Rna干扰酶及其使用方法

专利名称：Rna干扰酶及其使用方法
技术领域：
本发明涉及的是分子生物学领域，特别是新型酶活性的发现。特别地，本发明涉及的是对这里命名为mRNA干扰酶(interferase)的一个新型蛋白质家族的鉴定。这里描述的家族的示例成员包括MazF和PemK，以及它们的同源物和直向同源物(ortholog)。更为特别的是本发明涉及的是对作为核糖核酸内切酶或者mRNA干扰酶的MazF和PemK多肽的生化性质表征。发明还包括了对相关蛋白的分析，这些蛋白的作用是抑制mRNA干扰酶的活性。特别地，这里描述了对MazE蛋白质功能及其对MazF活性影响的表征，以及对PemI蛋白质功能及其对PemK活性影响的表征。这里还提供了对于新型mRNA干扰酶例如MazF和PemK、以及MazF和PemK活性的调节剂例如MazE和PemI的使用方法，它们可以用于研究和治疗性应用。
背景技术：
在大肠杆菌中，程序性细胞死亡是通过由两个基因组成的“上瘾组件”介导的，其中一个基因编码稳定的毒性蛋白(毒素)，另一个基因编码短寿的抗毒素(Engelberg-Kulka and Glaser，AnnuRev Microbiol 53，43-70(1999))。毒素和抗毒素由一个操纵子共同表达，相互作用形成一个稳定的复合物，它们的表达由毒素-抗毒素复合物或者抗毒素自身自动调节。例如当逆境条件抑制了它们的共表达时，抗毒素被蛋白酶降解，使毒素作用于其靶标。这种细菌细胞程序性死亡的遗传系统已经在许多大肠杆菌染色体外元件中有所报导，即所谓的分离后杀死效应(Tsuchimoto et al.，J Bacteriol 170，1461-6(1988)；Roberts and Helinski，J Bacteriol 174，8119-32(1992))。当细菌丢失了质粒或者其他染色体外元件时，细胞被选择性地杀死，因为不稳定的抗毒素相对于其相关的稳定毒素降解得更快。因此细胞嗜好短寿的抗毒素，因为它们的从头合成对于细胞的存活是必需的。在大肠杆菌染色体上已知的上瘾组件(addiction module)中(Gotfredsen and Gerdes，Mol Microbiol 29，1065-76(1998)；mittenhuber，J Mol Microbiol Biotechnol 1，295-302(1999))，大肠杆菌MazEF系统是第一个已知的原核染色体上瘾组件(Aizenmanet al.，Proc Natl AcadSci USA 93，6059-63(1996))。mazEF组件由两个重叠的基因mazE和mazF组成，它们位于relA基因的下游。MazF是一个稳定的毒素，而MazE是一个不稳定的抗毒素，很容易在体内被ATP依赖的ClpPA丝氨酸蛋白酶降解(Aizenman et al.，Proc NatlAcad Sci USA 93，6059-63(1996))。mazEF的表达被鸟嘌呤核苷3′，5′-二焦磷酸(ppGpp)负调控，ppGpp是在严重的氨基酸饥饿条件下由RelA合成的(Aizenman et al.，Proc Natl Acad Sci USA 93，6059-63(1996))。而且，mazEF介导的细胞死亡可以被一些抗生素包括利福霉素、氯霉素和壮观霉素(Sat et al.，J Bacteriol 183，2041-5(2001))所引发。使用大肠杆菌细胞进行的体内实验结果提示MazF抑制了蛋白质的合成和DNA的复制(Pedersen et al.，Mol Microbiol45，501-10(2002))。最近报导了无胸腺嘧啶的死亡是通过mazEF组件介导的(B.Sat，M.Reches，H.Engelberg-Kulka，J Bacteriol185，1803-7(2003))。在大肠杆菌中，已知染色体外的一些元件含有上瘾组件，并且通过所谓的分离后杀死效应导致细菌的程序性细胞死亡。研究最透彻的染色体外上瘾组件包括噬菌体P1上的phd-doc系统(Lehnherret al.(1993)J Mol Biol 233，414-428；Gazit and Sauer.(1999)J Biol Chem 274，16813-16818；Magnuson et al.(1996)J Biol Chem271，18705-18710；Lehnherr and Yarmolinsky.(1995)Proc NatlAcad Sci USA 92，32743277)，F因子上的ccdA-ccdB系统(Tam andKline.(1989)J Bacteriol 171，2353-2360；Bahassi et al.(1999)JBiol Chem 274，10936-10944；Afif et al.(2001)Mol Microbiol41，73-82；Dao-Thi et al.(2002)J Biol Chem 277，3733-3742)，质粒R1上的kis-kid系统(Ruiz-Echevarria et al.(1991)MolMicrobiol 5，2685-2693；Hargreaves et al.(2002)Structure(Camb)10，1425-1433；Ruiz-Echevarria et al.(1995)J Mol Biol247，568-577；Santos-Sierra et al.(2003)Plasmid 50，120-130)以及质粒R100上的pemI-pemK系统(Tsuchimoto et al.(1992)JBacteriol 174，42054211；Tsuchimoto et al.(1988)J Bacteriol170，1461-1466；Tsuchimoto and Ohtsubo.(1993)Mol Gen Genet237，81-88；Tsuchimoto and Ohtsubo.(1989)Mol Gen Genet215，463-468)。有趣的是，大肠杆菌染色体也含有一些上瘾组件系统，例如relBE系统(Gotfredsen and Gerdes.(1998)Mol Microbiol29，1065-1076；Christensen et al.(2001)Proc Natl Acad Sci USA98，14328-14333；Christensen and Gerdes.(2003)Mol Microbiol48，1389-1400；Pedersen et al.(2003)Cell 112，131-140)，mazEF系统(Aizenman et al.(1996)Proc Natl Acad Sci USA93，6059-6063；Marianovsky et al.(2001)J Biol Chem 276，5975-5984；Kamada et al.(2003)Mol Cell 11，875-884；Zhang etal.(2003)J Biol Chem 278，32300-32306)以及chpB系统(SantosSierra et al.(1998)FEMS Microbiol Lett 168，51-58；Masuda etal.(1993)J Bacteriol 175，6850-6856；Christensen et al.(2003)J Mol Biol 332，809-819)。与上瘾组件相关的毒素的细胞作用已经被深入研究。ccdA-ccdB系统中的毒素ccdB与DNA解旋酶相互作用阻止了DNA的复制(Bahassi et al.(1999)同上；Kampranis et al.(1999)J MolBiol 293，733-744)，relBE系统中的毒素RelE以高度的密码子特异性切割核糖体A位点的mRNA，但是不能降解自由的RNA(Pedersen et al.(2003)，同上)。但是最近表明，A位点的mRNA切割可以在没有RelE的情况下出现(Hayes and Sauer.(2003)Mol Cell 12，903-911)。因此，A位点mRNA切割的确切机制还不知道。mazEF系统编码的毒素MazF(ChpAK)和chpB系统编码的毒素ChpBK被认为通过一个与RelE的作用相似的机制，通过核糖体依赖和密码子特异的方式抑制翻译(Christensen et al.(2003)，同上)。但是本发明的发明者最近证明MazF是一个序列特异的核糖核酸内切酶，它只对单链RNA起作用，优先切割ACA序列处的mRNA，切割方式不依赖于核糖体和密码子，因此在功能上与RelE不同(Zhang et al.(2003)Mol Cell 12，913-923)。pemI-pemK系统和kis-kid系统分别参与了对两个密切相关的incFII低拷贝质粒即质粒R100(Tsuchimoto et al.(1992)同上；Tsuchimoto et al.(1988)同上)和R1(Ruiz-Echevarria etal.(1991)同上；Bravo et al.(1987)Mol Gen Genet 210，101-110)的稳定维护。现在知道这两个系统是相同的(Engelberg-Kulka andGlaser.(1999)，同上)。已经证明Kid(PemK)抑制了ColE1质粒的复制，它在DNA合成的起始时起作用，但是不抑制P4 DNA的体外复制(Ruiz-Echevarria et al.(1995)同上)。至今为止，还没有证据显示Kid(PemK)抑制染色体DNA的复制。毒素Kid(PemK)和解毒剂Kis(PemI)不仅仅在细菌中起作用，而且在许多真核生物中有效作用。Kid(PemK)抑制酵母、非洲爪蟾(Xenopus laevis)和人细胞的增殖，其中Kis(PemI)解除了这种抑制(de la Cueva-Mendez et al.(2003)Embo J 22，246-251)。已经证明Kid(PemK)引发了人细胞的凋亡(de laCueva-Mendez et al.(2003)同上)。这些结果提示Kid(PemK)在原核和真核生物中有一个共同的靶标。这里引用的文献不应该被理解为承认它们是本发明的现有技术。本发明的其他特点和优点从发明详述、附图和权利要求中会变得明确。
发明概述在第一方面，本发明涉及的是一个新型酶家族的发现，该酶在这里也被称为“RNA干扰酶”。正如这里所描述的，mRNA干扰酶家族中示例性的核糖核酸内切酶包括MazF和PemK及其同源物和直向同源物。因此本发明包括具有与MazF或PemK多肽同源的序列和/或同源的结构的核糖核酸内切酶。值得注意的是，在本发明的发现以前，MazF的细胞靶标还没有被发现。而且，本发明还涉及了以下发现，即PemK通过以序列特异的方式切割细胞mRNA阻断蛋白质的合成。因此本发明发明者的新发现提出了mRNA干扰酶(例如MazF和/或PemK)的新型应用，其中mRNA干扰酶的核酸和氨基酸序列及其组合物可以被有利地使用。这种使用包括，但是不限于，多种不同的研究和治疗性应用，如在这里以下描述的。还提供了包含mRNA干扰酶(例如MazF和/或PemK)核酸和/或氨基酸序列、与mRNA干扰酶活性相容的缓冲液以及用法说明材料。本发明还提供了检测mRNA干扰酶或者其功能性片段活性的方法，其中所述的活性是核糖核酸内切酶活性，所述的方法包括(a)提供编码所述mRNA干扰酶或者其功能性片段的核酸序列；(b)表达(a)步骤中的核酸序列；(c)将步骤(b)中表达的核酸序列与核糖核酸内切酶底物共同孵育；以及(d)测量所述底物的切割，其中所述底物的切割显示了核糖核酸内切酶活性并且提供了检测手段或者是mRNA干扰酶或者其功能性片段的核糖核酸内切酶活性的阳性指示。本发明还包括了鉴定能够调节mRNA干扰酶或者其功能性片段活性的因子的筛选方法，其中所述的活性是核糖核酸内切酶活性，所述的方法包含(a)提供编码所述mRNA干扰酶或者其功能性片段的核酸序列；(b)表达(a)步骤中的核酸序列；(c)在能够促进核糖核酸内切酶活性的条件下将步骤(b)中表达的核酸序列与核糖核酸内切酶底物共同孵育；(d)加入至少一种有可能调节mRNA干扰酶或者其功能性片段的核糖核酸内切酶活性的因子；以及(e)测量所述底物的切割，其中所述底物的切割显示了核糖核酸内切酶活性并且提供了检测核糖核酸内切酶活性的手段或者是mRNA干扰酶或者其功能性片段的阳性指示，其中在至少一种能够调节mRNA干扰酶或者其功能性片段核糖核酸内切酶活性的因子存在时被切割底物量的改变鉴定出了一种能够调节mRNA干扰酶或者其功能性片段核糖核酸内切酶活性的因子。这些方法在体外或者在细胞内进行。这种使用本发明的方法确定的因子，能够调节mRNA干扰酶或者其功能性片段的核糖核酸内切酶活性，可以引起底物切割增加或者减少。本发明还包括了使用本发明的方法鉴定出的因子。另一方面，提出了调节mRNA干扰酶或者其功能性片段活性的方法，其中所述的活性是核糖核酸内切酶活性，所述的方法包含(a)提供编码所述mRNA干扰酶或者其功能性片段的核酸序列；(b)表达(a)步骤中的核酸序列；(c)在能够促进核糖核酸内切酶活性的条件下将步骤(b)中表达的核酸序列与核糖核酸内切酶底物共同孵育；(d)加入能够调节mRNA干扰酶或者其功能性片段核糖核酸内切酶活性的因子；以及(e)测量所述底物的切割，其中所述底物的切割显示了核糖核酸内切酶活性并且提供了检测核糖核酸内切酶活性的手段或者是mRNA干扰酶或者其功能性片段的阳性指示，其中在该因子存在时被切割底物量的改变提供了调节mRNA干扰酶或者其功能性片段核糖核酸内切酶活性的手段。