专利名称：含有间叶细胞作为有效成分、治疗脑神经疾病的体内给药治疗剂的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及用于体内给药的脑神经疾病治疗制剂(agents)，其中包含间叶细胞，尤其是骨髓细胞、脐血细胞或外周血细胞，或来源于这些细胞的细胞作为有效成分。
背景技术：
近年来再生医学技术已成为众人关注的焦点。通过再生医学技术，人体天生的固有的再生愈合功能不能治愈的病症，可以通过外科手术把自体细胞人工增殖产生的再生器官等接在受损部位而治愈。这种治疗方法已在多种不同领域取得了成功。
少突神经胶质(少突胶质细胞)(请参考非专利文件1-3)或髓鞘形成细胞如雪旺(Schwann)细胞(请参考非专利文件4、2、5)或嗅盖细胞(olfactoryensheathing cells)(请参考非专利文件6-8)的移植，可以在动物模型中引起再髓化，且电生理功能可以恢复(请参考非专利文件9和5)。从患者或他人身上制备用于细胞治疗的这些细胞并非不可能，问题在于组织材料必须从脑或神经采集。
已知起源于脑的神经祖细胞或干细胞有自我增殖的能力，且可以分化为各个谱系的神经元和神经胶质细胞(请参考非专利文件10-13)。从胚胎组织采集的人神经干细胞，移植到新生小大鼠脑中，可以分化形成神经元和星形胶质细胞(请参考非专利文件14-16)，并可以使轴索再髓化(请参考非专利文件17)。已有研究报道取自成人脑组织的神经祖细胞植入脱髓鞘的啮齿类动物的脊髓后，可以产生再髓化和神经冲动传导的修复(请参考非专利文件18)。
上述研究引发了广泛的兴趣，因为它们提示了应用上述细胞对神经疾病进行修复策略的可能性(请参考非专利文件18、14-16、19)。
近期的研究显示神经干细胞可在体内产生造血细胞，提示神经祖细胞并非仅限于分化成神经细胞系(请参考非专利文件20)。此外，将骨髓间质细胞注入新生小大鼠的侧脑室中，有极小部分分化为表达星形胶质细胞标记物的细胞(请参考非专利文件21)。有报道表明，在体外适宜的细胞培养条件下，骨髓间质细胞可产生数量极少的表达神经系统细胞标记物的细胞，但这些细胞是否可用于神经再生目前尚未确定(请参考非专利文件22)。
本发明的发明者先前已经从成人脑组织中提取并培养了神经系统细胞(神经干细胞、神经祖细胞)，并建立了一些细胞株系(celllines)。通过研究这些细胞的功能，本发明的发明者发现神经干细胞具多能性并可自我复制(请参考非专利文件18)。具体地说，取自成人脑组织的神经祖(干)细胞的单细胞扩增可被用于建立细胞株系，然后可应用这些细胞株进行体外克隆分析。结果显示这些细胞株具有多能性(即具有分化为神经元、星形神经胶质(星形胶质细胞)和少突神经胶质(即少突胶质细胞))和自我复制的能力(即增殖潜能)。因此证实了这些细胞具有神经干细胞的特性。
从一小大鼠脑的少量神经组织中提取的神经干细胞，进行细胞培养后移植入同一小大鼠脑或脊髓的病变部位，似乎是自体移植治疗中应用很广泛的治疗方法。然而，尽管不会导致神经功能缺损，从脑中获取含有神经干细胞的组织并不容易。因此，考虑到目前为各种复杂的神经系统疾病建立治疗方法的需要，建立更为安全且简便的自体移植方法至关重要。因此，为了获取供体细胞，本发明的发明者开发了一种技术，用于从骨髓细胞、脐血细胞或胎肝细胞中采集单核细胞等，较之采集神经干细胞更为容易(请参考专利文件1)。具体地说，本发明的发明者已经证实由骨髓细胞制备的单核细胞级分(mononuclear cell fractions)具有分化为神经系统细胞的能力。发明者也证实从单核细胞级分分离出来的，含有中胚层干细胞(间叶干细胞)、间质细胞和AC133阳性细胞的细胞级分(cell fractions)，也具有分化为神经系统细胞的能力。
可通过直接将可分化为上述神经系统细胞的细胞给药至脑内受累部位来治疗脑神经疾病。然而该技术既复杂又危险。因此，开发用于治疗脑神经疾病的简单而安全的技术或制剂非常有必要。
WO 02/00849[非专利文件1]Archer DR，et al.1994.Exp Neurol 125268-77. Blakemore WF，Crang AJ.1988.Dev Neurosci 101-11. Gumpel M，et al.1987.Ann New York Acad Sci49571-85. Blakemore WF.1977.Nature 26668-9. Honmou O，et al.1996.J Neurosci163199-208. Franklin RJ，et al.1996.Glia 17217-24. Imaizumi T，et al.1998.J Neurosci 18(16)6176-6185. Kato T，et al.2000.Glia 30209-218. Utzschneider DA，et al.1994.Proc Natl Acad Sci USA9153-7. Gage FH，et al.1995.Proc Natl Acad Sci USA9211879-83. Lois C，Alvarez-Buylla A.1993.Proc Natl Acad Sci USA902074-7. Morshead CM，et al.1994.Neuron 131071-82. Reynolds BA，Weiss S.1992.Science 2551707-10. Chalmers-Redman RM，et al.1997.Neurosci 761121-8. Moyer MP，et al.1997.Transplant Proc 292040-1. Svendsen CN，et al.1997.Exp Neurol 148135-46. Flax JD，et al.1998.Nat Biotechnol 161033-9. Akiyama Y，et al.2001.Exp Neurol. Yandava BD，et al.1999.Proc Natl Acad Sci USA967029-34. Bjornson CR，et al.1999.Science 283534-7. Kopen GC，et al.Proc Natl Acad Sci USA 9610711-6. Woodbury D，et al.2000.J Neurosci Res 61364-70.
发明的公开(disclosure)本发明正是在这种形势下获得的，本发明的一个目的是为治疗脑神经疾病提供安全的技术和制剂。更加具体地说，一个目的是提供治疗脑神经疾病的体内施用制剂，尤其是静脉用制剂，其包含间质细胞，尤其是骨髓细胞、脐血细胞或外周血细胞，或起源于这些细胞的细胞作为有效成分。
本发明的发明者做了进一步的研究以达到上述目的。最初，他们研究了下列细胞对脑神经疾病的治疗效果从小大鼠骨髓中收集骨髓细胞，从中分离出单核细胞级分，将其作为供体细胞静脉给药至脑梗塞小大鼠模型。结果他们惊奇地发现，不仅是局部给药，还有静脉给药骨髓细胞也对脑神经疾病，包括脑梗塞、脊髓受损和脱髓鞘疾病等起治疗作用。
本发明的发明者采用同样的方法，通过把骨髓干细胞(间叶干细胞)静脉给予上述动物模型的方式对所述细胞治疗脑神经疾病的治疗效果做了进一步研究。他们发现静脉给药骨髓干细胞对治疗脑神经疾病非常有效。
他们也发现静脉给药或局部给药自体骨髓细胞或间叶干细胞对治疗脑神经疾病有效。相较于同种异体移植和异种移植，自体移植在治疗效果和无需进一步的免疫抑制药物两方面均极为有利。
如上所述，本发明的发明者发现了静脉给药间叶细胞(间叶干细胞)，尤其是指骨髓细胞或间叶干细胞对脑神经疾病的治疗效果。本发明正是在这些发现的基础上完成的。如下实施例所示本发明的发明者已经通过进行多种医学试验或生物试验和详细的分析，证实了静脉给药间叶细胞对脑神经疾病的治疗效果。
即间叶细胞(间叶干细胞)，尤其是骨髓细胞本身，可作为治疗脑神经疾病的静脉给药制剂。
本发明还考察了上述治疗效果与骨髓细胞或间叶干细胞的神经保护效应和神经再生作等的协同作用。因此，人们期待骨髓细胞或间叶干细胞成为静脉给药的脑神经保护剂或脑神经再生剂。
本发明涉及治疗脑神经疾病的体内给药制剂，尤其是静脉给药制剂，其中含有间叶细胞，尤其骨髓细胞，脐血细胞或外周血细胞，或起源于这些细胞的细胞作为有效成分。本发明也涉及对脑神经具有神经保护或神经再生效应的体内给药制剂，以及这些制剂的用法，所述制剂包含上述间叶细胞作为有效成分。更为具体地说，本发明提供了[1]一种用于治疗脑神经疾病的体内给药制剂，含有间叶细胞作为有效成分。
[1]中涉及的制剂，其中脑神经疾病指脑梗塞。
一种显示出神经保护效应的体内给药制剂，该制剂含有间叶细胞作为有效成分。
一种显示出脑神经再生效应的体内给药制剂，该制剂含有间叶细胞作为有效成分。
[1]至[4]任一项涉及的制剂，其中体内给药是静脉给药。
[1]至[5]任一项涉及的制剂，其中间叶细胞是(a)导入(introduce)了BDNF基因、PLGF基因、GDNF基因或IL-2基因的间叶细胞；或(b)导入hTERT基因的永生化间叶细胞。
[1]至[6]任一项涉及的制剂，其中间叶细胞是间叶干细胞。
[1]至[6]任一项涉及的制剂，其中间叶细胞是骨髓细胞、脐血细胞或外周血细胞。
一种治疗脑神经疾病的方法，包括将治疗有效剂量的[1]至[8]任一项所述制剂体内给药于患者。
[9]中涉及的方法，其中骨髓细胞是患者的自体细胞。
[9]或[10]涉及的方法，其中脑神经疾病是脑梗塞。
[9]至[11]任意一项涉及的方法，体内给药是指静脉给药。
[9]至[12]任意一项涉及的方法，其中间叶细胞是骨髓细胞、脐血细胞或外周血细胞。
本发明提供了治疗脑神经病的体内给药制剂，所述制剂包含间叶细胞(如骨髓细胞，脐血细胞、外周血细胞、间叶干细胞，或起源于这些细胞的细胞)作为有效成分。
此处术语“体内给药”通常指在头部(脑)以外的部位给药。体内给药包括静脉给药、肌肉给药、皮下给药及腹腔内给药，其中优选方式为静脉给药。
此处术语“间叶细胞”优选的是例如，骨髓细胞(骨髓细胞中的单核细胞级分；MCF(mononuclear cell fraction))、脐血细胞、外周血细胞、间叶干细胞(MSC)或来源于上述细胞的细胞。本发明中的间叶细胞包括间叶相关细胞、中胚层干细胞等等。即使本发明中作为“间叶细胞”的细胞将来的分类不属于间叶细胞，该类细胞仍适用于本发明。
骨髓中包含的干细胞是造血干细胞和“间叶干细胞(MSC)”。此处“干细胞”通常指具有自我增殖能力并能在构成活生命体的细胞的增殖和分化等生理过程中分化为具特定功能的细胞群的未分化细胞。造血干细胞是分化为红细胞、白细胞或血小板的干细胞。间叶干细胞可先分化为神经干细胞而后分化为神经，也可不经神经干细胞阶段直接分化为神经；可先分化为间质细胞而后分化为神经(但这种分化效力较低)，可分化为内脏，可分化为血管系统，或分化为骨骼、软骨、脂肪或肌肉。
本发明主要采用间叶干细胞(MSC)，但采用机体的造血干细胞和其他干细胞(祖细胞)也是可能的。间叶干细胞可从骨髓细胞中获取，而后者可从骨髓中采集。未分离出间叶干细胞的骨髓细胞也可用于治疗，同间叶干细胞一样，只是前者治疗效果较后者略差。
发明者认为也可以从外周血制备间叶干细胞等细胞。事实上，本发明的发明者已经成功地诱导来自外周血成分的培养细胞分化为能够表达神经干细胞和神经系统细胞(神经元和胶质细胞)标记物的细胞。诱导来自外周血的细胞分化为神经系统细胞时，G-CSF或SCF并非总是必不可缺的。具体地说，本发明的发明者已经发现，如果将从骨髓液或脐血分离出来的单核细胞级分制备的中胚层干细胞(间叶干细胞)，或胚胎干细胞(embryonic stemcells，ES细胞)，置于基础培养基中培养，该中胚层干细胞(间叶干细胞)或ES细胞会被诱导分化为神经干细胞，神经元或胶质细胞。因此，可以通过培养外周血细胞获得与间叶干细胞具有相同功能的细胞，而这些细胞可用于本发明。“基础培养基”不特指某种培养基，只要是细胞培养中常规的培养基即可，其中优选DMEM(Dulbecco’s改良的基础培养基)或NPBM(神经祖细胞基础培养基Clonetics)。对上述基础培养基的其他成分没有特别限制，最好能包含F-12、FCS和/或神经存活因子(Clonetics)等。该培养基中的浓度可设为，例如，F-1250％和/或FCS1％。培养基优选的CO2浓度为5％，但也不限于此。
此处应用的术语“中胚层干细胞”是指构成胚胎学分类为中胚层的组织的细胞，包括血细胞。“中胚层干细胞”亦指可以自我复制(分裂和增殖)，具有与原始细胞同样的潜能，并具有分化为构成中胚层组织的所有细胞类型的能力的细胞。中胚层干细胞表达的细胞标记物例如SH2(+)、SH3(+)、SH4(+)、CD29(+)、CD44(+)、CD14(-)、CD34(-)以及CD45(-)，但并不限于上述标记物。此外，本发明中的间叶干细胞也包括所谓的间叶相关干细胞。
上述术语“间叶相关干细胞”是指间叶干细胞、间叶细胞、间叶细胞的前体细胞和起源于间叶细胞的细胞。
术语“间叶干细胞”是指可从骨髓、外周血、皮肤、发根、肌肉组织、子宫内膜、血、脐血和不同组织的原代(primary)培养物中获取的干细胞。此外，本发明的间叶干细胞也包括可从外周血的培养细胞获取而机能上等同于间叶干细胞的细胞。
本发明中优选的间叶细胞为骨髓细胞和骨髓干细胞(间叶干细胞)。脐血细胞、外周血细胞和胎肝细胞也是本发明中优选的实例。
本发明中骨髓细胞、脐血细胞、外周血细胞和胎肝细胞优选的实施方案为从骨髓细胞、脐血细胞、外周血细胞或胎肝细胞中分离出来的细胞级分，其包含能分化为神经系统细胞的细胞。
另一种实施方案中，该细胞级分是包含以SH2(+)、SH3(+)、SH4(+)、CD29(+)、CD44(+)、CD14(-)、CD34(-)以及CD45(-)为特征的中胚层干细胞的细胞级分。
所述细胞级分的其他实例是包含以Lin(-)、Sca-1(+)、CD10(+)、CD11D(+)、CD44(+)、CD45(+)、CD71(+)、CD90(+)、CD105(+)、CDW123(+)、CD127(+)、CD164(+)、纤连蛋白(+)、ALPH(+)和胶原酶-1(+)为特征的间质细胞的细胞级分，或是包含以AC133(+)为特征的细胞的细胞级分。
上述细胞级分中包含的细胞优选是可分化为神经系统细胞的细胞。
本发明中的细胞级分包含从骨髓细胞中分离的单核细胞级分，其中包含以具有分化为神经系统细胞能力为特征的细胞。另一实施方案是从脐血细胞、外周血细胞或胎肝细胞分离的单核细胞级分，其中含有以具有分化为神经系统细胞的能力为特征的细胞。另一种实施方案是来自骨髓且释放到外周血的间叶干细胞，其特征在于具有分化为神经系统细胞的能力。例如，当间叶干细胞释放到外周血时，可以应用活性物质或制剂(agents)，但并非总需要加入这些物质。来自骨髓或外周血的间叶干细胞具有共同的特性，即可以产生神经干细胞和神经系统细胞的标记物；但在某些特性上又有所不同，如增殖率(proliferation rate)和分化诱导率(rate of differatiationinduction)。本发明采用的间叶干细胞不限于从骨髓中收集，还包括来自外周血的间叶干细胞。具体地说，本发明中“间叶干细胞”包括上述两种来源的细胞。本发明中来源于外周血的间叶干细胞也可简称为“间叶细胞”。
本发明中的细胞级分(cell fraction)所含细胞分化为神经细胞，究竟是由所谓的造血细胞转化为神经细胞，还是由包含在骨髓细胞、脐血细胞或外周血细胞中具有分化为神经细胞功能的未成熟细胞分化为神经细胞，尚未明确。然而，大部分分化为神经细胞的细胞被假设为干细胞或前体细胞(precursor cells)，即具有多能性和自我增殖能力的细胞。或者，分化为神经细胞的细胞可能是在一定程度上(to some extent)分化为内胚层或中胚层的干细胞或前体细胞。
本发明的细胞级分中的细胞可不添加任何营养因子而被增殖(但有营养因子存在的情况下增殖也是可能的)。因此，从神经系统自体移植技术发展的观点看，这些细胞是简单实用的，而对医药行业而言，也是非常有利可图的。总之，本发明中的骨髓细胞、脐血细胞或外周血细胞(细胞级分)来自脊椎动物，优选为哺乳动物(例如小大鼠、大鼠、兔子、猪、狗、猴、人类等等)，但不需特别限定。
本发明中的细胞级分可通过如下方法制备举例说明，将采集的脊椎动物骨髓细胞或脐血细胞置于溶液中进行密度-梯度离心，以2000rpm的速度做密度梯度离心，离心足够长时间以确保根据比重分离，回收比重在1.07-1.1g/ml范围的细胞级分。此处短语“离心足够长时间以确保根据比重分离”是指，足够使细胞根据比重不同在密度梯度离心溶液中迁移到不同位置的时间，通常约为10到30分钟。要回收的细胞级分的比重范围在1.07到1.08g/ml之间(如1.077g/ml)。Ficoll溶液和Percoll溶液可作为密度梯度离心的溶液，但并不限于此二种。此外，从脊椎动物收集的脐血细胞也可通过上述相同方法制备，并可用作细胞级分。
具体地说，首先，从脊椎动物收集的骨髓(5到10μl)与溶液(2ml L-15加3ml Ficoll)混合，然后以2000rpm的转速离心15分钟以分离出单核细胞级分(约1ml)。将单核细胞级分与培养液(2ml NPBM)混合以洗涤细胞，然后再将细胞以2000rpm的转速离心15分钟。然后，除去上清，回收沉淀的细胞。除股骨外，本发明中获取细胞级分的材料包括胸骨和组成骨盆的髂骨。只要体积足够大，其他任何骨骼均可作为原材料。本发明中的细胞级分亦可用贮藏在骨髓库中的骨髓液或脐血制备。用脐血制备时，细胞可从贮藏在骨髓库中的脐血获取。
本发明中细胞级分的另一种实施方案包括从骨髓细胞、脐血细胞或外周血细胞分离纯化的单核细胞级分，其中含有可分化为神经细胞的中胚层(间叶)干细胞。含有中胚层干细胞的细胞级分可通过下列方式获取，例如，从上述通过离心骨髓细胞、脐血细胞或外周血细胞获取的细胞级分中，选择带有细胞表面标记物如前述SH2标记物的细胞。
