集试管的前视图，该试管沿其内表面涂覆有CAM膜；
图2D描绘了直立的沿其内表面涂覆有CAM膜的组织培养瓶的前视图，该瓶可用于癌症和心血管疾病诊断和治疗；
图2E描绘了诸如图2A-2D中容器中的CAM膜的放大的前视图3A描绘了直立的血液收集试管的前视图，其带有涂覆有CAM膜的浸量尺插入物；
图3B描绘了图3A浸量尺的前视图4A描绘了血液过滤盒的三维视图，该盒包含用于导入要被过滤的样品的在外壳中的预过滤器筛网入口；塞满涂覆有薄的CAM膜的细胞分离珠的主要过滤室；用于除去过滤的血液的在外壳中的后过滤器筛网出口，其可与本发明的用于诊断、治疗或处理的血液过滤系统结合；以及
图4B是图4A塞满涂覆有CAM膜的细胞分离珠的主要过滤室放大的横断面图，描绘了内部密封区由细胞分离珠所形成的网格通道。图5是来自卵巢腺癌腹水的白细胞(A)和肿瘤细胞(B)/(C)/(D)的免疫细胞化学显微照片，所述细胞通过细胞粘附基质富集，使用了抗CD45抗体、全白细胞抗原、以及全细胞角蛋白(B)/(C)或CD-31(D)，而无阳性选择的(A)/(B)及(C)/(D)抗体EpCA。图6A-C是选自的DNA微阵列簇10个基因表达的实时RT-PCR相对表达分析，有关于来自腹水的肿瘤细胞(图6A和6B)以及来自原发性实体瘤的肿瘤细胞(图6A和6C)。
本发明实施方案的详述
本发明涉及取自患者的液体样品中靶细胞的分离和检测，所述靶细胞用于筛选、诊断和处理诸如癌症和心血管疾病的疾病，并用于产前诊断。使用本发明的方法利于从取自患者的液体样品中分离靶细胞。这样细胞的分离可用于处理与该细胞相关的疾病状态。例如，取自患者的血样中肿瘤细胞和内皮细胞分别是转移性癌症和心血管疾病的指示。同样地，存在于孕妇血液中的胎儿细胞可由此分离并用于与胎儿相关疾病的产前诊断。本发明的实施方案涉及靶细胞分离，包括使用基于侵袭伪足粘附表型行为捕获靶细胞的功能性富集方法进行的肿瘤、内皮和胎儿细胞分离策略。这种细胞粘附特性，表现出与模仿血管微环境的ECM基质高亲和力和特异性结合的倾向，似乎是并不是由一种特异性蛋白所介导的，而是通过蛋白复合物介导的，该蛋白复合物包括簇集在称为“侵袭伪足”的细胞凸出物表面上的特异性细胞粘附受体整联蛋白。
CAM细胞富集
CAM细胞富集的肿瘤和内皮细胞分离策略包括使用功能性的富集方法，其基于对材料的粘附表型行为来捕获靶细胞，如过去几十年所详细描述的(Aoyama和Chen，1990；Chen和Chen，1987；Chen等，1994a；Chen等，1984；Chen等，1994b；Chen，1996；Chen，1989；Chen和Wang，1999；Ghersi等，2002；Goldstein和Chen，2000；Goldstein等，1997；Kelly等，1994；Monsky等，1994；Monsky等，1993；Mueller等，1999；Mueller和Chen，1991；Mueller等，1992；Nakahara等，1996；Nakahara等，1998；Nakahara等，1997；Pavlaki等，2002；Pineiro-Sanchez等，1997；Saga等，1988；Zucker等，2000；Zukowska-Grojec等，1998)。业已发现具有侵袭伪足的细胞(“侵袭伪足细胞”)与模拟血管微环境的基质以高亲和力结合，特别是在干扰状态下。基于侵袭伪足的行为，可以设计功能性细胞富集步骤，该步骤对有活力的转移性肿瘤细胞和血管原性内皮细胞具高选择性且可捕获极少的白细胞/单核细胞和红细胞，并在溶液中留下其他类型细胞。CAM细胞富集测定可额外包括阴性鉴定/选择过程，该过程使用了直接抗白细胞共同抗原CD45的抗体。本发明方法采用的CAM包含了不进行生物化学反应的芯，如胶原聚合物，其与细胞粘附分子、特别是天然和合成的血源性粘附分子物理缔合。CAM优选设计成允许有活力的肿瘤细胞粘附在基质上，同时避免粘附于血液中正常的背景细胞；也就是说，允许有活力的肿瘤细胞以大的亲合力粘附，但避免粘附于正常细胞(优选包括，例如，超过99.9％的白细胞和99.9999％的红细胞)及死亡或垂死的肿瘤细胞。该CAM涂层也可包含能与一种或多种CAM-侵袭细胞反应的配体(如，抗体、荧光和/或比色标记等等)。该配体可产生可见或不可见的(但可检测的)CAM改变，作为要被检测的一个或多个细胞存在的指示。或者，这样的配体可串列布置在与CAM相关联的分离的检测层中。CAM薄涂层优选固定在细胞分离部件的内底表面。因此，CAM可用于成功地从例如，来自I和IV期非小细胞肺癌(NSCLC)患者血样的单核细胞级分中回收有活力的肿瘤细胞。CAM方法也可用于标记鉴定目的的肿瘤细胞。例如，当使用荧光标记的胶原制备CAM时，就标记了侵袭性肿瘤细胞，因为它们具有消化和摄取胶原的倾向。相反地，正常细胞就不干扰CAM。就所期望富集的侵袭伪足细胞而言，CAM组合物和试验表面结构可设计成改善对血管内微环境的模拟，使得从诸如全血的样品中回收最多数量的有活力的期望细胞。侵袭伪足细胞更有效的富集也可通过使用部件旋转方法而获得，该旋转方法能最佳地模仿血液流动并增加肿瘤细胞与CAM之间的接触。在一个优选的实施方案中，样品通常应以规定保留样品中侵袭伪足细胞活力的方式进行处理。
CAM-启动的细胞分离装置
