脂质包封的干扰rna的利记博彩app

专利名称：脂质包封的干扰rna的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及组合物和方法，其通过传递包封核酸的血清稳定性脂质传 递载体来对核酸进行治疗性传递从而提供在细胞或哺乳动物中有效的 RNA干扰(RNAi)。更具体地，本发明涉及使用被包封在血清稳定性脂质颗 粒中的小干扰RNA (siRNA)，所述颗粒具有适合于全身传递的小直径。
背景技术：
RNA干扰(RNAi)是进化上是保守的、由双链RNA(dsRNA)弓I发的序列 特异性机制，所述双链RNA(dsRNA)诱导互补耙单链mRNA的降解并使相 应的翻译序列"沉默"。(McManus和Sharp, i ev. C7e"" 3:737
(2002))。 RNAi通过将更长的dsRNA链酶促裂解成约21-23个核苷酸长度的 生物活性的"短干扰RNA"(siRNA)序列来发挥功能(Elbashir, W a/., Genes Dev. 15:188 (2001))。 siRNA可以用于使目的基因产物的翻译下调或沉默。 例如，理想的是下调与各种疾病和病症相关的基因。
siRNA的传递仍旧是个问题f见例如，Novina和Sharp, iV^we 430::161曙163 (2004);和Garber， 《/ Ato/. Owc^/"W. 95(7):500-2 (2003))。 一 种有效的和安全的核酸传递系统是siRNA有效用于治疗所必需的。施用给 大多数受试者的裸dsRNA将(1)被内源核酸酶降解；和(2)将不能穿越细 胞膜从而接触并使它们的耙基因序列沉默。
病毒载体是相对有效的基因传递系统，但是会遇到各种安全性问题， 诸如不理想的免疫应答的可能。而且，病毒系统从循环中迅速被清除，限制到"初次通过(first-pass)"器官诸如肺、肝和脾中的转染。此夕卜，这些系统 诱导免疫应答，所述免疫应答损害通过连续注射的传递。结果，非病毒基 因传递系统正在受到越来越多的注意(Worgall, Wa/., //wwa" 77^rap_y 8:37 (1997); Peeters, a a/.， Human Gene Therapy 7:1693(1996); Yei， " a/., Gene T/zena;^ 1:192 (1994); Hope, a/" Afo/ecw/ar AfemZ)rawe B/o/ogy 15:1(1998))。
质粒DNA-阳离子脂质体复合物是目前最常使用的非病毒基因传递载 体(Felgner， Scientific American 276:102(1997); Chonn， a/" CWreW C^'m'ow6:698 (1995))。例如，由两亲性化合物、中性脂质 和去污剂组成以转染昆虫细胞的阳离子脂质体复合物公开于美国专利号 6,458,382。阳离子脂质体复合物还公开于美国专利申请公开2003/0073640。 然而，阳离子脂质体复合物较大，系统很不确定，其不适于全身应用并可 激发相当大的毒性副作用(Harrison, Wa/., 5z'o^c/zm'^es 19:816(1995); Li， e^/.' r/ze 4:891(1997); Tarn, Wa/，77^. 7:1867 2000))。作为较 大的带正电荷的聚集体，当被体内施用时，lipoplexes被迅速清除，伴随在 初次通过器官，特别是肺中观察到最高的表达水平(Huang， "a/., A^&M 15:620 (1997》Templeton，a/., iVafwre 5Zofec/z"o/ogy 15:647 (1997); Hofland， 尸/z麵a，to/i e，n^l4:742 (1997))。
其它的脂质体传递系统包括，例如，如分别在例如美国专利号 6,429,200;美国专利申请号2003/0026831;和美国专利申请号2002/0081736 和2003/0082103中公开的反胶团、阴离子和聚合物脂质体的应用。
最近的工作已经显示核酸可被包封在小的(约70nm直径)"稳定的质粒 -脂质颗粒"(SPLP)中，其由包封在双层脂质载体中的单一质粒组成 (Wheeler, eM/.77zera;^ 6:271 (1999))。这些SPLPs典型地包含"融合性 的(fiisogenic)"脂质二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，低水平的阳离子脂质(即， 10%或更少)，并在存在聚(乙二醇)(PEG)包衣时在水性介质中是稳定的。 SPLP具有全身应用，因为在静脉内(i.v.)注射后，它们显示延长的循环生存 期，由于在这些区域增加的血管通透性，它们优先聚集在远侧肿瘤位点， 并可在这些肿瘤位点介导转基因表达。在i.v.注射包含萤光素酶标记基因的 SPLP后，在肿瘤位点观察到的转基因表达的水平优于使用质粒DNA-阳离子脂质体复合物(lipoplexes)或裸DNA可获得的水平。
然而，在本领域中仍存在对于将核酸，诸如siRNA引入细胞中的新的 和更有效方法及组合物的强烈需要。本发明解决这个和其它需求。
发明概述
本发明提供有效用于包封一个或多个siRNA分子的稳定的核酸-脂质 颗粒(SNALP)，制备包含siRNA的SNALPs的方法，包含siRNA的SNALPs 和将所述SNALPs传递和/或施用到受试者以使靶基因序列表达沉默的方 法。
在一个实施方案中，本发明提供核酸-脂质颗粒，其包含阳离子脂 质、非阳离子脂质、抑制颗粒聚集的缀合的脂质，和siRNA。在一些实施 方案中，siRNA分子被充分包封在核酸-脂质颗粒的脂双层中从而使在核酸 -脂质颗粒中的核酸在水溶液中对于核酸酶的降解具有抗性。所述核酸对于 哺乳动物是基本无毒的。所述siRNA分子可包含约15至约60个核苷酸。所 述siRNA分子可衍生自长度大于约25个核苷酸的双链RNA。在一些实施方 案中，所述siRNA转录自质粒，特别是包含靶序列的DNA模板的质粒。
阳离子脂质可以是N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC),N，N-二 硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)， N-(l-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N，N,N-三 甲基氯化铵(DOTAP),N-(l-(2,3-二油基氧基)丙基)-N，N,N-三甲基氯化铵 (DOTMA)，和N，N-二甲基-2，3-二油基氧基)丙胺(DODMA),及其混合物的 一个或多个。非阳离子脂质可以是二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，棕榈酰油 酰磷脂酰胆碱(POPC)，卵磷脂酰胆碱(EPC)， 二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)， 胆固醇及其组合的一个或多个。
抑制颗粒聚集的缀合的脂质可以是聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物，聚酰 胺(ATTA)-脂质缀合物及其组合的一个或多个。PEG-脂质缀合物可以是 PEG-二烷氧基丙基(DAA)， PEG-二酰基甘油(DAG)， PEG-磷脂，PEG-神 经酰胺及其组合的一个或多个。PEG-DAG缀合物可以是PEG-二月桂酰甘 油(d2)， PEG-二肉豆蔻酰甘油(d4)， PEG-二棕榈酰甘油(d6)，和PEG-二硬脂酰甘油(C,8)，及其组合的一个或多个。PEG-DAA缀合物可以是PEG-二月桂基氧基丙基(Cu)， PEG-二肉豆蔻基氧基丙基(d4), PEG-二棕榈基氧基丙基(C,6)和PEG-二硬脂基氧基丙基(ds)，及其组合的一个或多个。所述 核酸-脂质颗粒还可包含阳离子聚合物脂质。
在一些实施方案中，通过在第一个储存器中提供水溶液和在第二个储 存器中提供有机脂质溶液并将水溶液与有机脂质溶液混和从而基本瞬间 产生包封干扰RNA的脂质体来形成所述颗粒。在一些实施方案中，通过在 基于去污剂或基于有机溶剂的系统中形成疏水中间体复合体，随后去除去 污剂或有机溶剂来制成所述颗粒。优选的实施方案是电荷中性的。
在一个实施方案中，干扰RNA转录自质粒并且质粒在去污剂溶液中与 阳离子脂质结合从而提供包被的核酸-脂质复合体。接着，所述复合体与非 阳离子脂质接触以提供去污剂、核酸-脂质复合体和非阳离子脂质的溶液， 接着去污剂被去除从而提供血清稳定性的核酸-脂质颗粒的溶液，其中所述 包含干扰RNA模板的质粒被包封在脂双层中。因此，形成的颗粒具有约 50-150 nm的大小。
在另一个实施方案中，通过在有机溶剂中制备阳离子脂质和非阳离子 脂质的混和物来形成血清稳定性核酸-脂质颗粒；使包含干扰RNA的核酸 的水溶液与阳离子和非阳离子脂质的混和物接触从而提供清晰的单相；并
且去除有机溶剂从而提供核酸-脂质颗粒的混悬液，其中核酸被包封在脂双 层中，所述颗粒在血清中是稳定的并且具有约50-150 nm大小。
