修饰的抗cd52抗体的利记博彩app

专利名称：修饰的抗cd52抗体的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及具体给予人类并具体用于治疗的多肽。该多肽是经修饰的多肽，通过这种修饰可导致其潜在的T细胞表位数减少，从而使该多肽在给予人后引发免疫应答的倾向降低。本发明具体涉及能与人白细胞CD52抗原反应从而使其潜在T细胞的表位数减少但保留结合CD52能力的抗CD52抗体的修饰。
背景技术：
有许多例子表明，治疗蛋白的效率会受到不希望有的与该治疗蛋白发生免疫反应的限制。一些小鼠单克隆抗体有望作为许多人类疾病的治疗剂，但在某些情况下由于诱导了显著的人抗鼠抗体(HAMA)应答而失效[Schroff等，(1985)Cancer Res.45879-885；Shawler等，(1985)J.Immunol.1351530-1535]。就单克隆抗体而言，已经开发了许多技术以试图降低这种HAMA应答[WOA8909622；EPA0239400；EPA0438310；WOA9106667；EPA0699755]。这些重组DNA方法通常是减少最终抗体构建物中的小鼠遗传成分同时增加最终构建物中的人遗传成分。但在一些情况下，所得“人源化”抗体仍会引起患者的免疫应答[Issacs J.D.(1990)Sem.Immunol.2449，456；Rebello等，(1999)Transplantation 681417-1420]。
抗体不是唯一的一类作为治疗剂给予后可对其产生免疫应答的多肽分子。人来源的蛋白质以及具有与人体内产生的氨基酸序列相同的序列的蛋白质甚至也可诱导人的免疫应答。著名的例子包括治疗用的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子[Wadhwa等，(1999)Clin.Cancer Res.51353-1361]和干扰素α2[Russo等，(1996)Bri.J.Haem.94300-305；Stein等，(1988)New Engl.J.M编，3181409-1413]。
诱导免疫应答的关键是蛋白质内存在可通过在MHC II类分子上呈递而激活T细胞的肽，即所谓的“T细胞表位”。这种T细胞表位通常定义为能够结合MHC II类分子的氨基酸残基序列。含蓄地说，“T细胞表位”指当结合MHC分子时可被T细胞受体(TCR)识别的表位，这种表位至少从原则上说可通过与TCR结合而活化这些T细胞从而促进T细胞应答。
MHC II类分子是一组高度多态性的蛋白质，它们在辅助T细胞选择和活化中起着核心作用。人白细胞抗原DR组(HLA-DR)是这组蛋白质优势同种型，然而，同种型HLA-DQ和HLA-DP也具有类似功能。在人群中，各个体带有2-4个DR等位基因、2个DQ和2个DP等位基因。已经揭示了许多DR分子的结构，它们的结构显示是具有多个疏水口袋的两端不封闭的肽结合槽，这些口袋可以容纳肽的疏水残基(口袋残基)[Brown等，Nature(1993)36433；Stern等，(1994)Nature 368215]。多态性可区分II类分子的不同同种异型，构成了肽结合槽内不同肽结合表面的广泛多样性，并在群体水平上确保了能识别外源蛋白质及产生对病原生物免疫应答的最大灵活性。
对治疗蛋白质的免疫应答通过MHC II类肽呈递途径而发生。此途径中外源蛋白质被内吞加工以与MHC II类分子的DR、DQ或DP类一起呈递。MHC II类分子通过巨噬细胞和树突细胞等专职性抗原呈递细胞(APC)表达。T细胞表面的同源T细胞受体与MHC II类肽复合体以及CD4分子等其它协同受体的交叉结合可诱导T细胞活化状态。活化导致释放细胞因子，这进一步激活B细胞等其它淋巴细胞产生抗体或活化的T杀伤细胞组成了全面的细胞免疫应答。
如WO98/52976和WO00/34317所述，鉴定T细胞表位是表位消除的第一个步骤。在这些教导中，通过利用感兴趣蛋白质内的明智氨基酸取代来除去预测的T细胞表位。除了计算机技术，还有测定合成肽结合MHC II类分子的能力的体外方法。一种示例性的方法采用MHC同种异型明确的B细胞系作为MHC II类结合表面的来源并且可用于MHC II类配体鉴定[Marshall等，(1994)J.Immunol.1524946-4956；O′Sullivan等，(1990)J.Immunol.1451799-1808；Robadey等，(1997)J.Immunol 1593238-3246]。然而，由于MHC同种异型的广泛多样性，这种技术不适合筛选多个潜在表位，而且它们也不能证实其结合性肽是否能作为T细胞表位。
近年已开始采用混有合成肽的重组MHC分子的可溶性复合物技术[Kern等，(1998)Nature Medicine 4975-978；Kwok等，(2001)TRENDS in Immunol.22583-588]。这些试剂和方法可用来鉴定人或实验动物外周血样品中是否存在的能够结合特定MHC-肽复合体的T细胞克隆但不适合筛选MHC同种异型广泛多样性的多个潜在表位。
如上文所述以及作为其推论，希望鉴定并除去或至少减少某给定的从原理上说有治疗价值但最初具有免疫原性的肽、多肽或蛋白质中潜在的T细胞表位。这些有治疗价值的分子之一是能特异性结合人白细胞CD52抗原的单克隆抗体。本发明的优选单克隆抗体是称为“CAMPATH”的大鼠抗体的修饰形式。本发明的一个目的是提供除去了一个或多个潜在T细胞表位的CAMPATH抗体的修饰形式。
CD52分子的分子量为21-28kDa，成熟蛋白质包含一12个氨基酸的肽，其N-连接的寡糖通过其糖磷脂酰肌醇锚结合于细胞膜。至少95％的人外周血淋巴细胞以及除精子之外的单核细胞/巨噬细胞系细胞上存在该抗原。它在红细胞、血小板、组织树突细胞或骨髓干细胞上不存在(Hale等，(1990)Tissue Antigens 35873；Buggins等，(2002)Blood，1001715)。
第一种CD52抗体是来用人淋巴细胞免疫大鼠而产生以尝试获得能活化补体可用于移植前去除供体骨髓中的T细胞的抗体[Hale等，(1983)Blood 62873-882]。主要的溶细胞抗体是抗CD52 IgM抗体。虽然可离体应用，但CD52 IgM(CAMPATH-1M)介导的补体活化在体内不能有效消除T细胞。通过同种型转换从IgG2a抗体克隆获得的大鼠IgG2b单克隆抗体CAMPATH-1G能结合人Fc受体、通过抗体介导的细胞毒性(ADCCD)引起细胞死亡在体内有效消除细胞[Friend等，(1991)Transplant.Proc.232253-2254；Hale等，(1998)Blood 924581-4590]。然而，CAMPATH-IG的应用受到患者体内产生的免疫应答的限制[Cobbold，J.S.(1990)J.Immunol.Methods 12719-24；Dyer，M.J.S.(1989)Blood 731431-1439]。为降低免疫原性，通过将Kabat超变区克隆入人NEW和Rei骨髓瘤蛋白提供的框架构建了一种人源化IgG1抗体-CAMPATH-1H[Riechmann等，(1988)Nature 332323-327]。虽然与CAMPTH-1G相比其免疫原性降低，但这种人源化抗体仍能引发一些患者的免疫应答。在治疗类风湿性关节炎的早期报道中，经静脉注射(i.v.)给药治疗一个疗程的8名患者未报道有抗球蛋白应答，但接受2个疗程CAMPATH-1H治疗的4名患者中3名出现了抗球蛋白抗体(Issacs等，(1992)Lancet，211103-06)。在随后类风湿性关节炎患者中进行的升高单剂量i.v.研究中，有63％的病人产生抗球蛋白应答，这是最初的抗独特型应答[Weinblatt等，(1995)Arthritis.Rheum.381589-1594]。所有10名接受皮下给予升高剂量CAMPATH-1H的类风湿性关节炎患者也报道有抗球蛋白应答(Schnitzer等，J.Rheumatol.(1997)241031-36)。
因此，需要提供能减少潜在的T细胞表位数而降低或消除病人中诱导免疫应答潜能的抗CD52抗体。预计这种蛋白质在病人中能显示循环时间增加，能提高对非修饰抗体的免疫应答，并且可能对慢性或复发性疾病如许多CAMPATH适应证病理特别有益。因此，本发明提供能减少潜在T细胞表位数的抗CD52抗体的修饰形式，预计其可显示免疫原性降低但仍基本保留了与亲代非修饰抗体效力相关的有益治疗特征。
本发明公开了在抗CD52抗体重链和轻链可变区序列中鉴定的序列，这些序列是具有MHC II类结合能力的潜在T细胞表位。
尽管其它文献也提供了抗CD52抗体分子，包括其“人源化”形式[美国专利5846543；6120766；6569430；WO0230460]，但这些描述都没有认识到T细胞表位对于蛋白质免疫原性的重要性，也没有考虑按照本发明的方案以特异性可控方式来直接影响其所述性能。
附图简述

图1描述了经修饰重链“camp VH”的一种示例性载体。dhfr是二氢叶酸还原性选择；CMV pro是CMVIE启动子；pA是多聚A；Amp R是氨苄青霉素抗性。
图2描述了经修饰重链“camp VL”的一种示例性载体。Neo是新霉素(G148)选择；CMV pro是CMV IE启动子；pA是多聚A；Amp R是氨苄青霉素抗性。
图3描述了修饰的重链可变区DIVHv1的DNA和氨基酸序列。
图4描述了修饰的重链可变区DIVHv2的DNA和氨基酸序列。
图5描述了修饰的重链可变区DIVHv3的DNA和氨基酸序列。
图6描述了修饰的重链可变区DIVHv4的DNA和氨基酸序列。
图7描述了修饰的重链可变区DIVHv5的DNA和氨基酸序列。
图8描述了修饰的轻链可变区DIVKv1的DNA和氨基酸序列。
图9描述了修饰的轻链可变区DIVKv2的DNA和氨基酸序列。
图10描述了修饰的轻链可变区DIVKv3的DNA和氨基酸序列。
图11描述了修饰的轻链可变区DIVKv4的DNA和氨基酸序列。
图12描述了修饰的轻链可变区DIVKv5的DNA和氨基酸序列。
图13描述了人IgG1恒定区的DNA和氨基酸序列。
图14描述了人κ恒定区的DNA和氨基酸序列。
图15小结了采用另一种树突细胞T细胞方案以修饰的DIVHv5/DIVKv2抗体进行初步研究的结果。
图16小结了人源化的CAMPATH 1H和修饰的DIVHv5/DIVKv2抗体的T细胞免疫原性(树突细胞T细胞测定)比较。用斯氏T检测比较了(*)和未处理对照的Cpm值(p＜0.05)。