示例性的编码mRNA干扰酶的核酸序列包括，但是不限于，SEQ ID NO1或者3，和编码SEQ ID NO2或者4的核酸序列，以及在这里以下描述的其同源物和直向同源物。其一个示例性的同源物/直向同源物是MazF-mtl，包含分别包含SEQ ID NO69和74的核酸和氨基酸序列。在另一个实施方案中，提供了检测mRNA干扰酶或者其功能性片段活性的方法，其中所述的活性是核糖核酸内切酶活性，所述的方法包含(a)提供包含mRNA干扰酶的氨基酸序列；(b)在能够促进核糖核酸内切酶活性的条件下将步骤(a)的氨基酸序列与核糖核酸内切酶底物共同孵育；以及(c)测量所述底物的切割，其中所述底物的切割显示了核糖核酸内切酶活性并且提供了检测手段或者是mRNA干扰酶或者其功能性片段的核糖核酸内切酶活性的阳性指示。本发明还包括了鉴定能够调节mRNA干扰酶或者其功能片段活性的因子的筛选方法，其中所述的活性是核糖核酸内切酶活性，所述的方法包含(a)提供包含mRNA干扰酶的氨基酸序列；(b)在能够促进核糖核酸内切酶活性的条件下将步骤(a)的氨基酸序列与核糖核酸内切酶底物共同孵育；(c)加入至少一种有可能调节mRNA干扰酶或者其功能性片段的核糖核酸内切酶活性的因子；以及(d)测量所述底物的切割，其中所述底物的切割显示了核糖核酸内切酶活性并且提供了检测mRNA干扰酶或其功能性片段的核糖核酸内切酶活性的手段，其中在所述至少一种因子存在时被切割底物量的改变确定了能够调节mRNA干扰酶或者其功能性片段核糖核酸内切酶活性的因子。这些方法可以在例如体外或者在细胞内进行。使用这些方法确定的因子，能够调节mRNA干扰酶或者其功能性片段的核糖核酸内切酶活性，可以实现底物切割的增加或者减少。这种调节性因子是在本发明范畴内的。应当理解这种因子可以，例如通过作用于mRNA干扰酶(毒素)或者其抗毒素(例如各自PemI，MazE，或者二者中一个的功能性和/或结构性同源物或直向同源物的抗毒素)，或者通过改变自我调节反馈机制(毒素-抗毒素复合物借此下调毒素和抗毒素基因的表达)，调节mRNA干扰酶的核糖核酸内切酶(例如PemK，MazF或者功能性和/或结构性同源物或直向同源物)活性。能够改变自我调节反馈机制(毒素-抗毒素复合物借此下调毒素和抗毒素基因的表达)的因子能够改变这些基因的协调调控。在该实施方案的一方面，能够降低毒素-抗毒素复合物形成的因子抑制了抗毒素的作用，导致毒素活性的增加，最终导致细胞死亡。另一方面，涉及了能够阻断抗毒素和毒素基因表达的因子，其中该因子导致毒素水平由于毒素的稳定性质，相对于抗毒素水平的增加。这种不平衡也会导致细胞毒性。因此，这种因子可以有利地用于治疗具有细菌感染的受试对象，特别是那些被对抗生素有抗性的细菌菌株感染的受试对象。这种因子属于本发明的范畴内并且可以单独使用或者联合使用。还提供了调节mRNA干扰酶或者其功能性片段活性的方法，其中所述的活性是核糖核酸内切酶活性，所述的方法包含(a)提供mRNA干扰酶的氨基酸序列；(b)在能够促进核糖核酸内切酶活性的条件下将步骤(a)的氨基酸序列与核糖核酸内切酶底物共同孵育；(c)加入能够调节mRNA干扰酶或者其功能性片段的核糖核酸内切酶活性的因子；以及(d)测量所述底物的切割，其中所述底物的切割显示了核糖核酸内切酶活性并且提供了检测核糖核酸内切酶活性的手段或者是mRNA干扰酶或者其功能性片段的阳性指示，其中在该因子存在时被切割底物量的改变提供了调节mRNA干扰酶或者其功能性片段核糖核酸内切酶活性的手段。这些方法可以在例如基于细胞的检测中(在培养中或者在受试对象如非人类的动物或者人类患者中)或者在体外使用。根据本发明，包含mRNA干扰酶的示例性氨基酸序列包括，但不限于，SEQ ID NO2或者4以及这里在下面描述的其同源物和直向同源物。其示例性的同源物/直向同源物是MazF-mt1，它包含SEQ IDNO74的氨基酸序列。本发明还包括在细胞中检测mRNA干扰酶或者其功能性片段活性的方法，其中所述的活性是核糖核酸内切酶活性，所述的方法包括(a)提供包含表达载体的细胞，该载体包含编码mRNA干扰酶的核酸序列，和/或编码包含mRNA干扰酶的氨基酸序列，以及该载体可选择地包括至少一个调控序列；(b)在促进至少一种细胞底物核糖核酸内切酶活性的条件下孵育步骤(a)中的细胞；以及(c)测量所述的至少一种细胞底物的切割，其中所述的至少一种细胞底物的切割显示了核糖核酸内切酶活性并且提供了检测细胞中mRNA干扰酶或者其功能性片段的核糖核酸内切酶活性的手段。一方面，提出了在细胞中调节mRNA干扰酶或者其功能性片段活性的方法，其中所述的活性是核糖核酸内切酶活性，所述的方法包含(a)提供包含表达载体的细胞，该载体包含编码mRNA干扰酶的核酸序列，和/或编码包含mRNA干扰酶的氨基酸序列，以及该载体可选择地包括至少一个调控序列；(b)在促进至少一种细胞底物核糖核酸内切酶活性的条件下孵育步骤(a)中的细胞；(c)加入能够调节mRNA干扰酶或者其功能性片段核糖核酸内切酶活性的因子；以及(d)测量所述的至少一种细胞底物的切割，其中所述的至少一种细胞底物的切割显示了核糖核酸内切酶活性并且提供了检测细胞中mRNA干扰酶或者其功能性片段的核糖核酸内切酶活性的手段，且其中在该因子存在的情况下至少一种被切割底物量的改变提供了调节mRNA干扰酶或者其功能性片段的核糖核酸内切酶活性的手段。还提出的是筛选方法，以鉴定在细胞中能够调节mRNA干扰酶或者其功能片段活性的因子，其中所述的活性是核糖核酸内切酶活性，所述的方法包含(a)提供包含表达载体的细胞，该载体包含编码mRNA干扰酶的核酸序列，和/或编码包含mRNA干扰酶的氨基酸序列，以及该载体可选择地包括至少一个调控序列；(b)在促进至少一种细胞底物核糖核酸内切酶活性的条件下孵育步骤(a)中的细胞；(c)加入至少一种有可能调节mRNA干扰酶或者其功能性片段活性的因子；以及(d)测量所述的至少一种细胞底物的切割，其中所述的至少一种细胞底物的切割显示了核糖核酸内切酶活性并且提供了检测细胞中mRNA干扰酶或者其功能性片段的核糖核酸内切酶活性的手段，且其中在该因子存在的情况下至少一种被切割底物量的改变鉴定出了能够调节mRNA干扰酶或者其功能性片段的活性的因子。根据本发明，包含表达载体(表达载体包含编码mRNA干扰酶的核酸)的细胞包含的核酸序列包括，但是不限于，SEQ ID NO1或3，以及这里描述的其同源物和直向同源物；以及编码SEQ ID NO2和4的核酸序列及这里描述的其同源物和直向同源物。示例性的其同源物和直向同源物是MazF-mt1，分别包含含有SEQ ID NO69和74的核酸和氨基酸序列。还提供的是组合物，组合物包含至少一种mRNA干扰酶或者其功能性片段、编码mRNA干扰酶的核酸序列，和/或使用本发明的方法确定的mRNA干扰酶调节性因子，以及药物上可以接受的缓冲剂。一方面，提供了用于治疗具有疾病的患者的方法，所述的方法包含向所述的患者施用治疗上有效量的本发明组合物，以减轻所述疾病的症状。组合物包含至少一种能够增加或者降低核糖核酸内切酶底物切割的因子，这取决于困扰患者的疾病，以缓解疾病的症状。因此，本发明包括使用治疗有效量的mRNA干扰酶或者其功能性片段、编码mRNA干扰酶的核酸序列或者mRNA干扰酶调节性因子来制备药物，用于治疗具有疾病的患者以缓解所述疾病的症状。这种药物还可以进一步包含药物上可以接受的缓冲剂。疾病例如细菌感染是可以通过向患者施用包含治疗有效量的至少一种分子或者因子的组合物而被治疗的，所述的分子或者因子能够增加核糖核酸内切酶底物的切割，通过减少患者体内细菌的数目来缓解细菌感染的症状。在细菌感染包含至少一种抗生素抗性细菌菌株时使用这种方法具有特别的优势。本发明的方法在过度增生性疾病的治疗中也是有用的，其中将包含治疗有效量的至少一种分子或者因子(能够增加对核糖核酸内切酶底物的切割)的本发明组合物施用给患者，以通过减少患者中的过度增生性细胞，缓解过度增生性疾病的症状。可以使用本发明的组合物和方法治疗的过度增生性疾病(其特征是细胞增殖的失调)，包括，但是不限于，不同组织的发育异常和组织变形、炎性病症、自体免疫疾病、过度增生性皮肤疾病、牛皮癣、过敏/哮喘、动脉粥样硬化、血管成形手术后的再狭窄以及癌症。本发明还包括治疗具有疾病的患者的方法，所述的方法包含向患者施用治疗有效量的本发明组合物，其中至少一种所述组合物的因子实现了对核糖核酸内切酶底物的切割的降低，以缓解所述疾病的症状。还包括在细胞中制备多肽的方法，所述的方法包括(a)用编码所述多肽的核酸序列转染所述的细胞，其中编码所述多肽的核酸序列被突变，使用另外的三联体密码子替换mRNA干扰酶识别序列，其中由所述的突变核酸序列编码的所述多肽的氨基酸序列没有因为所述的突变而改变；(b)使用编码mRNA干扰酶的核酸序列转染所述的细胞，其中所述的mRNA干扰酶识别所述的mRNA干扰酶识别序列；以及(c)在所述的细胞中表达步骤(a)和(b)的核酸序列，其中在所述的细胞中表达步骤(a)和(b)的核酸序列提供了在所述细胞中制备多肽的方法。根据本发明，编码多肽或者mRNA干扰酶的核酸序列可以分别被包括在第一和第二表达载体中。而且，步骤(a)和(b)的转染步骤可以分开或者同时(例如通过共转染)进行。正如在这里以上所表明的，核酸序列中mRNA干扰酶识别序列突变为不同的三联体序列或者密码子不会改变由突变核酸序列编码的多肽的氨基酸序列。因此，就被编码多肽的氨基酸序列而言，突变是沉默突变。突变核酸序列的目的是显著降低该核酸转录出的mRNA对于所讨论的mRNA干扰酶的核糖核酸内切酶活性降解的敏感性。步骤(b)的核酸(例如编码例如PemK多肽或者其功能性片段、或者MazF多肽或者其功能性片段、或者MazF或PemK的同源物或直向同源物的核酸序列)的表达降低或者抑制了由包含mRNA干扰酶识别序列的核酸序列编码的细胞多肽的合成。因此，该方法产生了几乎没有细胞蛋白的所需多肽，所述细胞蛋白的RNA转录本包含被所表达的mRNA干扰酶识别的mRNA干扰酶识别序列。因此该方法提供了在细胞中制备“纯化的”多肽的方法。对于一些应用，该方法还包含在步骤(c)之前或者当中，将细胞在包含至少一种放射性标记同位素的培养基中孵育。这些应用包括，但是不止限于，制备标记的多肽，用于使用核磁共振(NMR)技术进行接下来的分析。在一个特别的实施方案中，在细胞中制备多肽的方法使用了mRNA识别序列腺嘌呤-胞嘧啶-腺嘌呤(ACA)以及包含SEQ ID NO2的mRNA干扰酶MazF或者其功能性片段。在该实施方案中，编码MazF或者其功能性片段的核酸的表达降低或者抑制了由包含ACA序列的核酸序列编码的细胞多肽的合成。在另一个实施方案中，在细胞中制备多肽的方法使用了mRNA识别序列尿嘧啶-腺嘌呤-X(UAX)，其中X是胞嘧啶(C)，A，或U，以及包含SEQ ID NO4的mRNA干扰酶PemK或者其功能性片段。在该实施方案中，编码PemK或者其功能性片段的核酸的表达降低或者抑制了由包含UAX序列的核酸序列编码的细胞多肽的合成。在另一个实施方案中，在细胞中制备多肽的方法使用了mRNA识别序列尿嘧啶-腺嘌呤-C(UAC)，以及包含SEQ ID NO74的mRNA干扰酶MazF-mtl或者其功能性片段。在该实施方案中，编码MazF-mtl或者其功能性片段的核酸的表达降低或者抑制了由包含UAC序列的核酸序列编码的细胞多肽的合成。在本发明的一个方面中，提出了制备多肽的方法，包含(a)提供编码所述多肽的核酸序列，其中编码所述多肽的核酸序列被突变，以用另外的三联体密码子替代mRNA干扰酶的识别序列，其中由所述突变核酸序列编码的所述多肽的氨基酸序列没有由于所述的突变而被改变；(b)提供编码mRNA干扰酶的核酸序列，其中所述的mRNA干扰酶识别所述的mRNA干扰酶识别序列；以及(c)表达步骤(a)和(b)的核酸序列，其中表达步骤(a)和(b)的核酸序列提供了制备多肽的手段。该方法可以在体外进行，例如在试管内或者类似地进行。在本领域内以及以下的描述中已知适宜的体外转录/翻译系统或者无细胞表达系统。mRNA干扰酶或者其片段可以可选择地作为表达蛋白提供，而不是以需要表达的核酸序列形式。在一个特别的实施方案中，制备多肽的方法使用了mRNA识别序列ACA以及包含SEQ ID NO2的mRNA干扰酶MazF或者其功能性片段。在另一个实施方案中，制备多肽的方法使用了mRNA识别序列UAX以及包含SEQ ID NO4的mRNA干扰酶PemK或者其功能性片段，其中X是C、A或U。在另一个实施方案中，制备多肽的方法使用了mRNA识别序列UAC以及包含SEQ ID NO74的mRNA干扰酶MazF-mt1或者其功能性片段。本发明还涉及使用本发明的mRNA干扰酶制备多个多核糖核苷酸序列的方法。该方法包含(a)提供第一和第二核酸序列，其中所述的第一核酸序列的一个区域与所述的第二核酸序列的一个区域互补，且所述的第一和第二核酸序列的互补区域都不包含与mRNA干扰酶识别位点互补的序列，且所述的第一和第二核酸序列在它们的5′末端都被磷酸化；(b)通过所述的第一和第二核酸序列的互补区域使所述的第一和第二核酸序列退火，形成双链的核酸序列，其包含侧翼为单链突出端的互补区域，其中每一个单链突出端包含至少一个与mRNA干扰酶识别位点互补的序列，且所述的单链突出端互相互补；(c)通过互补的单链突出端连接已经退火的第一和第二核酸序列，形成包含多个退火的第一和第二核酸序列的串联重复的多联体(concatamer)；(d)使用第一引物(包含T7启动子以及与所述的第一核酸序列互补的区域)和第二引物(与所述的第二核酸序列互补)扩增所述的多联体，其中所述的扩增产生多个包含T7启动子的多联体；(e)使用T7 RNA聚合酶从所述的多个多联体转录出RNA分子，其中每一个所述的RNA分子包含多个侧翼为mRNA干扰酶识别位点的多核糖核苷酸序列的串联重复；以及(f)使用能够在所述的干扰酶识别位点处切割RNA的mRNA干扰酶消化所述的RNA分子，其中所述的消化产生多个所述多核糖核苷酸序列。