本发明的核酸-脂质颗粒有效用于治疗性传递包含siRNA序列的核酸。 具体而言，本发明的目的是提供通过下调或使耙核酸序列的翻译沉默来在 哺乳动物中治疗疾病的体外和体内方法。在这些方法中，将siRNA分子配 制到核酸-脂质颗粒中，并将所述颗粒施用到需要这些治疗的患者中(例如， 被诊断患有与包含靶核酸序列的基因的表达或过表达相关的疾病或病症 的患者)。或者，将细胞从患者中移去，siRNA被体外传递，并将所述细胞 再注射到患者中。在一个实施方案中，本发明提供通过使细胞与核酸-脂质 颗粒接触来将siRNA分子引入细胞的方法，所述核酸-脂质颗粒包括阳离子 脂质、非阳离子脂质、抑制聚集的缀合脂质和siRNA。
可以，例如通过静脉内、肠胃外或腹膜内施用核酸-脂质颗粒。在一个 实施方案中，在注射后约24， 36， 48， 60， 72， 84， 或96小时， 核酸-脂质颗粒的总施用剂量至少的约10%出现在血浆中。在一个实施方案中，在注射后24， 36， 48， 60， 72， 84,或96小时，超过20%， 30%, 40%的并且多至60%， 70%或80%的核酸-脂质颗粒的总注射剂量出现在血 浆中。在一个实施方案中，siRNA在靶组织(即，肺、肝、肿瘤或在炎症位 点)的细胞中的存在可在施用后24， 48， 72和96小时后检测得到。在一个 实施方案中，靶序列表达的下调可在施用后24， 48， 72和96小时后检测 得到。在一个实施方案中，靶序列表达的下调优先发生在肿瘤细胞或在炎 症位点的细胞中。在一个实施方案中，siRNA在施用位点远侧位点的存在 可在核酸-脂质颗粒的静脉内注射至少4天后检测得到。在另一个实施方案 中，siRNA在耙组织(g卩，肺、肝、肿瘤或在炎症位点)的细胞中的存在可 在核酸-脂质颗粒注射的至少4天后检测得到。
所述颗粒适合用于静脉内核酸转移因为它们在循环中是稳定的，大小 是药物动力学性质所需要的，导致了与血管外位点和靶细胞群的接近。本 发明还提供包含核酸-脂质颗粒的药用组合物。
本发明的另一个实施方案提供体内传递siRNA的方法。将所述核酸-
脂质颗粒施用(例如，静脉内地，皮下地，腹膜内地，或真皮下地
(subdermally)给受试者(例如，哺乳动物诸如人)，所述核酸-脂质颗粒包
含阳离子脂质、非阳离子脂质、抑制颗粒聚集的缀合脂质，和siRNA。在
一些实施方案中，本发明提供将干扰RNA传递给哺乳动物受试者肝脏的体
内传递。
本发明的另一个实施方案提供治疗哺乳动物受试者的疾病或病症的 方法。将治疗有效量的核酸-脂质颗粒施用给患有疾病或病症的哺乳动物受 试者(例如，啮齿动物诸如小鼠，灵长类动物诸如人或猴)，所述核酸-脂质 颗粒包含阳离子脂质、非阳离子脂质、抑制颗粒聚集的缀合脂质，和siRNA。
在一些实施方案中，所述疾病或病症与基因的表达和/或过量表达相关并且 基因的表达或过量表达被siRNA沉默。在一些实施方案中，所述疾病是病 毒性疾病诸如，例如肝炎(例如，甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝 炎、戊型肝炎、G型肝炎，或其组合)。在一些实施方案中，所述疾病或病 症是肝疾病或病症，诸如，例如血脂异常(dyslipidemia)。
附图简述

图1举例说明通过在DSPC :胆固醇:DODMA:PEG-DMG脂质体中体外 传递被包封的抗-p-半乳糖苷酶siRNA来下调J3-半乳糖苷酶在CT26.CL25细 胞中的表达。
图2举例说明PEG-二酰基甘油和PEG-神经酰胺C2o的结构。 图3举例说明用LUVs进行的清除率研究显示包含PEG-DAGs的
SNALPs是可与包含PEG-神经酰胺C20的SNALPs相比较的。
图4举例说明包含PEG-DAGs的SNALPs可通过去污剂透析方法来进行配制。
图S举例说明包含PEG- DAGs的SNALPs的药物代谢动力学特性。
图6举例说明包含PEG- DAGs的SNALPs的生物分布特性。
图7举例说明在携带Neuro-2a肿瘤的雄性A/J小鼠中，在IV施用包含 PEG-神经酰胺C2o的SPLPs后24小时对比IV施用包含PEG-DAGs的SPLPs后 24小时的萤光素酶基因的表达。
图8举例说明在携带Neuro-2a肿瘤的雄性A/J小鼠中，在IV施用包含 PEG-神经酰胺C2。的SPLPs后48小时对比IV施用包含PEG-DAGs的SPLPs后 48小时的萤光素酶基因的表达。
图9举例说明在携带Neuro-2a肿瘤的雄性A/J小鼠中，在IV施用包含 PEG-神经酰胺C2。的SPLPs后72小时对比IV施用包含PEG-DAGs的SPLPs后 72小时的萤光素酶基因的表达。
图10举例说明适合用在本发明中的三个示范性PEG-二烷氧基丙基衍 生物，即N-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基)氨基甲酸酯PEG2,甲基醚(即， PEG-C-DMA)， N-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基)酰胺PEG2,甲基醚(即， PEG-A-DMA)，和N-(2,3-二肉豆蔻基氧基丙基)琥珀酰胺PEG2000甲基醚(即, PEG-S-DMA)的结构。
图11举例说明显示在静脉内施用包含PEG-DAA缀合物和PEG-DAG缀 合物的SPLP后48小时在肿瘤中的萤光素酶基因表达的数据。
图12举例说明显示在静脉内施用包含PEG-DAA缀合物和PEG-DAG缀 合物的SPLP后在肝、肺、脾、心脏和肿瘤中的萤光素酶基因表达的数据。
图13举例说明在施用SPLPs和SNALPs后在具有Neuro-2a肿瘤的雄性 A/J小鼠中的清除率研究的数据，所述SPLPs包括PEG-DAA缀合物和在CMV启动子控制下包含编码萤光素酶的质粒，所述SNALPs包括PEG-DAA 缀合物和包含抗-萤光素酶siRNA。
图14举例说明在具有Neuro-2a肿瘤的雄性A/J小鼠中，对SPLPs和 SNALPs的药物代谢动力学特性研究的数据，所述SPLPs包括PEG-DAA缀 合物并包含在CMV启动子控制下的编码萤光素酶的质粒，所述SNALPs包 括PEG-DAA缀合物并包含抗-萤光素酶siRNA。
图15举例说明在施用SPLPs， pSPLPs和SNALPs后在具有Neuro-2a月中瘤 的雄性A/J小鼠中的清除率研究的数据，所述SPLPs包括PEG-DAA缀合物 或PEG-DAG缀合物并包含在CMV启动子控制下编码萤光素酶的质粒，所 述pSPLPs包含PEG-DAG缀合物并包含在CMV控制下的编码萤光素酶的质 粒，所述SNALPs包括PEG-DAA缀合物并包含抗-萤光素酶siRNA。
图16举例说明在具有Neuro-2a肿瘤的雄性A/J小鼠中对SPLPs， pSPLPs 和SNALPs的药物代谢动力学特性的研究的数据，所述SPLPs包括 PEG-DAA缀合物或PEG-DAG缀合物并包含在CMV启动子下的编码萤光 素酶的质粒，所述pSPLPs包括PEG-DAG缀合物并包含在CMV启动子控制 下的编码萤光素酶的质粒，所述SNALPs包括PEG-DAA缀合物并包含抗萤 光素酶siRNA。
图17举例说明体外数据，所述体外数据证明在用SPLPs和SNALPs处理 的表达萤光素酶的细胞中的萤光素酶表达的沉默，所述SPLPs包括PEG-脂 质缀合物并包含在CMV启动子的控制下编码萤光素酶的质粒，所述 SNALPs包括PEG-脂质缀合物并包含抗萤光素酶siRNA。
图18举例说明体内数据，所述体内数据证明在用SPLPs和SNALPs处 理的具有Neum-2a肿瘤的雄性A/J小鼠中的萤光素酶表达的沉默，所述 SPLPs包括PEG-DAA缀合物并包含在CMV启动子的控制下编码萤光素酶 的质粒，所述SNALPs包括PEG-DAA缀合物并包含抗萤光素酶siRNA。
图19举例说明体内数据，所述体内数据证明在用SPLPs和SNALPs处理 的具有Neum-2a肿瘤的雄性A/J小鼠中的萤光素酶表达的沉默，所述SPLPs 包括PEG-DAA缀合物并包含在CMV启动子的控制下编码萤光素酶的质 粒，所述SNALPs包括PEG-DAA缀合物并包含抗萤光素酶siRNA。
图20举例说明体内数据，所述体内数据证明在用SPLPs和SNALPs处理的具有Neum-2a肿瘤的雄性A/J小鼠中的萤光素酶表达的沉默，所述SPLPs 包括PEG-DAA缀合物并包含在CMV启动子的控制下编码萤光素酶的质 粒，所述SNALPs包括PEG-DAA缀合物并包含抗萤光素酶siRNA。
图21举例说明体内数据，所述体内数据证明在用SPLPs和SNALPs处理 的具有Neuro-2a肿瘤的雄性A/J小鼠中的萤光素酶表达的沉默，所述SPLPs 包括PEG-DAA缀合物并包含在CMV启动子的控制下编码萤光素酶的质 粒，所述SNALPs包括PEG-DAA缀合物并包含抗萤光素酶siRNA。
图22举例说明体内数据，所述体内数据证明在用SPLPs和SNALPs处理 的具有Neuro-2a肿瘤的雄性A/J小鼠中的萤光素酶表达的沉默，所述SPLPs 包括PEG-DAA缀合物并包含在CMV启动子的控制下编码萤光素酶的质 粒，所述SNALPs包括PEG-DAA缀合物并包含抗萤光素酶siRNA。