此外，含有可分化为神经细胞的中胚层干细胞(间叶干细胞)的细胞级分可通过如下方法制备，将从脊椎动物收集的骨髓细胞或脐血细胞置于溶液中进行密度-梯度离心，以900rpm的转速离心足够长时间以确保根据比重分离，然后回收比重在1.07到1.1g/ml范围的细胞级分。此处，短语“离心足够长时间以确保根据比重分离”是指，足够使细胞根据比重不同在密度梯度离心溶液中迁移到不同位置的时间，通常约为10到30分钟。回收的细胞级分的比重，根据细胞来源的动物类别不同而不同(如人、大鼠或小大鼠)。可用作密度梯度离心的溶液包括Ficoll溶液和Percoll溶液，但并不限于这两种。
具体地说，首先，将从脊椎动物采集的骨髓(25ml)或脐血与等体积PBS溶液混合，然后以900G的转速离心10分钟。沉淀的细胞与PBS混合，然后回收(细胞密度等于约4×107细胞/ml)，除去血液成分。然后，取出5ml与Percoll溶液(1.073g/ml)混合，以900G的转速离心30分钟以提取单核细胞级分。提取的单核细胞级分与培养液混合(DMEM，10％的FBS，1％的抗生素-抗真菌溶液)以洗涤细胞，然后以2000rpm的转速离心15分钟。最后，移除上清，回收沉淀的细胞，在37℃、5％CO2的条件下培养。
本发明的细胞级分的另一个实施方案是从骨髓细胞或脐血细胞分离的单核细胞级分，其中包含可分化为神经细胞的间质细胞。间质细胞的实例包含以Lin(-)、Sca-1(+)、CD10(+)、CD11D(+)、CD44(+)、CD45(+)、CD71(+)、CD90(+)、CD105(+)、CDW123(+)、CD127(+)、CD164(+)、纤连蛋白(+)、ALPH(+)和胶原酶-1(+)为特征的细胞。含有间质细胞的细胞级分可通过下列方式制备，例如，从上述通过离心骨髓细胞或脐血细胞获取的细胞级分中，选择带有细胞表面标记物如前述Lin标记物的细胞。
此外，所述细胞级分可通过如下方法制备，将从脊椎动物收集的骨髓细胞或脐血细胞置于溶液中进行密度-梯度离心，以800G的转速离心足够长时间以确保根据比重分离，然后回收比重在1.07到1.1g/ml范围的细胞级分。此处，“离心足够长时间以确保根据比重分离”是指，足够使细胞根据各自的不同比重在密度梯度离心溶液中迁移到不同位置的时间，通常约为10到30分钟。回收的细胞级分的比重优选范围为1.07到1.08g/ml(例如，1.077g/ml)。可用作密度梯度离心的溶液包括Ficoll溶液和Percoll溶液，但并不限于这两种。
具体来说，首先，从脊椎动物收集的骨髓细胞或脐血与等体积的溶液(PBS、2％的BSA、0.6％的柠檬酸钠及1％的青霉素-链霉素)混合。从中取出5ml与Ficoll+Paque溶液(1.077g/ml)混合，以800G的转速离心20分钟以获取单核细胞级分。将单核细胞级分与培养液(Alfa MEM、12.5％FBS，12.5％的马血清、0.2％的异肌醇、20mM的叶酸、0.1mM的巯基乙醇、2mM的L-谷氨酰胺、1μM的氢化可的松、1％抗生素-抗真菌溶液)混合以洗涤细胞，然后以2000rpm的转速离心15分钟。离心后弃去上清，收集沉淀的细胞，在37℃、5％CO2的条件下培养。
本发明的细胞级分的另一个实施方案是包含以AC133(+)为特征，并可分化为神经细胞的细胞的单核细胞级分，是从骨髓细胞、脐血细胞、外周血细胞或胎肝组织中分离出来的。这些细胞级分可通过下述方法获取例如，从上文提到的通过离心骨髓细胞、脐血细胞或外周血细胞所得的细胞级分中，选择带有上述细胞表面标记物AC133(+)的细胞。
此外，另一个实施方案中，将从脊椎动物收集的胎肝组织置于溶液中进行密度-梯度离心，以2000rpm的转速离心足够长时间以确保根据比重分离，然后回收比重在1.07到1.1g/ml范围的细胞级分，然后从该细胞级分中回收AC33(+)的细胞。此处，“离心足够长时间以确保根据比重分离”是指，足够使细胞根据各自的不同比重在密度梯度离心溶液中迁移到不同位置的时间，通常约为10到30分钟。可用作密度梯度离心的溶液包括Ficoll溶液和Percoll溶液，但并不限于这两种。
具体地说，首先，从脊椎动物收集的肝细胞用L-15溶液洗涤，然后置于含0.01％的DnaseI、0.25％的胰蛋白酶及1％胶原酶的L-5溶液中，在37℃酶促处理30分钟。然后，将用移液管将组织打散成为单个细胞。这些单个的胎肝细胞，采用实施例1(1)中制备股骨单核细胞级分的步骤进行离心。洗涤所得细胞，然后用AC133抗体从洗涤后的细胞中收集AC133(+)的细胞。这样就可以从胎肝组织制得可分化为神经细胞的细胞。基于抗体回收AC 133(+)细胞可通过应用磁珠(magnetic beads)或细胞分拣器(cell shorter)完成。
将上述含有中胚层干细胞(间叶干细胞)、间质细胞或AC-133(+)细胞的细胞级分的任一种移植入脱髓鞘的脊髓，均可引起脱髓鞘区域的再髓化。具体地说，当上述包含中胚层干细胞(间叶干细胞)的细胞级分移植入脑梗塞模型中，它们可以顺利移入并分化为神经系统细胞或胶质细胞。
包含在上述细胞级分中、可分化为神经细胞的细胞包括神经干细胞、中胚层干细胞(间叶干细胞)、间质细胞以及包含在上述细胞级分中的AC133阳性细胞，但并不限于此，只要它们能够分化为神经细胞。
本发明治疗脑神经疾病的体内给药制剂的有效成分，不仅包括骨髓细胞，脐血细胞或外周血细胞，还包括上述细胞级分。本发明中给药未经修饰的骨髓细胞、脐血细胞或外周血细胞等间叶细胞是可能的。然而，为提高治疗效果，这些细胞可以作为添加了各种制剂的制剂(组合物)形式来给药，或者作为导入了增加疗效的基因的细胞来给药。本发明中制剂和转基因细胞的制备包括下述方法，但不限于此(1)加入可以加快细胞级分中细胞的增殖率或促进这些细胞向神经系统细胞分化的物质，或导入具有同样功能的基因；(2)加入可以提高细胞级分的细胞在受损的神经组织中的存活力的物质，或者导入具有同样功能(例如，抑制自由基)的基因；(3)加入可以抑制受损的神经组织对细胞级分的细胞的有害作用的物质，或者导入具有同样功能的基因；(4)加入可以延长供体细胞的寿命的物质，或者导入具有同样功能的基因(例如hTERT基因)；(5)加入可以调节细胞周期的物质，或者导入具有同样功能的基因；(6)加入旨在抑制免疫反应的物质，或者导入具有同样功能的基因；(7)加入促进能量代谢的物质，或者导入具有同样功能的基因；(8)加入可以提高供体细胞在宿主组织中的迁移能力的物质，或者导入具有同样功能的基因；(9)加入可以增加血流量(包括诱导血管生成)的物质，或者导入具有同样功能的基因(例如VEGF、血管生成素或PGF)；(10)加入具有神经保护效应的物质，或者导入具有同样功能的基因(例如BDNF、GDNF、NT、NGF、FGF、EGF或PFG)；(11)加入具有抑制凋亡作用的物质，或者导入具有同样功能的基因；或加入具有抗癌作用的物质，或者导入具有同样功能的基因(例如IL-2或IF-β)。
本发明的发明者证实导入BDNF(脑衍生神经营养因子)基因的间叶干细胞(MSC)对大鼠脑梗塞模型具有治疗作用，正如实施例中所示，BDNF是一种神经营养因子。此外，本发明的发明者证实静脉移植导入了BDNF基因的MSC对脑梗塞具有治疗作用。此外，他们也证实静脉移植导入了PLGF(胎盘生长因子)基因的MSC对脑梗塞具有治疗作用。
本发明的发明者发现，导入BDNF基因以外的其他基因如GDNF(胶质细胞株衍生的神经营养因子)、CNTF(纤毛(ciliary)神经营养因子)或NT3(神经营养蛋白3)等的MSC对脑梗塞具有治疗作用。他们证实导入了IL-2基因的间叶干细胞对大鼠脑肿瘤模型具治疗作用。因此，本发明中应用的间叶细胞优选的实施方案为导入BDNF基因、PLGF基因、GDNF基因或IL-2基因的间叶细胞。具体地说，本发明优选应用带有可表达的外源性BDNF基因、PLGF基因、GDNF基因或IL-2基因的间叶细胞作为间叶细胞。
除上述基因外，导入CNTF或NT3等基因的间叶干细胞也是本发明间叶细胞的优选例。后文中，导入了“XX”基因的间叶干细胞(MSC)可简称为“MSC-XX”。
将本发明的间叶细胞与负责血管生成的因子(基因)联合，预期会对脑梗塞具有显著的治疗效果，因为脑梗塞表现血管梗阻的症状。本发明的发明者发现，正如下文实施例中所示，把血管生成素基因直接注入脑梗塞部位显示出显著的血管生成作用。具体地说，导入了与血管生成有关的基因如血管生成素基因的MSC，预期具有治疗效果，对脑梗塞尤其如此。
以导入可表达的预期基因的间叶细胞可通过采用本领域技术人员已知的技术制备。
本发明中应用的骨髓液可通过如下方法采集麻醉(局部或全身)脊椎动物(包括人)，针头插入骨骼，然后用注射器抽取。骨骼包括但不限于股骨、胸骨和骨盆的髂骨。此外，婴儿出生时用针头直接穿刺脐带，用注射器抽取脐血收集并储存的操作也已成为一项成熟技术。骨髓细胞从局麻的对象收集，每次最好收集数毫升。请注意，该数量不适用于以下A情况，但适用于B情况和C情况。
收集骨髓的过程包括下述步骤，但不限于此(A)移植活的骨髓细胞例如，从人体收集骨髓细胞时，在充分考虑了全麻的安全性后，由麻醉师从全麻状态的患者(髂骨等)采集骨髓液。采集细胞的目标数目的是3×109或更多的单核粒细胞。假定该目标细胞数目可从大概200ml到400ml的骨髓液获取。考虑患者的承受能力(strain)来计算骨髓采集量的上限，用即将采集前的血红蛋白水平(Hb水平)、患者体重进行计算。然而，对老年患者，当采集必需量的骨髓液成问题时，采集的最大量由负责采集骨髓液的医生决定。
骨髓采集量的上限取决于即将采集前的Hb水平。
(1)当Hb水平低于12.5g/dl，每公斤体重采集12ml或更少；(2)当Hb水平低于13.0g/dl，每公斤体重采集15ml或更少；(3)当Hb水平低于13.5g/dl，每公斤体重采集18ml或更少；或者(4)当Hb水平等于或大于13.5g/dl，每公斤体重采集20ml或更少。
当患者外周血细胞减少时(白细胞计数小于2000/毫升，中性粒细胞计数小于1000/毫升，血红蛋白水平低于11.0g/dl，血小板计数小于10×104/毫升)或患者有出血倾向时，不应采集骨髓液。
应用抗凝药或抗血小板药的患者，需慎重考虑进行骨髓液采集和全身麻醉之前进行止血-凝血试验(FDP、纤维蛋白原、ATIII)，这类试验包括出血时间和ACT，作为紧急检查。
应用抗血小板药(如噻氯吡定(Panaldine)、对乙酰氨基酚(Bufferin)和拜阿司匹林(Bayaspirin))的患者停药7天或7天以上血小板功能才会恢复，急性期进行骨髓采集可能导致出血。因此，进行骨髓采集时应非常谨慎。如果出血时间超过十分钟，则不应进行骨髓采集。
(2)应用抗凝药(如华法令(Wanfarin))的患者应该在静注维生素K(K1或K2)使ACT正常后进行骨髓采集。
例如，骨髓细胞可静脉给药把骨髓细胞(3×109或更多)与等量的稀释剂(无抗生素的RPMI 1640)混合，静脉注入。预计总量约400到2000cc。给药应尽可能快速，为了在给药阶段抑制凝血，通常联合注射肝素。
举例说明，250cc采集的骨髓细胞液与等量的稀释剂和2500单位肝素配成500cc，迅速将该混合物经滤器过滤制成静脉输注制剂，制备后立即开始给患者静脉输注。在此期间骨髓细胞液的采集工作仍然继续。重复该操作两到六次，并给予指定量的骨髓细胞液。肝素的用量约5,000到15,000单位，该剂量基本上与脑梗塞急性期已获证据证实的安全有效剂量相同。然而，考虑给药过程中是否继续采集骨髓时，ACT起决定作用(ACT isdetermined，)，必要时可考虑鱼精蛋白中和等治疗。采集骨髓液需要的时间大约2小时。静脉输注的骨髓液总量(包括稀释剂)大约2000cc。静脉输注约需三到四小时完成，期间需充分监测右心负荷，中心静脉压等可显示该负荷。需注意静脉输注约2000ml骨髓液(包括稀释剂)，而采集了1000ml的骨髓液。因此三到四小时内患者的补液量为1000ml，考虑到脑梗塞常规治疗的液体负荷，该容量并非特别大。
优选根据下列要求选择患者，但并不限于此1.患者年龄为20到70岁；2.患者起病24小时以内；3.患者的弥散加权(diffusion-weighted)MRIs显示幕上大脑皮层和穿支供血区至少两者之一异常；4.患者的NINDS-III分类是动脉粥样硬化血栓形成性脑梗塞、腔隙性梗塞或心源性脑栓塞中的任一种；5.患者本次事件的修正版Rankin量表(Modified Rankin Scale)评分是3分或3分以上；6.根据日本昏迷量表(Japan Coma Scale)患者意识受损的评估为0到100；处于下列情况的患者最好排除在外1.症状正在改善、诊断为基本无症状或TIA(短暂性缺血发作)的患者；2.根据典型的CT或MRI，诊断除闭塞性脑血管损害外尚有其他导致症状的损害如颅内出血的患者；3.有心源性栓子且CT已发现该部位有出血改变的患者；4.昏迷且意识障碍严重、日本昏迷量表评分为200或以上的患者；5.怀孕或有怀孕可能的患者；6.有严重肾病、肝病或消化器官疾病的患者；7.有恶性肿瘤的患者；8.怀疑有严重的心血管系统异常如严重缺血性心脏病的患者；9.符合骨髓液采集的除外标准的患者；10.判断接受全麻会存在风险的患者；
11.小脑梗塞或脑干梗塞的患者；12.已经采取血管内手术治疗的急性期患者；或13.经主治医生判断不适于采取该治疗的患者。
(B)采自骨髓液等的间叶干细胞(MSC)的培养、保存和给药本发明中静脉给药的另一种实施方案为，举例说明，将从骨髓液等采集的MSC经培养、保存后静脉给药。采集、培养和保存骨髓细胞的优选条件如下具体地说(1)局麻下从髂骨采取约5ml骨髓液；(2)从采集到的骨髓液中提取MSC，培养并增殖，例如可采用WO02/00849中描述的方法；(3)置于保存介质中冷冻保存；(4)需要时将冷冻的MSC解冻，然后静脉给药。
本发明中，几乎对所有患者，均能在局麻下安全简单的采集骨髓液，因为初期要采集的骨髓量约为3到5ml，所以对身体的损伤很小。
因为采集的间叶干细胞如骨髓干细胞可以被增殖，可以提前增殖细胞以制备治疗所需总量。本发明中应用的MSC优选原代培养的MSC，更优选由2×108个或更多个原代培养MSC。本发明中通过上述方法增殖的间叶干细胞或治疗制剂，可采用预定的方法如冷冻方法保存很长时间。保存和解冻方法如下通过下述方法解冻细胞首先，仪器和材料要备好，如程序化冰箱(program freezer)，F-100冷冻袋、液氮和封管器。试剂也要准备好，如胰蛋白酶/EDTA、DMSO、右旋糖苷自体血清和D-MEM。
移除培养基后，加入T/E，回收经培养的MSC贴壁细胞，加入等量的细胞洗涤液(含有2％的自体血清的D-MEM)，然后以400g的转速离心五分钟。沉淀的细胞在细胞洗涤液(含有2％的自体血清的D-MEM)中搅拌，以400g的转速离心五分钟。下一步，在41ml细胞保存液(含有50％的自体血清的D-MEM)中搅拌细胞。期间，用1ml注射器吸取2份0.5ml的细胞混悬液，进行细胞计数。对搅拌液进行细菌学和病毒学检测以确保没有被细菌或病毒污染。下一步，加入10ml冷冻保护液(5ml DMSO(Cryoserv)和5ml 10％的右旋糖苷40)。所得混悬液分装到冷冻袋中，每袋50ml，袋上注明标本号。将袋子放在程序化冰箱中冷冻，冷冻好的袋子移入液氮中保存。
通过下述方法解冻并洗涤细胞首先，准备好仪器和材料如温水浴、洁净工作台、离心机、分离袋和封管器，准备好试剂如20％的人血清白蛋白(或自体血清)，生理盐水和10％的右旋糖苷40。装有细胞的冷冻袋从液氮槽中取出在气相中放置5分钟，室温放置2分钟。将冷冻袋放在气相和室温是为了防止液氮蒸发引发冷冻袋爆炸。冷冻袋置于灭菌后的塑料袋中，以防由于袋上有小孔之类的原因导致其内容物泄漏。塑料袋放在温水浴中解冻。解冻后，全部的细胞混悬液回收到血袋中(密闭系统)或管中(开放系统)。将回收的细胞混悬液加入等量的洗涤液(25ml 20％的人血白蛋白、75ml生理盐水和100ml10％的右旋糖苷40)中。将上述混合物放置五分钟以达到平衡，移除细胞内的DMSO，然后将混合物以400g的转速离心五分钟。细胞沉淀物在细胞洗涤液中搅拌。将所得的细胞混悬液注入患者体内，并且再次，用1ml注射器吸取2份各0.5ml的细胞混悬液作为样本做存活力分析和细菌学检测。
本发明中，经提前采集、培养、保存的原代培养的MSC，需要时可立即解冻进入活性状态并立即静脉给药以进行治疗。此处不需肝素。对接受治疗的患者没有特别限制。
(C)给药经hTERT永生化的间叶干细胞本发明的发明者成功地开发了一种方法，可以稳定地诱导大量细胞的分化和增殖(WO 03/038075)。一般说来，中胚层干细胞(间叶干细胞)在神经再生的医学领域是非常有用的，但是，培养条件下这些细胞的增殖有限。然而，根据本发明的发明者的研究，将带有永生基因如端粒酶基因作为插入片断的病毒载体体外导入间质细胞或间叶干细胞，结果表现为细胞的持续增殖，即使在细胞分裂周期以后也增殖，远远超出了细胞的生存跨度，并且仍旧保有与正常细胞相同的形态学特征。本发明的发明者发现通过导入永生化基因而具有永生特性的中胚层干细胞(间叶干细胞)，在适宜的培养条件下可以被有效地诱导分化为神经干细胞和神经系统细胞。
具体地说，发明者成功地诱导那些通过导入永生性基因hTERT而具有了永生性的中胚层干细胞(间叶干细胞)分化为脂肪细胞、成软骨细胞和成骨细胞。此外，发明者诱导通过导入hTERT基因而具有了永生性的中胚层干细胞(间叶干细胞)分化为包括神经干细胞在内的神经系统细胞。本发明的发明者进一步揭示，脊髓脱髓鞘区域可通过移植这些细胞自身(中胚层干细胞(间叶干细胞))、由中胚层干细胞(间叶干细胞)分化的神经干细胞、由中胚层干细胞(间叶干细胞)分化的神经干细胞分化的神经系统细胞及由中胚层干细胞(间叶干细胞)分化的神经系统细胞而修复。
此外，根据本发明中上述方法诱导分化的神经干细胞和神经系统细胞，或自身带有导入其中的永生基因的中胚层干细胞(间叶干细胞)，预期会在神经再生方面非常有用。
当通过导入原癌基因等使细胞具有永生性时，细胞的特性也会发生转变。相比而言，如本发明中所述，当通过导入永生化基因而使细胞具有永生性时，细胞保留其原始特性。此外，在导入永生化基因的情况中，该基因可在充分增殖后被移除。
本发明中导入了永生化基因的间叶细胞也适用于静脉给药。
因为技术(C)可以产生大量的细胞，因此有大量的细胞可用于静脉给药。优选给药1×109或更多的细胞。这是巨大的优势，因为当给药的细胞数目增多，治疗效果也相应提高。