在制备多个多核糖核苷酸序列的方法的一个特别方面，mRNA识别序列是ACA序列，且mRNA干扰酶是包含SEQ ID NO2的MazF或者其功能性片段。在制备多个多核糖核苷酸序列的方法的另一个方面，mRNA识别序列是UAX序列，其中X是C、A或者U，且mRNA干扰酶是包含SEQ ID NO4的PemK或者其功能性片段。在制备多个多核糖核苷酸序列的方法的另一个方面，mRNA识别序列是UAC序列，且mRNA干扰酶是包含SEQ ID NO74的MazF-mt1或者其功能性片段。本发明还涉及分离的核酸序列，其编码的多肽与SEQ IDNO2或者SEQ ID NO4或其功能性片段具有序列和/或结构同源性，其中所述的多肽能够表现出核糖核酸内切酶活性。在一个实施方案中，具有与SEQ ID NO2或其功能性片段序列和/或结构同源性的多肽是MazF的直向同源物，它能够表现出核糖核酸内切酶活性。能够表现出核糖核酸内切酶活性的多肽包括，但是不止限于，耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)MazF(NP_244588.1)，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)MazF(AAG23809.1)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)MazF(NP_372592.1)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)MazF(1NE8_A)，脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)MazF(NP_266040.1)，摩氏摩根氏菌(Morganella morgani)MazF(AAC82516.1)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)MazF(NP_217317.1)。在另一个实施方案中，具有与SEQ ID NO4或其功能性片段序列和/或结构同源性的多肽是PemK同源物或者直向同源物，它能够表现出核糖核酸内切酶活性。能够表现出核糖核酸内切酶活性的多肽包括，但是不止限于，PemK蛋白质家族的73个已知成员，包括MazF(ChpAK)，ChpBK以及其他的类PemK蛋白。下面是一个在网站上找到的这些蛋白名称的清单(http//pfam.wustl.edu/cgi-bin/getdesc？acc＝PF02452)Q9RX98；Q8F5A3；Q9K6K8；CHPA_ECOLI；Q7NPF9；Q88TP7；Q7WWW1；Q8YS80；Q8DW95；Q82YR2；Q7X3Y1；Q93S64；Q8PRN1；Q8GFY1；O52205；PEMK_ECOLIQ7N4H2；Q88PS7；Q8XCF2 CHPB_ECOLI；Q82VU0；Q8UGU5；Q9RWK4；Q9PHH8；Q7TXU4；P71650；Q7U1Y5；P96295；Q9JWF2；Q9JXI1；Q8E882；Q82VB5；Q8KJS3；Q7NMY4；Q9KFF7；P96622；Q81IT4；Q81VF4；Q8ESK5；Q92DC7；Q8Y8L0；Q97LR0；Q8XNN7；Q8R861；Q88Z43；O07123；Q837I9；Q9F7V5；Q8CRQ1；O05341；P95840；Q9FCV0；Q837L1；Q93M89；Q99IU9；Q82UB5；Q93MT8；YJ91_MYCTU；Q97MV8；Q7NHWO；Q7NI95；Q8YML2；Q7NHR3；YE95_MYCTU；Q9PCB9；Q8YZW8；Q7TZ90；P95272；Q8VJR1；Q7UON2；O53450；O06780；和Q7U1I8。本发明还包括了表达载体，它们包含了分离的核酸序列，其编码的多肽具有SEQ ID NO2或4或其功能性片段的序列和/或与SEQ ID NO2或4或其功能性片段具有结构同源性，其中所述的多肽能够表现核糖核酸内切酶活性。还包括包含这些表达载体的细胞以及包含本发明分离核酸序列的转基因动物，其中核酸序列在转基因动物的至少一个细胞中表达。在本发明的另一方面，提出了分离的氨基酸序列，其包含的多肽具有SEQ ID NO2或4或其功能性片段的序列和/或与SEQ IDNO2或4或其功能性片段具有结构同源性，其中所述的多肽能够表现核糖核酸内切酶活性。还包括了编码本发明氨基酸序列的表达载体，其中氨基酸序列的表达由表达载体内的调控序列控制，也包括包含这种表达载体的细胞以及包含本发明氨基酸序列的转基因动物，其中氨基酸序列在转基因动物中的至少一个细胞中表达。在本发明的另一方面，提供了包含SEQ ID NO1或者SEQID NO3的分离核酸序列。其中的核酸序列编码能够表现出核糖核酸内切酶活性的mRNA干扰酶或者其功能性片段。本发明还描述了包含SEQ ID NO1或者SEQ ID NO3的核酸序列的表达载体，其中的核酸序列编码能够表现出核糖核酸内切酶活性的mRNA干扰酶或者其功能性片段，且SEQ ID NO1或者SEQ IDNO3与调控序列有效连接。而且包含这种表达载体的细胞也属于本发明的范畴。另一方面，提出了转基因动物，其核酸序列包含SEQID NO1或者SEQ ID NO3，其中的核酸序列编码能够表现出核糖核酸内切酶活性的mRNA干扰酶或者其功能性片段，且其中核酸序列在转基因动物中的至少一个细胞中表达。还提供了编码包含SEQ ID NO2或者SEQ ID NO4的多肽的分离的核酸序列，其中的多肽是mRNA干扰酶或者其功能性片段，能够显示核糖核酸内切酶活性。另一方面，提供了包含分离核酸序列的表达载体，所述的核酸序列编码包含SEQ ID NO2或者SEQ ID NO4的多肽，其中的多肽是能够表现出核糖核酸内切酶活性的mRNA干扰酶或者其功能性片段，并且核酸序列与调控序列有效连接。本发明还包括了包含这些表达载体的细胞。另一方面，提出了转基因动物，其包含的分离核酸序列编码包含SEQ ID NO2或者SEQ ID NO4的多肽，其中多肽是能够表现出核糖核酸内切酶活性的mRNA干扰酶或者其功能性片段，且核酸序列在转基因动物中的至少一个细胞中表达。在本发明的一个实施方案中，提供了包含SEQ ID NO2或者SEQ ID NO4的分离氨基酸序列，其中的氨基酸序列是mRNA干扰酶或者其功能性片段，且mRNA干扰酶或者其功能性片段能够表现出核糖核酸内切酶活性。本发明还描述了表达载体，其编码的分离氨基酸序列包含SEQ ID NO2或者SEQ ID NO4，其中的氨基酸序列是mRNA干扰酶或者其功能性片段，且mRNA干扰酶或者其功能性片段能够表现出核糖核酸内切酶活性，且氨基酸序列的表达受到表达载体中调控序列的控制。本发明还包括包含这种表达载体的细胞。另一方面，提出了包含分离多肽的转基因动物，所述多肽包含SEQ ID NO2或者SEQ ID NO4，其中多肽是能够表现出核糖核酸内切酶活性的mRNA干扰酶或者其功能性片段，且多肽在转基因动物中的至少一个细胞中表达。本发明还包括试剂盒，其包含下列成分分离的核酸序列，所述核酸序列包含SEQ ID NO1或者SEQ ID NO3，其中的核酸序列编码mRNA干扰酶或者其功能性片段；包含SEQ ID NO2或者SEQ IDNO4的分离氨基酸序列，其中的氨基酸序列是mRNA干扰酶或者其功能性片段；与mRNA干扰酶活性相容的缓冲剂；以及用法说明材料。本发明还包括了本发明中mRNA干扰酶在涉及基因治疗方面的应用。也可以通过工程化使细胞表达分子，该分子在受试对象(例如人受试对象)中有缺陷或者缺乏，使该细胞通过整合本发明的mRNA干扰酶而自毁，mRNA干扰酶的表达受到可诱导调控元件的控制。在基因治疗应用中使用的用于细胞自毁的可诱导手段的整合，提供了一种自动防故障机制，这样可以在这种细胞为受试对象带来有利影响之后和/或在它们导致有害影响之前被清除掉。
附图的简要描述

图1A和1B显示在不同固体培养基上的细胞增殖以及MazFRNA干扰酶家族不同成员的序列比对。图1A显示了分别转化了pBAD-MazF，pBAD-MazF R29S或者pBAD-MazF R86G质粒的大肠杆菌BW25113(ΔaraBAD)细胞的生长性质。图1B描绘了来自大肠杆菌的MazF(GenBank Accession No.NP_289336.1)与来自耐盐芽孢杆菌(GenBank登录编号NP_244588.1)，表皮葡萄球菌(GenBank登录编号AAG23809.1)，金黄色葡萄球菌(GenBank登录编号NP_372592.1)，枯草芽孢杆菌(GenBank登录编号1NE8_A)，脑膜炎奈瑟氏球菌(GenBank登录编号NP_266040.1)，摩氏摩根氏菌(GenBank登录编号AAC82516.1)以及结核分枝杆菌(GenBank登录编号NP_217317.1)的MazF的序列比对。图2A-E显示了曲线图，描绘了MazF对于甲苯处理的大肠杆菌细胞35S-Met的掺入(Fig.2A)、[α-32P]dTTP的掺入(Fig.2B)以及[α-32P]UTP掺入(Fig.2C)的影响；以及MazF对于体内35S-Met掺入到大肠杆菌细胞中(Fig.2D)的影响；以及SDS-PAGE分析MazF诱导后体内蛋白质的合成(Fig.2E)。图3A-C显示了线性示踪(line trace)，描绘了多核糖体性质的光密度分析(图3A)，它显示了MazF对于多核糖体性质的影响，并且显示了蛋白质凝胶，表明MazF(His)6对于原核(图3B)和真核(图3C)的无细胞蛋白质合成的影响。图4A-D显示MazF对mRNA合成的影响。图4A显示在MazF存在时mazG mRNA的趾纹分析。图4B显示了用酚抽提后mazG mRNA的趾纹分析。图4C显示了MazE对于MazF对mazG mRNA切割的影响。图4D显示加入阿拉伯糖后(如所示)在不同时刻从含有pBAD-MazF的大肠杆菌BW25113细胞中提取总细胞mRNA进行Northern印迹分析的结果，使用放射性标记的ompA和lpp ORF DNA作为探针。图5A和B显示线性示踪，显示了春日霉素不存在(图5A)和存在(图5B)时多核糖体性质的光密度分析。70S、50S和30S核糖体的位置如所示。图6显示了趾纹分析，显示了核糖体对MazF对mazG mRNA切割的抑制。图7显示了趾纹分析，显示了mazG mRNA的Shine-Dalgarno序列由GGAG突变为UUUG对MazF功能的影响。图8显示了趾纹分析，显示了mazG mRNA起始密码子的突变对于MazF功能的影响。图9显示了趾纹分析，显示了在切割序列处UACAU(U1A2C3A4U5)的突变对MazF功能的影响。图10显示了丙烯酰胺凝胶，显示了MazF和MazE对于16S和23S rRNA切割的影响。图11显示了对于纯化的MazE-MazF(His)6复合物、MazF以及(His)6MazE蛋白的分析，使用tricine SDS-PAGE分离蛋白和考马斯亮蓝染色观察。图12A和12B显示了天然的聚丙烯酰胺凝胶，表明了在(His)6MazE和MazF之间化学计量形成的复合物。图13显示了蛋白质分子量标准曲线的图线，图示了MazF和MazE-MazF(His)6复合物的确定的分子量。图14A，14B和14C显示了EMSA凝胶，图示了(His)6MazE和/或MazF与mazEF启动子DNA的结合。图15显示了MazE同源物氨基酸序列的比对。显示了8个MazE家族蛋白质的序列比对。图16A和16B显示了EMSA凝胶，图示了蛋白质和DNA的相互作用。如图16A和16B所示，MazE的N端结构域介导了DNA分别与MazE-MazF(His)6复合物以及(His)6MazE蛋白质的结合。图17图示了MazE及其截断产物，以及酵母双杂交试验的结果，表明了MazF和MazE或者其截断产物/片段的相互作用。图18A和18B分别显示了非变性聚丙烯酰胺凝胶，图示了蛋白质相互作用；以及图示了蛋白质-DNA相互作用的EMSA凝胶。图19图示了MazE-MazF复合物的X射线结构。图20A和20B显示了大肠杆菌MazF的核酸和氨基酸序列。图21A和21B显示了大肠杆菌MazE的核酸和氨基酸序列。图22A-22H显示了大肠杆菌MazF直向同源物的核酸序列。图23A-23H显示了大肠杆菌MazF直向同源物的氨基酸序列。图24A-24G显示了大肠杆菌MazE直向同源物的核酸序列。图25A-25G显示了大肠杆菌MazE直向同源物的氨基酸序列。图26A-C显示了PemK对于DNA和蛋白质合成的影响。图26A和26B是曲线图，图示了PemK对于体内DNA(A)和蛋白质(B)合成的影响。图26C显示了在PemK诱导之后总细胞蛋白的SDS-PAGE分析。图27A-C显示了SDS-PAGE分离的蛋白质的放射性自显影。结果表明了PemK和PemI对于无细胞蛋白质合成的影响。