CAM启动的细胞分离装置可包括多种设计，例如细胞培养室载玻片、培养用微量滴定板、或培养瓶等。例如，如图1所示，CAM启动的细胞分离装置在一个单位阵列(14)中可包含多个孔(12)，在一个或多个孔(12)的底部具有CAM(10)。图1A说明的是一个13-孔微阵列，而图1B说明的是一个96-孔微阵列。CAM启动的细胞分离装置可包括各种形状(16，18，22)的血液收集试管，可装有或不装有盖(20)；或诸如图2所示的容器(24)，在其内壁上涂覆有CAM膜(10)，底表面(26)未涂覆，装有或不装有盖(20)。优选地，上述容器在使用前是灭菌的。CAM启动的细胞分离装置可用于，例如，从置于容器中的样品(28)中分离CAM(30)中的CTC和/或CEC。CAM(10)可包括，例如，并入包含细胞粘附材料的层(30)内的玻璃珠(34)。CAM启动的细胞分离装置可使用包含测量卡(38)的浸量尺(36)，如图3B中的透视图和剖视图，测量卡(38)的表面涂覆有CAM膜。浸量尺或测量卡插入到细胞分离容器(16)中。CAM膜可覆盖在浸量尺(38)表面上和/或试管(16)和/或盖(20)的内壁上。在一个实施方案中，CAM启动的细胞分离装置还包括分离前和/或分离后的部件，例如过滤器(如Amicon过滤器、中空过滤器)、膜、或帮助在细胞群与CAM膜接触前分离出细胞群的梯度(gradients)(如水溶性聚蔗糖、蔗糖等)。至于图4，所示的是血液过滤盒(43)的三维视图，该盒包含用于导入要被过滤的样品的在外壳中的预过滤器(41)，例如筛网(或CAM-涂覆的筛网)，塞满CAM(10)的主要过滤室(40)，和在外壳中的后过滤器(42)出口。图4B是塞满CAM(10)的主要过滤室(40)放大的横断面图。在一个实施方案中，CAM启动的细胞分离装置的CAM膜包含胶原涂覆的微珠，直径在200-2000微米范围内，成形以产生网格通道使得血液流入膜中。在该血液过滤单元中的全血可在约37℃下温育，并旋转以模仿血液流动以增加细胞和CAM之间的接触和，以及支持从血液中有效地富集有活力的细胞。含有诸如肿瘤细胞和内皮祖细胞的靶细胞的血液可贮藏在CAM-启动的富集装置中持续4-48小时的一段时间，以便增加富集效率。在设计CAM启动的细胞分离装置和系统时需要注意三个参数(i)CAM组成和试验表面结构，用以改善对肿瘤血管内微环境的模拟，以便从全血中回收最大数量的有活力的肿瘤细胞；(ii)部件旋转程序，用以最佳地模仿血液流动，增加肿瘤细胞与CAM之间的接触，并促进更有效地富集有活力的肿瘤细胞；以及(iii)血液处理方式，用以改善在血样中肿瘤细胞活力的保留。上述用于富集肿瘤细胞的阳性CTC选择方法也可作为阴性过滤步骤用于收集自体血液或骨髓，以除去癌细胞。因此，本发明的CAM启动的血液过滤方法可用于癌症手术过程中进行血液再利用的自体输血、治疗性骨髓移植、外周血干细胞移植和血浆分离置换。所述的CAM启动的血液过滤装置通过去除循环中能转移的细胞，可用于预防由此产生的癌症全面扩散。可以进行特异性和灵敏性对照试验以优化试验中肿瘤细胞富集的效率。重要的变量包括(a)CAM捕获后外源添加的肿瘤细胞系的活力，(b)最有效富集并分离有活力的肿瘤细胞的条件，以及(c)导致细胞从CAM膜上完全洗脱的细胞处理方式。
实施例1来自血液的CTC和CEC
可将全血置于CAM血液收集装置中，例如血液收集试管(图2和3)。该试管可在约37℃下温育，并旋转以模仿血液流动以便增加细胞和CAM之间的接触。可在抗凝血剂存在下进行血液收集，例如，每mE枸橼酸盐葡萄糖抗凝剂溶液USP(ACD，Baxter HealthcareCorporation，Deerfield，IL)中添加50单位的肝素锂，以阻止CAM血液测试装置中血液凝固。密封的CAM-血液试管可置于滚筒中，在约37℃下每分钟旋转5-30转，接着温育1-3小时用于产生细胞粘附。
实施例2特异性和灵敏性对照
可选择不同肿瘤来源的人肿瘤细胞系用于进行特异性和灵敏性对照试验。例如，可使用人结肠肿瘤细胞系SW-480、人胃肿瘤细胞系RF-48、几种乳腺肿瘤细胞系、人恶性黑色素瘤细胞系LOX、以及几种卵巢肿瘤细胞系。肿瘤细胞系可购自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)。所有的细胞系应确认对支原体(Mycoplasma)感染是阴性的。对肿瘤细胞系应检验(a)平板接种后1小时之内对CAM高亲和力结合；(b)高增殖率；以及(c)在使用或用表达质粒转化前，肿瘤细胞系应容易且稳定地(100％)用红色或绿色荧光染料进行荧光标记，所述质粒表达绿色荧光蛋白(GFP)以便能在富集处理结束时直接可见肿瘤细胞。对照正常血液可用已知的一些绿色荧光标记的或GFP表达性荧光性人肿瘤细胞接种，并进行CAM细胞富集方法，以评估它们的可比较效率。来自健康供体的全血或来自脐带的脐带血可通过NationalDisease Research Interchange(Philadelphia)获得。在采血后，血液应马上添加枸橼酸盐葡萄糖抗凝剂溶液USP(ACD，Baxter HealthcareCorporation，Deerfield，IL)和肝素锂以阻止经常在进一步试验操作过程中所发生的血液凝固。正常的血液不含有具癌特性的细胞。因此，掺入到这些血样中的肿瘤细胞应当是在该特异性和灵敏性检测中所唯一回收的。来自健康个体的脐带血或血样可用已知的一些荧光标记的，即荧光染料预标记的或GFP-标记的肿瘤细胞接种。可将3mL等份量的混合血样转移到CAM测定装置中用于肿瘤细胞富集。可除去悬浮的血细胞。例如，当I型胶原为支撑CAM膜的骨架时，使用胶原酶可将CAM捕获的细胞释放到悬浮液中。为了测定来自脐带血的对照有活力的肿瘤细胞的数量，例如，可掺入约3,000个GFP-肿瘤细胞到3mL脐带血(约15,000,000,000个血细胞)或细胞完全培养基(含15％人血清)中并进行CAM富集。回收自培养基的细胞可指示实际上有活力的肿瘤细胞的数量。(回收自脐带血的细胞数量)/(回收自培养基的细胞数目)的比率表示该测定的效率。与培养基相比，脐带血有活力的肿瘤细胞回收百分数可用于确定CAM富集测定所用的最佳条件。这些条件包括CAM-血液试管温育一段时间(如，1-3小时)、旋转速度(如，每分钟5-30转)、以及贮藏血液以保持细胞活力的时间长度(如4-48小时)。极其大量存在的背景血细胞将阻止癌细胞与CAM表面的直接接触，并减弱CAM方法的灵敏性。血液收集试管的CAM膜能有利地设计为使得CAM与肿瘤细胞表面接触面积最大化。细胞温育的时间长度也很重要，因为CAM依赖于肿瘤细胞区别于造血细胞的差异粘附。