本发明中，含有间叶细胞作为有效成分的脑神经疾病的体内给药治疗剂，可根据本领域技术人员已知的方法配制。例如，所述制剂可与水或其它可药用液体混合制成无菌溶液的剂型或者注射用的混悬液用于非肠道给药。例如，所述制剂可通过如下方法配制，与可药用载体或赋形剂(具体指无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、混悬剂、表面活性剂、稳定剂、填充剂、赋形剂、防腐剂和粘合剂)一起配制成药品生产中广泛接受的单位剂量。可以设定这些药物制剂中活性成分的量，以便生产出指示范围内的适当容量。可应用注射用蒸馏水之类的赋形剂，根据常规制备流程，配制成无菌的注射用组合物。
注射用含水溶液包括例如，生理盐水和含有其它辅助剂的等渗溶液，如葡萄糖、D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇或氯化钠。这些含水溶液可与适当的助溶剂如酒精、更具体的乙醇和多元醇，如丙二醇和聚乙二醇，以及非离子表面活性剂如Polysorbate 80TM和HCO-50联用。
油性液体包括芝麻油和大豆油。它们也可与苯甲酸苄酯或苯甲醇等助溶剂联用。缓冲液如磷酸盐缓冲液和醋酸钠缓冲液；镇静药如盐酸普鲁卡因；稳定剂如苯甲醇和苯酚以及抗氧化剂均可联用。通过这种方式制备的注射液通常用合适的安瓿包装。
对患者体内给药这种制剂时优选肠道外给药。具体是，单剂量静脉给药，但也可作为多剂量给药。所述给药可以是短期的，但也可以持续很长时间。更为具体地说，所述给药包括注射给药和经皮给药。注射给药包括静脉注射、动脉注射、选择性动脉注射、肌肉注射、腹膜内注射、皮下注射、脑室内注射、颅内注射和髓液腔内注射，其中优选的是静脉注射。
静脉注射使得能通过常规输血操作进行移植，而不需患者接受手术或局麻，减轻了患者和医生双方的压力。静脉注射的优势还在于，能进行床旁移植。考虑到将来急诊医学的进步，也可能在救护车转运患者过程中或事件发生现场进行给药。
此外，由于具有很强的迁移能力，本发明细胞级分中所含细胞可用作基因载体(vectors)。例如，所述细胞有希望用作多种神经疾病如脑梗塞和脑肿瘤的基因治疗的载体。
本发明中的脑神经疾病包括脑梗塞、脑卒中、脑出血、蛛网膜下出血和脑肿瘤，其中脑梗塞为优选。病因可为NINDS-III(NINDS(神经疾病和中风国际协会)制定的脑血管病分类第III版)分类中动脉粥样硬化血栓形成性脑梗塞、心源性脑栓塞和腔隙性梗塞中任一种。脑神经疾病也包括头部外伤性神经疾病(比如头部损伤和脑挫伤)、缺血性脑神经损伤、外伤性脑神经损伤、脑神经变性病和代谢性神经病，但不限于这些，只要是脑神经异常引起的疾病均可。
体内给药如静脉给药本发明的间叶细胞有脑神经保护效果和脑神经再生效果。因此，本发明提供显示出神经保护效应的体内给药制剂，其含有间叶细胞作为有效成分。此处术语“神经保护”指挽救不加治疗会受损或死亡的脑内神经细胞。
此外，本发明提供显示出脑神经再生效应的体内给药制剂，该制剂含有间叶细胞作为有效成分。此处术语“脑神经再生”是指使脑神经细胞再生以恢复功能的效果，或指由这种效果得到的治疗效果。
此外，本发明涉及治疗脑神经疾病的方法，包括将治疗有效剂量的本发明制剂对患者体内给药(优选静脉给药)。
为降低移植排异反应的风险，上述治疗方法所用制剂中的间叶细胞如骨髓细胞、脐血细胞或外周血细胞，最好取自患者本人，或来源于取自本人的细胞(取自患者的自体细胞)(自体移植治疗)，除非采取特别措施如免疫抑制。不需合用免疫抑制药物的方法更可取。如果实施免疫抑制，则异体移植是可能的；但是预计自体移植治疗会产生更加显著的治疗效果。
当自体移植治疗比较困难时，可以取用来自其他人或其他动物的用于医疗的细胞。这些细胞可被冷冻保存。
自体细胞可为下列任意一种采自患者的未分化细胞采自患者的未分化间叶干细胞经基因操作制备的细胞、采自患者的未分化间叶干细胞诱导分化后制备的细胞。
本发明中的制剂(间叶细胞如骨髓细胞)可通过上述方法适当地给药至患者。医生也可通过适当改进后的上述方法，将本发明的制剂给药于患者。
本发明的治疗方法不限于人类使用。总之，本发明中的方法，可以以相同的方式，将间叶干细胞应用于非人类的哺乳动物，如小大鼠、大鼠、兔、猪、狗及猴子。
此处引用的所有现有技术文献都掺入本说明书作为参考。
图1为照片，显示大鼠脑梗塞模型(一过性大脑中动脉阻塞模型)静脉给予MCF细胞的治疗作用。经静脉给予的MCF细胞聚集在脑梗塞区。
图2显示局部及静脉给予MCFs的治疗效果，其中空心的柱形代表局部给药，实心的柱形代表静脉给药。
图3为照片，描述大鼠脑梗塞模型(一过性大脑中动脉阻塞模型45分钟)移植自体MCFs(1×107个细胞)的治疗作用。脑梗塞3小时后(A)，脑梗塞6小时后(B)，脑梗塞12小时后(C)，脑梗塞24小时后(D)，或脑梗塞72小时后(E)，或非治疗组(F)。
图4显示上述图3的结果，其中空心的柱形代表非移植组的数据，实心的柱形代表移植组数据。*＜0.001。
图5为照片，描述对大鼠脑梗塞模型静脉给予自体MCFs(1×107个细胞)的结果，其中A表示移植的MCF细胞(蓝色)聚集在脑梗塞区。B为将A中空心的方形指示的区域高倍放大拍摄的照片(HE染色)。C为与B相同的区域用X-胶处理后的视图，聚集了许多移植的MCF细胞(蓝色)，LacZ-阳性细胞(D)为NSE-阳性(E)，而F为D与E重合的图像，LacZ-阳性细胞(G)为GFAP-阳性(H)，而I为G与H重合的图像。
图6为照片，描绘移植的MCF细胞在脑内的高频移动。细胞移植的时间为脑梗塞后3小时(A)，脑梗塞后12小时(B)，或脑梗塞后72小时(C)。D和G显示A中空心的方形指示的区域染色后的图像，E和H显示B中空心的方形指示的区域染色后的图像，F和I显示C中空心的方形指示的区域染色后的图像。
图7显示移植的治疗效果。(A)显示Morris水迷宫试验研究高级脑功能(记忆和学习)的结果，(B)显示踏车应激试验结果。实心的三角形代表非治疗组，空心的方形代表治疗组。*p＜0.05，**p＜0.01。
图8为描绘脑梗塞大鼠MRI试验结果的照片。上面一行显示脑梗塞后即刻的数据，下面一行显示脑梗塞1周后的数据。比例尺5mm。
图9描绘用MSC治疗的效果的照片。上面一行显示刚发生脑梗塞后且即将进行治疗前的数据，下面一行显示脑梗塞1周后进行治疗后的数据。比例尺5mm。
图10为照片和座标图，显示脑梗塞12小时后静脉给予MSC(1×104到1×107个细胞)的结果。
图11为照片和座标图，显示支持图10的组织学方面的结果。与非治疗组(A)相比，治疗组(B移植1×106个细胞)中可见显著的治疗效果。(C)显示量化的组织学结果。
图12的照片显示大鼠脑梗塞模型静脉给予MSC(1×106个细胞)的结果。移植的供体细胞聚集在脑梗塞的区域(A，B，C及D)。照片A和C是荧光片，照片C和D是荧光片与常规照片重合。非移植组没有显示供体细胞(E和F)。一些移植的供体细胞分化为神经元(G，I和K)和神经胶质细胞(H，J和L)。发现LacZ-阳性细胞(G)为NSE-阳性(I)。照片K显示照片G与照片I的重合。发现LacZ-阳性细胞(H)为GFAP-阳性(J)。照片L为照片H与照片J的重合。比例尺250μm(A和B)，10μm(C到F)，以及5μm(G到L)。
图13为照片和座标图，显示静脉给予MSC的治疗效果，用磁共振光谱学(MRS)研究。
图14显示MSC移植的治疗效果，用行为学检查来研究。
图15为照片，显示MSC对大鼠永久大脑中动脉阻塞模型的治疗作用的研究结果。
图16为照片，显示在严重脑梗塞(大鼠永久性大脑中动脉阻塞模型)的MRI检查中也检测到与脑梗塞区域一致的异常信号。
图17为照片，显示脑梗塞未经治疗时，图16中脑梗塞处的异常信号(MRI中的HIA)的清晰度随时间增高(梗塞后12小时，3天，7天)。
图18为MRI图像的照片，显示给大鼠永久大脑中动脉阻塞模型经静脉给予间叶干细胞(MSC)(1×106个细胞)的结果。按照由出现障碍到给予MSC的时间变化来划分结果。从上面的一行图像开始，依次显示未经治疗的数据，以及发作3小时、6小时、12小时、24小时和72小时后治疗的数据。每张图像均为脑梗塞发生1周后通过MRI检查(T2WI)获取。在这些图像中脑梗塞为白色。
图19为对严重脑梗塞(大鼠永久性大脑中动脉阻塞模型)静脉给予间叶细胞(1×106细胞)的结果的座标图，其中脑梗塞区域根据梗塞体积量化。
图20为照片，显示在严重脑梗塞的超急性期静脉给予MSD的治疗效果随时间的变化。
图21为照片，显示在严重脑梗塞的急性期静脉给予MSD的治疗效果随时间的变化的例子。
图22显示出现障碍后，严重脑梗塞(大鼠永久大脑中动脉阻塞模型)经静脉给予间叶干细胞(MSC)(1×106个细胞)以后的生存率。按照由出现障碍到给予间叶干细胞的时间间隔来划分结果。“n”代表样本的数目。
图23显示严重脑梗塞MSC移植治疗后的临床症状。
图24显示粘附的培养细胞的照片，如在非治疗组中或用皮下注射G-CSF或SCF因子预先给药的组中，由外周血中获取的间叶干细胞。
图25的左侧视图为照片，显示诱导粘附的培养细胞分化为神经干细胞(神经球Neurospheres)是可能的。图25的右侧视图为照片，显示使用RT-PCR来确认干蛋白(nestin)表达也是可能的。
图26上半部分的照片提示图25中显示的细胞可以被诱导分化为神经元(NF-阳性细胞)和神经胶质细胞(GFAP-阳性细胞)。图26下半部分的照片提示NF和GFAP的表达都可以通过PT-PCR证实。
图27表示培养MSC可以导致产生BDNF。AxCAhBDNF-F/RGD分别以感染复数100，300，1000及3000pu/细胞转染的MSC(MSC-BDNF)，在48小时分泌的BDNF分别为0.230±0.110，0.434±0.122，0.931±0.101和1.860±0.41ng/105个细胞。未转染的MSC也产生BDNF(0.0407±0.0059ng/105个细胞/48小时)。
图28显示脑缺血诱导的神经缺陷的评分。
A按照以下标准评价腿放置损害(leg placement impairment)0严重神经缺损，16无神经缺损。MCAO之后一天，脑内给予MSC之前，四个缺血组显示在腿-放置评分上无统计学差异。MCAO之后8天，MSC-BDNF治疗的大鼠的腿-放置评分显著高于对照组DMEM大鼠(P＝0.0001)和成纤维细胞治疗的大鼠(P＝0.003)。MCAO之后15天，MSC-BDNF治疗的大鼠相比于DMEM组(P＝0.024)的得分也同样升高。
B在MCAO前比较各组的平均踏车速度(average treadmill speed)。MCAO之后8天，MSC-BDNF组的大鼠达到的速度显著高于对照DMEM组(P＝0.001)和成纤维细胞治疗组(P＝0.017)。直到第15天，MSC-BDNF组的速度一直保持这种差异(显著高于对照DMEM组(P＝0.002)和成纤维细胞组(P＝0.023))。
图29A的照片显示，大鼠在MCAO之后2、7及14天时分别给予DMEM，成纤维细胞，MSC或MSC-BDNF后的T2加权成像(T2-weighted image，T2W)。MCAO之后7天，MSC-BDNF治疗的大鼠与用DMEM(P＝0.002)，成纤维细胞(P＝0.015)，或MSC(P＝0.028)治疗的大鼠相比，HLV(％)显著减小。MCAO之后14天，MSC-BDNF治疗的大鼠与用DMEM治疗的大鼠(P＝0.011)相比，HLV(％)显著减小。
图29B的照片显示，大鼠在MCAO之后2天和7天时分别给予DMEM，MSC或MSC-BDNF后的T2加权成像(T2W)。第7天时MSC-BDNF组与其他组相比，缺血损伤体积减小。
图30为体内BDNF产生水平的座标图。MCAO之后7天，移植MSC-BDNF的大鼠与DMEM(P＝0.0002)或MSC(P＝0.0006)治疗的大鼠相比，缺血大脑半球的BDNF水平显著升高。MSC治疗的大鼠与DMEM治疗的大鼠相比，缺血脑半球BDNF水平也显著增高(P＝0.0124)。
图31表示MCAO之后在缺血半暗带和给药部位存在具有DNA片断的细胞。
A照片，显示与DMEM治疗的大鼠相比，MSC-BDNF治疗的大鼠实际上没有TUNEL阳性细胞。FITC＝绿色(TUNEL-阳性)，PI＝red(核)，放大×200倍。
B照片A放大630倍。
图31C显示缺血边缘带经MSC-BDNF治疗的动物与给予DMEM的动物(P＝0.013)相比，TUNEL阳性细胞显著减少。
图31D为照片，显示MSC-BDNF治疗的大鼠比MSC治疗的大鼠中检测到的阳性细胞少。在给药部位2mm范围内检测到大量DsR阳性MSC。FITC(绿色，TUNEL-阳性)，DsR(红色，MSC)。
图32的显微照片显示大鼠脑中外源MSC和内源脑细胞的形态学特征。双免疫荧光染色显示EGFP细胞局限于给药部位附近。使用共焦激光扫描显微镜，可以在受体大鼠脑内发现EGFP细胞(绿色)、神经性核抗原(NeuN，A)及神经胶质纤丝酸性蛋白(GFAP，B)。比例尺20μm。
图33a到33e的照片显示用流式细胞术分析大鼠MSC中表面抗原的表达。MSC用特异针对要呈递的抗原的单克隆抗体进行标记。死亡细胞通过前方和侧方散射去除。图33f到33i为照片，显示大鼠MSC分化为典型的间叶细胞。原代MSC或MSC-IL2的骨原性分化可以通过von Kossa染色法检测。原代MSC(h)或MSC-IL2(i)的脂肪原性分化可以通过油红O染色法来检测。
图34显示MSC的抗肿瘤效应和迁移能力。实心柱代表NRK细胞，空心柱代表MSC细胞。(a)9L细胞(5×104个细胞/孔)与MSC或NRK细胞(5×103个细胞/孔)共同培养。(b)MSC或NRK细胞按1×105个细胞的浓度接种于Transwell Insert，并在孔中置入9L细胞(5×103个细胞/孔)。四天后计数9L细胞数。所有数据的表示方法采用增殖抑制百分数(％)＝[1-(与MSC或NRK细胞共同培养的9L细胞的个数/单独培养的9L细胞的个数)]×100。图(c)显示迁移试验的结果。125I-脱氧尿嘧啶核苷-标记的细胞(5×104)用孔径为8μm的滤器分离，然后置于Transwell的上层池中，9L细胞置于下层池中。温育24小时后，测定下层池的放射性。细胞迁移试验结果用下层池中细胞数与池中细胞总数的比值来表示。
图35为照片，显示患神经胶质瘤的大鼠中MSC的分布和迁移。移植9L-DsR细胞(4×104)，并在接种肿瘤3天后对肿瘤或对侧大脑半球给药4×105的MSC-EGFP。在移植肿瘤后14天将动物处死，切出大脑。(a)和(b)为将MSC-EGFP对肿瘤给药处的脑标本的显微照片。(c)和(d)为将MSC-EGFP对对侧大脑半球给药处的脑标本的显微照片。(a)和(c)为H-E染色，(b)和(d)为用抗GFP单克隆抗体进行的免疫组化染色。(e)和(h)为将MSC-EGFP对肿瘤给药处的脑的荧光显微照片。(e)显示神经胶质瘤和正常实质的交界区。(f)显示肿瘤内部，(g)显示末端微卫星灶。(h)为将MSC-EGFP对对侧大脑半球给药处的肿瘤和正常实质交界区的荧光显微照片。
图36显示经IL2遗传修饰的MSC对于接种9L细胞后存活的大鼠的影响。用基于Kaplan-Meier法的log-秩(log-rank)检验对生存率进行分析。(a)显示接种9L细胞后，有或无MSC接种的大鼠的生存率。(b)显示接种肿瘤3天后，有或无在肿瘤内MSC接种的大鼠的生存率。
图37为代表性MRI照片(Gd-DTPA-增强的T1-加权冠状位图像)。在接种肿瘤3天后9L神经胶质瘤被接种或未被接种MSC。所有动物每7天接受磁共振成像分析。按照图像厚度和每个成像区域Gd-DTPA-增强的部分的面积(mm2)之和来计算肿瘤体积(mm3)。
图38为照片，显示给予过遗传修饰的MSC的神经胶质瘤的组织学分析结果。用未修饰的MSC(a和b)或用MSC-IL2(c和d)接种的神经胶质瘤的组织学分析使用苏木精和伊红染色。用未修饰的MSC(e)或MSC-IL2(f)接种后，神经胶质瘤细胞中CD4-阳性淋巴细胞的浸润用W3/25单克隆抗体检测。用未经修饰的MSC(g)或MSC-IL2(h)接种后，神经胶质瘤细胞中CD8-阳性淋巴细胞的浸润用OX-8单克隆抗体检测。
图39显示导入了BDNF，GDNF，CNTF，和NT3基因的MSC产生BDNF，GDNF，CNTF，及NT3的检测结果。y轴显示细胞因子的产量(ng/105个细胞/48-hr)，x轴显示感染复数(pu/细胞)。
图40显示大脑缺血诱导的神经学障碍的评价结果。除BDNF基因外，将GDNF，CNTF，或NT3基因导入MSC，将得到的细胞移植到脑缺血区域，进行腿放置试验。y轴显示腿放置评分，x轴分别显示MCAO前、MCAO的1天后(注射前)、MCAO的8天后及MCAO的15天后的数据。
图41显示局部移植MSC-BDNF及MSC-GDNF后的梗塞体积(HLV)。y轴显示梗塞体积(％)，x轴分别显示MCAO之后2天、7天和14天的数据。
图42的照片显示，大鼠局部给予DMEM，MSC-BDNF，MSC-GDNF，MSC-CNTF，或MSC-NT3后代表性T2加权(T2W)成像，在MCAO之后2天和7天拍摄。
图43显示静脉给予MSC-BDNF的组，静脉给予MSC的组和非治疗组(对照)于MCAO之后24小时、72小时及7天时拍摄的MRI照片。
图44显示静脉给予MSC-BDNF的组，静脉给予MSC的组及非治疗组(对照)在MCAO之后脑梗塞体积的变化。y轴显示梗塞体积(％)，x轴分别显示MCAO之后6小时、24小时、72小时和7天的数据。
图45显示在MCAO之后静脉给予MSC-BDNF的组，静脉给予MSC的组及非治疗组(对照)踏车试验的结果。y轴显示最高运动速度，x轴分别显示MCAO之后24小时、72小时和7天的数据。
图46为非治疗组(对照)和静脉给予MSC-PLGF(MCAO之后3小时给药)组脑梗塞的MRI分析中DW2(b＝1000)成像和T2WI成像的照片，分别在MCAO之后3小时、24小时、3天和7天后观察。
图47显示随时间推移，MRI分析中观察到的在MCAO之后表现出异常信号的区域的体积定量结果。上图显示DWI成像，下图显示T2WI成像。