发明概述和描述本发明提供了一种修饰的抗体，其能减少潜在的T细胞表位数而修饰免疫特性。本发明公开了在CAMPATH-1G重链和轻链可变区序列中鉴定到的可与MHC II类分子结合的潜在的T细胞表位。本发明公开了在人类中可能具有免疫原性的抗体可变区序列中的主要区域以及可消除或减少这些位点潜在免疫原性效力的修饰的序列。
一方面，本发明提供了对大鼠抗体CAMPATH-1G所识别的CD52抗原具有特异性的修饰的抗体分子，该分子中，CAMPATH-1G抗体可变区的一个或多个氨基酸被取代而降低了MHC II类分子对该区域衍生肽的识别。当用于本发明的修饰抗体时，术语“抗CD52抗体”和“CAMPATH抗体”表示这种修饰的抗体保留了与CD52结合能力的能力。本发明的实施方案包括一种抗CD52抗体，其重链可变区包含具有一个或多个表1所列取代的SEQ ID NO1的取代变体，该变体中的氨基酸残基编号即是它们在SEQ ID NO1中的编号，其轻链可变区包含具有一个或多个表2所列取代的SEQ ID NO2的取代变体，该变体中的氨基酸残基编号即是它们在SEQ ID NO1中的编号。一些实施方案中，所述抗CD52抗体的重链还包含人IgG1恒定区，其轻链还包含人κ恒定区。
表1-CAMPATH-1G重链可变区中潜在T细胞表位的取代(SEQ ID NQ1)
表2-CAMPATH-1G轻链中潜在T细胞表位的取代(SEQ ID NO2)
在各种实施方案中，在重链和/或轻链中产生了2个以上，或3个以上，或4个以上，或5个以上，或6个以上，或7个以上，或8个以上，或9个以上，或10个以上，或11个以上，或12个以上的氨基酸取代。一些实施方案中，在重链和/或轻链中产生了5-20个，或7-14个氨基酸取代。
一些实施方案中，所述抗CD52抗体的重链可变区包含具有一个或多个下述取代的SEQ ID NO1的取代变体，其中，氨基酸残基编号即是它们在SEQ ID NO1中的编号用Gln取代氨基酸残基3上的Lys；用Ala、Cys、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Lys、Pro、Arg、Ser或Thr取代氨基酸残基5上的Leu；用Arg、Gly、Pro、Leu取代氨基酸残基18上的Met；用Ala、Cys、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Asn、Asp、Met、Gln、Glu、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代氨基酸残基20上的Leu；用Asp、Asn、Glu、Gln、Gly、His、Lys、Pro、Arg、Ser、Thr取代氨基酸残基23上的Ala；用Val取代氨基酸残基37上的Ile；用Ala取代氨基酸残基40上的Pro；用Pro取代氨基酸残基41上的Ala；用Gly、His、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Trp、Tyr取代氨基酸残基44上的Ala；用Leu取代氨基酸残基45上的Pro用Ile或Val取代氨基酸残基48上的Leu用Ala、His、Ile、Pro或Ser取代氨基酸残基77上的Thr；用Lys取代氨基酸残基78上的Gln；用Ala、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr或Ser取代氨基酸残基80上的Met；用Ala、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser或Thr取代氨基酸残基82上的Tyr；用Ala、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser或Thr取代氨基酸残基85上的Met；用Ser取代氨基酸残基87上的Thr；用Val取代氨基酸残基95上的Thr；用Thr取代氨基酸残基115上的Val；用Thr、Phe、Ile、Leu、Pro、Val、Trp或Tyr取代氨基酸残基116上的Met；且其轻链可变区包含具有一个或多个下述取代的SEQ ID NO2的取代变体，该变体中，氨基酸残基编号即是它们在SEQ ID NO2中的编号用Gln取代氨基酸残基3上的Lys；用Ala、Asp、Asn、Glu、Gln、Gly、His、Lys、Pro、Arg、Ser或Thr取代氨基酸残基10上的Phe；用Pro或Ile取代氨基酸残基21上的Leu用Thr取代氨基酸残基22上的Asn用Arg取代氨基酸残基24上的Lys；用Asp、Asn、Gln、Glu、Gly、His、Lys、Pro、Arg、Ser或Thr取代氨基酸残基40上的Leu；用Lys取代氨基酸残基42上的Glu；用Ala取代氨基酸残基43上的Ser；
用Ser取代氨基酸残基46上的Leu；用Ala、Phe、Gly、Ile、Met、Pro、Ser、Trp或Tyr取代氨基酸残基56上的Thr；用Ala、Gly、Met、Pro或Val取代氨基酸残基58上的Ile；用Ala、Asp、Asn、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Iys、Pro、Arg、Ser、Thr取代氨基酸残基83上的Val；用Tyr取代氨基酸残基87上的Phe。
在本发明的一些实施方案中，该抗CD52抗体的重链可变区包含具有一个或多个下述取代的SEQ ID NO1的取代变体，该变体中的氨基酸残基编号即是它们在SEQID NO1中的编号用Gln取代氨基酸残基3上的Lys；用Gln取代氨基酸残基5上的Leu；用Leu取代氨基酸残基18上的Met；用Ile取代氨基酸残基20上的Leu；用Ser取代氨基酸残基23上的Ala；用Val取代氨基酸残基37上的Ile；用Ala取代氨基酸残基40上的Pro；用Pro取代氨基酸残基41上的Ala；用Gly取代氨基酸残基44上的Ala；用Leu取代氨基酸残基45上的Pro；用Ile或Val取代氨基酸残基48上的Leu；用Ala或Ser取代氨基酸残基77上的Thr；用Lys取代氨基酸残基78上的Gln；用Thr或Ser取代氨基酸残基80上的Met用His取代氨基酸残基82上的Tyr；用Ala取代氨基酸残基85上的Met；用Ser取代氨基酸残基87上的Thr；用Val取代氨基酸残基95上的Thr；用Thr取代氨基酸残基115上的Val；用Leu取代氨基酸残基116上的Met；且其轻链可变区包含具有一个或多个下述取代的SEQ ID NO2的取代变体，该变体中的氨基酸残基编号即是它们在SEQ ID NO2中的编号
用Gln取代氨基酸残基3上的Lys；用Ser取代氨基酸残基10上的Phe；用Ile取代氨基酸残基21上的Leu；用Thr取代氨基酸残基22上的Asn；用Arg取代氨基酸残基24上的Lys；用Pro取代氨基酸残基40上的Leu用Lys取代氨基酸残基42上的Glu；用Ala取代氨基酸残基43上的Ser；用Ser取代氨基酸残基46上的Leu；用Ser取代氨基酸残基56上的Thr；用Val取代氨基酸残基58上的Ile；用Ile取代氨基酸残基83上的Val；用Tyr取代氨基酸残基87上的Phe。
在本发明的再一方面，提供能减少潜在T细胞表位数的变体单克隆抗体，所述变体包含重链可变区和轻链可变区的组合，所述重链可变区包含选自从SEQ ID NO3到SEQ ID NO7或从SEQ ID NO13到SEQ ID NO40的序列，所述轻链可变区包含选自从SEQ ID NO8到SEQ ID NO12或从SEQ ID NO41到SEQ ID NO70的序列。在一些优选的实施方案中，本发明提供了能减少潜在T细胞表位数的变体单克隆抗体，所述变体包含重链可变区和轻链可变区的组合，所述重链可变区包含选自从SEQ ID NO3到SEQ ID NO7的序列，所述轻链可变区包含选自从SEQ ID NO8到SEQ ID NO12的序列。一些实施方案中，所述抗CD52抗体还包含人IgG1恒定区和人κ恒定区。在进一步的实施方案中，所述包含人IgG1恒定区和人κ恒定区的抗CD52抗体的重链可变区含SEQ ID NO4，而其轻链可变区含SEQ ID NO12，或重链可变区含SEQ ID NO7而轻链可变区含SEQ ID NO12，或重链可变区含SEQID NO7而轻链可变区含SEQ ID NO10，或重链可变区含SEQ ID NO3而轻链可变区含SEQ ID NO10，或重链可变区含SEQ ID NO6而轻链可变区含SEQ ID NO10。
本发明还包括一种上述特定分子，该分子中所述氨基酸残基的改变是特定位置上用其它氨基酸残基取代、加入或删除原本存在的氨基酸残基；一种上述特定分子中，如果需要，通常通过对特定氨基酸进行取代、加入或删除来进行其它改变以恢复所述分子的生物活性；一种上述特定分子中的改变是在一个或多个残基上进行的，所述残基是以下序列(A)-(S)的任何一种或所有的连续残基串，其中所述序列衍生自该分子的CAMPATH-1G抗体可变区序列，序列用单字母代码；A.＝KLLESGGGLVQPG；B.＝GLVQPGGSMRLSC；C.＝GSMRLSCAGSGFT；D.＝DFYMNWIRQPAGK；E.＝MNWIRQPAGKAPE；F.＝FTISRDNTQNMLY；G.＝QNMLYLQMNTLRA；H.＝MLYLQMNTLRAED；I.＝LQMNTLRAEDTAT；J.＝NTLRAEDTATYYC；K.＝DYWGQGVMVTVSS；L.＝PSFLSASVGDRVT；M.＝ASVGDRVTLNCKA；N.＝DRVTLNCKASQNI；O.＝KYLNWYQQKLGES；P.＝QKLGESPKLLIYN；Q.＝TGIPSRFSGSGSG；R.＝SSLQPEDVATYFC；S.＝EDVATYFCLQHIS。
本发明的一个方面是含有经修饰而潜在的T细胞表位数减少并具有结合CD52能力的修饰的CAMPATH-1G分子的药物组合物，该组合物中含有药学上可接受的载体。