发明详述
I. 介绍
本发明提供有效用于包封一个或多个siRNA分子的稳定核酸-脂质颗 粒(SNALP)，制备包含siRNA的SNALPs的方法，包含siRNA的SNALPs， 和传递和/或施用SNALPs给受试者以使靶基因序列的表达沉默的方法。
本发明基于在SNALPs中包封短的干扰RNA(siRNA)分子的意外的成 功。使用本发明的方法，将siRNA分子以大于70X的效率，更通常地大于 80-90。/。的效率来将siRNA分子包封在SNALPs中。本文所述的SNALPs可方 便地进行体外和体内使用从而有效地将siRNA分子局部地或全身地传递施 用到表达耙基因的细胞中。 一旦进行传递，在SNALPs中的siRNA分子使靶 基因的表达沉默。
本文所述的SNALPs的直径典型地〈150 nm并在更长的时间阶段内在 循环中保持完整从而成功将siRNA传递给靶组织。所述SNALPs是不与细胞 和血管区室的其它成分相互作用的高度稳定的、包含血清抗性核酸的颗 粒。而且，所述SNALPs还容易地在疾病位点与靶细胞相互作用从而促进 所需的核酸(例如，siRNA或编码siRNA的质粒)的细胞内传递。
II. 定义
术语"脂质"指一组有机化合物，其包括，但不限于脂肪酸的酯，并且特征是在水中不溶的，但是在许多有机溶剂中是可溶的。通常将它们分成 三类(l)"简单的脂质"其包括脂肪和油以及蜡；(2)"化合物脂质"其包括 磷脂和糖脂；(3)"衍生的脂质"诸如类固醇。
"脂质小泡"指可用于传递化合物的任何脂质组合物，其包括，但不限 于，脂质体，其中水体积被两亲性脂双层所包封；或其中脂质包被包括大 分子组分的内部，诸如包括干扰RNA序列的质粒，伴随减少的水性内部； 或脂质聚集体或胶团，其中被包封的成分包含在相对混乱的脂质混合物 中。
用于本文时，"包封的脂质"可指提供具有充分包封、部分包封或两者 的化合物的脂质制剂。在一个优选的实施方案中，将所述核酸充分包封在 脂质制剂中。
用于本文时，术语"SNALP"指稳定的核酸脂质颗粒。SNALP代表包被 减少的水性内部的脂质的小泡，所述内部包括核酸诸如干扰RNA序列或其 中干扰RNA被转录的质粒。
术语"形成小泡的脂质"倾向于包括任何具有疏水部分和极性头部基 团的两亲性脂质并且其本身可以在水中自发形成双层小泡，示例为大多数 磷脂。
术语"采用小泡的脂质"倾向于包括稳定与脂双层结合的任何两亲性 脂，以及其它的两亲性脂质，其疏水部分与内部，双层膜的疏水区域接触， 并且其极性头部基团部分朝向外部，膜的极性表面。采用小泡的脂质包括 这样的脂质，其能够独立地适宜于采用非层状的相，还能够在存在双层稳 定组分时，采取双层结构。典型的实例是DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)。 双层稳定组分包括，但不限于，抑制SNALPs聚集的缀合的脂质，聚酰胺 低聚物(例如，ATTA-脂质衍生物)、肽、蛋白质、去污剂、脂质衍生物、 PEG-脂质衍生物诸如与二烷氧基丙基偶联的PEG、与二酰基甘油偶联的 PEG、与磷脂酰乙醇胺偶联的PEG，和与神经酰胺缀合的PEG(见，美国专 利号5，8S5,613，将其并入本文作为参考)。
术语"两亲性脂质"部分地指任何适合的材料，其中脂质材料的疏水部 分朝向疏水相，而亲水部分朝向水相。两亲性脂质通常是脂质小泡的主要 成分。亲水性质来自极性或带电基团诸如碳水化合物，磷酸盐(酯)，羧基、硫酸根合、氨基、巯基、硝基、羟基和其它类似基团的存在。疏水性可以 通过非极性基团的包含来赋予，所述基团包括，但不限于，长链饱和和不 饱和脂族烃基团和由一个或多个芳香族、脂环族或杂环基团取代的这样的 基团。两亲性化合物的实例包括，但不限于，磷脂、氨脂质和神经鞘脂类。 磷脂的代表性实例包括，但不限于，磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰 丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、 溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰 磷脂酰胆碱或二亚油酰磷脂酰胆碱。缺乏磷的其它化合物，诸如鞘磷脂、 鞘糖脂家族、二酰基甘油和P-酰氧基酸也在被称为两亲性脂质的组中。另 外，上述的两亲性脂质可与其它脂质混和，所述脂质包括甘油三酯和固醇。
术语"中性脂质"指在选定的pH以未带电荷或中性两性离子形式存在 的许多脂质种类中的任何一种。在生理pH，这样的脂质包括，例如，二酰
基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、神经鞘磷脂、脑磷脂、 胆固醇、脑苷脂和二酰基甘油。
术语"非阳离子脂质"指如上所述的任何中性脂质以及阴离子脂质。
术语"阴离子脂质，，指在生理pH带负电荷的任何脂质。这些脂质包括， 但不限于，磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、 N-十二烷酰磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰磷脂酰乙醇 胺，赖氨酰磷脂酰甘油、棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG)，和其它与中性脂 质连接的阴离子基团。
术语"阳离子脂质"指许多脂质种类中的任何一种，其在选定的pH，诸 如生理pH携带净正电荷。这些脂质包括，但不限于，N，N-二油基-N,N-二 甲基氯化铵("DODAC，，)； N-(2，3-二油基氧基)丙基)-N，N,N-三甲基氯化铵 ("DOTMA"); N，N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵("DDAB，，)； N-(2 ，3 -二油 酰氧基)丙基)-N,N，N-三甲基氯化铵("DOTAF，)； 3-(N-(N，，N，-二甲基氨基乙 垸)氨基甲酰基)胆固醇("DC-Chol")和N-( 1,2二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N，N-二甲基-N-羟乙基溴化铵("DMRIE")。如下的脂质是阳离子的并且在低于生 理pH时具有正电荷DODAP, DODMA, DMDMA等。
术语"疏水脂质"指具有非极性基团的化合物，其包括，但不限于，长 链饱和和不饱和脂族烃基团并且这些基团任选地被一个或多个芳香族、脂环族或杂环族基团所取代。合适的实例包括，但不限于，二酰基甘油、二
垸基甘油、N-N-二垸基氨基、1，2-二酰氧基-3-氨基丙烷和1,2-二垸基-3-氨
基丙烷。
术语"融合性的"指脂质体，SNALP或其它药物传递系统与细胞膜融合 的能力。所述膜可以是质膜或围绕细胞器，例如内体、核等的膜。
术语"二酰基甘油"指具有2-脂肪酰基链的化合物，其Ri和W都独立地 具有通过酯键与甘油的l-和2-位置键合的2-30个碳原子。所述酰基基团可 以是饱和的或具有不同程度的不饱和。二酰基甘油具有如下的通式
<formula>formula see original document page 20</formula>术语"二烷氧基丙基"指具有2-烷基链的化合物，其R'和f都独立地具 有2-30个碳。烷基基团可以是饱和的或具有不同程度的不饱和。二垸氧基 丙基具有如下的通式<formula>formula see original document page 20</formula>术语"ATTA"或"聚酰胺"指，但不限于，在美国专利号6,320,017和 6，586，559中公开的化合物，将它们都并入本文作为参考。这些化合物包括 具有如下式的化合物<formula>formula see original document page 21</formula><formula>formula see original document page 21</formula>
其中R是选自由氢、垸基和酰基组成的组中的成员；R'是选自由氢和垸 基组成的组中的成员；或任选地，R和R'和它们所结合的氮原子形成叠氮 基部分；w是选自氢、任选地取代的烷基、任选地取代的芳基和氨基酸侧 链的组的成员；w是选自由氢、卤素、羟基、烷氧基、巯基、肼基、氨基 和NR"RS组成的组的成员，其中R4和RS独立地是氢或烷基；n是4-80; m是 2-6; p是l-4;并且q是0或l。那些本领域技术人员将清楚的是其它聚酰胺 可用在本发明的化合物中。