图28A-E显示了聚丙烯酰胺凝胶(A)或者聚丙烯酰胺凝胶放射性自显影(B-E)的结果，表明PemK介导的核糖核酸内切酶活性。图29A-B显示了聚丙烯酰胺测序凝胶(A)和聚丙烯酰胺凝胶放射性自显影(B)的结果，表明PemK介导的核糖核酸内切酶活性对单链RNA的特异性。图30A-D显示了Northern印迹分析(A)或者聚丙烯酰胺凝胶放射性自显影(B-D)的结果，图示了PemK在体内介导了对各种不同的mRNA的内切核酸酶活性。图31A和31B显示了大肠杆菌PemK的核酸和氨基酸序列。图32A和32B显示了大肠杆菌PemI的核酸和氨基酸序列。图33显示了PemK、ChpBK和MazF多肽的序列比对。图34显示了PemK，ChpBK，MazF和来自隐藏分枝杆菌(Mycobacterium celatum)，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440和弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)2a str.301的三个类PemK蛋白的序列比对。图35显示了成熟人嗜酸性粒细胞趋化蛋白(eotaxin)的核酸和氨基酸序列(分别是SEQ ID NO67和68)。图36是pCold I载体的示意图。图37显示了聚丙烯酰胺凝胶放射性自显影的结果，显示了在没有背景蛋白质合成的情况下成熟人嗜酸性粒细胞趋化蛋白的产生。图38A-F是显微镜照片，显示了被诱导表达MazF毒素(D-F)和未诱导(A-C)的人细胞的形态。图39A-B显示了(A)用pET28a表达的MazF(E24A)突变体N端延伸的氨基酸序列；以及(B)聚丙烯酰胺凝胶的照片，显示了对应于切割的MazF突变体融合蛋白的条带(泳道1)以及凝血酶切割的MazF突变体融合蛋白(泳道2)。图40显示了MazF-mt1 mRNA干扰酶活性的引物延伸分析。图41A-B显示了(A)大肠杆菌MazF及其在结核分枝杆菌中的同源物的序列比对以及(B)大肠杆菌MazF及其在枯草芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)和金黄色葡萄球菌中的同源物的序列比对。图42显示了mazF开放阅读框(ORF)的RNA序列。所有的ACA序列用灰色显示，替换了ACA序列而没有改变由其编码的MazF氨基酸序列的碱基改变在RNA序列的上方显示。图43A-E显示了在结核分枝杆菌中的大肠杆菌MazF同源物的核酸序列。图44A-E显示了在结核分枝杆菌中的大肠杆菌MazF同源物的氨基酸序列。图45A-D显示了来自隐藏分枝杆菌，恶臭假单胞菌KT2440和弗氏志贺氏菌2a str.301的三个类PemK和ChpBK的核酸序列。图46A-D显示了来自隐藏分枝杆菌，恶臭假单胞菌KT2440和弗氏志贺氏菌2a str.301的三个类PemK蛋白和ChpBK的氨基酸序列。
发明详述在描述这里的发现及其使用方法之前，应当理解本发明不止限于这里描述的特定试验方法，或者试验化合物及试验条件，因为这些方法和化合物可能是多样的。还应当理解这里使用的术语目的仅仅是描述特定的实施方案，而不是要限制，因为本发明的范畴仅仅限于所附的权利要求。因此，在说明书和权利要求中使用的术语″MazF″或″PemK″指的既有一般类型的核糖核酸内切酶，还有具有特定名称的特定酶，包括与其具有结构和序列同源性的酶。同样地，本发明包括的酶家族这里称为“RNA干扰酶”，这是这里的发明者发现的新家族。而且，本发明还包括了与其在本发明中的角色相一致的结构和功能相似性的分子。而且，在说明书和权利要求中使用的术语″MazE″或″PemI″指的既有一般类型的MazE(或者MazF调节性分子)或者PemI(或者PemK调节性分子)，还有具有这一名称的特定分子，包括与SEQ ID NO6或者SEQ ID NO8具有结构和/或序列同源性的MazE(或者MazF调节性分子)或者PemI(或者PemK调节性分子)。的确，本发明还包括了与其在本发明中的角色相一致的具有结构和功能相似性的分子。细菌细胞的死亡和生长抑制是由细菌基因组中的内源毒素基因对于某些压力条件的响应而引发。MazF是一个内源的毒素，它导致细胞的死亡，由大肠杆菌中被称为″MazEF上瘾组件″的操纵子编码。MazE是一个对抗MazF的不稳定的抗毒素。正如这里所描述的，在通透化的细胞中检查MazF对DNA、RNA和蛋白质合成的作用。简而言之，在MazF诱导之后10分钟，ATP依赖的35S-甲硫氨酸的掺入被完全抑制，而[α-32P]dTTP和[α-32P]UTP的掺入没有被抑制，表明MazF是蛋白质合成的特异抑制因子。而且，纯化的MazF在原核和真核的无细胞系统中都抑制蛋白质的合成，且这种抑制在MazE存在的情况下被阻断。在使用蔗糖密度梯度离心进行分析的时候，MazF的诱导阻断了多核糖体的形成，同时增加了70S核糖体的组分，而50S和30S核糖体组分没有受到MazF表达的影响。显著的是，趾纹分析显示MazF是一个序列特异的核糖核酸内切酶，它识别ACA序列，独立于核糖体起作用。而且，Northern印迹分析表明在MazF诱导后总细胞mRNA被降解。因此本发明的发明者有了一个令人惊奇的发现，MazF是一个新型核糖核酸内切酶家族第一个被确定的成员，考虑到其干扰细胞mRNA作用的能力，它在这里被命名为“mRNA干扰酶”。正如这里显示的，干扰酶的功能由mRNA转录物在特异序列(ACA)处的切割产生，这导致细胞生长的迅速停止和/或细胞死亡。正如这里表明的，mRNA干扰酶的作用在正常的细胞生理和/或由压力条件诱导的受损细胞生理中具有广泛的含意。本发明的发明者还发现纯化的PemK(由“pemI-pemK上瘾组件”编码的毒素)抑制了在大肠杆菌无细胞系统中蛋白质的合成，而加入抗PemK的抗毒素PemI，恢复了蛋白质的合成。这里描述的其他研究显示PemK是一个序列特异的切割mRNA的核糖核酸内切酶，因此抑制了蛋白质的合成。PemI阻断了PemK介导的核糖核酸内切酶活性，这样恢复了蛋白质的合成。PemK只切割单链RNA，优选在“UAX(X是C、A或者U)”识别位点的A残基的5′或者3′一侧切割。在诱导之后，PemK切割细胞mRNA，有效地阻断大肠杆菌中蛋白质的合成。pemK的同源物已经在很多细菌的基因组中被发现，并且本发明的发明者在这里提出PemK及其同源物组成了一个新的核糖核酸内切酶家族，该家族通过以序列特异的方式切割细胞mRNA干扰了mRNA的功能。为了更清楚地给出本发明的参数，使用以下的定义短语“侧翼核酸序列”指的是那些位于内切核酸酶切割位点5′和3′的连续核酸序列。正如在本说明书和所附的权利要求中所使用的，除非在上下文中明确指明，单数形式″a″，″an″和″the″包括了复数指代。因此例如，“the method”包括一种或者更多的方法，和/或这里描述的步骤类型和/或在阅读本公开材料之后本领域内的技术人员可以明确的步骤等等。术语“内切核酸酶”指的是可以在内部切割DNA的酶。术语“核糖核酸内切酶”指的是可以在内部切割RNA的酶。术语“互补的”指的是表现出大体正常的碱基配对性质的两条DNA链。但是互补的DNA可以含有一个或者更多的错配。术语“杂交”指的是在两条互补的DNA链之间出现的氢键连接。“核酸”或者“核酸分子”在这里使用，指的是任何单链或者双链的DNA或RNA分子，如果是单链的，核酸分子的互补序列的分子可以是线形或者环状形式。在讨论核酸分子时，某个核酸分子的序列或者结构在这里进行描述时可以根据常规按照从5′到3′的方向给出其序列。在提到本发明的核酸时有时会用到术语“分离的核酸”。该术语在用于DNA时，所指的DNA分子已经与其来源的生物体天然存在的基因组上紧邻的序列分离开来。例如，“分离的核酸”可能包含插入到载体例如质粒或者病毒载体中的DNA分子，或者整合到原核或者真核细胞或者生物体基因组DNA中的DNA分子。在用于RNA时，术语“分离的核酸”主要是指根据以上确定的分离DNA分子编码的RNA分子。或者该术语所指的RNA分子已经同在天然状态(即在细胞或者组织中)下与该RNA分子联系在一起的其它核酸充分地分离开来了。分离的核酸(DNA或者RNA)还可以代表通过生物学或者合成方式直接产生的、并且同其产生过程中存在的其他组分分离开来的分子。某些核酸序列的“天然等位变异体”、“突变体”和“衍生物”指的是与该序列有密切联系、但是可能具有天然或者人工设计的序列或者结构改变的序列。有紧密联系的意思是序列中在确定长度上至少65％但是通常是85％以上的核苷酸与用一个特定SEQ ID NO表示的核酸序列相匹配。紧密联系的核酸序列之间核苷酸序列的改变或者差异可能代表了在某个核酸序列正常的复制过程中或者天然的重复中产生的序列核苷酸的改变。其他的改变可以根据特别的目的，例如改变核酸中的氨基酸密码子或者调控区域的序列，进行特异设计并且引入到序列中。这种特异的改变可以在体外使用多种不同的诱变技术进行，或者在被置于特定选择条件(该条件诱导或者选择这些改变)下的宿主生物体中进行。这种特异产生的序列变异体可以被称作初始序列的“突变体”或者“衍生物”。在提及某个特定序列时使用术语“百分比相似性”、“百分比一致性”以及“百分比同源性”，如同University of WisconsinGCG软件程序中提及的那样，这在本领域内是已知的。
本发明还包括本发明MazF多肽或者蛋白质的活性部分、片段、衍生物以及功能性或者非功能性模拟物。MazF多肽的“活性部分”的意思是小于MazF多肽全长，但是仍然保留了可测量生物活性的肽。
mRNA干扰酶的“片段”或者“部分”的意思是一段氨基酸残基的片段，至少有大约5-7个连续的氨基酸，一般至少有大约7-9个连续的氨基酸，通常至少有大约9-13个连续的氨基酸，最优选至少大约20-30个或者更多连续的氨基酸。mRNA干扰酶的“衍生物”或者其片段的意思是通过改变蛋白质的氨基酸序列，例如对编码蛋白质的核酸进行操作或者改变蛋白质自身而形成的经修饰的多肽。这种天然氨基酸序列的衍生物可能涉及了一个或者更多氨基酸插入、添加、删除或者替换，可能或者可能没有改变原来mRNA干扰酶的基本活性。
在自然界中存在不同的mRNA干扰酶“变异体”。这些变异体可能是等位基因，其特征是编码蛋白质的基因的核苷酸序列的差异，或者可能涉及不同的RNA加工或者翻译后的修饰。技术人员可以制备出具有单一或者多个氨基酸替代、删除、添加或者替换的变异体。此外，这些变异体可能包含(a)其中一个或者更多氨基酸残基被保守或者非保守的氨基酸替代的变异体，(b)其中一个或者更多氨基酸残基被加入到mRNA干扰酶中的变异体，(c)其中一个或者更多氨基酸包含了取代基团的变异体，以及(d)其中mRNA干扰酶与另外一个肽或者多肽(例如融合伴侣、蛋白标签或者其他化学部分，它们可能使mRNA干扰酶具有有用的性质，例如抗体的表位、多聚组氨酸序列、生物素部分等等)融合的变异体。本发明的其他mRNA干扰酶包括变异体，其中在保守或者非保守的位置来自一个物种的氨基酸残基被另外一个物种的相应残基替代。在另一个实施方案中，非保守位置的氨基酸残基被保守或者非保守的残基替代。获得这些变异体的技术，包括遗传学的(抑制、删除、突变等)、化学的以及酶学的技术，对于本领域内具有普通技术的人员是已知的。
这种等位变异、类似物、片段、衍生物、突变体以及修饰，包括可变核酸加工形式和可变翻译后修饰形式产生保留了mRNA干扰酶任何生物学性质的mRNA干扰酶衍生物，它们包括在本发明的范畴中。
这里使用的术语″直向同源物″或者″同源物″指由核酸序列编码的核酸酶，这些序列的多肽产物与MazF编码序列有大于60％的序列一致性，和/或这些序列的基因产物与MazF有相似的三维结构和/或生化活性。示例性的直向同源物/同源物包括，但不限于，耐盐芽孢杆菌的MazF(GenBank登录编号NP_244588.1)，表皮葡萄球菌的MazF(GenBank登录编号AAG23809.1)，金黄色葡萄球菌的MazF(GenBank登录编号NP_372592.1)，枯草芽孢杆菌的MazF(GenBank登录编号1NE8_A)，脑膜炎奈瑟氏球菌的MazF(GenBank登录编号NP_266040.1)，摩氏摩根氏菌(GenBank登录编号AAC82516.1)和结核分枝杆菌(GenBank登录编号NP_217317.1)。参见图22和23。术语″直向同源物″和″同源物″可以用来指任何物种的MazF核酸或者氨基酸序列的直向同源物/同源物。这些物种包括，但是不止限于，大肠杆菌，耐盐芽孢杆菌，表皮葡萄球菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，脑膜炎奈瑟氏球菌，摩氏摩根氏菌，结核分枝杆菌，小鼠(Mus musculus)，以及智人(Homo sapiens)。这里涉及了在本发明的方法中使用这些直向同源物/同源物编码的核酸酶。正如这里所使用的，术语″直向同源物″或者″同源物″还指由一些核酸序列编码的核酸酶，这些序列的多肽产物与PemK编码序列有大于60％的序列一致性，和/或这些序列的基因产物与PemK有相似的三维结构和/或生化活性。术语″直向同源物″和″同源物″可以用来指任何物种的PemK核酸或者氨基酸序列的直向同源物/同源物。这里涉及了在本发明的方法中使用这些PemK的直向同源物/同源物编码的核酸酶。示例性的同源物和直向同源物包括，但不限于，PemK蛋白质家族中的73个已知成员，包括MazF(ChpAK)，ChpBK以及其他类PemK蛋白。以下是在网站中(http//pfam.wustl.edu/cgi-bin/getdesc？