本发明的另一方面是含有编码本发明经修饰的重链或轻链的核酸序列的表达载体。一些实施方案中，该表达载体包含编码重链可变区的核酸序列，所述可变区包含潜在T细胞表位数减少并操作性连接于表达控制序列的SEQ ID NO1的取代变体。在不同实施方案中，所述表达载体包含选自SEQ ID NO71至SEQ ID NO75以及SEQ ID NO81至SEQ ID NO108或其简并变体的核酸序列。与多核苷酸有关的简并是指本领域所熟知的许多氨基酸的遗传密码可由一个以上密码子来确定的这一事实。简并造成20种不同氨基酸可由四个不同碱基的64种可能的三联序列来编码。一些实施方案中，该表达载体包含编码轻链可变区的核酸序列，所述可变区包含潜在T细胞表位数减少并操作性连接于表达控制序列的SEQ ID NO2的取代变体。在不同的实施方案中，所述表达载体包含选自SEQ ID NO76至SEQ ID NO80以及SEQ ID NO109至SEQ ID NO138或其简并变体的核酸序列。本发明重链的合适表达载体的一个例子见图1，本发明轻链的合适表达载体的一个例子见图2。本发明的另一方面是含有一种或多种上述载体的培养细胞。本发明的再一方面是制备免疫球蛋白的方法，该方法在合适的表达控制序列的控制之下允许表达的条件下培养上述细胞，并从所述细胞的培养基中纯化免疫球蛋白。
本发明的其它方面是治疗方法。其实施方案包括治疗恶性淋巴瘤的方法，该方法包括给予患者有效量的本发明所述的修饰抗体。一些实施方案中，所述恶性淋巴瘤是白血病或淋巴瘤。其它实施方案包括治疗患者自身免疫病的方法，该方法包括给予有效量的本发明所述的修饰抗体。在不同的实施方案中，所述自身免疫病是多发性硬化、类风湿性关节炎、全身性血管炎(systemic vasiculitis)、葡萄膜炎、炎性肠病或硬皮病。
实施方案还包括在器官移植之前或之后免疫抑制患者的方法，该方法包括给予所述患者有效量的本发明所述的抗体。一些实施方案中，所述器官移植是肾移植。
当提及“基本上无免疫原性”或“降低的免疫原性潜能”时包括与亲代抗体，即非修饰的鼠类或嵌合性(鼠类可变区，人恒定区)单克隆抗体或人源化单克隆抗体CAMPATH-1H相比，其免疫原性降低。术语“免疫原性”包括能够在宿主动物中引起、诱导或促进体液应答和/或T细胞介导应答，这里所述的“宿主动物”具体指人，或者能够在本文所述的树突细胞/T细胞试验等合适的体外试验中引发应答反应。
本发明的修饰抗体的一个优选特征是它们基本上保留了非修饰或“亲代”抗体CAMPATH-1G或人源化抗体CAMAPATH-1H的功能活性。因此，本发明的实施方案包含的修饰抗体具有一个或多个与CAMPATH-1H或亲代非修饰抗体的治疗效率有关的有益治疗特征。这种修饰抗体可用于人类的许多重要疾病，具体包括白血病和淋巴瘤等恶性淋巴瘤，包括但不限于多发性硬化、类风湿性关节炎、全身性血管炎、葡萄膜炎、炎性肠病和硬皮病等自身免疫病，也可用于移植。
因此，本发明的修饰抗体显示能结合CD52，在优选的实施方案中，与其靶抗原CD52的亲和力在数量级上高于或低于单克隆抗体CAMPATH-1H所显示的亲和力。
据信，亲代分子的治疗效率也是由该抗体能够诱导依赖于抗体的细胞介导细胞毒性(ADCC)和依赖于补体的细胞毒性(CDC)所介导的。ADCC和CDC现象是由完整抗体分子的重链恒定区所介导，本发明打算制造完整的抗体分子，其中包含与ADCC和CDC诱导相容的恒定区。在优选的实施方案中，所述修饰的抗体包含人IgG1恒定区和人κ恒定区。
“抗体”指免疫球蛋白家族中的一种蛋白质，它能够与抗原组合、相互作用或者缔合。术语“抗原”在本文中指一种能够与抗体相互作用的物质，在本发明中指CD52。
术语“免疫球蛋白”在本文用来表示一种由一个或多个由免疫球蛋白基因编码的多肽组成的蛋白质。已知的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、σ、ε和μ恒定区基因以及天然的多种免疫球蛋白可变区基因。免疫球蛋白的一种天然形式是含有两对相同的四聚体，其中每一对具有一条轻链和一条重链。在每一对中，重链和轻链可变区一起提供能与抗原相互作用的结合表面。术语Vh本文用来表示重链可变区，术语Vk本文用来表示轻链可变区，此时和多数单克隆抗体一样，轻链是“κ”型链。
文中，Vh指长度约为110-125个氨基酸残基的多肽，其序列与这里的任何特定Vh链相一致，Vh与Vk组合而能结合CD52抗原。类似地，Vk指长度约为95-130个氨基酸残基的多肽，其序列与这里的任何特定Vk链相一致，Vk与Vh组合而能结合Cd52抗原。全长免疫球蛋白重链的分子量约为50kDa，由N-末端Vh基因和C-末端一个恒定区基因(例如，γ)编码。类似地，全长轻链的分子量约为25kDa，由N-末端可变区基因和C-末端κ或λ恒定区基因编码。
除了完整抗体(四聚体)，免疫球蛋白可以用重组DNA技术或蛋白质生物化学技术衍生的多种其它形式存在。这些形式包括，例如，Fv、Fab、Fab’和(Fab)2分子都含有本发明的任何一种Vh或Vk序列。进一步的例子可包括“双特异性”抗体，该抗体含有本发明的Vh/Vk组合与具有不同抗原特异性的第二种Vh/Vk组合的组合。
按本发明的理解，术语″潜在的T细胞表位″指具有结合MHC II类分子潜能的氨基酸序列。这种序列可刺激T细胞和/或结合(无需具有可测活性)含MHC II类分子复合物的T细胞。
术语“肽”在文中和附加的权利要求中用来表示一种含有两个或多个氨基酸的化合物。氨基酸通过肽键(在下文定义)连接在一起。有20种不同的天然氨基酸参与肽的生物合成，它们中的任何一些可以任何顺序连接在一起形成肽链或肽环。用于肽的生物合成的天然氨基酸都具有L-构型。可采用常规合成方法用L-氨基酸、D-氨基酸或两种不同构型氨基酸的不同组合来制备合成肽。一些肽仅含有少数氨基酸单元。短肽，例如氨基酸单元数小于10，有时称为“寡肽”。其它的肽含有大量氨基酸残基，例如多达100个或更多，它们称为“多肽”。常规上，″多肽″可认为是含有三个或更多氨基酸的任何肽链，而“寡肽”通常认为是特定类型的“短”多肽。因此在本文中，当提及“多肽”时应理解为也包括寡肽。此外，当提及“肽”时包括多肽、寡肽和蛋白质。氨基酸的各种不同排列形成了不同的多肽或蛋白质。可形成的多肽数目实际是无限的，因此不同蛋白质的数目亦是如此。
本发明形成修饰的抗CD52抗体的通用方法包括以下步骤(a)测定该多肽或其一部分的氨基酸序列。
(b)用各种方法鉴定蛋白质氨基酸序列中的一个或多个潜在的T细胞表位，包括采用体外或计算机技术或者生物测定法确定该肽能够与MHC分子结合。
(c)设计含有所鉴定的潜在T细胞表位中经修饰的一个或多个氨基酸的新序列变体，通过体外或计算机技术或生物测定法测定，这种修饰大大减少或消除了该肽与MHC分子的结合能力。可用这种方法产生此类序列变体以避免用序列变化形成新的潜在T细胞表位，除非此类新的潜在T细胞表位又经这种方式修饰而大大减少或消除该肽与MHC II类分子的结合能力。
(d)通过重组DNA技术构建这类序列变体并检测所述变体以鉴定具有所需特性的一种或多种变体。
可按照本领域已述的方法来鉴定步骤(b)所述的潜在T细胞表位。合适的方法描述在WO98/59244；WO00/34317；美国申请20030153043，所有文献纳入本文作为参考。
实践中可制造许多抗CD52变体抗体和检测它们是否具有所需的免疫和功能特征。当改变蛋白质序列时特别重要的是要考虑这些变化是否会引入新的免疫原性表位。在实践中可通过采用合适的方法再检测所考虑的序列中是否存在表位和/或MHCII类配体。
在不同的实施方案中，可通过表达本文所述Vh和Vk基因的不同组合来产生本发明的修饰抗体。重链和轻链的所有这种组合都包括在本发明之内。
本发明涉及一种抗CD52抗体，其中该分子可变区内的诸位置上已经有至少一个氨基酸残基取代，而导致该蛋白质中一个或多个潜在的T细胞表位消除。最宜提供其中的氨基酸修饰(例如，取代)是在亲代分子免疫原性最强的区域内进行修饰的抗体分子。本发明的不同实施方案包括修饰的抗体分子，对该分子的任何MHC II类配体都已改变从而消除了该肽的结合或者减少该肽可结合的MHC同种异型数目。发明者发现并在本文中公开了人CAMPATH抗体分子的免疫原性区域。应理解，在某些情况下，除了本文所公开的序列区域，其它区域也可变为免疫原性表位，例如当受到能表达具有与所述情况类似序列的蛋白质或肽的病原体感染时。
MHC II类表位的去除包括氨基酸取代而产生潜在T细胞表位缺失的修饰变体。预计在该肽序列内的合适位点上进行氨基酸取代可大大减少或消除不需要的潜在T细胞表位活性。表1和2提供了关于这方面来特别有用的取代的例子，其中表1涉及Vh区取代而表2涉及Vk区取代。
本领域技术人员知道，为除去不需要的表位可进行多组可选的取代。然而，所产生的序列应广泛保留与本文所述特定组合物的同源性，因此仍在本发明的范围之内。就其最小同源性区域而言，这些序列与特定序列的同源性约为70％，或约90％，或约95％，或约99％或更高，因此在操作上仍是等价的。这种序列也在本发明的范围之内。
应理解，某给定的潜在T细胞表位内的单个氨基酸取代是最优选的消除该表位的方法。可考虑在单个表位内进行取代组合，例如，当各确定的表位相互重叠时这将特别适合。此外，就MHC II类结合槽而言，可在“口袋残基”之外的位置上进行某给定表位内的单个氨基酸取代或单个表位内氨基酸的组合取代，但在肽序列内的任何位点上。所有这种取代都在本发明的范围之内。
只要在本发明涉及的经修饰的抗CD52抗体内，含有这种修饰抗体或修饰抗体片段的组合物和相关组合物也应认为属于本发明的范围之内。因此，本发明考虑可采用和生产例如抗体的Fv、Fab、Fab’和F(ab’)2片段。这种片段可通过标准方法制备[例如Coligan等，Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons 1991-1997，纳入本文作为参考]。本发明还考虑从本领域熟知的抗体分子种类衍生的各种重组形式的抗体。所述种类包括稳定的Fv片段，其中包括含有连接Vh和Vk区域的肽接头的单链Fv形式(例如，scFv)，或通过链间二硫键而稳定的Fv(dsFv)以及经工程构而含有额外半胱氨酸残基有利于Vh和Vk区域结合的Fv片段。同样，其它组合物也是本领域熟悉的可包括称为“微体”的和单个单可变区“dAbs”的抗体。其它种类也包括能提高修饰的抗体可变区效价的方法，即具有多个抗原结合位点的抗体，例如通过构建二聚结构域(例如“亮氨酸拉链”)或者化学修饰方法。