实施例3相对于血液收集试管，在CAM-血液过滤装置中测定细胞活力
另一个难题是血样的细胞活力在运送到研究实验室路程中会改变。增加贮藏时间预计可能危害血液中细胞。为确定CAM血液装置中的肿瘤细胞在运送过程中是否保持活力，将3,000个GFP-肿瘤细胞掺入到3mL脐带血及含有15％人血清(Sigma)的对照培养基中。每一等份试样在4℃下贮藏一系列时间(4、6、8、12、16、24、36和48小时)。然后，通过CAM对每一等份试样进行捕获，并通过CAM测定GFP-肿瘤细胞回收百分率。对每一时间点，进行4次重复试验，并测定回收百分率。结果显示CAM-捕获的肿瘤细胞活力优于血液中悬浮的细胞。可使用本领域普通技术人员已知的任何方法对CAM-富集的细胞计数，包括镜检和流式细胞术(参见如下详细的方法)。对于细胞富集试验而言，通过镜检计数获得的初步数据表明回收率随掺入剂量而增加，大致依照对数曲线。使用本发明公开的CAM-启动的细胞分离装置，在原始样品每毫升血液中存在多于1,000个GFP-LOX细胞时，可获得约40％的掺入脐带血中的GFP-LOX人恶性黑色素瘤细胞的回收率，变率约为10％。
使用流式细胞仪计数并确认患者血液中有活力肿瘤细胞的策略
在临床实验室中，可通过多参数流式细胞分析仪测定标记的肿瘤细胞，使用FITC标记的胶原(绿色)来检测侵袭性肿瘤细胞，使用PE标记的抗-CD45白细胞共同抗原抗体(红色)来检测并排除白细胞，以及使用7-AAD来排除死亡的细胞。该自动化的细胞分析可通过使用镜检术进行平行和独立的镜检评估来验证，例如，使用细胞谱系标记，包括抗上皮、内皮和造血抗原的抗体。可使用多参数流式细胞分析仪通过流式细胞术对血液中侵袭性肿瘤细胞进行计数，使用了，例如(a)FITC标记的胶原，其可为肿瘤细胞所摄取(绿色)以检测侵袭性肿瘤细胞，和(b)PE-标记的抗-CD45白细胞共同抗原抗体(红色)，用于检测并排除细胞群中已污染的白细胞。例如，通过CAM捕获的肿瘤细胞和共分离的正常血细胞可用藻红蛋白(PE)-缀合的CD45抗体和死亡细胞核酸染料7-AAD后染色。吸出标记的细胞样品并进行分析，例如，在FACSCalibur流式细胞测定器(Becton Dickinson)上进行分析。除其它因素之外，用于数据分析的标准可包括(a)通过前向光散射确定的尺寸，(b)通过正交光散射确定的粒度，(c)死亡的7-AAD细胞阴性事件，(d)PE-标记的CD45单克隆抗体(mAb)正常细胞的阴性事件，以及(e)FITC-肿瘤细胞的阳性事件。本领域技术人员应当明白，存在几种从异源临床标本活细胞中辨别凋亡和死亡细胞的细胞计量法(例如，使用FITC-标记的膜联蛋白V和碘化丙锭)。例如，为将细胞活力测试整合入CAM纯化的细胞的多参数流式细胞术中，在固定的CAM细胞群中可使用7-氨基-放线菌素D(7-AAD，Molecular Probes)标记死亡细胞。7-AAD可为488nm的氩激光谱线所激发，并发射远红外光。7-AAD辐射光谱可与FITC和PE辐射所分离(OLIVER等，1999)。荧光参数容许鉴定CAM纯化的血液细胞亚群中的死亡细胞(7-AAD)、有活力且具侵袭性的肿瘤细胞(FITC-胶原)以及白细胞(PE-CD45)。新标记的细胞可递送至流式细胞仪分析室中用于即刻计数或贮藏在悬浮液中，例如，在4℃下贮藏1-3天。可设定FACSCalibur流式细胞测定器每小时计数2-4个细胞样品。在获得自癌症或心血管疾病患者个体的典型血样中，循环肿瘤和内皮细胞在数量上大大地超过(在超过100万倍的范围内)正常造血细胞。虽然所述的实施方案并不受限于任何具体假说，但本发明人假定(a)在癌症进展最初期，转移性细胞开始出现于原发性肿瘤；这些细胞具有侵袭行为，(b)作为癌症存在指示的血液肿瘤细胞群能用于早期诊断和进一步的分子分析，以及(c)存在于循环和原发性肿瘤细胞中基因的诊断性组合可用于确定循环肿瘤细胞的组织位置来源、确定特异性癌症亚型、以及高置信度地预测患者的转移潜能。
CAM培养方法富集细胞的镜检特性
可平行进行高产量的CAM培养，作为独立的CAM方法，以验证通过CAM富集和流式细胞仪计数的肿瘤细胞。使用镜检和免疫细胞化学方法可容易地放大该CAM培养方法，上述镜检和免疫细胞化学方法使用了细胞谱系或推定的肿瘤标记。镜检可用于鉴定通过CAM富集自血液的CTC，具有如下特征，表示为Co+/Epi+/Endo+/Leu-；CEC为Co-/Epi-/Endo+/Leu-；肿瘤相关的淋巴细胞为Co-/Epi-/Endo-/Leu+。具体来说，该CTC是1)来自摄取和浓缩的TRITC-标记的胶原片段的阳性荧光(Co+；降解和摄取ECM倾向是侵袭性和转移性细胞的标志之一)。
2)对上皮特异性标记的阳性免疫细胞化学检测，包括细胞角蛋白和上皮膜抗原(BerEP4、EpCAM、GA733和Muc-I)(Epi+)。
3)对内皮特异性标记的阳性免疫细胞化学检测，包括CD31，vanWillebrand因子(vWF)和VEGF受体(Endo+)。
4)对白细胞/单核细胞谱系标记的阴性免疫细胞化学检测，包括CD45、CD14和CD68；对白细胞样细胞学阴性(Leu-)。将CAM细胞室方法的抗体标记设计与差分干涉对比(DIC)亮视野相结合，并使用三重荧光过滤器，例如可使用Nikon Eclipse E300倒置荧光显微镜，提供了在每一显微视野内鉴定肿瘤细胞的强有力的多重方法。在同一个荧光显微视野中，尽管APAAP染色的细胞型标记在DIC亮光下呈现红色，但侵袭性细胞的TRITC-胶原标记观察到的是红色荧光，FITC-细胞型标记观察到的是绿色荧光，而Hoechst 33258核染料发出蓝色荧光。图片可储存在计算机硬盘驱动器中，可借助于诸如Metamorph图像分析软件(Universal Imaging Corporation)的软件对样品中带色或荧光标记的细胞数量计数。载有CAM-富集和标记的细胞的载玻片可在荧光显微镜下对阳性肿瘤细胞扫描。