术语"核酸"或"聚核酸"指包含至少两个脱氧核苷酸或核苷酸的以单或 双链形式存在的聚合物。除非具体限制，该术语涵盖包含天然核苷酸的已 知类似物的核酸，其具有与参照核酸相似的结合特性并且以与天然存在的 核苷酸相似的方式进行代谢。除非另外指出，具体的核酸序列还暗含涵盖 其保守性修饰的变体(例如，简并密码子取代)，等位基因，直向同源物， SNPs和互补序列以及明显指出的序列。具体地，可通过产生序列来获得简 并密码子取代，在所述序列中一个或多个选定(或所有)的密码子的第三个 位置由混和的碱基和/或脱氧肌苷残基所取代(Batzer " M/c/ez'c血Wi^s. 19:5081 (1991); OhtsukaeM/" /淑.Cta. 260:2605-2608 (1985);和 Cassol " a/ (1992); Rossolini ef a/" Mo/. Ce〃.尸roZ^ 8:91-98 (1994))。"核苷 酸"包含糖脱氧核糖(DNA)或核糖(RNA)，碱基，和磷酸基团。核苷酸通过 磷酸基团进行连接。"碱基"包括嘌呤和嘧啶，其进一步包括天然化合物腺 嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷，和天然类似物，以及 嘌呤和嘧啶的合成衍生物，其包括，但不限于取代新的反应基的修饰，所 述反应基诸如，但不限于，胺、醇、硫醇、羧酸盐(酯)和卤代烷。DNA可 以以反义、质粒DNA、质粒DNA的部分、预压縮的DNA、聚合酶链反应(PCR) 的产物、载体(P1,PAC,BAC,YAC，人工染色体)、表达盒、嵌合序列、染 色体DNA或这些组的衍生物存在。术语核酸与基因、cDNA、由基因编码 的mRNA和干扰RNA分子可替交地使用。术语"基因"指包括部分长度或全长的编码序列的核酸(例如，DNA或
RNA)序列，所述编码序列是产生多肽或多肽前体(例如，来自A,B，C,D，E， G型肝炎病毒；或单纯疱疹病毒的多肽或多肽前体)所必需的。
用于本文时，"基因产物"指基因的产物诸如包括，例如mRNA的RNA 转录物。
术语"干扰RNA"或"RNAi"或"干扰RNA序列"指双链RNA(即，双链体 RNA)，其当所述干扰RNA在与靶基因相同的细胞中时，能减少或抑制靶 基因的表达(即，通过介导与干扰RNA的序列互补的mRNAs的降解)。因此， 干扰RNA指由两个互补的链或由单个的，自我互补的链形成的双链RNA。 干扰RNA典型地具有与耙基因基本或完全的同一性。干扰RNA的序列可与 全长的耙基因或其亚序列(subsequence)—致。干扰RNA包括小的-干扰 RNA"或"siRNA"，即长度约15-60， 15-50， 15-50，或15-40 (双链体)核苷酸， 更典型地约15-30， 15-25或19-25(双链体)核苷酸的千扰RNA，并且优选地是 约20-24或约21-22或21-23(双链体)核苷酸的长度(例如，双链siRNA的每个 互补序列是15-60， 15-50, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25或19-25，优选地约 20-24或约21-22或21-23核苷酸长度，并且所述双链siRNA是约15-60, 15-50， 15-50， 15-40， 15-30， 15-25或19-25，优选地约20-24或约21-22或21-23碱基对 长度)。siRNA双链体可包括约l至约4个核苷酸，优选地约2至约3个核苷酸 的3'突出端和5 '-磷酸末端。所述siRNA可以通过化学合成或可能由质粒 编码(例如，转录为自动折叠为具有发夹环的双链体的序列)。siRNA还可 通过用大肠杆菌(A cw7) RNase ni或切酶裂解更长的dsRNA(例如，超过约 25个核苷酸长度的dsRNA)来产生。这些酶将dsRNA处理为生物活性的 siRNA (见，例如，Yang eZ a/., iWAS CZX4卯..9942-7(2002); Calegari " a/"
99: 14236(2002); Byrom W a/"爿m&ow rec/2iV0《es 10(1): 4-6 (2003); Ka麵aki ef a/"油c/ez'c31:981-7(2003); Knight和Bass， 5Wewce 293: 2269-71 (2001);禾口Robertson ef a/" /所o/. 243: 82
(1968))。优选地，dsRNA在长度上是至少50个核苷酸到约100，200，300,400 或500个核苷酸。dsRNA可以在长度上长至lOOO, 1500, 2000, 5000个核苷酸 或更长。所述dsRNA可以编码完整的基因转录物或部分基因转录物。
"基本同一性"指在严格条件下与参照序列杂交的序列，或在参照序列的具体区域上具有具体百分比同一性的序列。
短语"严格杂交条件"指这样的条件，在所述条件下，探针与其靶序列 杂交，但不与其它序列杂交，所述靶序列典型地在核酸的复杂混合物中。 严格条件是序列依赖性的并在不同的情形下是不同的。更长的序列在更高
的温度特异性杂交。对于核酸杂交的广泛指导见于Tijssen， reC/zm々M"
"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays"(1993)。通常，选定的严格条件在限定离子强度pH对于具体序列是 低于热熔点(Tm)约5-l(TC。所述Tm是这样的温度(在限定的离子强度、pH 和核酸浓度下)，在所述温度下50%的与靶标互补的探针与靶序列平衡地杂 交(当靶序列是过量存在的，在Tm， 50%的探针被平衡地占据)。严格条件 还可用添加去稳定剂诸如甲酰胺来获得。对于选择性或特异性杂交，阳性 信号至少是两倍于背景的，优选10倍于背景杂交的信号。
示范性严格杂交条件可以如下50%甲酰胺，5xSSC，禾卩in/。SDS,在 42。C温育，或5xSSC， 1%SDS，在65°〇温育，其中在65。C在0.2x SSC,和 0.1% SDS中进行洗涤。对于PCR，约36。C的温度对于低严格扩增是典型的， 尽管取决于引物的长度，退火温度可在约32'C和48X:之间变化。对于高严 格PCR扩增，约62"C的温度是典型的，尽管取决于引物长度和特异性，退 火温度可以在约5(TC和约65'C之间变化。高和低严格扩增两者的典型循环 条件包括:9(TC-95"C的变性阶段30秒到2分钟，退火阶段持续30秒到2分钟， 约72'C的延伸阶段l-2分钟。低和高严格扩增反应的方案和指导在例如， Innis o/. (1990)户Ci 尸,o/ocoZs,爿GWcfe /o她/Zzcxis1 々/7//ca//ora, Academic Press, Inc. N.Y.)中进行提供。
在严格条件下不彼此杂交的核酸仍旧是基本同一的，如果它们编码的 多肽是基本同一的。这发生在，例如，使用遗传密码允许的最大密码子简 并性产生核酸的拷贝时。在这些情形中，所述核酸典型地在适度严格杂交 条件下进行杂交。示例性"适度严格杂交条件"包括于37"C在4(P/。甲酰胺， 1MNaCl，"/。SDS的缓冲液中的杂交，和于45"C在lxSSC中的洗涤。阳性 杂交至少两倍于背景。本领域技术人员将容易地认识到选择性的杂交和洗 涤条件可用于提供相似严格性的条件。确定杂交参数的另外的指导在许多参考文献，例如Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, & "冲
进行提供。
在两个或多个核酸背景中的术语"基本上同一"或"基本同一性"指两个 或多个序列或亚序列，它们是相同的或其具体百分比的核苷酸是相同的 (即，在具体区域上至少约60%，优选地65%, 70%, 75%,优选地80%, 85%, 90%，或95%的同一性)，当如使用如下序列比较算法之一或通过手工对比和 肉眼观察进行测量，在比较窗，或指定区域上比较和对比最大对应时。当 上下文指出时，该定义还类似地指序列的互补体。优选地，所述基本同一 性存在于长度至少为约5， 10， 15， 20， 25， 30， 35， 40， 45， 50， 75， 或100个核苷酸的区域上。
对于序列比较，典型地， 一个序列充当与测试序列比较的参照序列。 当使用序列比较算法时，将测试和参照序列输入计算机，指定亚序列坐标， 如果必要，指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或可以指定 选择性的参数。接着基于程序参数，所述序列比较算法计算相对于参照序 列的测试序列的百分比序列同一性。
用于本文时，"比较窗"包括与任一个连续位置数目的片段的参比，所 述连续位置的数目选自由20-600，通常约50至约200，更通常地约100至约 150的组，其中在两个序列被优化地进行比对后，序列可以与相同数目的 连续位置的参照序列进行比较。对比序列从而进行比较的方法是本领域众 所周知的。进行比较的序列的最优对比可以通过SmithcS: Waterman, A/v. ^7/ /. M 仇2:482 (1981)的局部同源性算法，通过Needleman & Wunsch, /. Mo/. 5/o/. 48:443 (1970)的同源性对比算法，通过Pearson & Lipman, iVoc. W加？. JcW. 85:2444 (1988)的对相似性搜索的方法，通过这些算