acc＝PF02452)找到的这些蛋白质的命名清单Q9RX98；Q8F5A3；Q9K6K8；CHPA_ECOLI；Q7NPF9；Q88TP7；Q7WWW1；Q8YS80；Q8DW95；Q82YR2；Q7X3Y1；Q93S64；Q8PRN1；Q8GFY1；O52205；PEMK_ECOLI Q7N4H2；Q88PS7；Q8XCF2 CHPB_ECOLI；Q82VU0；Q8UGU5；Q9RWK4；Q9PHH8；Q7TXU4；P71650；Q7U1Y5；P96295；Q9JWF2；Q9JXI1；Q8E882；Q82VB5；Q8KJS3；Q7NMY4；Q9KFF7；P96622；Q81IT4；Q81VF4；Q8ESK5；Q92DC7；Q8Y8L0；Q97LR0；Q8XNN7；Q8R861；Q88Z43；O07123；Q837I9；Q9F7V5；Q8CRQ1；O05341；P95840；Q9FCV0；Q837L1；Q93M89；Q99IU9；Q82UB5；Q93MT8；YJ91_MYCTU；Q97MV8；Q7NHW0；Q7NI95；Q8YML2；Q7NHR3；YE95_MYCTU；Q9PCB9；Q8YZW8；Q7TZ90；P95272；Q8VJR1；Q7UON2；O53450；O06780；和Q7U1I8。参见图33和34。Swiss-Protein编号之后是NCBI编号。Q9RX98 NP_294140 Q8F5A3 NP_711962 Q9K6K8 NP_244588 CHPA_ECOLINP_417262 Q7NPF9 NP_923042 Q88TP7 NP_786238 Q7WWW1 NP_943016 Q8YS80NP_487251 Q8DW95 NP_720642 Q82YR2 NP_816992 Q7X3Y1 NP_857606 Q93S64 NP_862570Q8PRN1 NP_644713 Q8GFY1AAN87626.O52205 AAC82516 PEMK_ECOLI NP_957647Q7N4H2 NP_929611 Q88PS7 NP_742932 Q8XCF2 NP_290857 CHPB_ECOLI D49339 Q82VU0NP_841047 Q8UGU5 NP_531638 Q9RWK4 AAF10240 Q9PHH8 NP_061683 Q7TXU4NP_856470 P71650 NP_217317 Q7U1Y5 NP_854128 P96295 CAB03645 Q9JWF2 NP_283229Q9JXI1 AAF42359 Q8E882 NP_720377 Q82VB5 NP_841237 Q8KJS3 CAA70141 Q7NMY4NP_923577 Q9KFF7 NP_241388 P96622 NP_388347 Q81IT4 NP_830134 Q81VF4 NP_842807Q8ESK5 NP_691544 Q92DC7 NP_470228 Q8Y8L0 NP_464414 Q97LR0 NP_347134 Q8XNN7NP_561211 Q8R861NP_623721 Q88Z43 NP_784302 O07123 CAA70141 Q837I9 NP_814592Q9F7V5 NP_765227 Q8CRQ1 AAO05271 O05341 NP_646809 P95840 BAB95857 Q9FCV0CAC03499 Q837L1 NP_814568 Q93M89 NP_150051 Q82UB5 NP_841618 Q93MT8 NP_713024YJ91_MYCTU NP_216507 Q99IU9 P_856470 Q97MV8 NP_346728 Q7NHW0 NP_925371Q7NI95 NP_925234 Q8YML2 NP_488961 Q7NHR3 NP_925418 YE95_MYCTU CAA17218Q9PCB9 NP_299148 Q8YZW8 NP_484381 Q7TZ90 NP_855627 P95272 NP_216458 Q8VJR1NP_336589Q7U0N2 NP_854788 O53450 NP_216458 O06780 NP_215173 Q7U1I8 NP_854336.这里使用的术语″直向同源物″或“同源物”还指的是由核酸序列编码的核酸酶(抗毒素或者核酸酶的调节剂)的结合伴侣，其多肽产物与MazE的编码序列有大于60％的一致性，和/或其基因产物具有与MazE相似的三维结构和/或生化活性。示例性的直向同源物/同源物包括，但是不限于，MazE，耐放射异常球菌(Deinococcusradiodurans)(GenBank登录号NP_294139)；MazE，耐盐芽孢杆菌(GenBank登录号NP_244587)；PemI，质粒R100(GenBank登录号NP_052993)；PemI，质粒R466b(GenBank登录号AAC82515)；ChpS，大肠杆菌(GenBank登录号NP_290856)；MazE，恶臭假单胞菌KT2440(GenBank登录号NP_742931)；MazE，Photobacteriumprofundum(AAG34554)。参见图24和25。术语″直向同源物″或“同源物”还可以指任何物种的MazE的核酸或者氨基酸序列的直向同源物/同源物。这些物种包括，但是不止限于，大肠杆菌，耐放射异常球菌，耐盐芽孢杆菌，恶臭假单胞菌，Photobacterium profundum，表皮葡萄球菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，脑膜炎奈瑟氏球菌，摩氏摩根氏菌，结核分枝杆菌，小鼠(Mus musculus)，以及智人。这里还涉及由这些直向同源物/同源物编码的核酸酶调节性分子(抗毒素)在本发明方法中的使用。正如这里所使用的，术语″直向同源物″或“同源物”还指的是由核酸序列编码的核酸酶结合伴侣(抗毒素或核酸酶的调节剂)，其多肽产物与PemI编码序列有大于60％的序列一致性，和/或其基因产物与PemI有相似的三维结构和/或生化活性。示例性的PemI的直向同源物/同源物包括，但不止限于，MazE(抗毒素)蛋白质家族中的已知成员，包括MazE(ChpAI)，ChpBI以及其他MazE的同源物。术语″直向同源物″和“同源物”可以用来指任何物种的PemI核酸或者氨基酸序列的直向同源物/同源物。这里涉及了在本发明的方法中使用这些同源物编码的核酸酶调节性分子。这里涉及了在本发明的方法中使用这些同源物/直向同源物编码的核酸酶调节性分子(抗毒素)。正如在这里所使用的，术语“功能性的”意味着核酸或者氨基酸序列对于所述的试验或者目的是有功能的。正如在这里所使用的，术语“功能性片段”意味着核酸或者氨基酸序列是全长多肽的一部分或者亚结构域，并且对于所述的试验或者目的是有功能的。在指一个特定的核苷酸或者氨基酸时，短语“基本由……组成”的意思是具有给定SEQ ID NO序列性质的序列。例如在用来指一个氨基酸序列时，该短语包括了该序列本身以及不会影响该序列基本性质和新性质的分子修饰。“复制子”是能够主要在自身的控制下复制的任何遗传元件，例如质粒、粘粒、杆粒、噬菌体或者病毒。复制子可以是RNA或者DNA，可以是单链或者双链。“载体”是一个复制子，例如质粒、粘粒、杆粒、噬菌体或者病毒，另外的遗传序列或者元件(DNA或者RNA)可以与其相连，使得连接的序列或者元件也能复制。“表达载体”或者“表达操纵子”指的是可能具有转录和翻译控制序列(例如启动子、增强子、翻译起始信号(例如ATG或者AUG密码子)、多聚腺苷酸化信号、终止子等等)的核酸片段，其有助于多肽编码序列在宿主细胞或者生物体中的表达。正如这里所使用的，术语“有效连接”指的是能够介导编码序列表达的调控序列，它被放在DNA分子(例如表达载体)中相对于编码序列的适当的位置上，使得编码序列被表达。同样的定义有时应用在表达载体中的编码序列和转录控制元件(例如启动子、增强子和终止元件)的排列上。当产生了杂合核酸分子时，该定义有时还应用在杂合分子中第一个第二个核酸序列的核酸序列的排列上。正如这里使用的，术语“寡核苷酸”指的是本发明的引物和探针，其定义为由两个或者更多核糖或者脱氧核糖核苷酸、优选是三个以上核苷酸组成的核酸分子。寡核苷酸的准确大小取决于各种不同的因素、特定的应用以及寡核苷酸的使用。正如这里所使用的，术语“探针”指的是寡核苷酸，多核苷酸或者核酸，可以是RNA或者是DNA，可以是天然存在的(如从限制性酶消化产物纯化得到的)或者合成产生的，能够与序列同探针互补的核酸退火或者特异杂交。探针可以是单链或者双链的。探针的准确长度取决于许多因素，包括温度、探针的来源以及使用方法。例如对于诊断应用，根据靶向序列的复杂程度，寡核苷酸探针通常含有15-25或者更多的核苷酸，尽管它可能含有更少的核苷酸。在这里，选择探针，使其与特定的靶核酸序列的不同链“基本”互补。这意味着探针必须充分互补，才能够在一系列预先设置的条件下与它们各自的靶链“特异杂交”或者退火。因此，探针的序列不需要是靶标的精确互补序列。例如，一个非互补的核苷酸片段可以连接在探针的5′或者3′端，探针序列的剩余部分与靶链互补。另外，在探针序列同与探针特异退火的靶核酸序列有充分互补性的条件下，可以将非互补碱基或者更长的序列分散到探针中。术语“特异杂交”指的是充分互补序列的两个单链核酸分子之间的结合使得在本领域内一般使用的预先设定的条件下这种杂交可以进行(有时称为“基本互补”)。特别地，该术语指的是寡核苷酸与本发明的单链DNA或者RNA内部含有的基本互补序列之间的杂交，基本排除了寡核苷酸与非互补序列单链核酸之间的杂交。正如这里所使用的，术语“引物”指的是寡核苷酸，可以是RNA或者DNA，单链或者双链，可以来源于生物系统，由限制性酶切产生或者合成产生，当所述的寡核苷酸置于适当的环境中时，就能够作为依赖于模板进行核酸合成的起始物而起作用。在提供了正确的核酸模板、核酸的适宜的核苷三磷酸前体、聚合酶、适宜的辅助因子和条件(如适宜的温度和pH)时，引物就可以在其3′端通过聚合酶的作用或者类似的活性，通过加入核苷酸而得到延伸，产生引物延伸的产物。引物的长度根据特定的条件和应用的需要可以有所不同。例如，在诊断应用中，寡核苷酸引物的长度通常是15-25或者更多的核苷酸。引物必须与所要求的模板充分互补，才能引发所需延伸产物的合成，即引物应能够与所要求的模板链退火，退火的方式足以将引物的3′羟基部分置于正确的邻近位置，用于在聚合酶或者类似的酶作用下引发合成。并不需要引物的序列是所要求模板的完全互补序列。例如，非互补的核苷酸序列可以连接在互补引物的5′端。另外，在引物序列与所要求的模板链有充分互补性，能够有功能地提供一个模板-引物复合物用于延伸产物合成的前提下，可以将非互补碱基分散到寡核苷酸引物序列中。引物可以用6-羧基荧光素(6-FAM)进行荧光标记。或者引物可以用4，7，2′，7′-四氯-6-羧基荧光素(TET)进行标记。其他的DNA标记方法在本领域内是已知的并且被认为是在本发明范畴内的。这里有时使用术语“分离的蛋白质”或者“分离和纯化的蛋白质”。该术语主要是指通过表达本发明的分离核酸分子产生的蛋白质。或者该术语所指的蛋白质已经同在天然状态下与该蛋白质联系在一起的蛋白质充分地分离开来，以“基本纯”的形式存在了。“分离的”并不意味着排除与其他化合物或者材料形成人工或者合成混合物，以及不干扰基本活性的不纯物质的存在，这些物质可能由于例如不完全的纯化、稳定剂的加入或者配置成为如免疫原性制剂或药物上可以接受的制剂而存在。术语“基本纯”指的是一种制剂包含至少50-60％重量的给定材料(例如核酸、寡核苷酸、蛋白质等等)。更为优选地，制剂包含至少75％重量，最优选90-95％重量的给定化合物。纯度是由适合于给定化合物的方法来量度的(例如色谱法、琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、HPLC分析等等)。“成熟的蛋白质”或者“成熟的多肽”所指的多肽是具有任何加工事件之后的多肽序列，这些加工事件在多肽产生的过程中通常就出现，例如多肽前体的蛋白酶水解加工过程。在确定成熟蛋白质的序列或者界限时，成熟蛋白质序列的第一个氨基酸被称为氨基酸残基1。术语“标签”、“标签序列”或者“蛋白质标签”指的是化学部分，可以是核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸或者氨基酸、肽或者蛋白质或者其他化学物质，当这些物质加入到另一个序列中，则提供了额外的用处或者使序列具有了有用的性质，特别是关于检测或者分离该序列的方法的有用性质。因此，例如可以将与捕获寡核苷酸互补的同聚核酸序列或者核酸序列加到引物或者探针序列上，促进接下来对延伸产物或者杂交产物的分离。如果是蛋白质标签，可以将组氨酸残基(例如4-8个连续的组氨酸残基)加在蛋白质的氨基或者羧基端，通过金属螯合层析促进蛋白质的分离。或者将代表与特异抗体分子或其他分子有反应性的表位或结合决定簇的氨基酸序列、肽、蛋白质或融合伴侣(例如flag表位、c-myc表位、流感A病毒血凝素蛋白跨膜表位、蛋白A、纤维素结合结构域、钙调蛋白结合蛋白、麦芽糖结合蛋白、几丁质结合结构域、谷胱甘肽S-转移酶等等)加到蛋白质之上，促进蛋白质通过亲和或者免疫亲和层析的步骤被分离。化学标签分子包括如生物素的分子，它们可以加在核酸或者蛋白质上，有助于通过与抗生物素蛋白试剂等等的相互作用对核酸和蛋白质进行分离和检测。