CAM-富集细胞的多重分子分析微阵列和实时RT-PCR
相对于预计存在于白细胞中的那些，在循环肿瘤细胞中预计特异性存在的mRNAs表达水平可用作为富集成功程度的量度标准。在给定细胞群中肿瘤细胞的百分数可使用上皮(GA733-1)和白细胞(CD45)标记的表达来确认，使用了肿瘤细胞系和白细胞样品作为阳性对照。例如，对纯化自血样的细胞样品使用Roche LightCycler，可进行实时RT-PCR。可进行上皮标记GA733-1和白细胞标记CD45相对于β-肌动蛋白的实时PCR定量。预计上皮标记GA733-1在纯肿瘤细胞亚群和肿瘤细胞系中高水平表达，而不在白细胞中高水平表达。而且，白细胞标记CD45应在白细胞样品和不纯的肿瘤细胞群中被检测到，而不在肿瘤细胞系或纯肿瘤细胞样品中被检测到。在回收的肿瘤细胞样品中观察到的真实GA733-1信号可解释为证明了CAM富集方法恢复了细胞库，其中肿瘤特有的标记能容易且可再现地被测定。测定每一CAM肿瘤细胞群中CD45信号水平也是重要的，该信号水平指示了白细胞污染的程度。如果观察到实质上的污染，那么可推断，例如，CD45阴性选择步骤对于测试而言是必须的，且需要整合入最终的实验方案中。大多数实体癌的分子机制尚不清楚。在每一临床标本中，癌细胞的数量和病理学类型是易变的；癌细胞周围还围绕着许多类型和数量的正常细胞。此外，在进展和转移过程中肿瘤细胞改变了它们的基因表达谱。CAM细胞富集方法提供了有活力的肿瘤细胞群，它们可用于离体肿瘤细胞的分子分析，该分析使用了DNA微阵列和实时RT-PCR分析。这些有活力的肿瘤细胞群能拓宽发现通常表达于来自原发性肿瘤和血液的肿瘤细胞的基因，以及特定上皮癌的肿瘤细胞中特异性表达的基因的研究。如表1和2所示，本发明的细胞分离方法已用于鉴定分离自血样的肿瘤细胞，该鉴定使用了DNA微阵列和RT-PCR技术。数据显示了特定肿瘤细胞类型的特征基因的表达。
表1.细胞样品及其原始临床标本的组织病理学信息*
*在总共77个细胞样品中，41个细胞样品通过DNA微阵列检查；63个细胞样品通过实时RT-PCR检查；27个细胞样品通过DNA微阵列和实时RT-PCR检查。
表2A.富集自卵巢和子宫肿瘤标本的不同类型肿瘤细胞中正调节的126个基因
表2B.富集自卵巢和子宫肿瘤标本的不同类型白细胞中正调节的48个基因
表2C.富集自卵巢和子宫肿瘤标本的不同类型成纤维细胞中正调节的45个基因
测定宿主抗肿瘤免疫性的方法和组合物
由于宿主存在着对肿瘤的免疫性，因此在循环中大多数CTC是死亡或凋亡的，如共同未决的PCT专利申请PCT/US01/26735所述的。CAM-启动的血液装置，CTC活力以及来自个体供体的血浆结合成为测定宿主抗肿瘤免疫性的有效方法。CAM-富集的CTC经常与细胞毒性的白细胞形成簇。细胞粘附基质可容易地分离这样的免疫和癌细胞复合物的簇，所述复合物来自可能具有给人希望的预后的患者。此外，与肿瘤细胞溶解相关的补体系统可溶组分能通过在自体血浆存在下CTC的活力来测定，该自体血浆来自同一患者的血液。因此，对于宿主免疫性而言，肿瘤细胞毒性白细胞和可溶性补体系统的存在应该是重要的指示剂。为测定存在抗肿瘤细胞毒性白细胞和补体系统下有活力的CTC数量，在存在10-20％自体血浆下可通过CAM-启动的细胞分离装置筛选全血或单核细胞。当在不存在自体血浆下通过CAM富集的CTC数量高，而在存在自体血浆下数量低时，患者可能具有高的抗肿瘤免疫性。另一方面，在自体血浆存在和不存在下检测到的抵抗免疫杀死的高水平的有活力CTC，应当是患者具有高度的恶性肿瘤的最强指示剂。
实施例4来自全血的肿瘤细胞的CAM阳性分离
用于从全血中分离肿瘤细胞的例证性实验方案如下1.制备脐带血在CAM血液测试装置的每个试管中添加掺入已知数量GFP-肿瘤细胞的3mL抗凝的脐带血(加入300μg的ACD和肝素锂)。将密封的CAM-血液试管放置在滚筒上，在37℃下以每分钟5-30转进行旋转。温育1-3小时以产生肿瘤细胞粘附。
2.制备对照培养基在CAM血液测试装置的每个试管中添加掺入已知数量GFP-肿瘤细胞的3mL对照培养基(加入300μg的ACD和肝素锂)。将密封的CAM-肿瘤试管放置在滚筒上，在37℃下以每分钟5-30转进行旋转。温育1-3小时以产生肿瘤细胞粘附。
3.用移液管小心地除去血液或培养基上清液。用3mL洗涤溶液(PBS/0.1％，BSA/10％，ACD和肝素锂)洗涤试管5次，不要扰动内壁上的CAM膜。
4.在已彻底洗净和除去红细胞的CAM血液过滤装置的每个试管中添加1mL胶原酶溶液。将密封的CAM-血液试管放置在滚筒上，在37℃下以每分钟5转进行旋转。温育10分钟，以便溶解CAM并释放肿瘤细胞到悬浮液中。胶原酶溶液(PBS，0.3mM CaCl2，0.2μg/mL I型胶原酶[Worthington Biochemical]，25μg/mL DNase[Roche])。
5.将悬浮液转移到新的Bppendorf管中。在冰上立刻用TRITC-抗-CD45(用于镜检)或PE-抗-CD45(用于流式细胞术)进行免疫荧光标记。通过镜检和流式细胞术对标记的肿瘤细胞计数。
实施例5含有荧光材料的CAM膜