法的计算机化执行(在Wisconsin Genetics Software Package中的GAP, BESTFIT， FASTA,和TFASTA， Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison，WI)，或通过手工对比和视觉观察(见,例如，Cwrn /尸w/oco/j/" Afo/ecw/ar历o/ogy (Ausubel , eds. 1995增补)进行。
适合于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的优选实例是 BLAST禾Q BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul Wa/,, TV"c. ^"'A/ " 25:3389-3402 (1977)和Altschul a a/.， /嵐編.215:403-410(1990)。使用BLAST和BLAST2.0，以本文描述的参数，来确定本发明的核酸和蛋白质 的百分比序列同一性。执行BLAST分析的软件是可通过National Center for Biotechnology Information(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)来公开获得。该算
法包括首先通过在待查询序列中鉴定长度W的短序列(words)来鉴定高评 分序列对(HSPs)，当与数据库序列中的相同长度的序列进行比对时，其匹 配或满足某些正值的阈值分数T。 T指邻近的序列评分阈值(Altschul W /.， 同上)。这些起始的邻近字命中(hits)充当起始搜索的开端来寻找更长的 包含它们的HSPs。只要累积对比评分可被增加，字节命中沿每个序列在两 个方向上延伸。对于核苷酸序列，使用参数M(对于每对匹配残基的奖赏评 分； 一直X))和N(对于不匹配残基的惩罚评分； 一直<0)，来计算累积评分。 对于氨基酸序列，将评分矩阵用于计算累积评分。当累积对比评分从其最 大获得值下降数量X时，每个方向中的字节命中的延伸中断；由于一个或
多个负评分残基对比的聚集，累积评分到达0或更低；或达到任一序列的
末端。所述BLAST算法参数W,T,和X确定序列对比的敏感性和速度。所述 BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用作为默认值的字长(W)ll，预期值 (E)IO， M=5， N二-4和两条链的比较。对于氨基酸序列，所述BLASTP程 序使用作为默认值的字长3，预期值(E)IO，和BLOSUM62评分矩阵(见， Henikof汲Henikoff，尸rac. 7V^/. ^cad 5W. 89:10915(1989))，序列比对 (B)50，预期值(E)10, M=5， N;4和两条链的比较。
所述BLAST算法还进行两个序列之间相似性的统计学分析(见，例如， Karlin & Altschul,尸toc, .Sc/. 90:5873-5787(1993))。由 BLAST算法提供的相似性的一个措施是最小的总和或然性(P(N))，其提供 或然性的指示，通过它，在两个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配将偶然发 生。例如，如果在测试核酸和参照核酸比较中的最小总和或然性少于约0.2， 更优选地少于约0.01，并且最优选地少于约0.001，认为核酸与参照序列相 似。
短语"抑制靶基因的表达"指本发明的siRNA启动使靶基因沉默的基因 的能力。为了确定基因沉默的程度，将目标生物或培养物中的细胞的样品 或测定与对照样品进行比较，所述目标生物或培养物的细胞表达具体构建 体，所述对照不表达所述构建体。将对照样品(缺乏构建体的表达)设定为100%的相对值。当相对于对照的测试值是约90%，优选地50%，更优选地 25-0%时，成功获得对靶基因的表达的抑制。合适的测定包括，例如，使 用本领域技术人员已知的技术诸如点渍法、RNA印迹法、原位杂交、 ELISA、免疫沉淀法、酶作用、以及本领域技术人员已知的表型测定来检 测蛋白质或mRNA水平。
"核酸"指以单或双链形式存在的脱氧核苷酸或核苷酸及其聚合物。术 语涵盖包含这样的核酸，其包含已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或 键，其是合成的、天然存在的和天然不存在的，其具有与参照核酸相似的 结合性质，并且其以与参照核苷酸相似的方式进行代谢。这些类似物的实 例包括，但不限于，硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸甲酯、手性-磷酸甲酯、 2-0-甲基核苷酸、肽-核酸(PNAs)。
所谓使基因或核酸"沉默"或"下调"倾向于指与在缺乏干扰RNA或其 它核酸序列时检测到的水平相比，靶核酸序列，即被RNAi靶向的序列翻 译的可检测的减少，或在靶序列或蛋白质的量或活性中的减少。可检测 的减少可以小到约5%或10%，或大到约80%， 90%或100%。更典型地， 可检测到的减少是约20%， 30%， 40%， 50%， 60%，或70%。
siRNA的"治疗有效量"或"有效量"是足以产生理想效果的量，所述理 想效果是例如与在缺乏siRNA时检测到的正常表达水平比较靶序列表达的 减少。
用于本文时，术语"水溶液"指全部或部分包含水的组合物。 用于本文时，术语"有机脂质溶液"指全部或部分包含具有脂质的有机 溶剂的组合物。
用于本文时，"远端位点"指物理上的分离位点，其不限于邻近的毛细 血管床，而包括广泛分布于整个生物体的位点，在一些实施方案中，远端 位点指在物理上与疾病位点(例如，肿瘤位点，炎症位点，或感染位点)分 离的位点。
与核酸-脂质颗粒相关的"血清-稳定性"指在暴露于将显著降解游离 DNA的血清或核酸酶测定后不被明显降解的颗粒。合适的测定包括，例如， 标准血清测定或DNAse测定诸如那些在下面的实施例中描述的。
用于本文时，"全身传递"指导致化合物在生物体广泛生物分布的传递。 一些施用的技术可以导致某些化合物的全身传递，但是不能导致其它 化合物的全身传递。全身传递指有效的，优选地，治疗量的化合物与身体 的大部分接触。为了获得广泛的生物分布，通常需要血液生存期从而使化 合物在到达施用位点远端的疾病位点前，不被迅速降解或清除(诸如通过初 次通过器官(肝、肺等))或通过迅速、非特异性的细胞结合)。核酸-脂质颗 粒的全身传递可以以本领域已知的任何方式进行，所述方式包括，例如， 静脉内、皮下、腹膜内，在一个优选的实施方案中，核酸-脂质颗粒的全身 传递是通过静脉内的传递。
用于本文时，"局部传递"指在生物体内，化合物直接向靶位点的传递。 例如，化合物可以通过直接注射到疾病位点诸如肿瘤或其它靶位点诸如炎 症位点或靶器官诸如肝、心脏、胰腺、肾等来进行局部传递。
III.稳定的核酸-脂质颗粒
本文描述的稳定的核酸-脂质颗粒(SNALPs)典型地包括核酸(例如， siRNA序列或编码siRNA序列的DNA序列)、阳离子脂质、非阳离子脂质和 双层稳定组分诸如，例如抑制SNALPs的聚集的缀合的脂质。本发明的 SNALPs具有小于约150nm的平均直径并且是基本无毒的。此外，包封在 本发明的SNALPs中的核酸在水溶液中对于用核酸酶进行的降解是具有抗 性的。
A.阳离子脂质
各种合适的阳离子脂质可以单独或与一个或多个其它的阳离子脂质 种类或中性脂质种类结合而在本文描述的SNALPs中进行使用。
有效用在本发明中的阳离子脂质可以是许多脂质种类中的任何一种， 其在生理pH上携带净正电荷，例如DODAC， DOTMA， DDAB， DOTAP, DOSPA, DOGS， DC-Chol和DMRIE，或其组合。还有效用在本发明中的 许多这些脂质和相关类似物已经在美国专利号5,208,036， 5,264.618， 5,279,833, 5,283,185, 5，753，613和5，785，992中有所描述，将其每个的发明内
容并入本文作为参考。
阳离子脂质典型地包括在所述颗粒中存在总脂质的约2。/。至约60Q^，优选地在所述颗粒中出存在的总脂质的约5%至约45%。在某些优选的实 施方案中，阳离子脂质包括在所述颗粒中存在的总脂质的约5%至约15%。 在其它优选的实施方案中，所述阳离子脂质包括在所述颗粒中出现的总脂 质的约40%至约50%。取决于核酸-脂质颗粒的倾向用途，所述组分的比例 发生变化并且具体制剂的传递效率可使用内体释放参数(ERP)试验进行测 量。例如，对于全身传递，所述阳离子脂质可以包括在所述颗粒中存在的 总脂质的约5%至约15%，并且对于局部或区域性传递，所述阳离子脂质包 括在所述颗粒中存在的总脂质的约40%—约50 % 。
B.非阳离子脂质