在本发明的方案下提供了许多不同的重链可变区和轻链可变区序列。本发明公开的内容对可用来构建完全抗体分子的重链和轻链可能组合没有任何限制。可通过本领域熟知的重组DNA技术以及纯化和操作抗体分子的方法来构建完全的抗体分子。以下文献中阐述了必需的技术“Molecular CloningALaboratory Manual”，第二版，(Sambrook等，1989)；″Oligonucleotide Synthesis″(M.J.Gait编，1984)；″Animal CellCulture″(R.I.Freshney编，1987)；″Methods in Enzymology″(Academic Press，Inc.)；″Handbook of Experimental Immunology″(D.M.Weir & C.C.Blackwell编)；″GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells″(J.M.Miller & M.P.Calos编，1987)；″CurrentProtocols in Molecular Biology″(Ausubel等编，1987)；″PCRThe Polymerase ChainReaction，″(Mullis等编，1994)；″Current Protocols in Immunology″(Coligan等编，1991)。
可用几种方法之一制备本发明的优选分子，但最优选用常规的重组方法来制备。较容易的方法是利用本文提供的蛋白质序列和信息来推导编码任何优选抗体可变区的多核苷酸(DNA)序列。例如，这可用DNAstar成套软件[DNAstar Inc，Madison，WI，USA]或类似的计算机软件工具来完成。任何能编码本发明优选多肽或其重要同源物的DNA序列都应认为是本发明的实施方案。
一种通用方法是通过基因合成制备Vh或Vk链基因之一将它们克隆入合适的表达载体中。然后将该表达载体引入宿主细胞并选择和培养细胞。不难从培养基中纯化抗体分子并将其配制成适合治疗给药的制品。
一个非限制性的例子是，一种这样的方法包括采用一组合成的寡核苷酸进行基因合成。通过连接酶链式反应(LCR)装配这些基因，其中，使具有互补末端的多核苷酸退火，然后用聚合酶链式反应(PCR)扩增并补平。加入浓度升高的侧翼寡核苷酸作为引物进行PCR。将通过PCR从含有5’和3’免疫球蛋白基因侧翼区域的载体产生的PCR产物装配成全长抗体基因亚克隆入表达载体中表达完整的抗体。装配的Vh和Vk基因可作为模板进行诱变和构建多个变体抗体序列，如本文所述的任何序列。采用Higuchi等描述的“重叠衍生PCR”法特别方便[1988，Nucleic Acids Res.167351]，虽然也可容易地使用其它方法和系统。
最方便的是用重叠PCR来装配含有可变区盒的全长免疫球蛋白基因，将其亚克隆入含有所需免疫球蛋白恒定区的表达载体中。例如可采用电穿孔技术将所述表达载体引入哺乳动物或其它宿主细胞中。NS0细胞系是一种获自动物细胞培养物欧洲保藏所(European Collection of Animal Cell Cultures，ECACC)的不产生免疫球蛋白的小鼠骨髓瘤，是特别合适的宿主细胞系例子。增殖分泌抗体的细胞系，例如，可采用蛋白A亲和层析方便地纯化抗体[Harlow & Lane，同上]。可用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测感兴趣抗体的人κ恒定区从而确定纯化的抗体的浓度。
本发明的其它方面涉及用所述修饰抗体组合物治疗病人的方法。为了个体给药，应制备纯度宜至少为80％无热原及其它杂质的任何修饰的抗体组合物。还应理解，所述修饰抗体蛋白的治疗组合物可与药学上可接受的赋形剂联用。本发明的药物组合物可用常规方法制备，包括药物学上常用的物质，例如，Remington′s PharmaceuticalSciences(Alfonso R.Gennaro编，第18版，1990)所述，包括赋形剂、载体、佐剂和缓冲剂。所述组合物可通过以下途径给药，例如肠胃外、肠内、肌内、皮下、静脉内或可实现疗效的其它途径。例如，抗CD52抗体可静脉内给予(Cloes等，(1999)Ann.Neurol.，46296-304；Moreau等，(1996)Multiple Sclerosis，1357-65；Moreau等，(1994)Lancet，344298-301，所有文献被纳入本文作为参考)及皮下给予(Schnitzer等，(1997)J.Rheumatol.，241031-6；Bowen等，(1997)Br.J.Hematol.，96617-9，这两份文献被纳入本文作为参考)。常规赋形剂包括药学上可接受的适合肠胃外、肠内和其它途径给药的不含与该制剂发生有害反应的有机或无机载体。就肠胃外应用而言，特别合适的是可注射的无菌溶液，优选油性或水性溶液，以及悬浮液、乳液或植入物，包括栓剂。安瓿也是常用的单位剂量。所述药物制品可以是无菌的，如果需要，可以和不会与该活性化合物发生有害反应的稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂或其它物质混合。
在本发明的方法中，本发明所用的抗CD52抗体的确切剂量取决于各种因素，包括待治疗疾病的类型和严重程度以及所选择的其它治疗方法。关于剂量方案的指导可从本领域已知的CAMPATH-1H的剂量获得。
示例性实施例实施例1-抗CD52抗体VH和VK基因的构建从进入数据库衍生得到大鼠抗CD52抗体的重链可变区(VH)序列为RNIGHCC1G，轻链可变区(VK)序列为RNIGKCC1G。略微修饰这两个序列除去内部HindIII和BamHI位点但不改变氨基酸序列。通过基因合成制备VH和VK基因。简言之，设计并合成了一组合成的寡核苷酸。通过连接酶链式反应(LCR)装配此二基因，其中，使具有互补末端的寡核苷酸退火，然后用聚合酶链式反应(PCR)扩增并补平。加入浓度升高的侧翼寡核苷酸作为引物进行PCR。将通过PCR从含有5’和3’免疫球蛋白基因侧翼区域的载体产生的PCR产物装配成全长抗体基因，亚克隆入表达载体以表达完整抗体。装配Vh和Vk基因可作为模板进行诱变和构建已除去潜在T细胞表位的多个变体抗体序列。
为装配VH基因，使用了表3详细列出的寡核苷酸VH1-VH20。为装配VK基因，使用了表4详细列出的寡核苷酸VK1-VK20。对于这两种基因，将20μl磷酸化的寡核苷酸和1μl Pfu DNA连接酶(Stratagene，Amsterdam，NL)、10μl 10X反应缓冲液(补充了酶)和69μl水混合进行LCR。将反应混合物置于热循环仪中95℃培育2分钟，然后进行25轮循环，每轮95℃ 30秒，渐冷至50℃，50℃培育30秒，然后55℃ 20分钟，最后55℃培育3小时。用1％琼脂糖凝胶电泳分析LCR样品得到的胶能看到正确大小的暗条带。所有的寡核苷酸都购自Sigma-Genosys(Pampisford，UK)并在体外用T4DNA激酶(Promega，Southampton，UK)按照供应商推荐的方法磷酸化。LCR之后将5μL反应物转移到PCR混合物中以扩增该装配的片段。用寡核苷酸VH1和VH20来驱动VH反应，用寡核苷酸VK1和VK20来驱动VK反应。PCR的总体积为50μl，用1μl Pfu DNA聚合酶(Stratagene，Amsterdam，NL)总共进行30轮循环。用1％琼脂糖凝胶电泳分析PCR样品得到380bp的VH条带和377bp的VK条带。
用重叠PCR装配可变区盒。简言之，用衍生自载体M13-VHPCR1和M13-VKPCR1[Orlandi等，(1989)，PNAS，893833-7]的DNA作为模板来制造各VH和VK链的其它两个重叠的PCR片段，该片段中含有编码前导信号肽的5’侧翼序列和包含剪切位点和内含子序列的3’侧翼序列。通过PCR，用获得全长DNA序列所需的侧翼引物使如此制备的VH和VK的DNA片段相结合。用于这些“连接”反应的引物对为，寡核苷酸VHVK5’CHO/VHVK3’SIG和VH19/VH12用于VH基因，寡核苷酸VHVK5’CHO/VHVK3’SIG和VK19/VK3’CHO用于VK基因。
用Qiagen(Crawley，UK)PCR PREP试剂盒纯化后用HindIII和BamHI(Promega，Southampton，UK)切割PCR产物在1％琼脂糖凝胶上跑电泳。切取所需条带并用Qiagen(Crawley，UK)DNA提取试剂盒纯化。将产物克隆入用HindIII和BamHI切割的pUC19载体中并确认DNA序列。
表3-合成VH基因的寡核苷酸
表4-合成VK基因的寡核苷酸
构建了由连接于人IgG1[Takahshi等，(1982)Cell 29671]或κ[Heiter等，(1980)Cell 22197]恒定区的大鼠抗CD52可变区组成的嵌合性重链和轻链表达载体。然后将这些组合抗体基因转移到表达载体中以制造重组抗体。所述抗体基因在人巨细胞病毒立即早期启动子控制之下。所述重链载体包含dhfr基因而轻链载体包含neo基因可在哺乳动物细胞内选择。证实这种嵌合表达载体中VH和VK的DNA序列是正确的。