如果CAM基质发荧光的话，则侵袭伪足细胞消化并内化ECM基质，那么肿瘤细胞在富集过程中应当发出荧光。为达到该目的，在CAM涂覆到捕获容器之前，将发荧光的TRITC或FITC-I型胶原聚合物掺入到CAM底物中。阴性鉴定方法可用于区别癌细胞和白细胞，该方法使用了抗白细胞共同抗原CD45的藻红蛋白(PE)-或FITC或TRITC-缀合的抗体。当前，RT-PCR和免疫细胞化学(靶向上皮分子，例如CK18和CK20细胞角蛋白，GA733上皮膜抗原，Muc-1和全上皮抗原BerEP4)被用于确认上皮来源的循环肿瘤细胞(Ghossein等，1999；Molnar等，2001；Racila等，1998；Schoenfeld等，1997；Soeth等，1997；Vlems等，2002；Wharton等，1999)。尽管这两种方法都具有高检测灵敏性，并在全血单核细胞级分的差异离心富集(约500)后能成功地用于分辨血液中的循环肿瘤细胞，但检测率低，这是因为血液中每10亿个正常细胞中所存在的循环肿瘤细胞少于100个。此外，无法获知是否该方法捕获了最关键的细胞，因为仍然无法获知循环转移进程中的关键基因。基于抗上皮抗体的亲和纯化的应用将导致血液中肿瘤细胞大量损失。相反地，CAM可在一步反应中达到100万倍的富集，从来自15×109个血细胞的3,000个有活力的肿瘤细胞获得大于40％的收率。为了进一步改善靶细胞的富集，可进行多步骤的细胞富集方法从血液中回收超过85％的肿瘤细胞。该方法包括首先对全血细胞进行密度梯度离心以浓缩单核细胞，接着在发荧光的CAM膜上培养这些细胞一段合适的时间，如12-18小时，以便(a)标记肿瘤细胞，(b)在CAM膜上培养肿瘤细胞和少于0.1％的白细胞，以及(c)用抗体或核酸染料对CAM-捕获的细胞群染色。通过镜检，单个肿瘤细胞和细胞丛都能容易地观察到(而在流式细胞术中细胞丛通常难以产生)。CAM血液过滤测定法可用于分离癌症患者血液中有活力的肿瘤细胞、内皮祖细胞和免疫淋巴细胞。然后将CAM-捕获的细胞平行接种于16-孔室的载玻片(Lab-Tek，Rochester，NY)中，该载玻片涂覆有基于FITC(或TRITC)-胶原的CAM并培养了12-18小时。侵袭性肿瘤细胞将摄取发荧光的CAM并变成为FITC(或TRITC)所标记，而共纯化的内皮细胞和白细胞仍保持未标记状态。除循环肿瘤细胞的阳性鉴定之外，分离的细胞通过标记TRITC(或FITC)-CD45或CD31(用于荧光镜检)或用PE-CD45或CD31标记(用于流式细胞术)可进行阴性鉴定的测试。
实施例6通过流式细胞术对分离的细胞计数
每位患者约10-20mL的血液可收集在Vacutainer试管中(Becton Dickinson，绿色盖子，肝素锂抗凝剂，每一试管容有7ml)。可将新鲜收集血样的等份试样转移到CAM血液测试试管中，或进行密度梯度离心以获取单核细胞，并在CAM上进行进一步的细胞富集和鉴定。通过流式细胞术对血液中有活力的肿瘤细胞的计数，可基于如下标准进行(a)肿瘤细胞通过摄取FITC标记的胶原显象；(b)PE-标记的正常血细胞可用作为鉴定污染的白细胞的补充信号；(c)7-AAD细胞死亡的阴性事件。FITC-胶原-或GFP-标记的肿瘤细胞可通过CAM得到捕获，共分离的正常血细胞可用藻红蛋白(PE)缀合的CD45抗体进行免疫后染色。可以仅吸出500μl样品并在FACSCalibur流式细胞仪(BectonDickinson)上进行分析。通过使用核酸染料7-AAD的荧光阈值，数据可以列表方式获得。多参数数据分析的标准包括(a)通过前向光散射确定的尺寸，(b)通过正交光散射确定的粒度，(c)死亡的7-AAD细胞阴性事件，(d)FITC-胶原-或GFP-肿瘤细胞的阳性事件，以及(e)PE-标记的CD45单克隆抗体正常细胞的阴性事件。为了使血液中存在的肿瘤细胞能以低于已公开的每毫升血液10,000,000,000个血细胞中100,000个肿瘤细胞比率(Glaves等，1988；Karczewski等，1994)的频率进行计数，可有利地考虑下列因素
(i)样品体积可从3-20mL减少到500μl，总的细胞计数从15,000,000,000减少到1,000,000，而在合理的一段时间内通过流式细胞仪的肿瘤细胞没有明显的损失(样品流速＝60μl/mm)。(ii)富集的肿瘤细胞须可与共分离的正常细胞区分。该肿瘤细胞可以是FITC-胶原-或GFP-标记的，而超过99％的共分离细胞应当是白细胞且可用藻红蛋白(PE)-缀合的抗CD45抗体标记。(iii)肿瘤细胞经常以直径50μm-500μm的丛块存在。在加载到流式细胞仪之前，来自CAM血液过滤和基于抗体的磁珠方法的细胞样品可通过50μm筛网以除去大的丛块。或者，当在CAM上培养丛块时，循环肿瘤细胞从丛块上脱离并在12-18小时内开始侵袭CAM膜。当使用发荧光的CAM膜时，通过CAM方法富集的肿瘤细胞可用荧光胶原标记，并可通过胶原酶以单个细胞形式悬浮。
实施例7CAM富集的患者肿瘤细胞在流式细胞术中的应用
(1).在每一涂覆有FITC-标记的胶原的CAM血液过滤装置的试管中添加3mL抗凝的血液(0.3mL肝素锂加枸橼酸盐葡萄糖抗凝剂溶液USP-ACD，Baxter Healthcare Corporation，Deerfield，Jib)。将密封的CAM-血液试管放置在滚筒上，在37℃下以每分钟5-30转进行旋转。温育1-3小时用于产生肿瘤细胞粘附。(2).用移液管小心地除去非粘附的细胞和上清液。用3mL溶液小心地洗涤试管5次，避免扰动内壁上的CAM膜。洗涤溶液(PBS/O 1％BSA 1％ACD和肝素锂)。(3).添加1mL的完全细胞培养基到每一CAM血液过滤装置中，该培养基在pH7.4的HEPE缓冲液中含有15％人血清。将密封的CAM-血液试管放置在滚筒上，在37℃下以每分钟5转进行旋转。温育9-15小时以容许肿瘤细胞通过摄取的FITC-I型胶原而得到标记。(4).用移液管小心地除去培养基上清液。用3mL PBS洗涤试管3次，不要扰动内壁上的CAM膜。(5).添加1mL胶原酶溶液到业已彻底清洁的CAM血液过滤装置的每一试管中。将密封的CAM-血液试管放置在滚筒上，在37℃下以每分钟5转进行旋转。