本文描述的SNALPs的非阳离子脂质组分可以是能产生稳定复合体的 多种中性不带电荷、两性离子或阴离子脂质的任一个。它们优选地是中性 的，尽管它们可以替代地是带阳性或阴性电荷的。有效用在本发明中的非 阳离子脂质的实例包括磷脂相关物质，诸如卵磷脂，磷脂酰乙醇胺，溶 血卵磷脂，溶血磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰肌苷，神经鞘磷脂， 脑磷脂,心磷脂，磷脂酸，脑苷酯，联十六烷基磷酸酯、二硬脂酰磷脂酰胆 碱(DSPC)， 二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC), 二油 酰磷脂酰甘油(DOPG)，棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG), 二棕榈酰磷脂酰 甘油(DPPG), 二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，棕榈酰油酰磷脂酰胆碱 (POPC)，棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-马 来酰亚胺基甲基)-环已烷-l-羧酸酯(DOPE-mal)。非阳离子脂质或固醇诸如 胆固醇可以存在。另外的不包含磷的脂质是例如，十八胺，十二胺，十六 胺，乙酰基十六烷酯，甘油蓖麻醇酸酯，硬脂酸十六烷基酯，十四烷酸异 丙酯，两性丙烯酸酯类聚合物，三乙醇胺-硫酸月桂酯；垸基-芳基硫酸酯 聚乙氧基化(polyethyloxylated)脂肪酸酰胺，双十八烷基二甲基溴化铵等， 二酰基磷脂酰胆碱，二酰基磷脂酰乙醇胺，神经酰胺，神经鞘磷脂，脑磷 脂和脑苷脂。其它的脂质诸如溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰乙醇胺可存 在。非阳离子脂质还包括基于聚乙二醇的聚合物诸如PEG2000， PEG 5000 和与磷脂或与神经酰胺缀合的聚乙二醇(称为PEG-Cer)，如在美国专利号 5,820，873，中所描述的，将其并入本文作为参考。在优选的实施方案中，非阳离子脂质是二酰基磷脂酰胆碱(例如，二硬 脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱和二亚油酰磷 脂酰胆碱)，二酰基磷脂酰乙醇胺(例如，二油酰磷脂酰乙醇胺和棕榈酰油 酰磷脂酰乙醇胺)，神经酰胺或神经鞘磷脂。在这些脂质中的酰基基团优选 是衍生自具有C『C24碳链的脂肪酸的酰基基团。更优选地，所述酰基基团 是月桂酰、十四烷酰、棕榈酰、硬脂酰或油酰。在特别优选的实施方案中， 非阳离子脂质将包括一个或多个胆固醇、1，2-M-二油酰磷脂酰乙醇胺，或
卵神经鞘磷脂(ESM)。
所述非阳离子脂质典型地包括在所述颗粒中存在的总脂质的约5%至 约90%,优选地包括在所述颗粒中总脂质的约20%至约85%。所述 PEG-DAG缀合物典型地包括在所述颗粒中总脂质的1 %至约20 % ，优选地 包括在所述颗粒中总脂质的4%至约15 。％ 。本发明的核酸-脂质颗粒还可包 括胆固醇。如果存在，所述胆固醇典型地包括在所述颗粒中存在的总脂质 的约10%至约60%，优选地包括在所述颗粒中总脂质的约20。％至约45%。
C.双层稳定组分
在一个实施方案中，所述SNALP还包括双层稳定组分(BSC)。合适的 BSCs包括，但不限于，聚酰胺低聚物、肽、蛋白质、去污剂、脂质衍生物、 PEG-脂质，诸如与二垸氧基丙基(PEG-DAA)偶联的PEG，与二酰基甘油偶 联的PEG(PEG-DAG)，与磷脂酰乙醇胺(PE)偶联的PEG(PEG-PE)，或与神 经酰胺缀合的PEG，或其混合物(见，美国专利号5，885,613，将其并入作为 参考)。在一个实施方案中，双层稳定组分是PEG-脂质，或ATTA-脂质。 在一个优选的实施方案中，所述BSC是抑制SNALPs聚集的缀合的脂质。 合适的缀合的脂质包括，但不限于PEG-脂质缀合物、ATTA-脂质缀合物、 阳离子-聚合物-脂质缀合物(CPLs)或其混合物。在一个优选的实施方案中， 所述SNALPs包括与CPL—起的PEG-脂质缀合物或ATTA-脂质缀合物。
典型地，双层稳定组分存在的范围是所述颗粒中出现的总脂质的约 0.5%至约50%。在一个优选的实施方案中，所述双层稳定组分的存在在所 述颗粒中的总脂质的约0.5%至约25%。在其它优选实施方案中，所述双层 稳定组分的存在在所述颗粒中总脂质的约1%至约20%，或约3%至约15%或约4%至约10%。本领域技术人员将理解双层稳定组分的浓度可以取决 于使用的双层稳定组分以及脂质体成为融合的速度而变化。
通过控制组合物和双层稳定组分的浓度，可以控制双层稳定组分交换 出脂质体的速度并且再控制脂质体成为融合的速度。例如，当将聚乙二醇 -磷脂酰乙醇胺缀合物或聚乙二醇神经酰胺缀合物用作双层稳定组分时，例 如通过改变双层稳定组分的浓度，通过改变聚乙二醇的分子量，或通过改 变在磷脂酰乙醇胺或神经酰胺上的酰基链基团的链长度和饱和程度，脂质 体成为融合的速度可以变化。此外，其它的变量，包括，例如pH、温度、 离子强度等可以用于改变和/或控制脂质体成为融合的速度。阅读本说明书 后，本领域技术人员将清楚可用于控制脂质体成为融合的速度的其它方 法。
1. 二酰基甘油-聚乙二醇缀合物
在一个实施方案中，双层稳定组分包括二酰基甘油-聚乙二醇缀合物， 即DAG-PEG缀合物或PEG-DAG缀合物。在一个优选的实施方案中，所述 DAG-PEG缀合物是二月桂基甘油(Q2)-PEG缀合物、双十四烷基甘油((:14) -PEG缀合物(DMG)， 二棕榈酰甘油(d6)-PEG缀合物或二硬脂基甘油 (ds)-PEG缀合物(DSG)。本领域技术人员将容易地理解其它二酰基甘油可 以用在本发明的DAG-PEG缀合物中。用在本发明中的合适的DAG-PEG缀 合物和制备及使用它们的方法公开于被公布作U.S.P.A 2003/0077829的美 国申请号10/136,707，和PCT专利申请号CA02/00669中，将其每个的全部 内容并入作为参考。
2. 二烷氧基丙基缀合物
在另一个实施方案中，双层稳定组分包括二烷氧基丙基缀合物，即 PEG-DAA缀合物。在一个优选的实施方案中，所述PEG-DAA缀合物具有 下式 ，
<formula>formula see original document page 30</formula>在式I中，W和W被独立地进行选择并且是具有约10至约22个碳原子 的长链垸基基团。长链垸基基团可以是饱和的或不饱和的。合适的烷基基
团包括，但不限于，月桂基(d2)、十四烷基(d4)、十六烷基(d6)、十八烷
基(ds)和icosyl (C加)。在优选的实施方案中，Ri和W是相同的，即R3口R2 都是十四烷基(即双十四烷基)，R'和W都是十八烷基(即双十八烷基)等。 在式I中，PEG是具有约550至约8，500道尔顿的平均分子量的聚乙二醇。 在一个优选的实施方案中，所述PEG具有约1000 —约5000道尔顿的平均 分子量，更优选地，约1,000至约3，000道尔顿的平均分子量并且甚至更优 选地，约2000道尔顿的平均分子量。所述PEG可以任选地被烷基、垸氧 基、酰基或芳基基团所取代。在式I中，L是接头部分。可以使用任何适合 于将PEG偶联到二烷氧基丙基主链的接头部分。合适的接头部分包括，但 不限于，酰氨基(-C(O)NH-)、氨基(-NR-)、羰基(-C(O)-)、碳酸酯(O-C(O)O-)， 氨基甲酸酯(-NHC(O)O-)，尿素(-NHC(O)NH-)，琥珀酰 C-(0)CCH2CH2C(OK)，醚，二硫化物和其组合。其它合适的接头是本领域 众所周知的。
可以将磷脂酰乙醇胺与聚乙二醇缀合从而形成双层稳定组分，所述磷 脂酰乙醇胺具有不同链长度和饱和程度的各种酰基链基团。这些磷脂酰乙 醇胺是可商购的，或可以使用那些本领域技术人员已知的常规技术来分离 或合成。包含饱和的或不饱和的脂肪酸的磷脂酰乙醇胺是优选的，其具有 在do-C2()范围内的碳链长度。还可以使用这样的磷脂酰乙醇胺，其具有单 或双不饱和脂肪酸及饱和和不饱和脂肪酸的混合物。合适的磷脂酰乙醇胺 包括，但不限于，如下双肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)， 二棕榈酰磷 脂酰乙醇胺(DPPE), 二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和二硬脂酰磷脂酰乙醇 胺(DSPE)。
如磷脂酰乙醇胺，神经酰胺可以与聚乙二醇偶联从而形成双层稳定组 分，所述神经酰胺具有不同链长度和饱和程度的多个酰基链基团。本领域 技术人员将清楚的是与磷脂酰乙醇胺比较，神经酰胺仅具有一个酰基基 团，所述酰基基团可以根据其链长度和饱和程度来容易地进行变化。适合 于按照本发明应用的神经酰胺是可以商购的。此外，使用众所周知的分离 技术可以例如从卵和脑中分离神经酰胺，或使用在美国专利号5,820,873中公开的方法和技术来合成它们，将美国专利号5，820，873并入本文作为参 考。使用在前述申请中提出的合成途径，可以制备具有饱和或不饱和脂肪
酸的神经酰胺，所述脂肪酸具有在<:2-(:31范围内的碳链长度。
3.阳离子聚合物脂质