实施例2-修饰抗体VH和VK基因的构建用实施例1中产生的大鼠抗CD52可变区盒作为模板通过PCR诱变构建了修饰的VH和VK基因。表5列出了用于制造修饰的VH的寡核苷酸。以下突变用残基的Kabat数和括号中的与分别鉴定的多肽酸序列有关的线性数表示。DIVHv1(多肽SEQ ID NO3；多核苷酸SEQ ID NO71)包括突变K3Q(3)、M18L(18)、I37V(37)、P40A(40)、A41P(41)、A44G(44)、P45L(45)、L48V(48)、T74S(77)、Q75K(78)、M77T(80)、T82bS(87)、T89V(95)、V107T(115)、M108L(116)，使用寡核苷酸VHVK5’CHO、DIVH1、DIVH2、DIVH3、DIVH4、DIVH5、DIVH6、DIVH7、DIVH8、DIVH9、DIVH10和VH12。DIVHv2(多肽SEQ ID NO4；多核苷酸SEQ ID NO72)包括突变K3Q(3)、M18L(18)、A41P(41)、L48I(48)、T74S(77)、Q75K(78)、M77T(80)、T82bS(87)、T89V(95)、V107T(115)、M108L(116)，使用寡核苷酸VHVK5’CHO、DIVH1、DIVH2、DIVH3、DIVH4、DIVH5A、DIVH6A、DIVH7、DIVH8、DIVH9、DIVH10和VH12。DIVHv3(多肽SEQ ID NO5；多核苷酸SEQ ID NO73)包括突变L5Q(5)、L20I(20)、A23S(23)、A41P(41)、A44G(44)、L48I(48)、M77T(80)、Y79H(82)、M82A(85)、T89V(95)、V107T(115)、M108T(106)，使用寡核苷酸VHVK5’CHO、DIVH11、DIVH12、DIVH13、DIVH14、DIVH15、DIVH16、DIVH17、DIVH18、DIVH19、DIVH20和VH12。DIVHv4(多肽SEQ ID NO6；多核苷酸SEQ ID NO74)包括突变K3Q(3)、M18L(18)、I37V(37)、P40A(40)、A41P(41)、A44G(44)、P45L(45)、L48V(48)、T74A(77)、Q75K(78)、M77S(80)、T82bS(87)、T89V(95)、V107T(115)、M108L(116)，使用寡核苷酸VHVK5’CHO、DIVH1、DIVH2、DIVH3、DIVH4、DIVH5、DIVH6、DIVH7、DIVH8、DIVH9、DIVH10、DIVH21、DIVH22和VH12。DIVHv5(多肽SEQ ID NO7；多核苷酸SEQ ID NO75)包括突变K3Q(3)、M18L(18)、A41P(41)、T74S(77)、Q75K(78)、M77T(80)、T82bS(87)、T89V(95)、V107T(115)、M108L(116)，使用寡核苷酸VHVK5’CHO、DIVH1、DIVH2、DIVH3、DIVH4、DIVH23、DIVH6A、DIVH7、DIVH8、DIVH9、DIVH10和VH12。
表5-用于构建修饰的抗CD52VH的寡核苷酸
表6列出了用于制造修饰的VK的寡核苷酸。以下突变用残基的Kabat数表示，与分别鉴定的多肽序列的线性数相同。DIVKv1(多肽SEQ ID NO8；多核苷酸SEQ IDNO76)包括突变K3Q、F10S、L21I、N22T、K24R、L40P、E42K、S43A、L46S、T56S、I58V、V83I、F87Y，使用寡核苷酸VHVK5’CHO、DIVK1、DIVK2、DIVK3A、DIVK4A、DIVK5B、DIVK6、DIVK7、DIVK8A、DIVK9、DIVK10和VK3’CHO。DIVKv2(多肽SEQ ID NO9；多核苷酸SEQ ID NO77)包括突变K3Q、F10S、L21I、N22T、L40P、E42K、S43A、I58V、V83I、F87Y，使用寡核苷酸VHVK5’CHO、DIVK1、DIVK2、DIVK3、DIVK4、DIVK5、DIVK6、DIVK7、DIVK8、DIVK9、DIVK10和VK3’CHO。DIVKv3(多肽SEQ ID NO10；多核苷酸SEQ ID NO78)包括突变K3Q、F10S、L21I、N22T、K24R、L40P、E42K、S43A、T56S、I58V、V83I、F87Y，使用寡核苷酸VHVK5’CHO、DIVK1、DIVK2、DIVK3A、DIVK4A、DIVK5、DIVK6、DIVK7、DIVK8A、DIVK9、DIVK10和VK3’CHO。DIVKv4(多肽SEQ ID NO11；多核苷酸SEQ ID NO79)包括突变K3Q、F10S、L21I、N22T、L40P、E42K、S43A、L46S、I58V、V83I、F87Y，使用寡核苷酸VHVK5’CHO、DIVK1、DIVK2、DIVK3、DIVK4、DIVK5B、DIVK6、DIVK7、DIVK8、DIVK9、DIVK 10和VK3’CHO。DIVKv5(多肽SEQ ID NO12；多核苷酸SEQ ID NO80)包括突变K3Q、F10S、L21I、N22T、L40P、E42K、I58V、V83I、F87Y，使用寡核苷酸VHVK5’CHO、DIVK1、DIVK2、DIVK3、DIVK4、DIVK5A、DIVK6A、DIVK7、DIVK8、DIVK9、DIVK 10和VK3’CHO。
表6-用于构建修饰的抗CD52VK的寡核苷酸
将制得的修饰的VH和VK表达盒作为从HindIII到BamHI的片段(分别将DIVHYv1-DIVHv5的DNA和氨基酸序列示于图3-图7，DIVKv1-DIVKv5的DNA和氨基酸序列示于图8-图12)克隆入质粒载体pUC19中，证实每个修饰的VH和VK的完整DNA序列是正确的。
将修饰的VH和VK表达盒分别连接于人IgG1(SEQ ID NO139；图13)[Takahashi等，(1982)Cell 29671]和κ(SEQ ID NO140；图14)[Heiter等，(1980)Cell 22197]的恒定区。然后将这些组合抗体基因转移到表达载体中以制造重组抗体。所述抗体基因在人巨细胞病毒立即早期启动子控制之下。所述重链载体包含dhfr基因而轻链载体包含neo基因可在哺乳动物细胞内选择。证实该表达载体中VH和VK的DNA序列是正确的。
实施例3-抗CD52抗体的表达、纯化和定量用于抗体表达的宿主细胞系获自英国Porton的动物细胞培养物欧洲保藏所的CHO dhFr-(ECACC No 94060607)。通过电穿孔将重链和轻链表达载体共转染入CHO细胞中。在不含核苷但添加有10％经渗析的胎牛血清和400μg/ml遗传霉素(G-418硫酸盐)(都购自Gibco，Paisley，UK)的Iscove改进的Dulbecco培养基(IMDM)中培养选择表达neo和dhfr基因的菌落。用ELISA筛选转染的细胞克隆以制造人IgG的人抗体[Tempest等，(1991)BioTechnology 9266]。扩增分泌抗体的细胞系，选择最高生产细胞冻存在液氮中。所述抗CD52抗体用Prosep-A(Bioprocessing Ltd)按照制造商的说明纯化。用ELISA测定人IgG1κ抗体的浓度。
测定在96孔板上进行，所有测定一式两份。对于ELISA测定，平板(DynatechImmulon 2)用每孔100μl碳酸盐/碳酸氢盐包被缓冲液pH9.6(Sigma，Poole，UK)1250稀释的羊抗人κ抗体(The Binding Site，Birmingham，UK)包被。37℃包被1小时，各孔用PBST(含有0.05％ Tween 20的PBS)洗涤三次。在每个孔中加入100μL PBST并设置对照和测试抗体的稀释液。阴性对照仅用PBST不加抗体。标准抗体(人IgG1/κ纯化的骨髓瘤蛋白，The Binding Site，UK)用PBST稀释成2μg/ml。在第一列的复孔中加入100μL(最终浓度为1μg/ml)并在平板上作二倍稀释。测试抗体制品也进行二倍系列稀释。将平板室温培育1小时并如上洗涤各孔。用与过氧化物酶偶联的羊抗人IgGγ链特异性试剂(The Binding Site，Birmingham，UK)检测结合的抗体。第二抗体用PBST作1∶1000稀释平板各孔中加入100μl。将平板室温再培育1小时并如上洗涤。用邻苯二胺(OPD)底物进行检测。将1片(20mg)OPD(Sigma，Poole，UK)溶于45ml过氧化物酶缓冲液(Sigma，Poole，UK)中，临用前加入10μL 30％(w/w)过氧化氢(Sigma，Poole，UK)。各孔中加入100μL底物液室温培育5分钟或需要的时间。加入25μL 12.5％ H2SO4终止显色并在492nm检测结果。将抗体浓度与A492绘图，与标准抗体曲线比较确定样品抗体的浓度。
实施例4-用结合试验检测修饰的抗CD52抗体人T细胞淋巴瘤细胞系HUT-78是CD52阳性用于评价本发明修饰抗体的结合性能。在该实施例中，将不同浓度的测试抗体与细胞一起培育并在培育后用荧光标记的报告分子试剂评价结合抗体的量。报告分子用荧光激活细胞分选仪(FACS)测定。
简言之，在试验中，将106个HUT-78细胞与测试抗体和人源化抗体(CAMPATH-1H)以及作为对照的嵌合性抗CD52抗体的系列稀释液一起培育。用ng/ml表示的抗体浓度为40000、20000、10000、5000、2500、1250、625、312.5、156.25、78.125、39.06、19.53和0。所有的培育在96孔板上进行，最终体积为100μl PBS/2％ FBS。
将抗体和细胞的混合物在冰上黑暗中培育1小时，用200μl冰冷的PBS/2％ FBS洗涤两次。
检测时，将细胞与FITC-标记的抗人IgG Fc结构域的1∶1000稀释液冰上培育1小时。试剂为购自Sigma(Poole，UK)的羊抗人IgG(Fc特异性)。细胞按上文所述洗涤，重悬于100μl PBS/2％ FBS中，然后转移到含有900μl PBS/2％ FBS/碘化丙锭(1∶1000)的4ml FACS试管(Becton Dickinson)。用常规Becton Dickenson FACS Calibur装置分析细胞。
用荧光中值确定测试抗体和对照抗体的结合性能。从荧光中值-0抗体荧光中值和抗体浓度绘出的图确定抗体的饱和浓度。用SigmaPlot将结合曲线与4参数S曲线逻辑方程拟合，得到置信水平为95％的极佳拟合。效价，即产生50％最大结合的浓度，见图7。结果表明，本发明的许多抗体与嵌合性CAMPATH-1G抗体和人源化CAMPATH-1H抗体的性能结合几乎相等。
表7
实施例5-用竞争性试验测试修饰的抗CD52抗体用本发明的修饰抗体进行竞争性结合试验。在这些试验中评价了测试抗体与人源化CAMPATH-1H试剂竞争结合CD52的能力。在该实施例中，将HUT-78细胞与亚饱和量的生物素化CAMPATH-1H和不同浓度的未标记的竞争测试抗体共同培育。与细胞结合的生物素化参考抗体的量在与抗生物素蛋白-FITC报告分子进一步培育后测定，荧光按实施例4所述用FACS装置测定。
简言之，在竞争性试验中，将106个HUT-78细胞与2μg生物素化人CAMPATH-1H一起培育。已用生物素化CAMPATH-1H和未标记的CAMPATH-1H进行预试验以确定随后在各试验中需要加入的生物素化的抗体的最佳量。
将测试抗体和对照抗体在96孔板中作系列稀释，终体积为100μl PBS/2％ FBS。设置测试抗体的浓度为0、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100、500和1000μg/106细胞。