温育10分钟，以便溶解CAM并释放肿瘤细胞到悬浮液中。胶原酶溶液(PBS，0.3mM CaCl2，0.2μg/mL I型胶原酶[Worthington Biochemical]，25μg/mL DNase [Roche])。(6).将悬浮液转移到两个Eppendorf管中，每管500μl。(7).用于多参数流式细胞术的染色/制备添加100μl的固定剂溶液(PBS，6％多聚甲醛，pH7.2)到Eppendorf管的500μl细胞悬浮液中(最终固定剂浓度为1％多聚甲醛)，在20-25℃下固定10分钟。以1,000rpm旋转1分钟获得细胞沉淀。除去固定剂并用500μl PBS溶液洗涤试管3次。放置在冰上并添加10μg/mL的PE-抗-CD45(用于标记白细胞)和1μg/mL的7-AAD(用于染色死亡细胞)，接着在黑暗中于4℃下温育10分钟。上述实验方案指定用于CTC检测。对于CEC和肿瘤相关的淋巴细胞的检测，PE-抗-CD31和PE-抗-CD45可分别用于标记CEC和肿瘤相关的淋巴细胞。
实施例8通过CAM 96孔细胞室方法富集的肿瘤细胞在流式细胞术中的应用
(1).通过密度离心制备MNC级分使用存留在Vacutainer血液收集试管(Becton Dickinson，绿色盖子，肝素锂作为抗凝血剂，每一试管容有7mL)中的3-15mL抗凝的血液。以1,000rpm旋转获得细胞沉淀并将细胞重悬于含0.5mM EDTA的5mL PBS中。依照厂商说明通过Ficoll-Paque密度离心(Pharmacia)获得单核细胞(MNC)级分，用含15％牛血清的完全培养基洗涤，并悬浮在3-15mL的完全培养基中。(2).在CAM 96-孔室载玻片上培养MNC级分接种100μl/孔的细胞悬液(也适用于通过诸如CAM和Dynal AAMB的其它方法捕获的细胞)到期望的孔中，上述96-孔微量滴定板中有8孔涂覆有基于FITC-胶原的CAM，其中业已充满了100μl含15％牛血清的完全培养基，并在CO2培养箱中于37℃下培养12-18小时。该步骤通过测定它们消化和内化荧光胶原片段的能力对肿瘤细胞进行标记。(3).用移液管小心地除去非粘附的细胞及上清液，用200μl PBS洗涤孔2次，不要扰动内壁上的CAM膜。非粘附的细胞由MNC级分中死亡的肿瘤细胞和非肿瘤血细胞组成。可汇集悬浮的细胞并分离CD19白细胞或干细胞。(4).添加100μl胶原酶溶液(PBS，0.3mM，CaCl2，0.2μg/mL I型胶原酶[Worthington Biochemical]，25μg/mL DNase[Roche])到业已彻底清洁的96-孔CAM血液装置的一行8个孔的每一孔中。粘附的细胞温育10分钟，以便溶解CAM并释放结合的肿瘤细胞到悬浮液中。(5).从8-孔中转移总共800μl的悬浮液到Eppendorf管中。(6).添加200μl固定剂溶液(PBS，10％多聚甲醛，pH7.2)到Eppendorf管的800μl细胞悬浮液中(最终固定剂浓度为2％多聚甲醛)，并在20-25℃下固定10分钟。(7).以1,000rpm旋转1分钟获得细胞沉淀，除去固定剂并用500μl PBS溶液洗涤试管3次。将细胞沉淀放置在冰上并添加10μg/mL的PE-抗-CD45、CD14和CD68(用于标记白细胞、单核细胞、巨噬细胞)和1μg/mL的7-AAD(用于染色死亡细胞)，接着在黑暗中于4℃下温育10分钟。上述实验方案指定用于CTC检测。对于CEC和肿瘤相关的淋巴细胞的检测，PE-抗-CD31和PE-抗-CD45可分别用于标记CEC和肿瘤相关的淋巴细胞。
实施例9通过CAM 16-孔细胞室方法富集的肿瘤细胞的镜检鉴定
(1)在低速下制备细胞和血浆级分。750rpm离心5分钟Vacutainer血液收集试管(Becton Dickinson，绿色盖子，肝素锂作为抗凝血剂，每一试管容有7ml)中3-7mL抗凝的血液在750rpm旋转5分钟或在1,000rpm旋转3分钟获得细胞沉淀。将总共120μl的离心血液上清液的血浆转移到Eppendorf管中，该管装有680μl含15％牛血清的抗凝的完全培养基[称为血浆培养基来自特定供体的15％血浆、在10％的抗凝血剂(ACD和肝素锂)和75％的完全培养基中]。剩余血浆以0.5μL等份贮藏。(2).通过密度离心制备M7NC级分细胞可重悬于含0.5mM EDTA的5mL PBS中。依照厂商说明通过Ficoll-Paque密度离心(Pharmacia)获得单核细胞(MINC)级分，用含15％牛血清的完全培养基洗涤，并在分级分离前悬浮在相同体积的完全培养基中，如血液。(3).制备与含有或不含有来自每一特定供体的15％血浆的完全培养基预温育的CAM 16-孔室载玻片在涂覆有基于TRITC-胶原的CAM的16-孔室载玻片(96-孔微量滴定板形式；Lab-Tek，Rochester，NY)的上面8个孔的每个孔中，接种100μl的完全培养基和10％的抗凝血剂。16孔室载玻片(96孔微量滴定板形式；Lab-Tek，Rochester，NY)的下面8个孔的涂覆基于TRITC-胶原的CAM的每个孔中，装入100μl完全培养基和10％的抗凝血剂，以及15％的个体血浆[该血浆培养基15％血浆来自特定供体，在10％抗凝血剂(CDA+肝素)中，根据步骤1制备]。(4).在CAM 16-孔室载玻片上MNC级分的培养接种100μl的细胞悬液(也适用于通过诸如CAM和Dynal AAMB的其它方法捕获的细胞)到涂覆有基于TRITC-胶原的CAM的16-孔室载玻片(96-孔微量滴定板形式；Lab-Tek，Rochester，NY)的每个孔中，其中业已充满了100μl含15％牛血清的完全培养基，并在CO2培养箱中于37℃下培养12-18小时。该步骤通过测定它们消化和内化荧光胶原片段的能力对肿瘤细胞进行标记。(5).用移液管小心地除去非粘附的细胞和上清液。