受过训练的技术人员知道并且可以设想出许多其他的标签分子，它们也被认为是这一定义范畴内的。术语“转化”、“转染”、“转导”所指的是核酸引入到细胞或者宿主生物体中的方法或者手段，可以交换使用表达相同的含义。这些方法包括，但是不止限于，转染、电穿孔、微注射、PEG融合等等。被引入的核酸可以整合(共价连接)或者不整合到受体细胞或者生物体的核酸中。例如在细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞中，引入的核酸可以作为附加体元件或者独立复制子如质粒的形式维持。或者被引入的核酸可以整合到受体细胞或者生物体的核酸中，稳定地维持在那个细胞或者生物体中，进一步传递或者遗传到受体细胞或生物体的子代细胞或生物体中。在其他应用中，引入的核酸在受体细胞或者宿主生物体中可能仅仅短暂存在。“克隆”或者“克隆细胞群”是一群从单一细胞或者共同祖先通过有丝分裂形成的细胞。“细胞系”是能够在体外稳定生长多代的原代细胞或细胞群的克隆。含有本发明的分子或者化合物的组合物可以进行给药，用于预防和/或治疗性治疗。在一个治疗性应用中，例如，将组合物施用给已经患有过度增生性疾病(例如癌症)的患者，施用的量足以治愈或者至少部分停止疾病及其并发症的症状。足以完成这一目的的量被确定为“治疗上有效的量或者剂量”。对于这一用途有效的量取决于疾病的严重性以及患者的体重和一般状况。正如这里所使用的，术语“癌症”指的是由于细胞不可控制的持续增殖导致的组织的异常生长。可以根据本发明的方法进行治疗的癌症的示例包括，但不止限于，肉瘤，母细胞瘤和癌例如纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，骨肉瘤，脊索瘤，血管肉瘤，内皮肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管内皮肉瘤，滑膜瘤，间皮瘤，尤因瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌，结肠直肠癌，胃癌，胰腺癌，乳腺癌，脑膜癌病(最常见与扩散的乳腺或者肺癌相伴)，卵巢癌，前列腺癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，囊腺癌，髓样癌，肺癌，肾细胞癌，肝癌，肝癌转移，胆管癌，绒毛膜癌，精原细胞瘤，胚胎性癌，甲状腺癌例如未分化甲状腺癌，肾母细胞瘤，宫颈癌，睾丸癌，肺癌例如小细胞肺癌和非小细胞肺癌，膀胱癌，上皮细胞癌，神经胶质瘤，星型细胞瘤，成神经管细胞瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体瘤，成血管细胞瘤，听神经瘤，少突胶质细胞瘤，脑脊膜瘤，黑色素瘤，母细胞胞瘤和视网膜母细胞瘤。可以根据本发明的方法进行治疗的血液恶性肿瘤的示例包括急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多发性骨髓瘤、非何杰金淋巴瘤(NHL)，何杰金疾病和淋巴瘤(HD)，幼淋巴细胞白血病(PLL)，和骨髓增生异常综合征(MDS)。“免疫应答”表示的是任何抗原例如蛋白质抗原在具有正常功能免疫系统的宿主中产生的反应。免疫应答可以是体液的，涉及免疫球蛋白或者抗体的产生，或者是细胞的，涉及多种不同类型的B和T淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞、抗原呈递细胞等等，或者既有体液免疫又有细胞免疫。免疫应答还可能涉及多种不同的效应分子的产生和修饰，例如细胞因子、淋巴因子等。免疫应答可以在体外以及在各种不同的细胞或者动物系统中进行测量。“抗体”或者“抗体分子”是任何与特异抗原结合的免疫球蛋白，包括抗体和抗体片段。该术语包括了多克隆、单克隆、嵌合以及双特异性抗体。正如这里所使用的，抗体或抗体分子涉及完整无缺的免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子的免疫学活性部分例如那些在本领域内已知的部分，如Fab，Fab′，F(ab′)2和F(v)。术语“细胞底物”指的是细胞内的分子，它是酶或者相关酶家族的酶促靶标。就mRNA干扰酶而言，“细胞底物”包括了细胞内由内源或者外源核酸序列表达的多聚核糖核苷酸。正如这里所使用的，短语“在促进核糖核酸内切酶活性的条件下”包括了细胞内(在细胞培养中或者在体内)或者体外(在试管中或者其他类似的容器中)的任何条件，其中本发明的mRNA干扰酶表现出核糖核酸内切酶活性。这些条件在这里提出的实施例中有所描述。类似地，“与mRNA干扰酶相容的缓冲剂”是一种缓冲剂，本发明的mRNA干扰酶在其中表现出核糖核酸内切酶活性。正如这里所使用的，术语“mRNA干扰酶调节剂”指的是一种能够调节mRNA干扰酶的核糖核酸内切酶活性(例如提高或者降低)的因子。筛选或者鉴别这种因子的方法在以下提出。示例性的内源mRNA干扰酶调节剂包括MazE(抑制MazF的活性)以及PemI(抑制PemK的活性)。这里也描述了MazE和PemI的功能性片段，它们能够分别抑制MazF和PemK的活性。除非另有定义，这里使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属的领域内一个具有普通技术的人员通常理解的含义相同。虽然在本发明的实践或者试验中可以使用任何与这里描述的相似或者相同的方法和材料，但是现在描述优选的方法和材料。这里提到的所有出版物在这里被引用，以公开和描述被引用的出版物与其有关的方法和材料。I.编码mRNA干扰酶的核酸分子以及mRNA干扰酶的制备核酸分子可以通过两种一般的方法制备编码本发明核糖核酸内切酶(例如MazF或PemK)的核酸分子(1)从适当的核苷酸三磷酸合成；或者(2)从生物来源中分离，两种方法使用的试验方案是本领域内众所周知的。核苷酸序列信息，例如SEQ ID NO1或者3的全长cDNA(见图20A和31A)，使得通过寡核苷酸合成制备本发明的分离核酸分子成为可能。合成的寡核苷酸可以通过亚磷酰胺方法制备，使用Applied Biosystems 380A DNA合成仪或者类似的装置。产生的构建体可以根据本领域内已知的方法例如高效液相色谱(HPLC)进行纯化。由于目前的寡核苷酸合成方法中固有的大小限制，长的双链多核苷酸，例如本发明的DNA分子，必须分步合成。然后，通过这种方法构建的合成DNA分子可以被克隆并扩增到适当的载体中。使用本领域内已知的方法，可以从适当的生物来源中分离编码mRNA干扰酶的核酸序列。在一个优选的实施方案中，从一个细菌来源的cDNA表达文库中分离出cDNA克隆。在另一个实施方案中，使用该cDNA序列提供的序列信息，可以分离出编码mRNA干扰酶的基因组克隆。或者，可以使用mRNA干扰酶基因内部预先确定的序列对应的寡核苷酸探针，从其他物种中分离出与mRNA干扰酶具有同源性的cDNA或者基因组克隆。根据本发明，可以使用适当严谨性的杂交以及漂洗条件，鉴定出与SEQ ID NO1或3的蛋白编码区域具有适当同源性水平的核酸。例如，可以使用包含下列的杂交溶液进行杂交5XSSC，5XDenhardt′s试剂，0.5-1.0％SDS，100微克/毫升变性的片段化的鲑精DNA，0.05％焦磷酸钠以及至多50％的甲酰胺。一般在37-42摄氏度进行杂交，至少6小时。杂交之后，按照下面的步骤漂洗滤膜(1)2XSSC，0.5-1％SDS中室温下漂洗5分钟；(2)在2XSSC，0.1％SDS中室温下漂洗15分钟；(3)在1XSSC，1％SDS中37摄氏度下漂洗30分钟到1小时；(4)在1XSSC，1％SDS中42-65摄氏度下漂洗2小时，每30分钟更换一次溶液。
一个计算在两个具有特定序列同源性的核酸分子之间杂交所需的严谨性条件的通用公式(Sambrook et al.，1989)是Tm＝81.5℃16.6Log[Na+]+0.41(％G+C)-0.63(％甲酰胺)-600/双链中的碱基对数目。
为了说明以上公式，使用[Na+]＝
和50％的甲酰胺，GC含量是42％，平均的探针大小是200bp，则Tm是57摄氏度。同源性每降低1％，DNA双链的Tm降低1-1.5摄氏度。这样，使用42摄氏度的杂交温度可以观察到具有大于约75％序列一致性的靶标。这样的一个序列被认为与本发明的核酸序列具有显著的同源性。
从上可以看出，杂交和漂洗的严谨性主要取决于溶液的盐浓度和温度。一般地，为了使两个核酸分子的退火比率最大化，通常在计算出来的杂合分子的Tm值以下20-25摄氏度下进行杂交。对于探针同靶标一致性的程度而言，漂洗条件应该尽可能的严谨。一般地，漂洗条件应该选择低于杂合分子Tm大约12-20摄氏度。就本发明的核酸而言，中度的严谨性杂交条件确定为6XSSC，5XDenhardt′s溶液，0.5％SDS，100微克/毫升变性的鲑精DNA，42摄氏度下杂交。漂洗条件是2XSSC，0.5％SDS，55摄氏度15分钟。高度的严谨性杂交条件确定为6XSSC，5XDenhardt′s溶液，0.5％SDS，100微克/毫升变性的鲑精DNA，42摄氏度。漂洗条件是1XSSC，0.5％SDS，65摄氏度15分钟。非常高严谨性杂交条件确定为6XSSC，5XDenhardt′s溶液，0.5％SDS，100微克/毫升变性的鲑精DNA，42摄氏度。漂洗条件是0.1XSSC，0.5％SDS，65摄氏度15分钟。
本发明的核酸可以作为DNA，在任何方便的克隆载体中保存。在一个优选的实施方案中，克隆在质粒克隆/表达载体中保存，例如在pBluescript(Stratagene，La Jolla，Calif.)中，其可以在适宜的大肠杆菌宿主细胞中增殖。本发明中编码mRNA干扰酶基因的基因组克隆可以在lambda噬菌体FIX II(Stratagene)中保存。
本发明中编码mRNA干扰酶的核酸分子包括cDNA、基因组DNA、RNA及其片段，它们可以是单链或者双链的。这样，本发明提供了寡核苷酸(DNA的有义或者无义链或者RNA)，它们具有的序列能够与至少一个本发明的核酸分子序列(例如SEQ ID NO1或者3的cDNA中选出的片段)进行杂交。这种寡核苷酸在检测或分离mRNA干扰酶基因的探针时是有用的。
本领域内的技术人员应当理解在细菌的群体和/或物种中存在这些序列的变异体(例如等位变异体)，而且在设计和/或使用本发明的寡核苷酸时必须考虑到变异体。因此，本发明的范畴也包括了这样的变异体，涉及这里公开的mRNA干扰酶序列或者靶向于各自基因或RNA转录本上特定位置的寡核苷酸。就这种变异体的包括而言，这里使用术语“天然的等位变异体”，指在一个给定的DNA群体中可能出现的多种不同的特异核苷酸序列及其变异体。在被编码的蛋白中引起保守或者中性氨基酸替代的遗传多态性是这种变异体的实例。
此外，术语“基本互补的”指的是与靶序列不完全匹配的寡核苷酸，但是这些错配没有在实质上影响该寡核苷酸在描述的条件下与其靶序列杂交的能力。
这样，编码序列可能是在例如SEQ ID NO1或3中显示的或者可能是这两个序列中一个的突变体、变异体、衍生物或者等位基因。该序列可能与所示的序列有所不同，区别在于所示序列的一个或者更多的核苷酸出现一个或者更多的添加、插入、删除以及替代。核苷酸序列的改变可能导致蛋白质水平上由遗传密码确定的氨基酸的改变或者不变。
因此，根据本发明的核酸可能包括与SEQ ID NO1或3所示的序列不同的序列，但是它编码的多肽与SEQ ID NO1或3编码的多肽具有相同的氨基酸序列。
另一方面，编码的多肽包含的氨基酸序列可能与SEQ ID NO2或者4所示的氨基酸序列有一个或者更多氨基酸残基的差异。参见图20B和31B。本发明还提供了编码多肽的核酸序列，所述多肽是SEQ ID NO2或者4所示氨基酸序列的突变体、变异体、衍生物或者等位基因。编码这种多肽的核酸与SEQ ID NO1或3所示的编码序列可能有大于60％的一致性，大于约70％的一致性，大于约80％的一致性，大于约90％的一致性或者大于约95％的一致性。
本发明提供了获得目标核酸的方法，该方法包括将具有部分或者全部SEQ ID NO1或3所示序列或者其互补序列的探针与靶核酸杂交。成功的杂交可以使与探针杂交上的核酸被分离出来，这可能涉及一个或者更多的聚合酶链式反应(PCR)扩增步骤。
这种寡核苷酸探针或者引物，以及全长的序列(以及突变体、等位基因、变异体和衍生物)在筛选含有核酸的检测样品中是否存在mRNA干扰酶的等位基因、突变体或者变异体时是有用的，探针与从待测的细胞、组织或者生物体获得的样品中的靶序列杂交。可以控制杂交的条件，使非特异结合最小化。优选地使用严谨到中度严谨的杂交条件。在教科书例如Sambrook et al(1989)和Ausubel et al(1992)的帮助下，技术人员能够容易地设计这种探针、标记它们并且设计适宜的杂交反应条件。
在一些优选的实施方案中，根据本发明的寡核苷酸(是SEQ ID NO1或3所示序列的片段或者任何与核糖核酸内切酶活性相关的等位基因)，其长度至少大约10个核苷酸，更为优选至少15个核苷酸长，更为优选至少大约20个核苷酸长。这些片段各自代表了本发明的方面。片段和其他寡核苷酸可以用作所讨论的引物或者探针，但是也可以通过与确定检测样品中是否存在编码mRNA干扰酶的同源物或者直向同源物序列有关的方法产生(例如通过PCR)。