图48的照片显示，非治疗组(对照)和静脉给予MSC-PLGF的组的脑组织在MCAO的7天后用TTC染色的结果。上部照片显示MSC-PLGF治疗组，下部的照片显示非治疗组(对照)。
图49的照片是用Evans蓝和FITC葡聚糖染色显现正常大鼠的血管系统。左侧照片显示用Evans蓝的结果，右侧照片显示用FITC葡聚糖的结果。
图50为照片，显示用FITC来在视觉上比较MCAO模型大鼠中诱导血管生成的结果，所述大鼠经局部注射腺病毒载体携带的血管生成素基因或未经处理。左图为用基因(血管生成素)注射的MCAO模型大鼠的结果，右图为未经基因注射(对照)的MCAO模型大鼠的结果。
图51显示用FITC定量化计算同侧/对侧比值的结果。图51中，″ANG″代表血管生成素处理。
图52为照片，显示用Evans蓝染色来在视觉上比较注射与未注射基因的MCAO模型大鼠中诱导血管生成的结果。左图为用基因(血管生成素)注射的MCAO模型大鼠，右图为未经基因注射(对照)的MCAO模型大鼠。
图53显示MSC治疗组与非治疗组(对照)的踏车试验结果，前者在脑梗塞后的慢性期局部给予MSC。y轴显示最高运动速度，x轴代表MSC给药后的天数。
实现本发明的最佳模型本发明参考以下实施例进一步详述，但决不限于此。
一过性大脑中动脉阻塞模型采用大鼠大脑中动脉阻塞模型作为卒中模型。一过性大脑中动脉阻塞(MCAO)用血管内阻塞技术诱导45分钟(E.Z.Longa，P.R.Weinstein，S.Carlson，R.Cummins，Reversible middle cerebral artery occlusion withoutcraniectomy in rats，Stroke 20(1989)84-91)。
选用成年雄性Sprague-Dawley大鼠(n＝113)，体重为250到300g，用5％异氟烷麻醉，机械通气维持麻醉，用70％N2O和30％O2的气态混合物，其中含1.5％异氟烷。使用红外线加热灯，维持肛温在37℃。手术中在左股动脉插入套管，用于测量血pH、pO2和pCO2。取20.0到22.0mm长的3-0外科缝线(DermalonSherwood Davis & Geck，UK)，通过在火焰旁加热的方法使其尖端成为圆形，由颈外动脉向前进入颈内动脉腔，直到由此阻塞大脑中动脉(MCA)的起始处。MCAO之后45分钟将外科缝线的尖端由颈内动脉取出，进行再灌注。
在手术和移植治疗过程中，维持所有大鼠的生理学参数(肛温、血pH、pO2、pCO2及血压)在正常范围，试验组间没有统计学差异。
骨髓细胞的制备在骨髓细胞移植前一个半小时，从MCAO大鼠的股骨收集自体骨髓。
大鼠用氯胺酮(75mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg；i.p.)麻醉。在皮肤上做1cm的切口，使用空气钻机在股骨上穿一个小洞(2×3mm)，用22-号针抽吸1ml骨髓。采集的样本经过稀释，悬浮于培养基中，其中含有2ml的L-15培养基和3ml Ficoll(Amersham Biosciences)。以2,000rpm离心15分钟后，收集单核细胞级分，再次悬浮于2ml不含血清的培养基(NPMM神经祖细胞维持培养基，Clonetics，San Diego，CA，USA)。再次离心(2,000rpm，15分钟)后，将细胞悬浮于1ml NPMM中。
试验组用11个组进行试验(n＝88)。1号组(对照)的大鼠在MCAO之后不给予任何处理(n＝8)。2到6号组的大鼠在MCAO之后的3，6，12，24，及72小时后经静脉仅给予培养基(不给予供体细胞)(每组n＝8)。7到11号组的大鼠在MCAO之后的3，6，12，24，及72小时后经静脉给予自体骨髓细胞(1.0×107个细胞)(每组n＝8)。每组中用6只大鼠计算梗塞体积，其他的用于其他组织学分析。
对大鼠脑梗塞模型静脉给予自体骨髓细胞。
将LacZ基因引入骨髓细胞(单核细胞级分MCF)，然后移植给大鼠脑梗塞模型(一过性大脑中动脉阻塞模型)。
使用Adex1CAlacZ腺病毒来将LacZ基因转导入骨髓细胞。构建过程详见其它文献(I.Nakagawa，M.Murakami，K.Ijima，S.Chikuma，I.Saito，Y.Kanegae，H.Ishikura，T.Yoshiki，H.Okamoto，A.Kitabatake，T.Uede，Persistent and secondary adenovirus-mediated hepatic gene expression usingadenoviral vector containing CTLA4IgG，Hum.Gene Ther.9(1998)1739-1745.Y.Nakamura，H.Wakimoto，J.Abe，Y.Kanegae，I.Saito，M.Aoyagi，K.Hirakawa，H.Hamada，Adoptive immunotherapy with murine tumor-specific Tlymphocytes engineered to secrete interleukin 2，Cancer Res.54(1994)5757-5760.M.Takiguchi，M.Murakami，I.Nakagawa，I.Saito，A.Hashimoto，T.Uede，CTLA4IgG gene delivery preven)。该腺病毒载体具有腺病毒血清型-5基因组，其中缺失了E1A、E1B和E3区，这阻碍了病毒复制。代替了E1A和E1B域的是，该载体包含lacZ基因，这是大肠埃希氏菌(Escherichia coli)的β-半乳糖苷酶基因。lacZ基因包含于以下两者之间一为CAG启动子，其包含巨细胞病毒增强子和鸡β-肌动蛋白启动子(H.Niwa，K.Yamamura，J.Miyazaki，Efficient selection for high-expression transfectants with a noveleukaryotic vector，Gene 108(1991)193-199)；另一个为兔β-球蛋白多聚腺苷酸信号。重组的腺病毒在293细胞中繁殖，然后分离。病毒溶液储存在-80℃中备用。将自体骨髓细胞(1.0×107个细胞)与50MOI的AdexlCalacZ置于含有10％胎牛血清的DMEM中，维持在37℃，使腺病毒进行体外感染。
此后，曾被采取骨髓细胞的大鼠再被进行MCAO。接着，经左侧股静脉给予总体积为1ml的液体(NPMM)，其中包含约1×107个刚刚由自体骨髓制备出的单核细胞。
移植后2周，检测到体内有表达β-半乳糖苷酶的细胞。
首先，深度麻醉的大鼠的大脑被切出，通过留置于(leaving to stand)添加了0.5％戊二醛的磷酸盐缓冲液进行固定。用振动切片机将大脑切片(100μm)，并将断片置于X-Gal显影剂(磷酸盐缓冲的生理盐水，含有35mMK3Fe(CN)6/35mM K4Fe(CN)6.3H2O/2mM MgCl2)中，在37℃中温育过夜。X-Gal的最终浓度为1mg/ml。在细胞内形成蓝色反应物，因此表达β-半乳糖苷酶的细胞可以被检测到。
在解剖显微镜下观察每个脑切片的横截面，并用图像分析器记录。然后将切片留置于添加了4％的多聚甲醛的磷酸盐缓冲液中过夜固定，脱水，再包埋于石蜡中。切割切片(5μm)，用光学显微镜(ZeissAxioskop FS)评价蓝色反应产物(β-半乳糖苷酶反应产物)的出现。将一些切片用苏木精和伊红复染。
X-gal在宿主脑组织中显蓝色，因此供体MCF细胞在宿主脑组织中作为蓝色细胞显现(图1)。经静脉给予的MCF细胞聚集在脑梗塞区。
局部及静脉给予MCF对治疗效果的影响试验结果显示治疗效果随移植细胞的数目增多而增加(图2)。结果还显示，要达到基本相同的治疗效果，静脉给药所需的剂量约为局部给药的一百倍。反之，当静脉给药的细胞数是局部给药的一百倍时，预计静脉给药可以显示出与局部给药基本一致的治疗效果。
自体MCF移植对大鼠脑梗塞模型的治疗效果自体MCF(1×107个细胞)被移植给大鼠脑梗塞模型(一过性大脑中动脉阻塞模型45分钟)。
梗塞灶的范围用2，3，5-氯化三苯基四唑(TTC)染色来检查(J.B.Bederson，L.H.Pitts，S.M.Germano，M.C.Nishimura，R.L.Davis，H.M.Bartkowski，Evaluation of 2，3，5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection andquantification of experimental cerebral infarction in rats，Stroke 17(1986)1304-1308)。正常脑用这种方式染为红色。
移植2周后，将大鼠用戊巴比妥钠深度麻醉(50mg/kg，i.p.)。大脑被小心地切出，用振动切片机切为1mm的冠状位切片。新鲜脑切片浸入37℃的含有2％的2，3，5-氯化三苯基四唑(TTC)的生理盐水中30分钟。
结果，脑梗塞区域(包括大脑皮质及基底核)轻微染色，脑梗塞为白色图像，在MCAO模型大鼠的脑中可以清楚显现。
用解剖显微镜检查每个脑切片中的梗塞的横截面积，并用图像分析软件NIH image测量。将所有脑切片中的梗塞区域相加，计算每个脑的总梗塞体积。
对梗塞体积进行统计分析。数据用“平均值±SD”表示。用鉴别组间差异的Scheffes post hoc检验法通过ANOVA来评价组间差异。将差异达到p＜0.05视为具有统计学显著意义。
未给予细胞的(对照组)缺血病灶的组织分析显示，缺血病灶的出现具有再现性和一贯性，它们的平均体积为258±55mm3(n＝6)(图3F)。关于梗塞模型的阻塞指数，通过TTC测定缺血程度最高的为纹状体(尾核-壳核)，苍白球和隔核，而皮质相对轻微。
使用同一梗塞参数，在诱导梗塞后3，6，12，24和72小时静脉给予骨髓细胞。在上述所有时间点，移植都使梗塞体积减少，但在诱导缺血后早期进行移植所得的结果更好。当在MCAO之后3小时静脉给予自体骨髓干细胞，事实上没有发现梗塞(图3A)，TTC染色上的变化几乎检测不到，但在目标梗塞区域检测到轻微的炎症反应。当在MCAO之后6小时给予细胞，基底核的梗塞部分TTC染色强度减弱(40±28mm3，n＝6)(图3B)。在MCAO之后12小时(80±25mm3，n＝6，图3C)，24小时(140±18mm3，n＝6，图3D)，以及72小时(180±22mm3，n＝6，图3E)给予细胞，梗塞依次增强。
移植越早进行，治疗效果越明显。但是，值得注意的是，即使是在脑梗塞后72小时进行治疗，也可以获得一定程度的治疗效果。
治疗效果被认为是神经保护和神经再生的协同效果。在脑梗塞后进行移植越早，神经保护效应就越强。此外，治疗进行得相对晚时，神经保护效应相对削弱，但神经再生效应则会更强。
将所得结果量化并用图4的柱状图显示，梗塞体积为对照组的(没有植入细胞的组)和梗塞模型动物的(移植了细胞的组)，后者在MCAO之后3，6，12，24及72小时给予细胞。
对大鼠脑梗塞模型静脉给予自体MCF的效果诱导MCAO之后给大鼠脑梗塞模型静脉给予引入了LacZ的自体MCFs(1×107个细胞)。体内识别骨髓细胞。
用激光扫描共焦显微镜来分析体内移植细胞的表型(n＝5)。大鼠用戊巴比妥钠(50mg/kg，i.p.)深度麻醉，心脏先用PBS灌注，然后用固定液灌注，后者为含有4％多聚甲醛的0.14M Sorensen′s磷酸盐缓冲液(pH7.4)。将脑切出，在4℃的含有4％的多聚甲醛的磷酸盐缓冲液中固定24小时，再在含30％蔗糖的0.1M PBS溶液中脱水。将组织置于O.C.T.化合物(Miles Inc.)，在液氮中冷冻，用冷冻切片机切成10μm厚的冠状位切片。切片在附有硅烷的载玻片上干燥。
为了识别由供体骨髓衍生的细胞类型，用抗β-半乳糖苷酶的抗体(用Alexa Fluor 594标记的多克隆兔抗β-半乳糖苷酶抗体(IgG)，CHEMICON)，神经元抗体(用Alexa Fluor 488[NSE]标记的单克隆小鼠抗神经元特异性烯醇化酶抗体(IgG)，DAKO)以及星形胶质细胞抗体(用Alexa Fluor 488[GFAP]标记的单克隆小鼠抗神经胶质纤维酸性蛋白抗体(IgG)，SIGMA)进行双标记研究。第一抗体用Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 594标记，按照产品说明书，使用Zenon小鼠或兔IgG标记试剂盒(Molecular Probes)。组织切片在覆有硅烷的载玻片上干燥，再用PBS洗(3次，每次5分钟)，再用含0.1％Triton-X的PBS在室温处理30分钟，再用封闭液(Protein Block SerumFree，DAKO)在室温温育10分钟。进一步用两种第一抗体处理组织切片，置于在室温60分钟，再用PBS冲洗(3次，每次5分钟)。免疫染色后，用荧光封片剂(DAKO)将盖玻片覆盖在载玻片上。分别用源自氩激光的488nm的激光束激发Alexa Fluor 488(绿色)，用源自He-Ne激光的543nm激光束激发Alexa Fluor 594(红色)。用激光扫描共焦显微镜(Zeiss)及软件(Zeiss)获得共焦图像。
移植的MCFG细胞用X-gal处理，使供体细胞以蓝色显现出来。
结果显示，移植的供体细胞聚集在脑梗塞的内部及周围。图5A显示梗塞区的冠状位切片中含有聚集的LacZ-阳性细胞。用光学显微镜检查，显示在缺血病灶内部及周围有许多细胞(图5B)，其中大部分为LacZ-阳性供体细胞(图5C)。免疫组化分析显示有一些LacZ-阳性供体细胞表达神经元标记物NSE(图5E)或星形胶质细胞标记物GFAP(图5H)。图5F和5I均显示LacZ，NS E，和GFAP图像的合成图像。在对照组未发现清晰的荧光信号。这些结果显示至少一些移植的骨髓细胞可以分化为神经元细胞系(图5E和5F)和神经胶质细胞系(图5H和5I)。
移植的MCF细胞向脑内迁移移植的MCF细胞迁移入脑内的比例很高(图6)。迁移随移植距脑梗塞的时间而不同。例如，在MCAO之后3小时静脉给予细胞且梗塞体积减小(图6A)的情况下，在受保护的病灶的血管组织和实质脑组织中均观察到LacZ阳性细胞，提示移植的细胞移行到将会出现脑梗塞、且不治疗将会受到不可逆损坏的位置，这些细胞显示出显著的神经保护效应，挽救通常情况下将会被杀死的神经系统细胞(图6D和G)。当在MCAO之后12小时给予自体骨髓细胞(图6B)，病理生理学特性更加复杂。在认为缺血应激导致了严重损伤的区域发现了数量相对较多的蓝色供体细胞，而病灶的非损伤区域只有数量较少的供体细胞(图6E和6H)。除以上所观察到的神经保护效应之外，也发现了神经再生效应(图6A，6D及6G)。相反，在MCAO之后72小时给予自体骨髓细胞，缺血损伤更重(图6C)，在病灶中发现的移植细胞更少(图6F和I)。以上观察到的神经保护效应(图6A，6D和6G)相对小，但是观察到强大的神经再生效应。但是应该注意，甚至在这一组中，TTC检测也显示脑梗塞被骨髓细胞移植所抑制。
通过行为学测试来确认MCF移植的治疗效果MCF移植的治疗效果被两个行为学测试证实。一个是莫里斯水迷宫测试(Morris water maze test)，用来评价学习和记忆行为，另一个是踏车应激试验(treadmill stress test)，用来评价运动功能。
高级大脑功能(记忆、学习)用基于莫里斯方法(R.G.M.Morris，Spatiallocalization does not depend upon the presence of local cues，Learn Motiv.12(1981)239-260)改良的水迷宫试验来测试。静脉给予自体骨髓或假给药均在诱导梗塞后12小时进行。
装置包括一个白色钢槽，直径为1.3m，盛水达30cm深。用白色蛋彩染料(tempera paint)使水变得不透明，维持水温24℃。空间的壁有可见的提示，这些提示在试验过程中保持位置不变。每次训练试验中，在水槽的四分之一空间(one quadrant)中，放置直径为8cm的圆形陶瓷平台，距水面2.5cm。训练的第一天，仅完成一项驯化试验，是将每只大鼠在隐藏的平台上放置60秒。如果大鼠由平台上掉下或跳下，将大鼠由水中救起，放回平台上。将摄像机安装在顶板上，连接到计算机跟踪成像分析系统，用于搜索该空间和监视游泳的速度。
也进行踏车应激试验。静脉给予自体骨髓或假给药均在诱导梗塞后12小时进行。
训练大鼠，使其在驱动的踏车上以20m/分的速度跑，踏车倾斜度为0°，每天训练20分钟，每周两天。大鼠被放置在背离通电格栅运动的传动带上，使大鼠向传动带移动的相反方向跑动。也就是说，大鼠必须向前跑才能避免脚爪被电击(强度为1.0mA)。只将学会避免微弱电击的大鼠纳入试验(n＝10)。记录大鼠在驱动的踏车上跑动的最大速度。
对莫里斯水迷宫试验和踏车应激试验中的行为学得分进行统计学分析。数据用“平均值±SD”表示。用鉴别组间差异的Scheffes post hoc检验法通过ANOVA来评价组间差异。将差异达到p＜0.05视为具有统计学显著意义。
试验数据显示在两个试验中均观察到行为有进步(每组n＝10)(图7A和7B)。对未经移植组和移植组在正常时间的观察均未发现运动障碍。但是，踏车试验显示，经过治疗的大鼠在驱动的踏车上跑动的速度较未经治疗的大鼠快(图7B)。这显示移植可以显著改善因脑梗塞引起的运动功能衰退。严重的运动障碍可以潜在地影响游泳速度，但认为本发明中轻度的运动障碍不会导致莫里斯水迷宫测试中表现不佳。
治疗效果的经时MRI分析用MRI来按照时间顺序检查在存活动物中的治疗效果。在临床检查和治疗中使用该方法，用本方法获得的数据可以不经修正直接用于临床，因此很有作用。