非粘附的细胞由MNC级分中死亡的肿瘤细胞和非肿瘤细胞组成。(6).抗体和核酸染色添加200μl固定剂溶液(PBS，3.7％多聚甲醛，pH 7.2)到CAM标记室装置的每个孔中并在20-25℃下温育10分钟。除去固定剂并用200μl PBS洗涤试管3次，放置在冰上立即使用蓝色荧光Hoechst 33342核染料和绿色荧光FITC-抗-vonWillebrand因子(标记内皮表型)(用于荧光镜检)，和红色APAAP-抗-ESA(细胞角蛋白，EMA等上皮标记，造血细胞标记CD45/CD14/CD68/CD19/CD8，或其他内皮细胞标记CD31，fit-1，等)(用于DIC亮视野镜检)进行免疫标记。上述实验方案指定用于CTC检测。对于CEC和肿瘤相关的淋巴细胞的检测，抗-CD31和抗-CD45可分别用于标记CEC和肿瘤相关的淋巴细胞，接着用于产生cRNA探针。
实施例10CAM 96-孔细胞室方法富集的肿瘤细胞在实时RT-PCR和DNA微阵列分子分析中的应用
(1).通过密度离心制备MNC级分[与上述实施例7实验方案平行进行]使用存留在Vacutainer血液收集试管(BectonDickinson，绿色盖子，肝素锂作为抗凝血剂，每一试管容有7mL)中的3-15mL抗凝的血液。以1,000rpm旋转获得细胞沉淀并将细胞重悬于含0.5mM EDTA的5mL PBS中。依照厂商说明通过Ficoll-Paque密度离心(Pharmacia)获得单核细胞(MNC)级分，用含15％牛血清的完全培养基洗涤，并悬浮在3-15mL的完全培养基中。(2).在CAM 96-孔室载玻片上培养MNC级分接种100μl/孔的细胞悬液(也适用于通过诸如CAM和Dynal AAMB的其它方法捕获的细胞)到96-孔微量滴定板的其余88个孔中，这些孔涂覆有基于I型胶原的CAM，其中业已充满了100μl含15％牛血清的完全培养基，并在CO2培养箱中于37℃下培养12-18小时。(3).用移液管小心地除去非粘附的细胞及上清液，用200μl PBS洗涤孔2次，不要扰动内壁上的CAM膜，非粘附的细胞由MNC级分中死亡的肿瘤细胞和非肿瘤血细胞组成。可汇集悬浮的细胞并分离CD19白细胞或干细胞。(4).CAM-捕获的细胞的RNA分离添加10μL/孔Trizol试剂到业已彻底清洁的96-孔CAM血液装置88-孔中的每一孔中。使用Trizol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)抽提总RNA，接着在RNeasy旋转柱(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)上纯化。
实施例11使用细胞型抗体标记的免疫细胞化学用以确认细胞级分的纯度
使用细胞型抗体标记的免疫细胞化学被用于确认细胞级分的纯度。图5上面两个图显示了通过CAM从卵巢浆液性腺癌腹水中富集的白细胞(Leu)和肿瘤细胞(Epi)的免疫细胞化学鉴定，使用了抗CD45(一种全白细胞抗原)的抗体(左图，Leu，红色)，以及抗全细胞角蛋白(上皮抗原)的抗体(右图，Epi，红色)。下面两个图显示了先通过CAM富集再通过抗体EpCAM阳性选择的纯肿瘤细胞的免疫细胞化学鉴定。在此，用抗全细胞角蛋白抗体标记的肿瘤细胞居多(左图，Epi，红色)。注意一些EpCAM抗体-Dynal珠子在肿瘤细胞上可见。少量(2％)纯肿瘤细胞用抗CD31(一种内皮表面抗原)抗体标记(右图，Endo，红色)。细胞核被染成蓝色作为普遍的细胞标记，在用非离子型去污剂浸渍质膜后使用Hoechst 33342核染色来进行。(图片尺寸，331μm×239μm。)实施例12实时RT-PCR分析
实时RT-PCR分析可用于进一步解释一种或多种癌症的遗传原理。RT-PCR分析也可用于验证微阵列数据。定量实时RT-PCR被用于测定选自DNA微阵列簇的10种基因的表达，这些基因特异于纯化的63种细胞样品中具代表性的7种细胞群(图5A)。(A)在不同肿瘤细胞类型中5种正调节基因(MMP7，粘蛋白1，GA733-1，脂笼蛋白2和细胞角蛋白18)；白细胞中4种正调节基因(CD45，自分泌运动因子，CXCR4和SDF-1)；所有63种细胞样品中成纤维细胞(I型胶原)中的一种正调节基因的定量实时RT-PCR分析。(B)在7种细胞组中差异调节的10种基因的定量实时RT-PCR分析。条形图用于显示不同细胞组的典型基因表达模式，以及细胞组内和细胞组之间表达水平的波动。对于每个基因而言，相对表达与每组中数个细胞样品的平均倍数表达(对β-肌动蛋白归一化)进行比较。误差线(Error bars)，平均值的标准误差(SE of themeans)。通过CAM启动的细胞分离装置分离的4种不同类型的肿瘤细胞中，发现5种正调节基因在大多数富集自卵巢和子宫肿瘤标本的腺癌细胞样品中高表达(图6A-6C)。在针对肿瘤细胞、白细胞和成纤维细胞相关基因的不同类型细胞组之间的表达差异也可看出DNA微阵列数据与实时RT-PCR数据之间存在相似。这些结果表明大多数阵列探针组有可能准确地测定复杂的转录物混合物中期望转录物的水平。应当理解上述所公开的各种内容及它们的其他特征和功能或替换物可理想地组合成许多其他不同的系统或应用。同样地，应当理解目前各种未预见到的或不曾预料到的替换物、变型、变体或改进在此可随后为本领域技术人员所实施，其也意在为下列权利要求所包含。
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权利要求
1.一种用于从液体样品中分离靶细胞的装置，包括具有内表面和外表面的容器；细胞粘附基质，其包含与一种或多种细胞粘附分子缔合的非反应性芯材；其中所述细胞粘附基质涂覆在所述容器的所述内表面上。
2.权利要求1的装置，其中所述细胞粘附基质的非反应性芯材是选自明胶、交联的明胶、骨、玻璃、惰性聚合物和葡聚糖的材料中的至少一种。