B.蛋白质MazF是第一个被发现以高度特异性在特异的核酸序列(即ACA)处切割RNA的核酸酶。PemK是第一个被发现以高度特异性在特异的核酸序列(即UAX，其中X是C、A或U)处切割RNA的核酸酶。本发明的全长mRNA干扰酶蛋白(例如MazF或者PemK)可以根据已知的方法，以多种不同方式制备。蛋白质可以从适当的来源中纯化。但这不是一个优选的方法，原因是在任何时刻一个给定的细胞中存在的蛋白量可能很少。编码MazF和PemK的核酸分子的可获得性使得用本领域内已知的体外表达方法生产这两个蛋白成为可能。例如可以将cDNA或者基因克隆到适当的体外转录载体例如pSP64或者pSP65中，用于体外转录，之后在适宜的无细胞翻译系统(例如小麦胚芽或者兔网织红细胞裂解物)中进行无细胞翻译。体外转录和翻译系统是商品化的，可以从例如Promega Biotech，Madison，Wis.或者BRL，Rockville，Md获得。
或者，根据一个优选的实施方案，可以通过在适宜的原核或者真核系统中表达生产大量的mRNA干扰酶。例如，DNA分子的部分或者全部，例如SEQ ID NO1或3的cDNA，可以插入到适合于在细菌细胞如大肠杆菌细胞中表达的质粒载体中。这种载体包含DNA在宿主细胞(如大肠杆菌)中表达所需的调控元件，调控元件的位置允许DNA在宿主细胞中表达。这种表达所需的调控元件包括启动子序列、转录起始序列以及可选择地，增强子序列。
在重组原核或者真核系统中基因表达产生的mRNA干扰酶可以根据本领域内已知的方法进行纯化。在一个优选的实施方案中，可以使用商品化的表达/分泌系统，通过它重组蛋白表达之后从宿主细胞中分泌出来，容易地从周围的培养基中纯化出来。如果不使用表达/分泌载体，另外一种方式涉及用亲和分离纯化重组蛋白，例如与特异结合重组蛋白的抗体发生免疫相互作用或者用镍层析柱，用于分离在N端或者C端添加6-8个组氨酸的标签的重组蛋白。其他的标签可能包括FLAG表位或者血凝素表位。这些方法是技术人员通常使用的。
通过以上提到的方法制备的本发明的mRNA干扰酶，可以根据标准的步骤进行分析。例如，可以根据已知的方法，对这些蛋白进行氨基酸序列分析。
本发明还提供了是氨基酸序列变异体、等位基因、衍生物或者突变体的多肽。属于变异体、等位基因、衍生物或者突变体的多肽可能具有与SEQ ID NO2给出的序列不同的序列，有一个或者更多氨基酸的一个或多个添加、替换、删除以及插入。优选的这些多肽具有MazF的功能，即具有一个或者更多以下性质在RNA中切割ACA序列的能力；与抗体的交叉反应性，该抗体与具有SEQ ID NO2序列的多肽具有反应性；与SEQ ID NO2给出的序列所示的多肽具有共同表位(根据例如两个多肽之间的免疫交叉反应确定)。或者属于变异体、等位基因、衍生物或者突变体的多肽可能具有与SEQ ID NO4给出的序列不同的氨基酸序列，有一个或者更多氨基酸的一个或多个添加、替换、删除以及插入。优选的这些多肽具有PemK的功能，即具有一个或者更多以下性质在RNA中切割UAX序列(其中X是C、A或者U)的能力；与抗体的交叉反应性，该抗体与具有SEQ ID NO4序列的多肽具有反应性；与SEQ ID NO4给出的序列所示的多肽具有共同表位(根据例如两个多肽之间的免疫交叉反应确定)。属于SEQ ID NO2或者4所示氨基酸序列的氨基酸序列变异体、等位基因、衍生物或者突变体的多肽可能包含的氨基酸序列与所示的序列有大约35％以上的序列一致性、大约40％以上的一致性、大约50％以上的一致性、大约60％以上的一致性、大约70％以上的一致性、大约80％以上的一致性、大约90％以上的一致性或者大约95％以上的一致性。特定的氨基酸序列变异体与SEQ ID NO2或者4所示的序列之间，通过插入、添加、替换或者删除1个氨基酸、2，3，4，5-10，10-20，20-30，30-40，40-50，50-100，100-150，或者150个以上的氨基酸而可能有差异。氨基酸的“同源性”可以被理解为一致性或者相似性(根据确定的氨基酸相似性原则，例如，使用算法GAP(GeneticsComputer Group，Madison，Wis.)确定的相似性原则)。GAP使用Needleman和Wunsch算法比对两个完整序列，使匹配的数目最大化，使缺口数目最小化。一般地，使用缺省参数缺口产生罚分＝12以及缺口延伸罚分＝4。使用GAP可能是优选的但是也可以使用其他算法，包括，但不止限于，BLAST(Altschul et al.(1990 J.Mol.Biol.215405-410)；FASTA(Pearson and Lipman(1998)PNAS USA852444-2448)或者Smith Waterman算法(Smith and Waterman(1981)J.Mol.Biol.147195-197)，一般使用缺省参数。在这里使用术语“同源性”或者“同源的”并不意味着所比较的两个序列之间有任何必然的进化关系。这两个术语的使用与短语“同源重组”的使用类似，即术语仅仅要求两个核苷酸序列充分相似，以在适当的条件下重组。
根据本发明的多肽可以用于筛选影响或者调节其活性或功能的分子。这些分子可以用于研究目的。
本发明还提供了能够免疫特异性结合本发明蛋白质的抗体。针对mRNA干扰酶(例如MazF或者PemK)的多克隆抗体可以根据标准方法制备。在一个优选的实施方案中，制备了单克隆抗体，它们与mRNA干扰酶的各种不同的表位发生免疫特异反应。可以根据Kohler和Milstein的一般方法，使用标准试验方案制备单克隆抗体。与mRNA干扰酶发生免疫特异反应的多克隆或者单克隆抗体可以用于鉴定和纯化这些蛋白质。例如，抗体可以用于亲和分离与其发生免疫特异相互作用的蛋白质。还可以使用抗体从含有蛋白质和其他生物分子混合物的样品中将蛋白质免疫沉淀出来。以下描述了抗mRNA干扰酶的抗体的其他用途。
根据本发明的抗体可以通过多种方式进行修饰。的确术语“抗体”应当被理解为任何具有所需特异性的结合结构域的结合性物质。因此，本发明包括了抗体片段、抗体的衍生物、功能性等价物以及同源物，包括合成的分子和形状模拟了抗体使其能够结合抗原或者表位的分子。
示例性的能够结合抗原或者其他结合伴侣的抗体片段有由VL，VH，C1和CH1结构域组成的Fab片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体一个单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；由VH结构域组成的dAb片段；分离的CDR区域以及F(ab′)2片段，它是包括了两个Fab片段的双价片段，这两个Fab片段在铰链区由一个二硫桥连接。还包括了单链的Fv片段。
II编码mRNA干扰酶的核酸、mRNA干扰酶及其抗体的使用例如MazF和PemK是RNA核酸内切酶，可以用于降低或者抑制细胞、组织或者生物体内的蛋白质合成。而且，本发明的mRNA干扰酶可以特异地靶向于受试对象的特定组织，以特异降低或者抑制在靶向组织中的蛋白质合成。对于一些应用，有利的是靶向特异的RNA转录产物，用于MazF的核酸内切酶切割。这种序列可能包含升高频率的ACA序列，因此是MazF活性的天然优选靶标。或者可以通过改变MazF多肽使其特异地或者优先结合和/或切割用于切割的转录产物，从而靶向RNA转录产物用于MazF的切割。或者，可能有利的是靶向特异的RNA转录产物用于PemK的核酸内切酶切割。这种序列可能包含升高频率的UAX序列(其中X是C、A或者U)，因此是PemK活性的天然优选靶标。或者可以通过改变PemK多肽使其特异地或者优先结合和/或切割用于切割的转录产物，从而靶向RNA转录产物用于PemK的切割。特别地，mRNA干扰酶分子(例如MazF和PemK)以及本发明的组合物可以有利地用于治疗具有过度增生性疾病的患者。这些疾病包括，但不止限于，不同组织的发育异常和组织变形、炎性病症、自体免疫疾病、过度增生性皮肤疾病、牛皮癣、过敏/哮喘、动脉粥样硬化、血管成形手术后的再狭窄以及癌症。mRNA干扰酶分子(例如MazF和PemK)以及本发明的组合物可以有利地用于治疗具有细菌感染的患者。此外，根据本发明的mRNA干扰酶核酸、蛋白质及其抗体，可以用作研究工具，鉴定其他密切参与RNA识别和切割反应的蛋白质。A.编码mRNA干扰酶的核酸编码MazF和PemK的核酸可以用于根据本发明的各种不同的目的。编码MazF和PemK的DNA、RNA或者其片段可以用作探针，以检测编码类MazF以及类PemK蛋白质的基因的存在和/或表达。编码MazF和PemK的核酸可以用于这种检测的探针的方法包括，但是不止限于，(1)原位杂交；(2)Southern杂交；(3)northern杂交；以及(4)各种扩增反应例如PCR。本发明的编码mRNA干扰酶的核酸还可以用作探针，鉴定来自其他细菌、植物或者动物物种的相关基因。本领域内众所周知的是，可以调整杂交严谨性，使核酸探针与具有不同程度同源性的互补序列之间发生杂交。因此，编码MazF和PemK的核酸可以用于鉴定和表征其他与MazF和/或PemK有不同程度相关性的基因，这样使得进一步表征RNA降解系统的性质成为可能。此外，它们可以用于鉴定编码与MazF和/或PemK相互作用的蛋白质的基因(例如通过“相互作用陷阱”技术)，这应该会进一步加快对参与RNA切割的组分的鉴定。编码MazF或者PemK的核酸分子或者其片段还可以用于控制MazF或者PemK的生产，这样调控参与RNA切割反应的蛋白质的量。生理量的MazF或者PemK蛋白的改变可能显著影响参与RNA切割的其他蛋白质因子的活性。B.mRNA干扰酶及其抗体通过编码本发明MazF或者PemK的核酸的表达制备的纯化mRNA干扰酶，例如分离的MazF或者PemK蛋白，或者其片段，可以用于制备多克隆或者单克隆抗体，所述抗体可以在检查细菌细胞中MazF(或者含有MazF的复合物)或者PemK(或者含有PemK的复合物)的存在和累积时作为敏感的检测试剂。重组技术使得表达含有部分或者全部MazF或者PemK蛋白质的融合蛋白成为可能。全长的蛋白质或者蛋白质片段可以用于产生一系列对于蛋白质表位特异的单克隆抗体，这样就在检测细胞中的蛋白质时提供了更高的敏感性。对于mRNA干扰酶(例如MazF或者PemK)免疫特异的多克隆或者单克隆抗体可以用于多种不同的检测中，对蛋白质进行检测和定量。这些检测包括，但是不止限于(1)流式细胞仪分析；(2)在例如细菌细胞中mRNA干扰酶的免疫化学定位；以及(3)各种细胞的提取物的免疫印迹分析(例如，点印迹、Western印迹)。此外，如上面所描述，例如抗MazF和抗PemK抗体可以用于纯化MazF及其直向同源物或者PemK及其直向同源物(例如亲和柱纯化、免疫沉淀)。mRNA干扰酶，例如MazF或者PemK蛋白，还可以用于降低或者抑制细胞、组织或者生物体中蛋白质的合成，如上面所讨论的。从前面的讨论中，可以看出本发明中编码mRNA干扰酶的核酸、表达mRNA干扰酶的表达载体以及抗mRNA干扰酶的抗体，可以用于制备大量的mRNA干扰酶、检测mRNA干扰酶的基因表达以及改变mRNA干扰酶的积累，目的是确定参与RNA切割的遗传和蛋白质相互作用。本发明的发明者令人惊奇的发现来自细菌的稳定毒素MazF是一种核糖核酸内切酶。正如这里所描述的，MazF被作为称作“RNA干扰酶”的新型酶家族的第一个成员。而且，MazF是这个新型“RNA干扰酶”家族的示例。重要的是，在本发明的发现之前，没有发现MazF的细胞靶标。如这里所显示的，MazF的作用是高度序列特异的核糖核酸内切酶，它们在ACA位点处切割细胞的mRNA。这种活性可能对细胞内的蛋白质合成产生部分或者全部的抑制。依据四种核苷酸中的任何一种掺入到三个核苷酸位置的每一个位置的可能性是相同的原理，根据标准的计算，ACA序列出现在RNA转录产物中的预测频率是1/64。应当理解，与预测频率比较，一些RNA转录产物中包含较低或者较高频率的ACA序列。因此，特异RNA转录产物或者相关RNA转录产物家族被MazF核糖核酸内切酶切割的敏感性取决于ACA序列或者MazF靶序列在转录产物中的频率。而且，本领域内具有普通技术的人员能够根据RNA转录产物的序列预测转录产物对于MazF介导的切割的敏感性。本发明的发明者还发现PemK是这里被称为“RNA干扰酶”的新型酶家族的一个成员。如这里所显示的，PemK的作用是高度序列特异的核糖核酸内切酶，它们在UAX位点处切割细胞的mRNA，其中X是C、A或U。这种活性可能对细胞内的蛋白质合成产生部分或者全部的抑制。依据四种核苷酸中的任何一种掺入到三个核苷酸位置的每一个位置的可能性是相同的原理，根据标准的计算，UAX序列(其中X是C、A或U)出现在RNA转录产物中的预测频率是3/64。应当理解，与预测频率比较，一些RNA转录产物中包含较低或者较高频率的UAX序列。因此，特异RNA转录产物或者相关RNA转录产物家族被PemK核糖核酸内切酶切割的敏感性取决于UAX序列(其中X是C、A或者U)或者PemK靶序列在转录产物中的频率。而且，本领域内具有普通技术的人员能够根据RNA转录产物的序列预测转录产物对于PemK介导的切割的敏感性。因此本发明发明者的新发现提出了mRNA干扰酶(例如MazF和PemK)的核酸和氨基酸序列及其组合物新的应用。这些应用包括，但是不止限于，如这里描述的各种不同的研究和治疗性应用。还提供了包含MazF和PemK核酸和/或氨基酸序列、MazF和/或PemK活性相容缓冲剂以及用法说明材料的试剂盒。III.编码mRNA干扰酶抑制剂的核酸分子以及mRNA干扰酶抑制剂蛋白质的制备编码MazE和PemI的核酸分子以及MazE和PemI多肽、及其功能性片段基本上按照上面描述的制备编码MazF和PemK的核酸分子以及MazF和PemK多肽的方法产生。