还可将阳离子聚合物脂质(CPLs)用在本文所述的SNALPS中。合适的 CPL典型地具有如下的结构特色(l)将CPLs结合到脂双层中的脂质锚，诸 如疏水脂质；(2)将脂质锚定于阳离子头部基团的亲水间隔臂，诸如聚乙二 醇；和(3)产生可质子化的阳离子头部基团的聚阳离子部分，诸如天然存在 的氨基酸。用在本发明中的合适的SNALPs和SNALP-CPLs，以及制备使用 SNALPs和SNALP-CPLs的方法公开于例如美国申请号09/553,639和 09/839,707 (公布为U.S.P.A. 2002/0072121)中和PCT专利申请号CA 00/00451(公布为WO00/62813)中，将其每个全文并入本文作为参考。
简而言之，本发明提供式II的化合物
A—W—Y I
其中A， W和Y如下。
参考式II， "A"是脂质部分诸如两亲性脂质，中性脂质或充当脂质锚的 疏水性脂质。合适的脂质实例包括小泡-形成脂质或小泡采用脂质并包括， 但不限于二酰基甘油基、二垸基甘油基、N-N-二烷基氨基、1，2-二酰氧基 -3-氨基丙垸和1,2-二垸基-3-氨基丙垸。
"W"是聚合物或低聚物，诸如亲水性聚合物或低聚物。优选地，亲水 性聚合物是生物相容的聚合物，其是非免疫原性的或具有低内在免疫原 性。或者，如果与合适的佐剂一起使用，所述亲水聚合物可以是弱抗原性 的。合适的非免疫原性聚合物包括，但不限于，PEG、聚酰胺、聚乳酸、 聚乙醇酸、聚乳酸/聚乙醇酸共聚物及其组合。在一个优选的实施方案中， 所述聚合物具有约250至约7000道尔顿的分子量。
"Y"是聚阳离子部分。所述术语聚阳离子部分指化合物、衍生物，或 在选定的pH，优选生理pH上带正电荷、优选地带至少2个正电荷的官能团。 合适的聚阳离子部分包括碱性氨基酸和它们的衍生物诸如精氨酸、天冬酰 胺、谷氨酰胺、赖氨酸和组氨酸；精胺；亚精胺；阳离子树状聚体；聚胺;聚胺糖；和氨基多糖。所述聚阳离子部分在结构上可以是线性的诸如线性 四赖氨酸(tetmlysine)、支链或树状聚体。聚阳离子部分在选定的pH值，具 有介于约2—约15个之间的正电荷，优选地具有约2至约12之间的正电荷， 并且更优选地具有介于约2至约8个之间的正电荷。选择使用的聚阳离子部 分的类型可以通过理想的脂质体应用的类型来进行确定。
在聚阳离子部分上的电荷可以分布在整个脂质体部分周围或，它们可 以是在脂质体部分的一个具体区域中电荷密度的不连续集中，例如电荷突 起。如果电荷密度分布在脂质体上，电荷密度可以相等地分布或不相等地 分布。聚阳离子部分的电荷分布的所有变化包含在本发明中。
脂质"A"和非免疫原性的聚合物"W"可以通过各种方法以及优选地通 过共价连接进行连接。本领域那些技术人员已知的方法可以用于"A"和 "W"的共价连接。合适的键合物包括，但不限于，酰胺、胺、羧基、碳酸 酯、氨基甲酸酯、酯和腙键合物。本领域技术人员将清楚的是"A"和"W" 必需具有互补的官能团从而完成所述键合。这样两个官能团的反应将提供
理想的键合，所述官能团一个在脂质上并且另一个在聚合物上。例如，当 所述脂质是二酰基甘油并且所述末端羟基被用例如NHS和DCC激活从而 形成活性酯，接着与包含氨基基团的聚合物诸如与聚酰胺反应时(见，美国 专利号6，320，017和6,586,559，其都并入作为参考)，酰胺键将在两个基团 之间形成。
在某些情形中，聚阳离子部分可以具有连接的配体诸如靶向配体或络 合钙的鳌合部分。优选地，在所述配体连接后，所述阳离子部分维持正电 荷。在某些情形中，连接的配体具有正电荷。合适的配体包括，但不限于， 具有反应官能团的化合物或装置并包括脂质，两亲性脂质，载体化合物， 生物亲和性化合物，生物材料，生物聚合物，生物医用装置，在分析上可 检测的化合物，治疗上有活性的化合物，酶，肽，蛋白质，抗体，免疫剌 激物，放射性标记，荧光，生物素，药物，半抗原，DNA， RNA，多糖， 脂质体，病毒体，微团，免疫球蛋白，官能团，其它靶向部分或毒素。 D.siRNA
SNALPs的核酸组分典型地包括可以以数种形式提供的干扰RNA(即， siRNA)，所述形式包括，例如， 一个或多个分离的小-干扰RNA(siRNA)双链体，更长的双链RNA (dsRNA)或翻译自DNA质粒中转录盒的siRNA或 dsRNA。
RNA群可以用于提供长的前体RNAs，或与可用于制备siRNA的选定 靶序列具有基本或完全同一性的长前体RNAs。所述RNAs可以按照本领域 技术人员中众所周知的方法来从细胞或组织中分离，合成，和/或克隆。所 述RNA可以是混和的群(获自细胞或组织，转录自cDNA，扣除的 (subtracted),选择等)，或可以代表单一靶序列。RNA可以是天然存在的， 例如分离自组织或细胞样品，例如使用T7或SP6聚合酶和PCR产物或克隆 的cDNA在体外合成的；或以化学方法合成的。
为了形成长dsRNA，对于合成性RNAs，互补体还可以在体外转录并 杂交以形成dsRNA。如果使用天然存在的RNA群，例如通过转录相应于 RNA群的cDNAs，或通过使用RNA聚合酶，还提供了RNA互补体(例如， 形成dsRNA,其通过大肠杆菌(& //)1^八86111或切酶进行消化)。接着前 体RNA杂交以形成双链RNAs从而消化。所述dsRNAs可直接被包封在 SNALPs中或可在包封前被体外消化。
或者，可以将一个或多个编码一个或多个siRNA模板的DNA质粒包封 在核酸-脂质颗粒中。例如，基于小核RNAU6或人RNasePRNAHl的天然 存在转录单位，可以从质粒中的DNA模板将siRNA转录为自动折叠为具有 发夹环的双链体的序列，所述质粒具有RNA聚合酶m转录单位卩见， Brummelkamp， "a/. ， <SWewce 296:550 (2002》Donz6， efa/, M/c/e/c
30:e46 (2002); Paddison， & a/., Dev. 16:948 (2002); Yu， W a/.，
TVoc. iVaf/. ^cad Sci. 99:6047(2002); Lee， ef a/., iVaf. Bzo&c/z. 20:500 (2002); Miyagishi， Wa/.,^A/i^. 5z.o&c/z. 20:497(2002); Paul, e/a/.,7VaA S/ofec/ . 20:505 (2002);和Sui， "a/., iVoc. A^/.血ac/. Sc/. 99:5515 (2002》。典型地，转 录单位或盒将包含RNA转录启动子序列，诸如H1-RNA或U6启动子和终止 序列，所述启动子序列可操作地与转录所需siRNA序列的模板连接，所述 终止序列包括2-3个尿苷残基和聚胸苷(T5)序列(多腺苷酸化信号) (Brummelkamp， 5Wewce,同上)。选定的启动子可以提供组成性或可诱导的 转录。将组合物和DNA-指导的RNA干扰分子的转录的方法详细描述于美 国专利号6,573,099，将其并入本文作为参考。优选地，所述合成性或转录的siRNA具有约l-4个，优选地约2-3个核苷酸的3'突出端以及5，磷酸末端 (Elbashir， "a/.， Z)ev. 15:188 (2001); Nyk組en， efa/., Ce〃 107:309
(2001))。将转录单位结合到质粒或DNA载体中，干扰RNA转录自所述质粒 或DNA载体。将适合于体内传递遗传物质用于治疗目的的质粒详细描述于 美国专利号5,962，428和5，910,488中，它们两者都结合到本文作为参考。选 定的质粒可以提供靶细胞的瞬时或稳定的传递。本领域那些技术人员将清 楚的是起初被设计用于表达所需基因序列的质粒可以被进行修饰从而包 含转录siRNA的转录单位盒。
分离RNA，合成RNA，杂交核酸，制备和筛选cDNA文库以及进行PCR 的方法是本领域众所周知的(见，例如.，Gubler&Hoffinan， 25:263-269(1983); Sambrook W a/.,同上；Ausubel e^/.，同上)，PCR方法 也是这样(见美国专利4，683,195和4，683,202; PC7 /Votoco/r ^ GWcfe to MeAoA om/J/^/Zco^ora (Innis eM/.， eds, 19卯))。表达文库也是本领域技术 人员众所周知的。公开用在本发明中的一般方法的另外的基本书籍包括 Sambrook ef a/" Afo/ecw/ar C7o"/"g, j丄a6onato^y Afowwa/ (2nd ed. 1989); Kriegler, (7ewe 7"rara/er 五xpmwz.o/r yi丄a6orato^y Afa"wa/(799C^;禾卩 Ci/n-e"f /Votoco/s Afo/ecM/ar 5z'o/ogy (Ausubel & a/., eds. ， 1994))。
1.耙基因
通常，传递SNALPS从而使目标基因产物的翻译(即，表达)下调或沉 默是理想的。基因产物的合适的分类包括，但不限于，与病毒感染和存活 相关的基因，与代谢疾病和病症(例如，其中肝作为耙的疾病和病症，和肝 疾病和病症)相关的基因，与肿瘤发生和细胞转化相关的基因，生血管基因， 免疫调节剂基因诸如与炎症和自身免疫应答相关的那些，配体受体基因和 与神经变性病症相关的基因。