3.权利要求1的装置，其中所述细胞粘附基质的所述细胞粘附分子是选自蛋白聚糖、纤连蛋白、纤维蛋白、肝素、层粘连蛋白、生腱蛋白、玻连蛋白、和/或其片段的至少一种分子。
4.权利要求1的装置，其中所述容器的内表面至少5％涂覆有所述的细胞粘附基质。
5.权利要求1的装置，还包括至少一种对所述靶细胞具有亲和性的配体，该配体当与所述靶细胞缔合时是可检测的。
6.权利要求5的装置，其中所述的配体是荧光标记的。
7.权利要求5的装置，其中所述配体整合到所述细胞粘附基质中。
8.权利要求5的装置，其中所述配体在与所述细胞粘附基质缔合的层中。
9.权利要求1的装置，还包括邻近所述细胞粘附基质的细胞分离机构，所述细胞分离机构被有效地构造成在所述靶细胞和所述细胞粘附基质相互作用前从含有所述靶细胞的样品中除去细胞。
10.权利要求9的装置，其中所述细胞分离机构是选自过滤器、膜、筛网、材料梯度的至少一种机构。
11.权利要求5的装置，其中至少一种配体被有效地配置以便容许对配体与分离的靶细胞相互作用进行可视检测。
12.一种使用权利要求1的装置的方法，包括将所述液体样品中细胞混合物与所述装置中所述细胞粘附基质接触；从所述细胞粘附基质上分离靶细胞。
13.权利要求12的方法，还包括从所述细胞粘附基质上除去未结合的细胞。
14.权利要求12的方法，其中所述液体样品是血样或腹水样品或活组织切片或刮片或涂片样品。
15.权利要求12的方法，其中所述细胞混合物包括在密度梯度离心或红细胞裂解后来自血样的单核细胞。
16.权利要求12的方法，其中所述靶细胞是肿瘤细胞、内皮细胞或胎儿细胞。
17.权利要求16的方法，其中肿瘤细胞来自肺癌、膀胱癌、乳房组织癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、乳癌、皮肤癌、肝癌、胃癌、食道癌、头颈癌、宫颈癌、子宫癌、脑癌、肾癌、甲状腺癌、结肠癌或直肠癌中的至少一种。
18.权利要求12的方法，其中靶细胞是内皮细胞或内皮祖细胞。
19.权利要求12的方法，其中靶细胞是获得自孕妇的胎儿细胞。
20.权利要求12的方法，其中所述细胞粘附基质包括珠子。
21.权利要求12的方法，其中所述细胞粘附基质包括荧光标记的细胞粘附基质成分。
22.权利要求12的方法，其中所述靶细胞包含侵袭伪足。
23.权利要求12的方法，其中靶细胞包括细胞粘附受体整联蛋白。
24.一个具有开口、底部和环绕的侧壁的容器，在所述容器的内表面上包含至少一涂层的细胞粘附基质，该涂层被有效地构造成在液体置于所述容器的开口中时与液体样品接触。
25.权利要求24的容器，其中所述容器选自微量滴定板、显微镜载玻片室、组织培养装置、细胞室装置、血液过滤装置、试管、瓶、或其组合。
26.权利要求21的荧光标记的细胞粘附基质，其中所述基质被用于标记血液中的癌细胞。
27.一种用于产前诊断疾病的方法，包括将来自孕妇的血样与细胞粘附基质接触，从所述细胞粘附基质上分离所述胎儿细胞，在培养基中培养所述胎儿细胞，以及检测所述胎儿细胞遗传和染色体异常的存在。
28.权利要求27的方法，其中遗传和染色体异常选自唐氏综合征、马凡氏综合征、Taysach氏病和地中海贫血。
29.权利要求27的方法，其中所述细胞粘附基质包括多个涂覆的珠子，该珠子包括非反应性芯材和围绕所述芯材的细胞粘附分子。
30.权利要求29的细胞粘附基质，其中所述非反应性芯是选自胶原微珠、明胶微珠和玻璃微珠、或其组合的至少一种材料。
31.权利要求30的容器，其中胶原标记有荧光染料。
32.一种用于体外诊断癌症的方法，包括将获得自患者的样品液体与包含血源性成分的细胞粘附基质接触；从所述样品液体的细胞中分离与所述基质粘附的转移性肿瘤细胞；培养与所述基质粘附的转移性肿瘤细胞一段预定时间；以及对所述培养物中所述转移性肿瘤细胞进行镜检和流式细胞术分析。
33.权利要求32的方法，其中所述方法还包括对转移性癌细胞进行免疫细胞化学操作和/或用标记的细胞粘附基质和核酸染料对所述癌细胞染色的步骤，以鉴别在所述样品液体中存在的癌细胞类型。
34.权利要求32的方法，其中所述方法还包括使用DNA微阵列分析和/或实时PCR定量上皮肿瘤基因标记以鉴定所述转移性肿瘤细胞。
35.权利要求34的方法，其中肿瘤基因标记是GA733-2、GA733-1、MMP7、粘蛋白1、脂笼蛋白2和细胞角蛋白18、E-钙粘蛋白-1、seprase、自体毒素和CXCR4。
36.一种具有液体入口和液体出口的过滤盒，包括邻接所述液体入口的预过滤器；邻接所述液体出口的后过滤器；以及包含细胞粘附基质的过滤室，所述过滤室位于所述预过滤器和所述后过滤器之间。
37.权利要求36的方法，其中所述预过滤器或所述后过滤器中之一与细胞粘附基质结合。
38.一种用于从液体样品中分离靶细胞的装置，包括具有一用以容纳所述液体样品的内表面和一外表面的容器；包括与具有细胞粘附基质的卡连接的盖子的浸量尺。
全文摘要
公开了用模拟转移性环境、心血管环境或胎盘环境的细胞粘附基质系统进行分离和诊断疾病的方法和装置。所述细胞粘附基质使从诸如血液的液体样品中富集诸如转移性肿瘤细胞、胎儿细胞和内皮祖细胞的靶细胞更容易，用于诊断和治疗患有诸如癌症、心血管和胎儿疾病的疾病的患者，和用于转移性疾病、心血管疾病和胎儿疾病的分子分析研究应用。在此描述了使用多重分子分析的用于循环肿瘤细胞和内皮细胞的细胞富集和检测的血液测试样机和方法。此外，在此也描述了用于确定具有癌症进展危险的患者中针对肿瘤的宿主免疫性的方法和组合物，以及分离来自孕妇的胎儿细胞富集级分用于产前诊断的方法。
文档编号C12Q1/68GK1922304SQ200480039363
公开日2007年2月28日 申请日期2004年10月30日 优先权日2003年10月31日
发明者陈文典, 陈力, 陈策 申请人:维特克公司