首先，大鼠用氯胺酮(75mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg；i.p.)麻醉。每只大鼠被置于动物容器/MRI探测装置，并放置在磁铁中。大鼠头固定在成像线圈中。每次MRI测定使用7个特斯拉的超导磁体(Oxford MagnetTechnologies)，内部直径为18cm，与BiospecI分光计(Bruker Instruments)连接。获取冠状截面的T2加权成像，厚度为0.5mm，视野为3cm，TR＝3000ms，TE＝30ms，并用128×128图像矩阵进行重建。
用MRI检查被诱导脑梗塞的大鼠，自脑梗塞后3小时起检测异常信号。具体地，脑缺血区域在MRI(T2WI)中以高密度区域(HIA)而被检测到(图8，上行)。未经治疗组中异常信号持续存在(图8，下行)，逐渐形成脑梗塞区域。
使用间叶干细胞的治疗效果。
静脉给予骨髓细胞(单核细胞级分MCF)，显示对脑梗塞显著的治疗效果。MCF中约0.1％是间叶干细胞(MSC)，也用于治疗，其治疗效果是明确的。间叶干细胞易于采样、培养、增殖和保存。
将MSC(1×107个细胞)用于图8中脑梗塞的大鼠。在脑梗塞后12小时静脉给予细胞，在脑梗塞后MRI检查已经显示异常信号(HIA)(图9，上行)，而在治疗后1周再次检查异常信号消失。
因而，证实了静脉给予MSC可以治疗脑梗塞，这在当前的医疗水平还不可治疗。
移植MSC细胞数目和治疗效果之间的关系在脑梗塞后12小时静脉给予MSC(1×104到1×107个细胞)。
为阐明MSC和hTERT-MSC移植对于减小缺血病灶体积的效果，在诱导梗塞后12小时静脉给予不同浓度的细胞(1×104到1×107个细胞)，并在MCAO之后12小时后及静脉给予不同浓度的hTERT-MSC后一周分别获得所有试验动物的脑成像(T2加权像)。用活体内MRI来估计最初的梗塞体积。
图10的左侧一行(A1-E1)显示5只大鼠的简易脑成像，在损伤12小时后获取。这些前脑冠状截面均在尾-壳复合体水平获得。可见缺血损伤位置为高密度区域。对侧脑组织显示正常信号，可以作为对照。
通过分析由整个大脑收集的一系列图像中的高密度区域来评价梗塞体积(mm3)。估测的梗塞体积在检测的动物中是恒定的(214±23mm3，n＝25)。
仅给予载体(介质)时，MRI分析没有发现梗塞范围的变化(图10A2)。随着静脉给予hTERT-MSC数目的增加，梗塞体积减小。给予104hTERT-MSC时，梗塞体积轻微缩小，显示轻微治疗效果(图10B2)(176±21mm3，n＝5)给予105个细胞(138±36mm3，n＝5)和106个细胞(56±18mm3，n＝5)时，梗塞体积的缩小逐渐增加，而且治疗效果变得显著(图10C2和10D2)。给予107个细胞时，梗塞体积减小最多，预计实际上可达到完全的治疗效果(图10E2)(23±31mm3，n＝5)。在治疗前(图10A1，B1，C1，D1，和E1)观察到的异常信号(HIA)，如果不经治疗则保持不变(图10A2)，但治疗后部分或几乎全部消失(图10B2，C2，D2，和E2)。
在另一试验中，也静脉移植初级MSC。移植106初级MSC与使用同样数目的hTERT-MSC(图10F)对梗塞体积的缩小程度相同。(61±18mm3，n＝5，vs.56±18mm3，n＝5，p＝0.69).进行一个附加的伪装对照试验，使用106的皮肤成纤维细胞(图10F)。移植106的皮肤成纤维细胞未显示梗塞体积减小(240±27mm3，n＝5，p＝0.95)。
静脉给予MSC对脑梗塞的治疗效果与移植细胞的数目相关。即移植的细胞越多，治疗效果越强。
也进行组织学确证(图11)。
通过MRI分析评价病灶体积后，在给予细胞之前和之后，对大鼠进行灌注(were perfused)，用2，3，5-氯化三苯基四唑(TTC)染色，获得梗塞体积的次级独立测量(second independent measurements)。正常脑组织通常被TTC染色，但是梗塞病灶不被染色或轻微染色。图11A显示TTC染色的结果，为未经细胞移植的情况，在MCAO之后1周获得。在病灶侧的染色主要在纹状体观察。通过测量前脑中TTC染色减轻的区域来计算病灶体积。与用MRI分析一样，梗塞面积随移植细胞的数目增加而减小。TTC染色的评价显示静脉给予107hTERT-MSC显著减少了病灶体积(图11B and C)。
移植供体细胞的积聚MCAO之后12小时给大鼠脑梗塞模型静脉给予引入了LacZ或GFP的MCFs(1×106个细胞)。
培养的细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗，用固定溶液在4℃固定15分钟，固定液为含有4％多聚甲醛的0.14M Sorensen′s磷酸盐缓冲液。固定的细胞用含有0.2％Triton X-100和5％的正常山羊血清的封闭液温育15分钟，在用第一抗体温育。使用的第一抗体为抗神经特异性烯醇酶(NSE；1∶1000多克隆兔抗-NSE，Nitirei)抗体，抗神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP；1∶200多克隆兔抗-GFAP，Nitirei)抗体和抗-Nestin(Nestin；1∶5000大鼠单克隆抗-Nestin，Chemicon)抗体。为使第一抗体可以肉眼观察，使用带有荧光素(FITC)(1∶100，Jackson免疫研究实验室，Inc.)的山羊抗-大鼠IgG抗体和山羊-抗兔IgG抗体，或碱性磷酸酶反应(Zymed)，按照产品说明书使用。免疫染色后，将盖玻片置于显微镜载玻片上，使用封固介质(Dako)，细胞侧向下。使用免疫荧光显微镜(Axioskop FS；Zeiss)拍摄照片。
分别用源自氩激光的488nm的激光束激发FITC荧光染料(绿色)，用源自He-Ne激光的543nm激光束激发玫瑰红荧光染料(红色)。用激光扫描共焦显微镜(Zeiss)及软件(Zeiss)获得共焦图像。
如图10和11所示，移植治疗使梗塞体积显著减小，但是，表达hTERT-MSC的GFP主要在纹状体发现(未经移植的大鼠中形成梗塞最多的部位most infarctionwas identified in the untransplanted rats)。
图12A和12B显示GFP荧光的共焦成像与透射光成像transmitted lightimage的融合图像，分别为低倍和高倍放大，图像均为梗塞侧的纹状体。注意类似GFP阳性细胞的成分很丰富。表达GFP的细胞主要集中在纹状体，但在受影响的整个大脑半球都可以发现一些。在对侧的纹状体获取的图像中没有发现GFP的表达，在这一侧没有诱导梗塞。这些数据显示全身途径给予的细胞到达了病灶部位。
进行组化分析来确认移植了LacZ转导的hTERT-MSC的大鼠的梗塞部位中的不成熟神经元(NeuN)和星型细胞GFAP)。
结果，有少量的NeuN-阳性细胞和GFAP-阳性细胞可以用LacZ联合染色(图12G到L)。
移植的供体细胞积聚在脑梗塞区域(图12A，B，C，和D)。在荧光显微镜下，宿主脑组织中的MSC变为绿色。在未经移植的组中没有发现供体细胞(图12E和F)。某些移植的供体细胞分化为神经元(图12G，I和K)和神经胶质细胞(图12H，J和L)。
通过代谢分析确证静脉给予MSC的治疗效果以代谢的方式调查静脉给予MSC对脑梗塞的治疗效果。
具体地，使用磁共振光谱法(MRS)来测定在细胞移植之前和之后脑内的NAA和乳酸盐水平。已经报道在NAA信号与正常神经元的存在有相关性，乳酸盐升高与神经元死亡有相关性(Barker，P.B.，Gillard，J.H.，van Zijl，P.C.，Soher，B.J.，Hanley，D.F.，Agildere，A.M.，Oppenheimer，S.M.and Bryan，R.N.，Acute stroke用连续质子MR光谱学成像进行评价，Radiology，192(3)(1994)723-32.)对诱导MCAO之后12小时的病灶侧和非病灶侧大脑半球进行NAA和乳酸盐水平的MRS分析。
进行MRS的参数为TR＝1500毫秒，TE＝20毫秒，均值＝1024，体素大小为2.5×2.5×2.5mm3.通过如下方法精确定位大脑，将大鼠头保持在头颅平卧位flat skull position，并将成像截面的中心定位于鼻裂后方5mm。
从而，也可以用代谢的方式验证静脉给予MSC对脑梗塞的治疗效果。正常的大脑半球显示NAA水平最高，而没有乳酸盐信号(图13A和D)。相反，病灶侧显示NAA水平低，而乳酸盐信号高(FIGS13A和E)。不经过细胞移植，则在诱导梗塞后1周NAA信号低，乳酸盐信号高(图13B和F)。相反，静脉给予107hTERT-MSC后，NAA信号出现，乳酸盐信号低，提示脑组织被移植治疗保护(n＝5)(图13C和G)。
通过行为学分析来确认MCF移植的治疗效果进行两个试验来评价诱导了梗塞的大鼠和移植后的大鼠的行为能力莫里斯水迷宫试验和踏车应激试验。这些行为学试验在诱导梗塞后1周时开始，单独进行或与细胞移植同时进行。
莫里斯水迷宫试验每隔一天进行一次。对照大鼠在几秒钟内学会登上平台(Morris，R.G.M.，空间定位不依赖于局部暗示的存在，Learn Motiv，12(1981)239-260.)。诱导MCAO之后的大鼠完成试验需要大约140秒。未经移植的大鼠显示逐步的提高，在试验的第26天学会在约40秒内登上平台。诱导MCAO并静脉给予hTERT-MSC后的大鼠，登上平台所需的时间逐渐缩短，在试验的第26天，可以在几秒钟内登上平台，提示移植导致了显著的提高(图14A)。
踏车应激试验中，对照大鼠(无梗塞)的最大踏车速度达到约60m/min。单纯诱导MCAO之后1周的，或诱导MCAO并进行移植后1周的，踏车试验的最大速度约为35m/min(图14B)。未经治疗的大鼠在诱导梗塞后11天时开始显示踏车速度提高，逐渐改善，25天时提高最多(46.3+6.1，n＝10)。细胞移植治疗组显示踏车速度提高更多，损伤后25天其最高速度达到了对照组的水平(62.0+7.2，n＝10)。这些结果显示移植可以显著改善因脑梗塞引起的运动功能衰退。
MSC对严重脑梗塞的治疗效果用严重脑梗塞(永久大脑中动脉阻塞模型)的大鼠研究使用MSC的再生医疗技术的治疗效果，以便确定组织损伤达到何种程度时该治疗可以促进恢复。与例1到15所用的一过性大脑中动脉阻塞模型不同，这里使用的模型中大脑中动脉被永久性阻塞。这一模型的制备条件与例1到15中使用的模型相同，只有阻塞时间除外。
与前述大鼠脑梗塞模型(一过性大脑中动脉阻塞模型45分钟)相比，严重脑梗塞的大鼠显示的脑梗塞区域更广泛(图15，用TTC染色显白色的部分)。
在严重脑梗塞中，用MRI分析也检测到与脑梗塞一致的异常信号(图16)。如果不经治疗，脑梗塞引起的异常信号(MRI中的HIA)随时间变得更加清晰(12小时、3天及7天后)(图17)。
将MSC(1×106个细胞)静脉给予严重脑梗塞的大鼠(大鼠永久大脑中动脉阻塞模型)。在脑梗塞后1周用MRI分析(T2WI)研究治疗效果。脑梗塞处显白色。移植在脑梗塞后3小时、6小时、12小时、24小时及72小时定时进行。在未经治疗组(最上行)可以观察到清晰的脑梗塞灶，但在脑梗塞后3小时静脉给予MSC的组几乎观察不到(图18)。特别地，静脉给予MSC也对严重脑梗塞有显著的治疗效果。移植越早进行，治疗效果越明显。但是应该注意到，即使在脑梗塞后24小时或更久进行治疗也可以观察到一定程度的治疗效果。
治疗效果被认为是神经保护和神经再生的协同作用的效果。在脑梗塞后进行移植越早，神经保护和抗水肿反应越强。治疗进行得相对晚时，神经保护效应相对削弱，但神经再生效应则会更强。
图19对结果定量化，用脑梗塞体积测定对严重脑梗塞(大鼠永久性大脑中动脉阻塞模型)静脉给予MSC(1×106个细胞)的结果。按照障碍出现到给予MSC的时间间隔对结果进行划分。座标图显示，未经治疗组的梗塞体积约为500mm3，但MCAO之后3小时治疗的组的梗塞体积仅为200mm3，提示效果明显。在MCAO之后12小时内进行治疗，梗塞体积较未经治疗组明显减小。治疗越灶，梗塞体积减小越多，说明预后越好。
在大鼠脑梗塞模型超急性期静脉给予MCF的效果。
调查在超急性期静脉给予MSC对严重脑梗塞按时间顺序的治疗效果。
当在诱导脑梗塞后3小时对严重脑梗塞静脉给予MSC(1×106个细胞)，MRI检查中显示的异常信号(HIAs)在治疗几天后消失，而且这种效果会持续下去。(图20)MSC的治疗效果表现在给药相对早的时期，脑梗塞的急性期静脉给予MSC的主要治疗效果可能是神经保护效应和抗水肿反应，而不是继续这些作用。
在大鼠脑梗塞模型急性期静脉给予MCF的效果。
检查在急性期静脉给予MSC对严重脑梗塞按时间顺序的治疗效果。当在诱导脑梗塞后6小时对严重脑梗塞静脉给予MSC(1×106个细胞)，MRI检查在治疗前立即出现的异常信号(HIAs)在治疗后逐渐消失(移植治疗后18小时、1周、2周及4周)。(图21)未经治疗组中没有观察到这些治疗效果。(无数据)[实施例19]严重脑梗塞在静脉给予MSC后的存活能力对严重脑梗塞(大鼠永久大脑中动脉阻塞模型)静脉给予MSC(1×106个细胞)，调查出现障碍后存活能力的变化并作座标图。
座标图显示了静脉给予MSC(1×106个细胞)可以显著提高严重脑梗塞(大鼠永久大脑中动脉阻塞模型)的存活能力(图22)。不经治疗，同样的脑梗塞模型大鼠有90％死亡，但是，当在脑梗塞后3小时静脉给予MSC(1×106个细胞)，80％的大鼠可以存活。这显示治疗开始越早，存活能力越高。治疗后的存活能力也是显著的。
MSC移植对于严重脑梗塞的临床症状的作用对严重脑梗塞进行MSC移植治疗，并研究临床症状。
MSC移植显著改善严重脑梗塞的临床症状(图23)。踏车应激试验显示移植可以显著改善曾因脑梗塞引起衰退的运动功能。
诱导源于外周血的粘附的培养细胞分化为神经干细胞或神经系统细胞由外周血获得粘附的培养细胞如间叶干细胞。已经显示，事先皮下注射因子如g-CSF或SCF，可以获得大量这种细胞。
所获得的粘附的培养细胞可以被诱导分化为神经干细胞(Neurosphere)。Nestin的表达可以通过RT-PCR来证实(图25)。
所获得的粘附的培养细胞可以被诱导分化为神经元(NF阳性细胞)和神经胶质细胞(GFAP阳性细胞)。NF和GFAP的表达都可以通过RT-PCR来证实(图26)。
以下的例22到31调查在脑梗塞后相对较长的时间对脑实质移植转基因干细胞的治疗效果。
细胞的制备获取健康成人志愿者的知情同意后，由其后髂嵴获取人骨髓(BM)。本试验由Sapporo医科大学研究所审查委员会(Institutional Review Board ofSapporo Medical University)批准。BM单核白细胞被铺于塑料组织培养瓶上，温育过夜。冲洗掉游离的细胞后，将粘附细胞在37℃下用Dulbecco’s改良要素培养基(DMEM)培养，其中含有10％的加热失活的胎牛血清(FBS)(GIBCO BRL，Rockville，Maryland)，空气经湿化，含CO25％。
达到会合后，收集细胞并用于基因转染，使用逆转录病毒载体BABE-hygro-hTERT(Kawano，Y.，等(2003).使用协调细胞培养系统与人类端粒酶催化亚单位(hTERT)-转染的人类间质细胞共同进行人脐带造血祖细胞的活体外扩增Blood 101，532-540.)。本研究中使用群体倍增数(PD)在40以内的MSC。
MSC的生态学特征与Kobune等先前所描述的相同(Kobune，M.，等(2003).调聚后的Telomerized人类多能间叶细胞可以分化为造血的和支持鹅卵石区cobblestone area-supporting的细胞。Exp Hematol 31，715-722.).由TAKARA BIO INC.(日本)获取成人正常人类皮肤成纤维细胞(NHDF-Ad)，并在上述的含有10％FBS的DMEM中培养。
腺病毒载体按照已知程序(Nakamura，T.，Sato，K.and Hamada，H.(2002).通过整联蛋白靶向的腺病毒载体对人黑色素瘤进行有效的基因转移Hum Gene Ther13，613-626.、Dehari，H.，et al.(2003).RGD纤毛改良的腺病毒对与口腔癌的基因治疗的强化的抗肿瘤作用Cancer Gene Ther 10，75-85.)，构建一个腺病毒载体(AxCAEGFP-F/RGD)，载有RGD突变纤毛与Aequoria victoria绿色荧光蛋白(增强GFP.EGFP)的人类的变体的基因，由CA启动子(带有CMV-IE增强子的鸡β肌动蛋白启动子)控制。
由pEGFP载体(BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA)中分离EGFP基因片段并插入pCAcc载体(pCAEGFP)(Yamauchi，A.，et al.(2003).在兔缺血模型中预先给予血管生成素-1，再给予VEGF诱导有功能的成熟血管生成。J Gene Med即将发行的一期in press)由此产生的粘粒载体pWEAxCAEGFP-F/RGD与ClaI-和来自Ad5dlx-F/RGD的EcoT221-消化的DNA-TPC一起，共同转染给人类胚肾293细胞。由孤立的菌斑中获取的腺病毒表达EGFP的载体，AxCAEGFP-F/RGD，在这些细胞中扩增，并用氯化铯超速离心法提纯(Kanegae，Y.，等(1995).使用表达位置特异的Cre重组酶的重组腺病毒在哺乳动物细胞中进行有效的基因活化。Nucleic Acids Res23，3816-3821.)。
如上所述，构建另一个腺病毒载体(AxCADsR-F/RGD)，载有RGD突变纤毛与Discosoma红色荧光蛋白(DsR)的人类的变体的基因，由CA启动子控制。
通过聚合酶联反应，使用由最初培养的MSC中提取的总RNA作为模板(RT-PCR)，克隆人BDNF cDNA。用测序并与GenBank序列XM 006027比较的方法，检验以此方式获取的BDNF cDNA的同一性。人类BDNF引物的序列为前向5′-CGGAATTCCACCATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTA-3′(SEQ ID NO1)；逆向5′-CCAGATCTATCTTCCCCTTTTAATGGTCAATGTA-3′(SEQ ID NO2).