将细胞和抗体混合物在冰上黑暗中培育1小时，用200μl冰冷的PBS/2％ FBS洗涤两次。通过与1∶200稀释的抗生物素蛋白-FITC试剂(Sigma，Poole，UK)一起培育检测结合的生物素化抗体。冰上培育1小时后按上文所述洗涤2轮。将细胞重悬于100μl PBS/2％ FBS中转移到含有900μl PBS/2％ FBS/碘化丙锭(1∶1000稀释)的4ml试管中。用常规的Becton Dickenson FACS Calibur装置分析细胞。
测试和对照抗体的结合性能表示为与生物素标记的对照抗体最大结合的抑制百分比。
抑制百分值可用下式确定
用SigmaPlot将结合曲线与4参数S曲线逻辑方程拟合，得到置信水平为95％的极佳拟合。计算出的EC50值见表8。结果表明，本发明的抗体与HUT-78细胞上CD52的结合与嵌合性CAMPATH-1G抗体和人源化CAMPATH-1H抗体等效。
表8
实施例6-T细胞免疫原性分析从培养在添加有L-谷氨酰胺和抗生素-抗真菌素(Gibco/Invitrogen Cat No15240-062)的无CHO蛋白无动物组分的培养基(Sigma Cat NoG7513)中的CHO CAMPATH-1G DIVH2/DIVK5细胞系制备修饰的抗体CAMPATH-1G DIVHv2/DIVKv5。通过PROSEP-A层析(Millipore)纯化抗体，用0.1M甘氨酸pH3.0洗脱，中和并用磷酸缓冲盐水(PBS)透析，最后过滤除菌。
用阳离子交换层析和尺寸排阻层析2阶段纯化DIVH2/DIVK5修饰的抗体和人源化CAMPATH对照抗体。当为Sephadex G25(PD10柱)上的缓冲液交换50mM MES pH6后，使蛋白质通过阳离子交换柱(Mono-S 10/10)用氯化钠梯度(0-0.5M)洗脱。然后将洗脱的含蛋白质组分加到Superdex 200制备柱(XK16/60)上，用PBS洗脱。合并峰组分4℃保存。用ELISA测定人IgG的抗体浓度。
实验推测抗CD52 CAMPATH抗体本身将抑制T细胞，将干扰标准T细胞测定中对免疫原性的分析。进行预试验来测试CAMPATH抗CD52抗体对T细胞的作用。制备3个健康正常供体的血PBMC。将它们与人源化CAMPATH-1H(由Ilex提供)单独培育，与匙孔血蓝蛋白(KLH)单独培育，与KLH和CAMPATH-1H抗体一起培育并设置了未处理对照。结果显示，由于该抗体对T细胞的作用，所有3个供体都竞争性抑制了对对照抗原KLH的应答反应。
为分析完整抗CD52抗体的免疫原性，使用了更加复杂的T细胞测定法，该实验中，洗涤除去加载有完整抗CD52抗体和外源(未处理的)抗原的树突细胞(DC)，然后加入自体T细胞。用这种方法可避免抗CD52抗体的抑制作用和获得对KLH的正常应答反应。该方法总共采用了10个健康供体，用人源化CAMPATH-1H作为测试对照抗原。
简言之，将PBMC用作单核细胞来源，通过附着于组织培养塑料板(＞90％ CD14+)上分离单核细胞。在含有3％热灭活的人AB血清(Autogen Bioclear)(生长培养基)的AIM V培养基(Gibco)中培养单核细胞至密度约为每孔1×106个细胞(24孔板)。为诱导APC样表型(CD40+、CD80hi、CD83hi、CD86hi、MHC II类hi)，在含有人IL-4(Peprotech)和GM-CSF(Peprotech)的生长培养基中培养单核细胞4天。在第4天加入50μg/ml的测试抗原(人源化CAMPATH-1H或修饰的CAMPATH-1G DIVHv2/DIVKv5抗体)。对照孔仅加入培养基。24小时后除去生长培养基和抗原洗涤细胞一次，然后加入新鲜的含有TNFα(Peprotech)、GM-CSF和IL-4的生长培养基培养4天。收获并计数粘附和不粘附的树突细胞(DC)。以1×104/孔的密度将DC分布到96孔圆底板的每个孔中，每个供体的每种处理一式六份(人源化CAMPATH-1H或修饰的CAMPATH-1GDIVHv2/DIVKv5抗体或对照)。用4000rads的γ射线照射DC，然后以1×105/孔的密度加入从PBMC阴性分离的(Dynal Human CD4+Negative Isolation Kit)自体CD4+T细胞。将平板培育7天通过氚化胸腺嘧啶的掺入测定细胞增殖(用3H-胸腺嘧啶以1μCi/孔脉冲6小时)。
这些数据表示为刺激指数，如下 阳性结果定义为刺激指数(SI)大于2。预试验的结果(图15)显示，10个供体中有2个对CAMPATH-1H有应答反应，其中一个有非常高的刺激指数。
CAMPATH-1H和修饰的DIVHv5/DIVKv2抗体的比较根据HLA-DR类型选择一组20个健康供体(见表9)在T细胞测定中筛选人源化抗体和修饰抗体。这样能够筛选出抗80％以上在全世界人群中表达的DR等位基因的抗体。
表9-用来检测人源化CAMPATH抗体和修饰的CAMPATH抗体免疫原性的一组20个健康供体的HLADR单元型
图16显示，人源化CAMPATH 1H在三个健康个体(供体14、17和19)中诱导了显著的(p＜0.05)增殖性应答(与未处理对照相比的cpm)。然而，只有供体14和17的T细胞产生了分别为4.2和2.5的明显较高(SI＞2)的刺激指数。供体19的应答反应被排除，因为其刺激指数低于该实验设定的域值(SI约1.5)。对于供体8，未处理对照产生了低于400cpm的结果因此被排除。重要的是，没有供体对修饰的DIVHv5/DIVKv2抗体有应答反应。
因此，人源化CAMPATH 1H抗体在一些具有某种MHC II类同种异型的病人中具有诱导依赖于T细胞的体液免疫应答的潜能(表现为亲和力成熟的、同种型转换的抗CAMPATH 1H抗体)。该观察结果得到离体T细胞测定的支持，该测定中，至少有2个健康个体(供体14和17)在对用抗原加工的CAMPATH 1H处理的应答中发生了T细胞活化(表现为成熟的DC)。与用抗原加工修饰的DIVHv5/DIVKv2抗体的离体T细胞应答相比，显示其在任何测试的供体中都完全不诱导T细胞增殖。这些数据证明，当人源化CAMPATH-1H被代替时，特别是当用于需要重复剂量的适应证时，这种修饰抗体可能提供了一种改进的治疗分子。
序列表<110>F.J.卡尔(Carr，Francis J.)A.A.汉米尔顿(Hamilton，Anita A.)<120>修饰的抗CD52抗体<130>ILEX095WO<140>PCT/IB2004/003879<141>2004-10-29<150>60/516,210<151>2003-11-01<160>231<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>121<212>PRT<213>大鼠(Rattus norvegicus)<400>1Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Met Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe20 25 30Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Ala Pro Glu Trp Leu35 40 45Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro50 55 60Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Gln Asn Met65 70 75 80Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr85 90 95Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser115 120<210>2<211>107<212>PRT<213>大鼠(Rattus norvegicus)<400>2Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Leu Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asp Lys Tyr20 25 30Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ser Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45
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atgacccagt ctccctcatc cctgtctgca tc 32<210>216<211>35<212>DNA<213>人工的<220>
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<223>合成的
<400>221cccggaaaag ctcccaaact cctgatatat aatac 35<210>222<211>35<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成的<400>222cccggaaaat ctcccaaact cctgatatat aatac 35<210>223<211>35<212>DNA<213>人工的<220>
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<223>合成的<400>224tttgggagct tttccgggct tttgctgata cc 32<210>225<211>32<212>DNA<213>人工的<220>
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<223>合成的<400>226cgtcccatca aggttcagtg gcagtgg27<210>227<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成的
<400>227gccactgaac cttgatggga cgcccgtttg c 31<210>228<211>35<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成的<400>228cactgaacct tgatgggacg ccagattgca aattg 35<210>229<211>35<212>DNA<213>人工的<220>