与病毒感染和存活相关的基因包括通过病毒表达从而结合，进入并在 细胞中复制的那些。与慢性病毒疾病相关的病毒序列是特别感兴趣的。特 别感兴趣的病毒序列包括肝炎病毒的序列(Hamasaki， a a/., 543:51 (2003); Yokota， W"/,五MBOi ep. 4:602 (2003); Schlomai， e/a/., //e/ ato/ogy 37:764 (2003); Wilson， Wa/., iVoc.A^仏Jcad 100:2783(2003); Kapadia， /Voc.胸/.颠d 5W. 100:2014 (2003);和F正LDS
VIROLOGY (Knipe e a/. eds. 2001))，人免疫缺陷病毒(HIV)(Banerjea， & a/., Afo/ 772". 8:62 (2003); Song,a/., / K/ro/. 77:7174 (2003); Stephenson 289:1494 (2003); Qin， 尸亂歸.颠"".100:183 (2003))，
疱疹病毒(Jia， efa/., J! F/to/. 77:3301 (2003))，和人乳头状瘤病毒(HPV) (Hall, a/., / Wra/. 77:6066 (2003); Jiang， W a/., O腳g簡21:6041 (2002))。
可以被沉默的示例性肝炎病毒核酸序列包括，但不限于涉及转录和翻译
的核酸序列(例如；Enl，En2，X,P)，编码结构蛋白质的核酸序列(例如，包 括C和C相关的蛋白质的核心蛋白；包括S， M，禾Q/或L蛋白质的衣壳和包 膜蛋白质，或其片段Y见，例如，FIELDS VIROLOGY, 2001，同上)。可以 被沉默的丙型肝炎核酸序列包括但不限于丝氨酸蛋白酶(例如， NS3/NS4)，解旋酶(例如，NS3)，聚合酶(例如，NS5B)和包膜蛋白(例如， El, E2,和p7)。甲型肝炎核酸序列在例如Genbank登记号NC—001489中提及； 乙型肝炎核酸序列在例如Genbank登记号NCJ)03977中提及；丙型肝炎核 酸序列在例如Genbank登记号NC—004102中提及；丁型肝炎核酸序列在例 如Genbank登记号NC—001653中提及；戊型肝炎核酸序列在例如Genbank 登记号NCJ)01434中提及；并且G型肝炎核酸序列在例如Genbank登记号 NC—001710中提及。使编码与病毒感染和存活相关的基因的序列沉默可以 方便地与用于治疗病毒疾病的常规药剂的施用结合来进行使用。
与代谢疾病和病症(例如，其中肝被靶向的病症和肝疾病以及病症)相 关的基因包括，例如，在例如血脂异常(例如，肝X受体(例如，LXRa和LXR(3 Genback登记号NM—007121))，类法尼醇X受体(FXR)(Genbank登记号 NM_005123)，固醇调节元件结合蛋白质(SREBP),位点-l蛋白酶(SlP)， 3-羟基-3-甲基戊二酰基辅酶-A还原酶(HMG辅酶-A还原酶)，载脂蛋白 (ApoB)，和载脂蛋白(ApoE))和糖尿病(例如，葡糖-6-磷酸)中表达的基因 (见，例如，Forman " a/., Ce〃 81:687 (1995); Seol W a/., Afo/. 5"cfocW"o/. 9:72 (1995), Zavacki "a/.，iWJ51 94:7909(1997); Sakai, "a/., Ce// 85:1037-1046 (1996); Duncan, Wa/" J. 5z'o/.C/zem. 272:12778-12785 (1997); Willy, " a/" Ge腦Dev. 9(9): 1033-45(1995); Lehmann, " a/., /編.Cta. 272(6):3137-3140 (1997); Janowski， Wa/" A^we 383:728-731(199; Peet, W"/., Ce〃93:693-704 (1998))。本领域技术人员将理解与代谢疾病和病症(例 如其中肝被靶向的疾病和病症以及肝疾病和病症)相关的基因包括在肝本 身中表达的基因以及在其它器官和组织中表达的基因。使编码与代谢疾病 和病症相关的基因的序列沉默可以方便地与用于治疗所述疾病或病症的 常规药剂的施用结合来进行使用。
与肿瘤发生和细胞转化相关的基因的实例包括易位序列诸如MLL融 合基因，BCR-ABL(Wilda， ef a/., (9"cogewe， 21:5716(2002); Scherr， " a/, 5/oodl01:1566)， TEL腸AML1， EWS-FLIl， TLS-FUS， PAX3-FKHR， BCL-2, AML1-ET0和AML1 -MTG8 (Heidenreich, " a/., 101:3157(2003));过
度表达的序列诸如多药物抗性基因(Nieth,5^5.7W(2003); Wu， C瞎wM 63:1515 (2003))，细胞周期蛋白(Li， "a/., C薩w
7 仏63:3593 (2003); Zou， Wa/., Dev. 16:2923 (2002))， |3-联蛋白
(Verma， ef a/.， C/Z" Ca"cw/ 饥9:1291 (2003))，端粒末端转移酶基因 (Kosciolek， e a/" Mo/ C""cer2:209 (2003))， c-MYC， N-MYC， BCL-2, ERBB1和ERBB2 (Nagy, W a/.Ce〃i 仏285:39(2003));和突变序列诸 如RAS (综述于Tuschl和Borkhardt， Mo/./打&n;e""o"" 2:158(2002))。使 编码DNA修复酶的序列沉默与化疗剂的施用结合使用(Collis, e/a/.， C""cer i 仏"50(2003))。编码与肿瘤迁移相关的蛋白质的基因也是目标靶序 列，所述蛋白质，例如整联蛋白、选择蛋白和金属蛋白水解酶。前述实例 并不是排外的。可以将有利于或促进肿瘤发生或细胞转化，肿瘤生长或肿 瘤迁移的任何完整或部分基因序列包括进来作为模板序列。
生血管基因能够促进新血管的形成。血管内皮生长因子(VEGF)是特别 感兴趣的(Reich, "a/., Mo/. P7s. 9:210 (2003))。
免疫调节剂基因是调节一个或多个免疫应答的基因。免疫调节剂基因 的实例包括细胞因子诸如生长因子(例如，TGF-a， TGF-p, EGF, FGF， IGF, NGF, PDGF， CGF, GM-CSF， SCF，等)，白细胞介素(例如.，IL-2, IL-4, IL-12 (Hill, ef a/., J /mmw"o/. 171:691(2003))， IL-15， IL-18, IL-20,等),干扰素(例 如，IFN-a， IFN-卩，IFNi，等)和TNF。 Fas禾口Fas配体基因也是目标免疫调节 剂靶序列(Song, a/., Ato. MW. 9:347 (2003))。在造血和淋巴样细胞中编码 次级信号分子的基因也包括在本发明中，例如，Tec家族激酶，诸如Bruton's酪氨酸激酶(Btk) (Heinonen,F五5S丄幼.527:274(2002))。
细胞受体配体包括这样的配体，其能结合细胞表面受体(例如，胰岛 素受体、EPO受体、G-蛋白质偶联受体、具有酪氨酸激酶活性的受体、细 胞因子受体、生长因子受体等)以调节(例如，抑制，激活等)受体涉及的生 理途径(例如，葡萄糖水平调节、血液细胞发展、有丝分裂发生等)。细胞 受体配体的实例包括细胞因子、生长因子、白细胞介素、干扰素、促红细 胞生成素(EPO)、胰岛素、胰高血糖素、G-蛋白质偶联受体配体等)。编码 三核苷酸重复序列(例如，CAG重复序列)扩张的模板发现用于使在神经变 性疾病中的病原序列沉默，所述疾病由三核苷酸重复序列的扩张所引起， 诸如脊髓延髓肌肉萎縮和亨廷顿病(Caplen， Wa/.， /^m. Mo/. 11:175 (2002))。
IV.制备SNALPs
本发明提供制备血清稳定性核酸脂质颗粒，从而使核酸(例如，siRNA 或编码siRNA的质粒)被包封在脂双层中并被保护以免于降解的方法。通过 本发明的方法制备的SNALPs直径典型地是约50至约150nm。它们通常具有 小于约150nm的中位数直径，更典型地具有少于约100nm的直径，其中大 部分颗粒具有约65至约85nm的中位数直径。通过使用本领域已知的任何方 法来形成所述颗粒，所述方法包括，例如去污剂透析方法或通过改进反相 方法，所述反相方法利用有机溶剂来在混和成分的过程中提供单相。不倾 向于被任何具体形成机制所束缚，质粒或其它核酸(即，siRNA)与阳离子 脂质的去污剂溶液接触从而形成被包被的核酸复合体。这些被包被的核酸 可以聚集并沉淀。然而，去污剂的存在减少了这种聚集并且使被包被的核 酸与过量脂质(典型地，非阳离子脂质)接触从而形成颗粒，在所述颗粒中， 质粒或其它核酸被包封在脂双层中。下面描述的使用有机溶剂形成核酸-脂质颗粒的方法按照相似的方案。制备SNALPS的示范性方法公开于美国 专利号5，705,385; 5,981,501; 5,976,567; 6,586,410; 6，534，484;美国申请 系列号09/553,639; U.S.P.A.
发明者E·G·安贝吉亚, I·麦克拉克伦, J·海斯 申请人:普洛体维生物治疗公司