将BDNF cDNA插入pCAcc载体的EcoRI位置和BglII位置之间，获得一个质粒，命名为pCAhBDNF。质粒pCAhBDNF被ClaI消化后，用琼脂糖凝胶电泳分离出包含表达BDNF cDNA的单元的片断。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司，东京，日本)制备表达BDNF的腺病毒载体pWEAxCAhBDNF-F/RGD。
使用病毒载体之前，评估病毒的浓度和滴度，检查病毒库是否受到有复制能力的病毒的潜在的污染。为检测病毒的浓度(微粒单位(pu)/ml)，病毒溶液在0.1％十二烷基硫酸钠中温育，再测量A260(Nyberg-Hoffman，C.，Shabram，P.，Li，W.，Giroux，D.and Aguilar-Cordova，E.(1997).腺病毒感染滴度测定的敏感性和可重复性Nat Med 3，808-811.)。AxCAhBDNF-F/RGD，AxCAEGFP-F/RGD，and AxCADsR-F/RGD的病毒滴度分别为4.35×1011，5.38×1011，和1.03×1012pu/ml。
腺病毒感染如上所述进行腺病毒介导的基因转染(Tsuda，H.，等(2003).通过纤毛突变的腺病毒载体进行有效的BPM2基因转移和间叶干细胞的骨骼形成。MolTher 7，354-365.).
简单地说，细胞被散布在15cm的平皿上，密度为每个平皿2×106个细胞。将MSC暴露于含有传染性病毒颗粒的DMEM悬液7.5ml，置于37℃下60分钟。用来感染细胞的AxCAhBDNF-F/RGD，AxCAEGFP-F/RGD，andAxCADsR-F/RGD的病毒的MOIs分别为1×103，4×103，以及4×103pu/cell。然后移除培养基，用DMEM冲洗细胞一次，再用正常培养基二次培养24小时，再移植入大脑。
免疫反应性人类BDNF的体内检测和定量分析用AxCAhBDNF-F/RGD(MSC-BDNF)转染的MSC在MOIs为100，300，1000，及3000pu/细胞时，分泌BDNF速度分别为0.230±0.110，0.434±0.122，0.931±0.101，以及1.860±.410ng/105个细胞/48小时。未转染的MSC也产生BDNF蛋白，速度为0.0407±0.0059ng/105个细胞/48小时。MSC-BDNF细胞在MOI为1000pu/cell时生产BDNF的水平是未感染的MSC的23倍。(图27)[实施例26]一过性MCAO动物模型和大脑内移植本研究中使用的动物经过Sapporo医科大学动物管理及使用委员会的批准，所有程序均按照研究指南进行。
大鼠用3.5％氟烷麻醉，并用面罩以及含有1.0％到2.0％的氟烷的70％N2O和30％O2保持无意识状态。手术后，将动物置于加热灯下，保持体温为37℃。对雄性Wistar大鼠(每只为250到300g)诱导局部脑缺血，使用血管内大脑中动脉阻塞(Tamura，A.，Gotoh，O.and Sano，K.(1986)[大鼠的局部大脑梗塞I.慢性模型的手术技术和生理监护]No To Shinkei 38，747-751.).将一根末端覆有硅树脂的5-0单纤维尼龙缝线通过右颈总动脉切开术逐渐插入，通过颈内动脉进入颈动脉分叉处远端约18mm的位置。短时间阻塞90分钟后抽出尼龙缝线，恢复脑的血流。
将供体MSC植入大脑时按照Goto等人描述的方法(Goto，S.，Yamada，K.，Yoshikawa，M.，Okamura，A.and Ushio，Y.(1997).通过在受损的纹状体移植胎儿纹状体原基，用GABA受体激动剂促进纹黑突途径的再形成Exp Neurol147，503-509.)。
用以下所述行为学试验确证诱导了缺血性脑损伤后，将动物随机分组进行移植。动物用腹腔注射(IP)氯胺酮(2.7到3mg/100-g)和.甲苯噻嗪(0.36到0.4mg/100-g)来麻醉，并置于Narishige脑功能区定位框中(Model SR-6N，Narishige Co.，Ltd.，日本)。使用26号汉密尔顿注射器，在2.5分钟内将含有5×105MSC的无血浆的DMEM悬液5μl注射入颅骨表面以下4mm、前囟水平外侧3mm的右侧背外侧纹状体。(Paxinos，G.，Watson，C.，Pennisi，M.and Topple，A.(1985)不同性别、品种和体重的大鼠进行脑功能区定位手术中的前囟、人字缝和耳间正中点J Neurosci Methods 13，139-143.).这一位置近似为缺血边界区。为抑制对人MSC移植的排斥，给移植后的大鼠腹腔内给予环孢A(10mg/kg/天)。
MSC-BDNFs的治疗效果(试验1)试验1在MCAO之后14天进行，为了检验MSC-BDNF的治疗有效性。试验分组如下第1组(对照)在MCAO之后24小时在缺血边界区注射DMEM的大鼠(n＝7)第2组在MCAO之后24小时在缺血边界区移植成纤维细胞的大鼠(NHDF-Ad)(n＝6)第3组在MCAO之后24小时在缺血边界区注射MSC的大鼠(n＝7)第4组在MCAO之后24小时在缺血边界区移植MSC-BDNFs的大鼠(n＝7)在MCAO之后1、8、15天进行LPT，MCAO之后8和15天进行踏车应激试验。MRI在第2、7及14天时进行。
(1)肢体放置试验(LPT)(图28A)LPTs包括8个亚组试验，由Johansson和coworkers描述(Ohlsson，A.L.and Johansson，B.B.(1995).环境影响大鼠脑梗塞的功能方面的结局。Stroke26，644-649.)，在诱导缺血后24小时进行。
简单地说，用一个计数器顶的顶端和边缘the top and edges of a countertop来评估大鼠的四肢。在每一个亚组试验，对动物如下评分0＝不能放置肢体；1＝局部放置肢体和/或延迟(超过2秒)；2＝立即正确地放置肢体MCAO之前的神经学评分对所有动物都相似。MCAO之后1天，脑内注射MSC之前，在四个缺血的组之间肢体放置评分没有统计学差别。MCAO之后8天，给予MSC-BDNF的大鼠的肢体-放置评分(8.43±1.52)显著高于对照组用DMEM大鼠(3.71±0.49，P＝0.0001)和成纤维细胞治疗的大鼠(5.00±1.10，P＝0.003)。MCAO之后15天，给予MSC-BDNF的大鼠得分为9.14±2.61，得分显著高于DMEM组(5.00±1.73，P＝0.024)。相反，给予MCS的大鼠在第8天和第15天的得分都未能高于给予DMEM或成纤维细胞的对照大鼠，(2)踏车试验(图28B)踏车试验中，将大鼠放置在加速踏车上(Model MK-680，MuromachiKikai Co.，Ltd.，Japan)(Mokry，J.(1995).帕金森病的研究中使用的试验模型和行为学试验。Physiol Res 44，143-150.).使大鼠在传送带上跑，传送带的速度逐渐提高，每10秒增加10m/s，最大速度为70m/s，同时保持大鼠位于传送带的中间位置。大鼠不能再跑时，试验正式结束。测量每只动物能够跑动的最大速度。在MCAO之后8天和15天对大鼠进行测试。
比较各组在MCAO前的平均踏车速度。MCAO之后8天，MSC-BDNF组的大鼠的速度(23.4±2.6m/s)显著高于对照组用DMEM(9.57±5.6m/s；P＝0.001)和成纤维细胞治疗的大鼠(11.8±6.2m/s；P＝0.017)。这种差异甚至在第15天也持续存在。MSC-BDNF，对照DMEM和对照成纤维细胞组的速度分别为36.6±9.5，12.1±9.4(P＝0.002)，以及15.8±11.3(P＝0.023)。MSC治疗的大鼠在第8或15天都没有显示对康复有促进作用。
(3)MSC-BDNF治疗后梗塞体积减小，如MRI测定的结果(图29A和29B)在MCAO之后第2、7及14天时对所有动物进行MRI。动物在MRI前被麻醉。MRI装置由以下部分组成7T的超导磁体，直径为18cm，其与UNITYINOVA控制台(Oxford Instruments，UK，and Varian，Inc.，Palo Alto，CA)通过一个接口相连。成像过程中动物被固定于相同的体位。获取多截面T2加权自旋回波MR成像(TR 3000毫秒，TE 40毫秒，观察视野40×30mm，层厚2mm，无间隙)。
通过计算T2加权成像中大脑半球病灶体积的百分比评价缺血区域的分布，使用成像软件(Scion Image，Beta 4.0.2版，Scion公司)。标记每个切面中的缺血组织，并根据切面的厚度(2mm/切面)来计算梗塞的体积。为避免过高估计梗塞体积，通过以下公式计算校正的梗塞体积(CIV)，由Neumann-Haefelin等人描述(Neumann-Haefelin，T.，et al.(2000).大鼠一过性局部脑缺血后的连续MRI组织损伤动力学，血-脑屏障损害和水肿形成。Stroke 31，1965-1972；discussion 1972-1963.)CIV＝(LT-(RT-RI))×d该公式中，LT代表左侧大脑半球的面积，单位是mm2；RT代表右侧大脑半球的面积，单位是mm2；RT代表梗塞面积，单位是mm2；d代表层的厚度(2mm)。相对梗塞体积(％HLV)用右侧大脑半球体积的百分比表示。
将6个主要MR图像的T2加权像中高密度区域相加，病灶体积用对侧大脑半球病灶体积的百分比表示(％HLV)。所有组都显示由第2天到第14天的％HLV缩小。MCAO2天后，％HLV在MSC-BDNF(35.0±4.8％)，DMEM(38.7±4.9％)，成纤维细胞(37.9±3.8％)，和MSC(37.8±2.8％)组之间没有显著差异，但MSC-BDNF组的％HLV与其他组相比有所减小。
相反，MCAO之后7天，与对照的用DMEM治疗组(32.8±4.9％；P＝0.002)，和对照的用成纤维细胞治疗组(31.6±2.2％；P＝0.015)和对照的MSC治疗组(30.8±4.3％；P＝0.028)相比，MSC-BDNF组的大鼠显示％HLV显著减少(25.4±2.8％)。MCAO之后14天，MSC-BDNF组的大鼠显示HLV(％)(29.6±3.6％；P＝0.011)显著减小，与用DMEM治疗的大鼠(29.6±3.6％；P＝0.011)相比。与对照DMEM和成纤维细胞组相比，MSC治疗的大鼠没有显示％HLV有任何显著的康复，在MCAO之后7天(30.8±4.3％)或14天(26.2±2.9％)时。
体内BDNF的产生水平(试验2，图30)试验2中，测定以下动物组的生长因子第1组(对照)正常大鼠(n＝3)，第2组(对照)注射DMEM的大鼠(n＝3)，第3组注射MSC的大鼠(n＝3)，以及第4组在MCAO之后24小时在缺血边界区注射MSC-BDNFs的大鼠在MCAO之后7天，将大鼠处死，来测定局部脑组织中的BDNF浓度。
本发明者决定使用三明治ELISA法来测定MCAO之后7天局部脑组织中的BDNF浓度。
将MSC在体内以不同MOIs(pu/cell)转染，48小时后收集培养液的上清进行分析。MCAO之后7天，将大鼠麻醉，使用腹腔注射氯胺酮(4.4到8mg/100g)和甲苯噻嗪(1.3mg/100g)，切出脑组织，在冰上将其缺血半球前囟的-1.0到1.0mm的部分切成冠状位切片(200mg)，储存于-80℃直到使用。每个组织样本均悬浮于等重的组织匀浆缓冲液(1ml；137mM NaCl，20mM Tris，1％NP40，1mM PMSF，10μg/ml抑肽酶，1μg/ml亮肽素，0.5mM钒酸钠)组织匀浆在4℃离心(10,000g)10分钟，收集上清液(5μg/μl)进行分析。用市售BDNF ELISA试剂盒(Promega，Madison，Wisconsin)定量测定每个标本的BDNF浓度(分析3份analyzed in triplicate)MCAO之后7天，移植MSC-BDNF的大鼠显示缺血大脑半球的BDNF水平(45.2±14.8pg/mg蛋白)显著升高，与用DMEM(12.5±1.9pg/mg蛋白；P＝0.0002)或MSC (19.3±5.5pg/mg protein；P＝0.0006)治疗的大鼠相比较。与DMEM治疗的大鼠相比，MSC治疗的大鼠也显示缺血半球BDNF水平显著增高(P＝0.0124)。
MSC-BDNF治疗的动物的核DNA片断(试验3A和B，图31)进行试验3A是为了评价缺血后7天脑细胞中DNA片断的强度。此处的试验组于试验2中描述的相同。在MCAO之后7天将大鼠处死，用TUNEL染色来评价其脑组织。
MCAO后7天，将大鼠麻醉并经心灌注，先用磷酸盐缓冲盐水(PBS)，然后用含有4％多聚甲醛(PFA)的PBS。将脑切出，浸入含有4％多聚甲醛(PFA)的PBS中2天，用恒冷切片机在-20℃切成30μm的冰冻切片(以前囟为座标-1.0到1.0mm的冠状位)。用原位凋亡检测试剂盒(TakaraBiomedicals，Shiga，Japan)检测缺血边界区中细胞的DNA片断，使用末端脱氧核苷酸转移酶(dUTP)缺口端nick-end标记(TUNEL)技术(Gavrieli，Y.，Sherman，Y.and Ben-Sasson，S.A.(1992).通过核DNA片断的特异标记来原位识别程序性细胞死亡J Cell Biol119，493-501.).特别地，在蛋白酶消化后，将切片在末端脱氧核苷酸转移酶核荧光素异硫氰酸酯-标记的dUTP(绿色)中温育。切片用染为红色的PI(propidium碘)复染。在这些切片中转染了AxCADsR-F/RGD的MSC被染为红色。计数3个1×1mm2大小的内侧边缘区中阳性红色细胞的总数(Hayashi，T.，Abe，K.and Itoyama，Y.(1998).一过性缺血后对大鼠脑给予血管内皮生长因子使缺血的损伤减小J Cereb BloodFlow Metab 18，887-895.)。
用振动切片机制备厚度为100μm的切片，与第一抗体在4℃下温育过夜，并用含3％BSA和0.1％Triton X-100的PBS稀释。本试验中用的第一抗体为抗神经元细胞核抗体(NeuNmAb377；Chemicon International，Temecula，CA，USA)和抗神经胶质细胞纤丝酸性蛋白(GFAPG3893，Sigma)抗体。在PBS中清洗后，切片与荧光次级抗体(Alexa Fluor 594山羊抗大鼠IgG(H+L)A-11032，分子探针，Inc.)在室温温育1小时。
MCAO之后7天，缺血边缘区的TUNEL阳性细胞(绿色)的数目在注射MSC-BDNF的动物显著少于注射DMEM组(275±73与55.0±41.0；P＝0.013)。相反，在注射MSC的动物中这种细胞显著多于注射DMEM的动物(173.0±64.9与55.0±41.0；P＝0.20)(图31A，B，和C)在试验3B中，在第7天时以下各组动物的DNA片断移植了MSC-DsR-的(第2组；n＝3)或移植了MSC-BDNF-DsR-的(第3组，n＝3)，以及对照组动物(第1组；n＝3)。
在给药部位2mm内检测到大量的DsR阳性MSC。用MSC-BENF治疗的动物显示在注射部位移植的TUNEL阳性的MSC细胞数目较MSC组减少。(图31D)此外，与MSC组相比较，用MSC-BENF治疗的动物显示在注射部附近位移植的TUNEL阳性的MSC细胞数目减少。
MSC表现型(试验4，图32)在第7天时进行试验4来鉴定细胞多型性，试验组包括注射DMEM的对照大鼠(第1组，n＝3)，移植MSC-EGFP-的大鼠(第2组；n＝3)和移植了MSC-BDNF-EGFP-的大鼠(第3组，n＝3)。MCAO之后7天将大鼠处死进行脑组织的形态学评价。