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<223>合成的<400>230tgcaagcagt aatatgtggc aatatcttca ggctg 35<210>231<211>36<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成的<400>231gcgatagctg gactgaatgg atccagtcga cgaagc 3权利要求
1.一种抗CD52抗体，该抗体重链的重链可变区包含具有一个或多个下述取代的SEQ ID NO1的取代变体，其中，氨基酸残基编号即是它们在SEQ ID NO1中的编号用Gln取代氨基酸残基3上的Lys；用Ala、Cys、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Lys、Pro、Arg、Ser或Thr取代氨基酸残基5上的Leu；用Asn、Asp、Glu、His、Lys、Pro、Gln、Arg、Ser或Thr取代氨基酸残基12上的Val；用Ala、Phe、His、Lys、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr取代氨基酸残基13上的Gln；用Asp、His、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr取代氨基酸残基15上的Gly；用Gly、Met、Pro或Trp取代氨基酸残基17上的Ser；用Arg、Gly、Pro、Leu取代氨基酸残基18上的Met；用Ala、Cys、Phe、Gly、Ile、Leu、Met、Pro、Val、Trp或Tyr取代氨基酸残基19上的Arg；用Ala、Cys、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Asn、Asp、Met、Gln、Glu、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代氨基酸残基20上的Leu；用Pro取代氨基酸残基21上的Ser；用Asp、Asn、Glu、Gln、Gly、His、Lys、Pro、Arg、Ser、Thr取代氨基酸残基23上的Ala；用Phe、Gly、Leu、Pro、Trp或Tyr取代氨基酸残基25上的Ser；用Asp、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Pro、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr取代氨基酸残基26上的Gly；用Ala、Phe、Gly、Ile、Met、Pro、Val、Trp或Tyr取代氨基酸残基31上的Asp；用Ala、Gly、Met或Pro取代氨基酸残基33上的Tyr；用Pro取代氨基酸残基35上的Asn；用Ala、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser或The取代氨基酸残基36上的Trp；用Val取代氨基酸残基37上的Ile；用Phe、His、Pro或Tyr取代氨基酸残基38上的Arg；用Ala取代氨基酸残基40上的Pro；用Asp、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Pro、Arg、Ser、The或Trp取代氨基酸残基41上的Ala；用Ile、Pro、Thr、Tyr取代氨基酸残基42上的Gly；用Gly、His、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Trp、Tyr取代氨基酸残基44上的Ala；用Leu取代氨基酸残基45上的Pro；用Ile或Val取代氨基酸残基48上的Leu；用Phe、Leu、Pro、Trp或Tyr取代氨基酸残基71上的Thr；用Asp、Glu、His、Lys、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser或Thr取代氨基酸残基72上的Ile；用Ala、Gly或Pro取代氨基酸残基73上的Ser；用Ala、Phe、Gly、Ile、Met、Pro、Trp或Tyr取代氨基酸残基74上的Arg；用Ala、Gly、Met、Pro、Trp或Tyr取代氨基酸残基76上的Asn；用Ala、His、Ile、Pro或Ser取代氨基酸残基77上的Thr；用Lys取代氨基酸残基78上的Gln；用Ala、Phe、Gly、Ile、Met、Pro、Val、Trp或Tyr取代氨基酸残基79上的Asn；用Ala、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr或Ser取代氨基酸残基80上的Met；用Ala、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser或Thr取代氨基酸残基82上的Tyr；用Ala、Phe、Gly、Ile、Leu、Met、Pro、Val、Trp或Tyr取代氨基酸残基84上的Gln；用Ala、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser或Thr取代氨基酸残基85上的Met；用Ser取代氨基酸残基87上的Thr；用Asp、Glu、Gly、His、Lys、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr取代氨基酸残基88上的Leu；用Phe、Pro、Trp、Tyr取代氨基酸残基89上的Arg；用Asn、Asp、Glu、Gln、His、Lys、Pro、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr取代氨基酸残基90上的Ala；用Pro取代氨基酸残基91上的Glu；用Ala、Phe、Gly、Ile、Leu、Met、Pro、Val、Trp、Tyr取代氨基酸残基92上的Asp；用Val取代氨基酸残基95上的Thr；用Ala、Phe、Gly、Ile、Leu、Met、Pro、Val、Trp或Tyr取代氨基酸残基109上的Asp；用Ala、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser或Thr取代氨基酸残基111上的Trp；用His、Pro、Ser或Thr取代氨基酸残基114上的Gly；用Thr取代氨基酸残基115上的Val；用Thr、Phe、Ile、Leu、Pro、Val、Trp或Tyr取代氨基酸残基116上的Met；用Ala、Phe、Gly、Ile、Met、Pro、Trp或Tyr取代氨基酸残基117上的Val；该抗体轻链的轻链可变区包含具有一个或多个下述取代的SEQ ID NO2的取代变体，其中，氨基酸残基编号即是它们在SEQ ID NO2中的编号用Gln取代氨基酸残基3上的Lys；用Ala、Asp、Asn、Glu、Gln、Gly、His、Lys、Pro、Arg、Ser或Thr取代氨基酸残基10上的Phe；用Ala、Gly、His或Pro取代氨基酸残基15上的Val；用Pro取代氨基酸残基17上的Asp；用Pro或Trp取代氨基酸残基19上的Val；用Pro或Ile取代氨基酸残基21上的Leu；用Thr取代氨基酸残基22上的Asn；用Arg取代氨基酸残基24上的Lys；用Ala、Asp、Asn、Gln、Glu、Gly、His、Lys、Pro、Arg、Ser或Thr取代氨基酸残基33上的Leu；用Asp、Asn、Gln、Glu、Gly、His、Lys、Pro、Arg、Ser或Thr取代氨基酸残基40上的Leu；用Lys取代氨基酸残基42上的Glu；用Ala取代氨基酸残基43上的Ser；用Ser取代氨基酸残基46上的Leu；用Ala、Phe、Gly、Ile、Met、Pro、Ser、Trp或Tyr取代氨基酸残基56上的Thr；用Ala、Gly、Met、Pro或Val取代氨基酸残基58上的Ile；用Ala、Phe、Gly、Ile、Met、Pro、Trp或Tyr取代氨基酸残基60上的Ser；用Pro取代氨基酸残基上的Arg；用Phe、Leu、Pro、Trp或Tyr取代氨基酸残基63上的Ser；用Asp、Asn、Gln、Glu、His、Lys、Pro、Arg、Ser或Thr取代氨基酸残基64上的Gly；用Asp、Asn、Gln、Glu、Gly、His、Lys、Pro、Arg、Ser、Thr取代氨基酸残基78上的Leu；用Ala、Asp、Asn、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Lys、Pro、Arg、Ser、Thr取代氨基酸残基83上的Val；用Tyr取代氨基酸残基87上的Phe。