为了确定缺血区域的MSC是否表达神经原的表型phonotype，在MCAO后7天进行形态学检查。某些移植的MSC对于神经原标记物NeuN和星型细胞标记物GFAP为免疫学阳性。某些出现纤维突触，而另外一些形状为圆形。移植MSC-BDNFs的显示与移植MSC的特性相同。
数据分析例22到31显示的数据以“平均值±标准差(SD)”表示。肢体放置和踏车试验的数据用单因素ANOVA和Games Howell’s post hoc检验法分析。HLV数据用单因素ANOVA再用Tukey’s HSD post hoc检验法分析。ELISA数据在每组之间比较，使用Student’s t-检验法。TUNEL阳性细胞的数目在每组之间比较，用单因素ANOVA再用Sheffe’s post hoc检验法分析。如果P值＜0.05则认为有显著性。
以下的例32到44检查转基因干细胞移植对于脑肿瘤的治疗效果。
细胞系的建立9L大鼠神经胶质细胞系(与Fisher 344大鼠共生)和正常大鼠肾(NRK)细胞保存于Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(DMEM，Sigma-Aldrich Inc.，St Lewis，MO，USA)中，其中添加10％的加热失活的胚胎牛血浆(FBS，Invitrogen Life Technologies Inc.，Grand Island，NY，USA)，2mM L-谷氨酰胺，50μg链霉素，以及50单位/ml青霉素。为了对9L细胞进行生物学标记，由BD Biosciences Clontech(Palo Alto，CA，USA)购买pDsR2-N1质粒，其编码人类的Discosoma红色荧光蛋白(DsRed2)，位于CMV启动子的控制之下。使用按照1μg DNA2.5μl的NeuroPORTER试剂(基因治疗系统，Inc.，San Diego，CA，USA)比例制备的DNA复合物，用NeuroPORTER将pDsR2-N1转染入细胞，达到50％到60％融合。转染后24小时，使用FACScalibur(Becton Dickinson Co.，Franklin Lakes，NJ，USA)分离DsRed2-阳性细胞，在转染后72小时通过重复选择进一步纯化。分离出的DsRed2-阳性9L细胞在添加了10％FBS和1mg/ml G418(Invitrogen Life Technologies)的DMEM中选择14天，以便建立稳定的细胞系(9L-DsR)。
制备MSC
由骨髓制备MSC，按照先前报道的步骤(Tsuda H et al.通过纤毛突变的腺病毒载体进行有效的BPM2基因转移和间叶干细胞的骨骼形成。Mol Ther2003；7354-365.)。
简单地说，Fischer 344大鼠(大鼠龄为9周，雄性)用颈部离断的方法处死，将股骨和胫骨由软组织切下，用骨钳移除骨骺。将股骨和胫骨的中段骨干骨髓冲洗入常规培养基(DMEM中添加10％FBS，100单位/ml青霉素，100μg/ml链霉素，0.25μg/ml两性霉素-B，以及2mM L-谷氨酰胺)用尺寸逐渐减小(分别为18，20和22号)的针头将骨髓连续抽吸入注射器，以形成单个细胞的悬液。按照每10cm培养皿中5×107个细胞的密度将最初培养的MSC接种于常规培养基。最初培养4天后，将培养基用新鲜常规培养基替换，以便移除非粘附细胞。将MSC保持在37℃和5％CO2下，每隔4天用新鲜培养基替换损耗的培养基。
腺病毒载体和体内基因转导一种腺病毒载体具有改良的纤毛，编码人IL-2(AxCAhIL2-F/RGD)，已有描述(Dehari H et al.RGD纤毛改良的腺病毒对与口腔癌的基因治疗的强化的抗肿瘤作用Cancer Gene Ther 2003；1075-85.)按照已知程序(Dehari H etal.RGD纤毛改良的腺病毒对与口腔癌的基因治疗的强化的抗肿瘤作用Cancer Gene Ther 2002；10，75-85.Nakamura，T.，Sato，K.and Hamada，H.(2002).通过整联蛋白靶向的腺病毒载体对人黑色素瘤进行有效的基因转移Hum Gene Ther2003；13，613-626.)，构建一个腺病毒载体(AxCAEGFP-F/RGD)，载有RGD突变纤毛与Aequoria victoria绿色荧光蛋白(增强GFP.EGFP)的人类的变体的基因，由CA启动子(带有CMV-IE增强子的鸡β肌动蛋白启动子)控制。
由pEGFP载体(BD BiosciencesBIOSCIENCES CLONTECH，Palo Alto，CA，USA)中分离EGFP基因片段并插入pCAcc载体(pCAEGFP)(Yamauchi，A.，et al.在兔缺血模型中预先给予血管生成素-1，再给予VEGF诱导有功能的成熟血管生成。J Gene Med2003；5994-1004.)(pCAEGFP)。通过限制性酶消化来分离含有EGFP基因的表达单位，具有ClaI，插入粘粒载体pL的ClaI位置。由此产生的粘粒载体pLEGFP与ClaI-和来自Ad5dlx-F/RGD的EcoT221-消化的DNA-TPC一起，共同转染给人类胚肾293细胞。使用病毒基因组的限制性酶消化方法，分离和评价由转染的293细胞产生的菌斑。AxCAEGFP-F/RGD为具有RGD纤毛的表达EGFP的腺病毒载体，由分离出的菌斑中获得，并在293细胞中扩增。所有的腺病毒载体在293细胞中扩增并用氯化铯超速离心进行纯化。纯化后，将病毒向含有10％甘油的磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中渗析，储存于-80℃。病毒滴度用波长为A260nm分光光度法按照微粒单位检测(Dehari H et al.RGD纤毛-改良的腺病毒对于口腔肿瘤的基因治疗具有增强的抗肿瘤作用Cancer Gene Ther 2003；1075-85.)初始培养的MSC的活体外腺病毒基因转导已经有描述。(Tsuda H et al.通过纤毛突变的腺病毒载体进行有效的BPM2基因转移和间叶干细胞的骨骼形成。Mol Ther 2003；7354-365.).
简单地说，在腺病毒感染前1天，将5×105个MSC接种在10cm的培养皿上。感染细胞，通过与5ml保存的病毒溶液在37℃下，5％CO2中温育1小时，病毒溶液中含有1000pu/个细胞的AxCAEGFP-F/wt或AxCAhIL2-F/RGD。感染后，用PBS(pH 7.4)洗涤细胞2次，并添加10ml常规培养基。
初次培养的大鼠MSC的特性本发明者使用流式细胞仪分析了大鼠初次培养的MSC的表面抗原。
使用FACScalibur(Becton，Dickinson and Company)分析初次培养MSC的表现型。总之，细胞用含有0.1％牛血清蛋白(BSA)的PBS冲洗2次。细胞先用抗大鼠CD73(SH3)，CD45或CD11b/c单克隆抗体(Pharmingen，SanDiego，CA，USA)标记，然后再用次级抗体与异氰酸荧光素联合的抗大鼠IgG抗体(Immunotech，Marseille，France)分析大鼠IgG1-标记的细胞(Immunotech)或大鼠IgG2a-标记的细胞，作为同型匹配的对照。
培养的大鼠MSC细胞是CD73抗原阳性的(图33b)据报道这一抗原是人类MSC上的典型的间叶细胞表面抗原(Kobune，M.，等调聚后的Telomerized人类多能间叶细胞可以分化为造血的和支持鹅卵石区cobblestone area-supporting的细胞。Exp Hematol 2003；31，715-722.)在本发明者的MSC培养物中没有检测到有造血干细胞(CD45或CD11/b)的污染。(图33c和33e). MSC在体内分化为间叶细胞的能力本发明者同样调查了大鼠MSC向典型间叶细胞系的分化。
大鼠初次培养的MSC或基因改良的MSC在体内分化为典型间叶细胞系的能力被评价，如先前所描述的(Tsuda H et al.通过纤毛突变的腺病毒载体进行有效的BPM2基因转移和间叶干细胞的骨骼形成。Mol Ther 2003；7354-365.).、Kobune M et al.(Kobune，M.，等调聚后的Telomerized人类多能间叶细胞可以分化为造血的和支持鹅卵石区cobblestone area-supporting的细胞。Exp Hematol 2003；31，715-722.)总之，MSC细胞用成骨性分化的培养基处理，其中添加80μg/ml维生素C磷酸盐(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.，Osaka，Japan)，10mM β-甘油磷酸钠(CALBIOCHEM，San Diego，CA，USA)，和10-7M地塞米松(Sigma-Aldrich Inc.)，或用成脂肪性分化的培养基处理，其中添加0.5μM氢化可的松，500μM异丁醇甲基黄嘌呤，和60μM消炎痛。分化培养基酶隔3天更换一次，直到第21天。
为了证实成骨性分化，细胞用10％福尔马林固定10分钟，再用5％硝酸银(Sigma-Aldrich)染色15分钟，以便检测矿物质沉积。(von Kossastaining)为检测成脂肪性分化，细胞用10％福尔马林固定15分钟，再用新鲜油红O溶液(将0.5％异丙醇原料溶于油红O的溶液与蒸馏水按3∶2混合)染色，以便检测细胞培养物中的脂质滴形成。
本发明者培养的大鼠MSC可以分化为骨细胞系(图33f)和脂肪细胞系(图33h)最初培养的MSC分化为成骨细胞和成脂肪细胞系的能力不被使用腺病毒载体进行的LI-2基因修饰所影响(图33g和33i)。
MSC对于9L细胞在体内扩增的作用。
体内对脑肿瘤给予MSC是否可以影响肿瘤生长还不清楚。但是，已知MSC可以产生细胞因子，如成纤维细胞生长因子(GFG)和其他可以支持肿瘤生长的肿瘤生长因子(TGFs)(Tille JC，Pepper MS.间叶细胞在体内增强了血管内皮生长因子诱导的血管生成Exp Cell Res 2002；280179-191.)..本发明者首先评价MSC协调细胞培养在体内对于9L神经胶质细胞生长的作用。
本发明者单独培养Ds-Red2(人类Discosoma红色荧光蛋白)-标记的9L细胞(9L-DsR)(5×104cell/孔)或与MSC(5×103cell/孔)共同培养或与正常大鼠肾细胞(NRK)共同培养(5×103cell/孔)。然后将细胞胰蛋白酶化并计数。用流式细胞仪(FACScalibur)确定9L-DsR细胞的数目。
如图34a所示，与MSC协调培养的9L细胞被显著抑制(抑制24.5±1.9％)，相对于与NRK细胞协调培养的9L细胞(抑制17.4±1.9％，p＜0.01)。
为了确定MSC释放出的可溶性因子对于9L细胞的扩增的影响，本发明者使用双房培养系统。
MSC或NRK细胞在含有10％FBS的DMEM中温育，置于TranswellInsert中(孔径0.4μm，Costar Corporation，Cambridge，MA，USA)，密度为1×105cell/Transwell.9L细胞在含有10％FBS的DMEM中温育，孔内的密度为5×103cell/孔。协调培养物温育72小时，直接计数细胞来检测协调培养系统中的扩增。所有的数据用抑制的百分数来表示，按照如下公式计算生长抑制的百分数＝[1-(与MSC或NRK细胞协调培养的9L-DsR的细胞数/单独培养的9L-DsR的细胞数)]×100如图34b所示，在不同的池中培养，用MSC产生对9L细胞显著的生长抑制作用，而用NRK细胞没有这种作用(分别为9.8±3.1％和1.8±1.2％，P＜0.01)。
这些结果显示体内试验中MSC本身对于9L神经胶质瘤细胞具有直接的抗肿瘤作用，这种作用是由可溶性因子介导的。
MSC的体内迁移能力本发明者评价了MSC在体内向神经胶质瘤细胞迁移的特性。
进行细胞迁移的分析时使用双池的培养皿Transwell(CostarCorporation)。用125I-脱氧尿嘧啶核苷(125U-IUDR，Amersham BiosciencesCorp.，Piscataway，NJ，USA)对细胞进行代谢性标记。
总之，将1×105cell/ml的细胞在含有0.1μCi/ml125I-IUDR的培养基中培养24小时。接着，用DMEM冲洗细胞三次，并用相同的培养基重新悬浮。将125I-脱氧尿嘧啶核苷-标记的细胞(5×104个细胞)置于孔径为8μm的滤器中，并将9L细胞置于下部的池中。将Transwell直立留置在37℃下5％CO2中24小时，然后下层池中的细胞用1N NaOH溶解。使用gamma计数器来测定细胞溶解物的放射性。细胞迁移分析的结果用百分数的形式表示(下层池中的计数占全部细胞计数的％)。
MSC或NRK细胞均没有自发迁移，但是在下层池中添加9L细胞可以刺激发生自发迁移(图34c)。迁移活性随着9L细胞的数目呈剂量依赖性增高。发现MSC的迁移活性显著高于NRK细胞(p＜0.01)。
移植的MSC的迁移和肿瘤定向在确定MSC的体内迁移能力之后，本发明者研究移植的MSC在体内是否可以经过正常脑实质迁移到颅内的神经胶质瘤。
为了评价MSC的颅内分布，在颅内将4×1049L-DsR神经胶质瘤细胞接种到右基底核神经胶质瘤，3天后再将4×105EGFP(增强的绿色荧光素蛋白)-标记的MSC(MSC-EGFP)直接注射进神经胶质瘤中或对侧大脑半球中。接种肿瘤14天后，将深度麻醉下的大鼠脑用PBS灌注，然后再用4％多聚甲醛灌注。切出的脑用4％多聚甲醛固定过夜，再用含有30％蔗糖的PBS平衡48小时。固定的脑包埋于OTC化合物(Miles，Inc.，Elkhart，IN，USA)中，在液氮中快速冷冻，再储存于-70℃。组织被冰冻切片为20μm厚，再用苏木精和伊红(H-E)染色，或用抗-GFP单克隆抗体(BD Sciences Clontech)进行免疫组化染色。用VECTASTATIN试剂盒(Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)将第一抗体染色的切片显影。用Zeiss-Pascal显微镜(Carl Zeiss，Inc.，Thornwood，NY，USA)处理图像。
如图35a和35c所示，在所有用9L细胞接种的大鼠中发现一个大的神经胶质瘤团块，被苏木精染色较强。神经胶质瘤团块占据了右侧大脑半球，引起中线向左侧大脑半球移位。大多数基因标记的MSC都在肿瘤与正常实质的交界区观察到，但在肿瘤内注射后，其中的一部分相对均匀地浸润入肿瘤床中(图35b)。MSC没有迁移到远处的脑实质，也没有迁移到对侧大脑半球。
共聚焦激光显微镜显示了EGFP-阳性MSC的聚集。它们中的大部分保持了纺锤状外形，位于DsRed-阳性肿瘤的边缘(图35e)。MSC的存在与神经胶质细胞相一致，后者由肿瘤主体播散出来(图35g)。相反，接种到对侧大脑半球的MSC由最初的注射部位沿胼胝体迁移到神经胶质瘤细胞(图35d)。这些MSC中的大部分存留于胼胝体中及相邻肿瘤的边缘(图35h)。MSC也浸润入肿瘤。MSC颅内移植后具有极好的迁移能力和神经胶质瘤导向性得到了确认，因此在下一步中制备治疗性基因改良的细胞，用于治疗试验性神经胶质瘤。
基因改良的MSC产生的人IL-2
选择人IL-2(hIL-2)作为治疗基因，因为大鼠模型中IL-2对于9L神经胶质瘤细胞的抗肿瘤作用以及得到充分证实(Rhines LD et al.用生物可降解的多聚体微球产生的白介素-2进行的局部免疫治疗与间隙性化疗联合试验性恶性神经胶质瘤的新疗法Neurosurgery 2003；52872-879；讨论879-880.，Iwadate Y et al.外周组织中免疫性的诱导与脑内移植产生白介素-2的细胞相联合，清除了已经形成的脑肿瘤。Cancer Res 2001；618769-8774.).