2.如权利要求1所述的抗体，其重链可变区包含具有一个或多个下述取代的SEQID NO1的取代变体，其中，氨基酸残基编号即是它们在SEQ ID NO1中的编号用Gln取代氨基酸残基3上的Lys；用Ala、Cys、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Lys、Pro、Arg、Ser或Thr取代氨基酸残基5上的Leu；用Arg、Gly、Pro、Leu取代氨基酸残基18上的Met；用Ala、Cys、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Asn、Asp、Met、Gln、Glu、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代氨基酸残基20上的Leu；用Asp、Asn、Glu、Gln、Gly、His、Lys、Pro、Arg、Ser、Thr取代氨基酸残基23上的Ala；用Val取代氨基酸残基37上的Ile；用Ala取代氨基酸残基40上的Pro；用Pro取代氨基酸残基41上的Ala；用Gly、His、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Trp、Tyr取代氨基酸残基44上的Ala；用Leu取代氨基酸残基45上的Pro；用Ile或Val取代氨基酸残基48上的Leu；用Ala、His、Ile、Pro或Ser取代氨基酸残基77上的Thr；用Lys取代氨基酸残基78上的Gln；用Ala、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr或Ser取代氨基酸残基80上的Met；用Ala、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser或Thr取代氨基酸残基82上的Tyr；用Ala、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser或Thr取代氨基酸残基85上的Met；用Ser取代氨基酸残基87上的Thr；用Val取代氨基酸残基95上的Thr；用Thr取代氨基酸残基115上的Val；用Thr、Phe、Ile、Leu、Pro、Val、Trp或Tyr取代氨基酸残基116上的Met；且其轻链可变区包含具有一个或多个下述取代的SEQ ID NO2的取代变体，其中，氨基酸残基编号即是它们在SEQ ID NO2中的编号用Gln取代氨基酸残基3上的Lys；用Ala、Asp、Asn、Glu、Gln、Gly、His、Lys、Pro、Arg、Ser或Thr取代氨基酸残基1O上的Phe；用Pro或Ile取代氨基酸残基21上的Leu；用Thr取代氨基酸残基22上的Asn；用Arg取代氨基酸残基24上的Lys；用Asp、Asn、Gln、Glu、Gly、His、Lys、Pro、Arg、Ser或Thr取代氨基酸残基40上的Leu；用Lys取代氨基酸残基42上的Glu；用Ala取代氨基酸残基43上的Ser；用Ser取代氨基酸残基46上的Leu；用Ala、Phe、Gly、Ile、Met、Pro、Ser、Trp或Tyr取代氨基酸残基56上的Thr；用Ala、Gly、Met、Pro或Val取代氨基酸残基58上的Ile；用Ala、Asp、Asn、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Lys、Pro、Arg、Ser、Thr取代氨基酸残基83上的Val；用Tyr取代氨基酸残基87上的Phe。
3.如权利要求1所述的抗体，其重链可变区包含具有一个或多个下述取代的SEQID NO1的取代变体，其中，氨基酸残基编号即是它们在SEQ ID NO1中的编号用Gln取代氨基酸残基3上的Lys；用Gln取代氨基酸残基5上的Leu；用Leu取代氨基酸残基18上的Met；用Ile取代氨基酸残基20上的Leu用Ser取代氨基酸残基23上的Ala；用Val取代氨基酸残基37上的Ile；用Ala取代氨基酸残基40上的Pro；用Pro取代氨基酸残基41上的Ala；用Gly取代氨基酸残基44上的Ala；用Leu取代氨基酸残基45上的Pro；用Ile或Val取代氨基酸残基48上的Leu；用Ala或Ser取代氨基酸残基77上的Thr；用Lys取代氨基酸残基78上的Gln；用Thr或Ser取代氨基酸残基80上的Met；用His取代氨基酸残基82上的Tyr；用Ala取代氨基酸残基85上的Met；用Ser取代氨基酸残基87上的Thr；用Val取代氨基酸残基95上的Thr；用Thr取代氨基酸残基115上的Val；用Leu取代氨基酸残基116上的Met；且其轻链可变区包含具有一个或多个下述取代的SEQ ID NO2的取代变体，其中，氨基酸残基编号即是它们在SEQ ID NO2中的编号用Gln取代氨基酸残基3上的Lys；用Ser取代氨基酸残基10上的Phe；用Ile取代氨基酸残基21上的Leu；用Thr取代氨基酸残基22上的Asn；用Arg取代氨基酸残基24上的Lys；用Pro取代氨基酸残基40上的Leu；用Lys取代氨基酸残基42上的Glu；用Ala取代氨基酸残基43上的Ser；用Ser取代氨基酸残基46上的Leu；用Ser取代氨基酸残基56上的Thr；用Val取代氨基酸残基58上的Ile；用Ile取代氨基酸残基83上的Val；用Tyr取代氨基酸残基87上的Phe。
4.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，在所述重链和所述轻链中至少有7个氨基酸残基被取代。
5.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，在所述重链和所述轻链中有7-14个氨基酸残基被取代。
6.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述重链还包含人IgG1恒定区。
7.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述轻链还包含人κ恒定区。
8.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述重链包含选自以下的氨基酸序列SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6和SEQ ID NO7、所述轻链包含选自以下的氨基酸序列SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11和SEQ ID NO12。
9.如权利要求8所述的抗体，其特征在于，所述重链含SEQ ID NO4而所述轻链含SEQ ID NO12，或其中所述重链含SEQ ID NO7而所述轻链含SEQ ID NO12，或所述重链含SEQ ID NO7而所述轻链含SEQ ID NO10，或所述重链含SEQ ID NO3而所述轻链含SEQ ID NO10，或所述重链含SEQ ID NO6而所述轻链含SEQ IDNO10。
10.如权利要求9所述的抗体，其特征在于，所述重链含SEQ ID NO4而所述轻链含SEQ ID NO12。
11.如权利要求9所述的抗体，其特征在于，所述重链还包含人IgG1恒定区而所述轻链还包含人κ恒定区。
12.一种含有如权利要求1所述抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。
13.一种含有如权利要求11所述抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。
14.一种治疗恶性淋巴瘤的方法，所述方法包括给予患者有效量的如权利要求1所述的抗体。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述抗体的所述重链含SEQ ID NO4和人IgG1恒定区，而所述抗体的所述轻链含SEQ ID NO12和人κ恒定区。
16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述恶性淋巴瘤是白血病或淋巴瘤。
17.一种治疗患者的自身免疫病的方法，所述方法包括施用有效量的如权利要求1所述的抗体。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述抗体的所述重链含SEQ ID NO4和人IgG1恒定区，而所述抗体的所述轻链含SEQ ID NO12和人κ恒定区。
19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述自身免疫病是多发性硬化、类风湿性关节炎、全身性血管炎、葡萄膜炎、炎性肠病或硬皮病。
20.一种在器官移植之前或之后免疫抑制患者的方法，所述方法包括给予所述患者有效量的如权利要求1所述的抗体。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述抗体的所述重链含SEQ ID NO4和人IgG1恒定区，而所述抗体的所述轻链含SEQ ID NO12和人κ恒定区。
22.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述器官移植是肾移植。
23.一种包含核酸序列的表达载体，所述核酸序列编码如权利要求1所述的包含SEQ ID NO1取代变体的重链可变区，且所述核酸序列操作性连接于表达控制序列。
24.如权利要求23所述的表达载体，其特征在于，所述编码如权利要求1所述的包含SEQ ID NO1取代变体的重链可变区的序列是SEQ ID NO71、SEQ ID NO72、SEQ ID NO73、SEQ ID NO74或SEQ ID NO75，或是其简并变体。
25.如权利要求24所述的表达载体，其特征在于，所述编码如权利要求1所述含有SEQ ID NO1取代变体的重链可变区的序列是SEQ ID NO72。
26.如权利要求23所述的表达载体，还包含编码人IgG1恒定区的核酸序列。
27.一种含有如权利要求23所述载体的培养的细胞。
28.一种包含核酸序列的表达载体，所述核酸序列编码如权利要求1所述的包含SEQ ID NO2取代变体的轻链可变区，且所述核酸序列操作性连接于表达控制序列。
29.如权利要求28所述的表达载体，其特征在于，所述编码如权利要求1所述的包含SEQ ID NO2取代变体的轻链可变区的序列是SEQ ID NO76、SEQ ID NO77、SEQ ID NO78、SEQ ID NO79或SEQ ID NO80，或是其简并变体。
30.如权利要求29所述的表达载体，其特征在于，所述编码如权利要求1所述包含SEQ ID NO2取代变体的轻链可变区的序列是SEQ ID NO80。
31.如权利要求28所述的表达载体，还包含编码人κ恒定区的核酸序列。
32.一种含有如权利要求28所述载体的培养的细胞。
33.一种用权利要求23所述载体和权利要求28所述载体转染的培养的细胞。
34.一种制备免疫球蛋白的方法，所述方法包括在允许在表达控制序列的控制之下进行表达的条件下培养如权利要求33所述的细胞，并从所述细胞的培养基中纯化得到免疫球蛋白。
全文摘要
本发明提供含有的潜在T细胞表位数减少因而预计免疫原性降低的抗CD52抗体的修饰形式。
文档编号C12N5/06GK1898267SQ200480036043
公开日2007年1月17日 申请日期2004年10月29日 优先权日2003年11月1日
发明者F·J·卡尔, A·A·汉米尔顿 申请人:生物维新有限公司