通过用改良的腺病毒载体感染来制备人类被IL-2-转染的MSC(MSC-IL2)，如先前所描述(Tsuda H et al.通过纤毛突变的腺病毒载体进行有效的BPM2基因转移和间叶干细胞的骨骼形成。Mol Ther 2003；7354-365.).大鼠的初次培养的MSC对于腺病毒受体和科萨奇-腺病毒受体(CAR)的表达水平低，对于野生型腺病毒感染相对耐受。因此采用纤毛突变的载体。
为了测量用人IL-2转染的MSC所产生的人白介素-2(IL-2)的产量，在腺病毒感染前12小时将MSC接种到24孔板，共三份(in triplicate)，密度为104cell/孔。然后，将细胞用AxCAhIL2-F/RGD感染，温育72小时。测量培养上清液中人IL-2的浓度，使用ELISA法(IL-2免疫分析试剂盒；R&DSystems，Inc.，Minneapolis，MN，USA)在用相对低浓度的AxCAhIL2-F/RGD感染的MSC的上清液中测到的IL-2水平较高(在300和1000个颗粒/cell时，分别为8.6±0.5和24.0±1.7ng/ml/104cell/72h)这符合本发明者先前的发现。这种高水平的IL-2生产进一步地随着腺病毒浓度的增加呈剂量依赖性的升高。
移植了IL-2基因转染的MSC的患有神经胶质瘤的大鼠生存期延长本发明者调查MSC-IL2是否可以在体内产生治疗效益。
由日本SLC，Inc.(Hamamatsu，Japan)购买雄性Fisher 344大鼠(大鼠龄7到8周，200到240g)。动物被麻醉，置于脑功能区定位装置中(NarishigeScientific Instrument Lab.，Tokyo，Japan)。在适当的位置磨出小孔(在前囟后方1mm，中线右侧3mm)。将26号针插入到硬膜的腹侧4mm处，用10-μl微注射器(Hamilton Company，Reno，NV，USA)在该处接种9L肿瘤细胞的PBS上清液5μl。然后，将4×1049L细胞与5μl的PBS上清液混合，后者含有4×105MSC或IL-2-转染的MSC(MSC-IL2)(用1000pu/cellAxCAhIL2-F/RGD感染)。获得的细胞上清液按上述方法颅内注射(图35a)。也用同样的方法对91细胞注射进行评价，注射时与未经改良的MSC或EGFP-改良的MSC(MSC-EGFPs)合用。
注射9L神经胶质细胞和MSC-IL2的大鼠显示其生存期显著延长(26.3±2.2天，与单用9L相比较P＝0.0003，与MSC相比P＝0.0008，与MSC-EGFP相比P＝0.0007)。注射9L细胞和未经改良的MSC(22.0±0.8天，P＝0.0003)或MSC-EGFPs(21.3±1.5天，P＝0.0003)的大鼠存活期较对照组显著延长，但在MSC组和MSC-EGFP组之间没有发现生存期有显著差异(P＝0.5881)。
MSC的IL-2基因改良对于注射MSC和9L神经胶质瘤细胞的大鼠的生存期具有额外的治疗优越性，但基因改良本身并不影响其生存期。
MSC-IL2的治疗收益也在患有神经胶质瘤的大鼠的治疗模型中得到证实。大鼠用4×1049L神经胶质瘤细胞移植。在接种肿瘤的第3天，将含有4×105MSC或MSC-IL2的PBS上清液5μl移植入肿瘤(图36b)。
MSC-IL2的肿瘤内接种显著延长了患有9L神经胶质瘤的大鼠的生存期(27.7±1.1天，与单用9L相比P＝0.0002)，对照组为(17.1±1.1天)。注射MSC-EGFP的患有神经胶质瘤的大鼠的评价生存期(23.2±0.8天)显著短于注射MSC-IL2的大鼠(P＝0.0024)，但显著长于未经治疗的对照组(P＝0.0006)。
基因改良的MSC对于MRI评价的体内肿瘤生长的作用本发明者评价注射MSC-IL2或MSC后观察到的生存期的延长是否与肿瘤生长移植相关。本发明者对所有动物进行了磁共振成像(MRI)，每隔7天一次，来评价颅内肿瘤体积。
动物用腹腔注射(IP)氯胺酮(2.7到3mg/100-g)和甲苯噻嗪(0.36到0.4mg/100-g)来麻醉。接着，给动物注射0.2ml的Gd-DTPA(0.8 to 1.0mg/kg，Magnevist，Schering Japan，Tokyo，Japan)，再获取冠状位T1加权的旋转回声成像(TR 500msec，TE 10msec，观察视野为50×50mm，层厚1.5mm，无间隙)，使用7T的超导磁体，直径为18cm，通过一个界面连接UNITYINOVA控制台(Oxford Instruments KK，Tokyo，Japan)。将每个成像区域Gd-DTPA-增强的部分的面积(mm2)之和与图像厚度相乘来计算肿瘤体积(mm3)。基于MRI估计的肿瘤体积与成像试验后即刻测得的实际肿瘤重量成线性相关(Namba H et al.通过连续磁共振成像评价带有单纯疱疹病毒-胸腺嘧啶核苷激酶基因的试验性脑肿瘤的附加作用bystander effect Hum Gene Ther 1996；71847-1852.).
T1加权成像中，9L神经胶质瘤在冠状截面上显示为增强区，清晰可见(图37)。如表1和图37所示，9L神经胶质瘤在未经治疗的大鼠脑中显示进展性生长，在肿瘤接种后第14天达到致命性体积。图1显示用MRI测量的9L神经胶质瘤的体积(mm3)表1
表1中，符号″b″代表肿瘤接种后的天数，符号″c″表示该检验未进行，符号″*″代表与单用9L组相比较p＜0.01，符号″**″代表与MSC相比较p＜0.01。
相反，MSC-IL2-或MSC-治疗的动物的脑肿瘤体积显著较小(在肿瘤接种后14天与未经治疗组相比P＜0.01)。在第14天，未改良的MSC治疗组和MSC-IL-2治疗组的肿瘤体积无显著差异。但是，根据MRI，IL-2基因改良在肿瘤接种后21天显示明确的治疗效果。此时，未经改良的MSC治疗的动物中的神经胶质瘤实际上已经达到了致死性体积，而用MSC-IL2治疗的动物则肿瘤仍然很小。这些关于肿瘤体积变化的结果与不同治疗组的生存期相一致。
通过MSC-IL2移植诱导淋巴细胞向神经胶质瘤中浸润本发明者调查将MSC-IL2移植入9L神经胶质瘤是否可以诱导体内免疫反应。
为了监测MSC-IL2治疗后CD4或CD8阳性细胞向神经胶质瘤的浸润，移植4×1049L-DsR细胞，并在肿瘤接种后3天向肿瘤中注射4×105个细胞的MSC-EGFPs或MSC-IL2。在移植肿瘤后7天将大鼠处死，切下的大脑用石蜡包埋。用抗大鼠CD4(Clone W3/25，Serotec Inc.，Oxford，UK)或抗大鼠CD8(Clone OX-8，Serotec Inc.)单克隆抗体对6μm厚的脑标本进行免疫组化染色，并用Vectastain ABC试剂盒(Vector Laboratories Ltd.)显影。
MSC治疗的9L神经胶质瘤用HE染色进行组织学分析，显示IL-2基因改良的MSC治疗的9L神经胶质瘤表现出大量的单核白细胞浸润(图38c和d)。相反，未经改良的MSC治疗的神经胶质瘤显示少量的炎性细胞浸润(图38a和b)。未经改良的MSC治疗的肿瘤样品显示，实际上没有CD4和CD8细胞的浸润。(图38e和g)。与此明显相反的是，接种了IL-2基因改良的MSC的肿瘤显示有CD4和CD8阳性淋巴细胞浸润(图38f和h)。
数据分析例32到43中细胞扩增测定和迁移测定的统计学分析采用Student’s t-检验。第7天和第14天的肿瘤体积评价用Scheffe’s检验，第21天进行Student’s t-检验。Student’s t-和Scheffe’s检验中P值小于0.05则认为有显著性。存活期的统计学分析用log-rank检验。
引入细胞因子基因而非BDNF的MSC(1)细胞因子生产率除BDNF(脑衍生的神经营养因子)基因之外的基因，如GDNF(胶质细胞系衍生的神经营养因子)，CNTF(cliary神经营养因子)或NT-3(神经营养因子3)基因，被引入MSC，检测培养细胞产生的BDNF，GDNF，CNTF和NT3产生。
结果显示在图39中。用AxCAhBDNF-F/RGD(MSC-BDNFs)转染的MSC在MOIs为100，300，1000，及3000pu/细胞时，分泌BDNF速度分别为0.230±0.110，0.434±0.122，0.931±0.101，以及1.860±.41ng/105个细胞/48小时。未转染MSC的也产生BDNF(0.0407±0.0059ng/105个细胞/48小时)。
对于GDNF，用AxCAhGDNF-F/RGD(MSC-GDNFs)转染的MSC在MOIs为300，1000，及3000pu/细胞时，分泌GDNF速度分别为1.05±0.20，2.26±0.41，和4.15±0.54ng/105个细胞/48小时。未转染的MSC也产生GDNF(0.044±0.034ng/105个细胞/48小时)。
对于CNTF，用AxCAhCNT-F/RGD(MSC-CNTFs)转染的MSC在MOIs为300，1000，及300pu/细胞时，分泌CNTF速度分别为0.136±0.028，0.854±0.145，和3.58±0.43ng/105个细胞/48小时。未转染的MSC也产生CNTF(0.0520±0.0150ng/105个细胞/48小时)。
对于NT3，用AxCAhNT3-F/RGD(MSC-NT3s)转染的MSC在MOIs为300，1000，及3000pu/细胞时，分泌NT3速度分别为2.67±0.09，4.24±0.16，和6.88±0.07ng/105个细胞/48小时。未转染的MSC也产生NT3蛋白(0.12±0.001ng/105个细胞/48小时)。
(2)由脑缺血诱导的神经学障碍的评价引入GDNF，CNTF或NT3基因的MSC细胞被移植到大脑梗塞区，如以上各例所述，并进行肢体放置试验。按照例27(1)的步骤进行肢体放置试验。按照以下参数评价腿放置障碍0严重神经学障碍，16无神经学障碍在MCAO之后8天和15天进行肢体放置试验。
结果如图40所示，在MCAO之后一天(此时在颅内给予MSC之前)，四个缺血组显示在腿-放置评分上无统计学差异。MCAO之后8天，用MSC-BDNF和MSC-GDNF给药的大鼠的肢体放置评分显著高于DMEM大鼠的评分(均为P＜0.05)。MCAO之后15天，用MSC-BDNF和MSC-GDNF给药的大鼠的肢体放置评分也表现为显著高于DMEM大鼠的评分(均为P＜0.05)。
相反，给予MCS-CNTF和MSC-NT3的大鼠在第8天和第15天的得分都未能高于给予DMEM或对照组的大鼠。
(3)用MRI测定，MSC-BDNF和MSC-GDNF治疗后梗塞体积减小在MCAO之后第2、7及14天时对所有动物进行MRI。步骤及评价如例27(3)。
MCAO之后7天，与对照DMEM组大鼠相比，MSC-BDNF和MSC-GDNF组大鼠表现为HIV显著减小(均为P＜0.05)。类似地，14天后，MSC-BDNF和MSC-GDNF组大鼠表现为HIV较对照DMEM组大鼠显著减小。7天和14天后，与对照DMEM组和MSC-EGFP组相比，用MSC-CNTF或MSC-NT3给药的大鼠显示HIV没有显著恢复(均为P＜0.05)。结果在图41中显示。
图42为典型的T2加权(T2W)成像的照片，为局部给予DMEM，MSC-BDNF，MSC-GDNF，MSC-CNTF，或MSC-NT3的大鼠，在MCAO之后2天和7天拍摄。第7天时与其他组相比，MSC-BDNF组和MSC-GDNF组显示缺血损伤体积减小。
静脉给予MSC-BDNF细胞按照上述例子制备引入了BDNF基因的MSC细胞(107个细胞)。在有严重大脑梗塞(永久性大脑中动脉阻塞模型)的大鼠，例16中已有描述，大脑梗塞已经产生，上述细胞在12小时后给入左侧腔静脉。
用MRI来按照时间顺序检查在存活动物中的治疗效果。在MCAO之后24小时、72小时及7天后观察以下各组的大脑梗塞病灶非治疗组(对照)、给予MSC的组、给予MSC-BDNF的组。(图43)另外，在MCAO之后6小时，24小时、72小时及7天后计算并检查以下各组的大脑梗塞体积非治疗组(对照)、给予MSC的组、给予MSC-BDNF的组(图44)。
在MCAO之后24小时、72小时及7天后进行踏车试验检查以下各组的运动恢复非治疗组(对照)、给予MSC的组、给予MSC-BDNF的组。(图45)所有数据显示，引入BDNF基因的MSC显示高于单用MSC的治疗效果。
静脉给予MSC-PLGF细胞将PLGF(胎盘生长因子)而不是BDNF基因引入MSC。在有严重大脑梗塞(永久性大脑中动脉阻塞模型)的大鼠产生脑梗塞后3小时，如例16中描述，将MSC-PLGF细胞(107个细胞)给入大鼠左侧腔静脉。
在MCAO之后3小时、24小时、3天及7天后观察以下各组的大脑梗塞病灶非治疗组(对照)、给予MSC-PLGF的组。(图46)比较DW2(b＝1000)成像和T2WI成像的结果。
MCAO之后出现显示异常信号的区域的体积用MRI分析法续贯定量。在MCAO之后24小时DWI成像的结果开始减少，MCAO之后3小时T2WI成像的结果开始减少(图47)。
为了比较大脑梗塞的体积，在MCAO7天后将非治疗组(对照)和静脉给予MSC-PLGF的组的脑组织用TTC染色(图48)。
所有数据显示，引入PLGF基因的MSC显示高于单用MSC的治疗效果。
大鼠脑梗塞模型注射血管生成素基因的血管生成作用血管生成素基因被直接注射到大鼠大脑梗塞模型(一过性大脑中动脉阻塞模型45分钟)的大脑梗塞病灶。
使用腺病毒作为载体，引入血管生成基因。
用FITC葡聚糖或Evans蓝将毛细血管显影，来评价血管生成。
用Evans蓝和FITC葡聚糖显影显示正常大鼠的血管系统的图像在图49中显示。
用FITC来在视觉上比较经过或没有经过基因注射的MCAO模型的大鼠的血管生成的诱导(图50)。同侧/对侧比值也被测量(图51)。
用Evans蓝来在视觉上比较经过或没有经过基因注射的MCAO模型的大鼠的血管生成的诱导(图52)。
结果，观察到显著的血管生成。脑梗塞是一种血管阻塞的疾病。因此预计合并的血管生成可以显示显著的治疗效果。
脑梗塞后慢性期局部给予MSC在有严重大脑梗塞(永久性大脑中动脉阻塞模型)的大鼠局部给予MSC，例16中已有描述，在脑梗塞后的慢性期，研究其治疗效果。特别地，在MCAO之后2周，将1×104MSC移植到脑梗塞区。在给予MSC后1天、14天、28天和42天后进行踏车试验，比较其与未经MSC治疗组(对照组)相比较的运动功能改善。结果，可以发现运动功能改善。结果在图53中显示。
与急性期移植相比治疗效果相对较低，但是还是观察到一定治疗效果。优选地是在急性期进行治疗，因为急性期进行治疗显示疗效较好。但是，在实际临床中，已经患有脑梗塞的患者的需求很大，因此认为治疗对于慢性期的患者也是有效的。
因此，本发明的药物优选地用于处于脑神经疾病急性期的患者，但是不局限于急性期，例如，对于慢性期的患者也是有效的。
工业实用性本发明发现，具有如下所述的优良特性的更新的药物可以使用间叶细胞(间叶干细胞)来产生，特别是骨髓细胞，脐带血细胞或外周血细胞。特别地，使用骨髓细胞，脐带血细胞或周围血细胞的再生治疗，通过注射或滴注的方式单纯体内给予(如静脉给予)患者-来源的骨髓干细胞，使神经系统损伤所造成的损害部位可以再生，障碍可以进行治疗。这些神经系统损伤实际上通过传统技术不能治疗。本治疗对于脑梗塞的效果得到了有力的证实。另外，认为这些治疗对于所有神经科疾病均有效，如以下原因引起的神经系统损害脑梗塞、脑内出血、脊髓损伤、心肌梗死、包括蛛网膜下腔出血的脑中风、中枢性及周围性脱髓鞘疾病、中枢性及周围性退行性疾病、脑肿瘤、高级功能障碍包括痴呆、精神障碍、癫痫、伤性神经科疾病包括头部外伤、脑挫伤、脊髓外伤、炎性疾病以及损伤脑细胞的感染性疾病包括Creutzfeldt-Jakob病。治疗可以在特殊的治疗机构进行，也可以在普通治疗单位进行(如综合医院，急救车运送途中或在事故现场)。这些是革命性的治疗，因为它们使得用传统疗法不能治疗的障碍可以进行治疗，进一步地，这些治疗可以用简单的步骤完成，如静脉给药。另外，因为神经系统损害会对患者造成严重障碍，对于这些障碍的治疗可以使患者受益极大，也具有极大的经济效益。
本发明的再生性药物的医学作用机制如下移植的骨髓干细胞或间质干细胞迁移到并固定在受影响的区域(体内损伤部位)，通过分泌适当的物质，促进内在自愈作用或分化为适当的细胞，使受影响区域的功能恢复。因此，本发明的再生性药物可以对所有类型的伴有神经系统损害的疾病和事件起作用。
序列表<110>株式会社雷诺再生医学研究所(Renomedix Institute Inc.)三井住友海上火灾保险株式会社(Mitsui Sumitomo Insurance Company，Limited)帝国脏器制药株式会社(TEIKOKU HORMONE MFG.CO.，LTD.)株式会社日立制作所(Hitachi，Ltd.)<120>含有间叶细胞作为有效成分、体内给药治疗脑神经疾病的治疗剂<130>SSK-X0301Y1P<150>JP 2003-185260<151>2003-06-27<150>JP 2003-432329<151>2003-12-26<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>40<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>1cggaattcca ccatgaccat ccttttcctt actatggtta40<210>2<211>34<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>2ccagatctat cttccccttt taatggtcaa tgta 3权利要求
1.脑神经疾病治疗制剂，用于体内给药，包含间叶细胞作为活性成分。
2.如权利要求1所述的制剂，其中的脑神经疾病是脑梗塞。
3.制剂，用于体内给药，显示神经保护效应，并且包含间叶细胞作为活性成分。
4.制剂，用于体内给药，显示脑神经再生效应，并且包含间叶细胞作为活性成分。
5.如权利要求1到4之一所述的制剂，其中的体内给药指静脉给药。
6.如权利要求1到5之一所述的制剂，其中的间叶细胞指(a)引入了BDNF基因、PLGF基因、GDNF基因或IL-2基因的间叶细胞，或(b)引入了hTERT基因的永生化间叶细胞。
7.如权利要求1到6之一所述的制剂，其中的间叶细胞是间叶干细胞。
8.如权利要求1到6之一所述的制剂，其中的间叶细胞是骨髓细胞，脐带血细胞或外周血细胞。
9.治疗脑神经疾病的方法，包含体内给予患者治疗有效剂量的权利要求1到8之一所述制剂。
10.如权利要求9所述的方法，其中的骨髓细胞是患者的自体细胞。
11.如权利要求9或10所述的方法，其中的脑神经疾病是脑梗塞。
12.如权利要求9到11所述的方法，其中的体内给药指静脉给药。
13.如权利要求9到12所述的方法，其中的间叶细胞是骨髓细胞，脐带血细胞或外周血细胞。
全文摘要
对大鼠脑梗塞模型静脉给予由大鼠骨髓收集的骨髓细胞被发现对于脑梗塞的治疗是有效的。人类和小大鼠骨髓干细胞显示同样的效果。间叶细胞如骨髓细胞、脐带血细胞或外周血细胞可以作为药物用于静脉给药，治疗脑神经疾病。
文档编号C12N5/07GK1842339SQ20048002464
公开日2006年10月4日 申请日期2004年6月25日 优先权日2003年6月27日
发明者本望修, 滨田洋文 申请人:株式会社雷诺再生医学研究所, 三井住友海上火灾保险株式会社, Aska制药株式会社, 株式会社日立制作所