根据本发明，提供了编码MazE蛋白质、包含SEQ ID NO5的核酸序列。参见图21A。还提供了包含SEQ ID NO6的氨基酸序列及其功能性片段。参见图21B。相应地提供了编码PemI蛋白、包含SEQ ID NO7的核酸序列。参见图32A。还提供了包含SEQID NO8的氨基酸序列及其功能性片段。参见图32B。IV.编码mRNA干扰酶抑制剂的核酸以及mRNA干扰酶抑制剂蛋白质的使用本发明包括了SEQ ID NO5编码的MazE多肽、编码包含SEQ ID NO6的MazE多肽的核酸序列及其功能性片段，以及包含SEQID NO6的MazE多肽及其功能性片段。正如这里描述的，MazE多肽及其功能性片段表现出调节MazF活性的能力。参见实施例III和下面的总结。简而言之，正如这里所表明的，纯化的(His)6MazE与mazEF启动子DNA的结合被MazF增强。在MazE N端区域的保守氨基酸残基定点突变(K7A，R8A，S12A和R16A)破坏了(His)6MazE和MazE-MazF(His)6复合物的DNA结合能力，提示MazE通过N端结构域与mazEF启动子DNA结合。在溶液中，MazE-MazF(His)6复合物中，MazE和MazF(His)6的比例是大约1∶2。由于MazE和MazF(His)6均以同二聚体形式存在，所以预测MazE-MazF(His)6复合物(76.9kDa)是由一个MazE二聚体和两个MazF(His)6二聚体组成的。还使用酵母双杂交系统研究了MazE和MazF之间的相互作用。发现MazE的残基38到75区域对于与MazF的结合是必需的。该区域的定点诱变显示Leu55和Leu58在MazE-MazF复合物的形成中，而不是在MazE与mazEF启动子DNA的结合中起重要作用。现在的结果证明MazE由两个结构域即一个N端DNA结合结构域和一个C端MazF相互作用结构域组成。因此在一个实施方案中，本发明的MazE多肽和MazE功能性片段抑制了MazF的活性。在一个特殊方面中，本发明的MazE多肽或MazE功能性片段抑制了MazF核糖核酸内切酶的活性或者使核糖核酸内切酶的活性降低。的确，MazE及其功能性片段是本发明首先研究的分子，这里证明其能够实现核糖核酸内切酶活性的降低，因而实现核糖核酸内切酶底物切割的下降。示例性的能够实现核糖核酸内切酶底物切割下降的MazE功能性片段包括，但是止限于，C端MazF相互作用结构域。在一个特定的实施方案中，C端MazF相互作用结构域包含MazE的38-75号残基区域。正如这里描述的，在这一区域发现的关键残基包括Leu55和Leu58。在另一个实施方案中，C端MazF相互作用结构域包含MazE分子的Hp-Box以及其中发现的关键残基。在本发明的一个特定方面，MazE的两个C端肽可以通过化学合成，一个肽是T54-K77(24个氨基酸残基；TLAELVNDITPENLHENIDWGEPK；SEQ ID NO9)，另一个是N60-K77(18个氨基酸残基；NDITPENLHENIDWGEPK；SEQ ID NO10)。根据MazE-MazF复合物的X射线结构，这些多肽预计与MazF二聚体形成稳定的抑制复合物。前一个肽含有螺旋2以及C端的酸性尾巴，后一个肽没有螺旋2。使用合成的30碱基RNA(5′-UAAGAAGGAGAUAUACAUAUGAAUCAAAUC-3′；SEQ ID NO11)作为底物，检查这些肽抑制MazF mRNA干扰酶活性的能力。使用完好的MazE作为对照，比较它们的抑制活性。在另一个实施方案中，本发明的MazE多肽和MazE功能性片段增加或者提高MazF的活性。在一个特殊的方面，本发明的MazE多肽或MazE功能性片段提高MazF核糖核酸内切酶的活性或者实现核糖核酸内切酶活性的升高。的确，MazE多肽突变体及其功能性片段是第一个本发明表征出能够实现核糖核酸内切酶活性增加并且实现核糖核酸内切酶底物切割增加的分子。示例性的能够实现核糖核酸内切酶底物切割增加的MazE多肽包括，但是不止限于，在C端MazF相互作用结构域、MazE 38到75号残基、Hp-Box或者Leu55或Leu68(或者其同源位置)包含突变的MazE多肽，其中这样的突变降低或者抑制了MazE结合MazF的能力。示例性的能够实现核糖核酸内切酶底物切割提高的MazE片段包括，但是不止限于，包含突变的MazE片段，所述突变降低或者抑制了MazE片段结合MazF的能力。这些包含这种突变的MazE片段包括，但是不止限于，C端MazF相互作用结构域或MazE的38-75号残基区域。已知降低或者抑制MazE片段结合MazF能力的示例性的残基突变包括在Leu55和Leu58的突变。这种MazE突变体多肽和片段在这里可以被称为具有显性失活活性。一般地，显性失活多肽用于降低或者抑制相应的野生型多肽的活性，因为它们仍然能够结合并因此竞争底物和/或相互作用蛋白或者分子，但是其野生型的功能至少受到了部分削弱。本发明还包含了SEQ ID NO7编码的PemI多肽、编码包含SEQ ID NO8的PemI多肽的核酸序列以及它们的功能性片段，以及包含SEQ ID NO8的PemI多肽及其功能性片段。正如这里所描述的，PemI多肽及其功能性片段显示了调节PemK活性的能力。能够调节PemI活性以及PemK活性的示例性的PemI功能性片段包括N端DNA结合结构域以及C端PemK相互作用结构域。参见这里下面的实施例IV。因此，在一个实施方案中，本发明的PemI多肽和PemI功能性片段抑制了PemK的活性。在一个特别的方面，本发明的PemI多肽或者PemI功能性片段抑制了PemK核糖核酸内切酶活性或者实现了核糖核酸内切酶活性的降低。的确，PemI及其功能性片段是本发明首先研究的分子，这里表明其能够实现核糖核酸内切酶活性的降低，因而实现了核糖核酸内切酶底物切割的降低。在另一个实施方案中，涉及了能够抑制PemI活性的突变形式的PemI多肽或者其衍生物或者其片段。这种PemI突变体多肽以及片段可以在这里被称为具有显性失活活性。一般地，显性失活多肽用于降低或者抑制相应的野生型多肽的活性，因为它们仍然能够结合并因此竞争底物和/或相互作用蛋白或者分子，但是其野生型的功能至少受到部分削弱。由于PemI通常与PemK结合，因此抑制了其毒性作用，阻止PemI介导的对PemK的抑制可以将PemK从这个负调控中释放出来。因此，抑制PemI活性导致PemK活性的增加。C.鉴定能够调节MazF活性的化合物的一般方法大肠杆菌染色体MazE/MazF上瘾组件的结构被确定到1.7埃的分辨率(Kamada et al.，Mol Cell 11，875-884(2003))。正如这里所描述的，上瘾组件由控制细菌细胞死亡的稳定的毒素和不稳定的解毒剂蛋白组成。MazE(解毒剂)和MazF(毒素)形成一个线形的异六聚体，由毒素和解毒剂同二聚体交替组成(MazF2-MazE2-MazF2)。Kamada et al.表明MazE同二聚体含有一个β桶，从β桶延伸出两个C端，与两侧的MazF同二聚体相互作用。这种相互作用与质粒编码的毒素CcdB和Kid之间的相互作用相似。MazE/MazF异六聚体结构证明了染色体和质粒携带的上瘾组件具有共同的解毒剂-毒素识别机制，对毒素作用、在没有毒素时解毒剂的降解以及解毒剂/毒素复合物与启动子DNA的结合提供了一般的分子认识。根据这里提出的信息，MazE中适宜的肽靶标包括，但是不止限于，那些下面列出的残基和区域。MazE中适宜的肽靶标包括N-box，MazE中高度保守的N端区域(它从残基7到残基18，介导与DNA结合)，以及其中的关键残基。MazE的N-box中的关键残基包括K7A，R8A，S12A和R16A，这些残基的突变破坏了MazE和MazE-MazF复合物的DNA结合能力。MazE中从残基53到64的保守C端区域Hp-Box，富含疏水残基，也是适宜的用于基于肽的治疗法的靶标。Hp-box区域参与了MazE和MazF之间看起来最稳定的界面。Hp-box中疏水氨基酸残基的侧链(Leu55，Leu58，Val59和Ile62)与MazF同二聚体中的一簇疏水残基相互作用。根据这里提出的信息，MazF中适宜的肽靶标包括，但是不止限于，那些下面列出的残基和区域。MazF中适宜的肽靶标包括R29S，N40D，T52K，Q77H，R86G，I110N，E24A和K79A残基以及包含这些关键残基的小肽(例如包含这些残基以及其侧翼残基的5-10个残基的肽)。在本发明的一个实施方案中，2∶4 MazE/MazF复合物及其结构组分的晶体结构(Kamada et al.，同上)，以及在MazE和MazF之间发现的界面，被作为靶标，在一个虚拟的配基筛选步骤中，通过计算机对驳方法，从一个庞大的化合物文库中鉴定出能够以高度亲和性结合靶位点的候选化合物。在另一个实施方案中，MazE/MazF复合物(Kamada et al.，同上)及其组分的结构信息以及在MazE和MazF之间发现的界面，被用于设计化合物，这些化合物预计与MazF和/或MazE/MazF的界面结合，并检测这些化合物是否具有高的亲和结合性。在特定的实施方案中，选择对MazF与RNA的结合有调节作用的候选化合物和“设计的化合物”。这些化合物可以提高或者抑制MazF与RNA的结合。这种化合物可以实现底物(即RNA)切割的增加或者减少。然后对来源于任意一种方法并在对驳步骤中评分最高的化合物进行基于细胞的和无细胞的试验(在下面描述)，以确定其调节MazF活性的效力。然后将任何在生物试验中显示效力的化合物与MazF共结晶，以发现结合位点。在本发明的另一个实施方案中，能够结合MazF的候选化合物被本领域内已知的方法修饰，进一步提高特异性质，例如提高效力和/或特异性和/或可溶性。选出的显示最合需要性质的化合物被指定为先导化合物，在例如具有过度增生性疾病的动物模型中进一步检测其效力。D.鉴定能够调节PemK活性的化合物的一般方法根据这里提出的信息，PemI中适宜的肽靶标包括，但是不止限于，那些下面列出的残基和区域。PemI中适宜的肽靶标包括在PemI多肽家族的成员中保守的区域。根据这里提出的信息，PemK中适宜的肽靶标包括，但是不止限于，那些下面列出的残基和区域。在β链S1和S2之间的保守环(命名为S1-S2环)以及其中的残基是适宜的肽靶标。参见图33和34获得保守区域的氨基酸序列比对以及其中的氨基酸序列。在本发明的一个实施方案中，2∶4 MazE/MazF复合物及其结构组分的晶体结构(Kamada et al.，同上)，以及在MazE和MazF之间发现的界面，可以用于检查PemI/PemK复合物。因此，这些推断可以在一个虚拟的配基筛选步骤中，通过计算机对驳方法，从一个庞大的化合物文库中鉴定出能够以高度亲和性结合靶位点的候选化合物。在另一个实施方案中，MazE/MazF复合物(Kamada et al.，同上)及其组分的结构信息以及在MazE和MazF之间发现的界面，可以用于检查PemI/PemK复合物。因此，这些推断可以用于设计化合物，这些化合物预计与PemK和/或PemI/PemK界面结合，并检测这些化合物是否具有高的亲和结合性。在特定的实施方案中，选择对PemK与RNA的结合有调节作用的候选化合物和“设计的化合物”。这些化合物可以提高或者抑制PemK与RNA的结合。这种化合物可以实现底物(即RNA)切割的增加或者减少。然后对来源于任意一种方法并且在对驳步骤中评分最高的化合物进行基于细胞的和无细胞的试验(在下面描述)，以确定其调节PemK活性的效力。然后可将任何在生物试验中显示效力的化合物与PemK共结晶，以鉴定结合位点。在本发明的另一个实施方案中，能够结合PemK的候选化合物被本领域内已知的方法修饰，进一步提高特异性质，例如提高效力和/或特异性和/或可溶性。选出的显示最合需要性质的化合物被指定为先导化合物，在例如具有过度增生性疾病的动物模型中进一步检测其效力。通过弹性对驳技术(Flexible Docking Technology)进行的虚拟配基筛选目前的对驳和筛选方法可以使用一个特异的蛋白质结构从大的化合物文库中选择少量可能的先导候选配基。这种方法在例如Abagyan和Totrov(2001)Current Opinion Chemical Biology 5375-382中有所描述，这里将其全部引用作为参考。基于高通量弹性对驳的虚拟配基筛选(VLS)在设计和鉴定能够与某个特定蛋白结构结合的化合物时是有用的。VLS可以用于虚拟地从大量化学分子中取样而不需要合成和在实验中检测每一个化学分子。一般地，该方法从多肽建模开始，它使用通过常规方式例如X射线晶体衍射、NMR、同源建模选择的蛋白质结构。然后使用任何一种现有的对驳程序，例如MCDOCK(Liu et al.(1999)J.Comput.AidedMol.Des.13435-451)，SEED(Majeux et al.(1999)Proteins 3788-105；DARWIN(Taylor et al.(2000)Proteins 41173-191；MM(David et al.(2001)J.Comput.Aided Mol.Des.15157-171，将一组化合物和/或分子片段对驳到选择的结合位点中。将化合物按照配基评分，产生一系列预计具有最高结合亲和性的候选化合物，用于在体外和体内进一步检测和/或化学修饰。在VLS的一种方法中，在化学制备之前，将分子“建造”到选择的结合口袋中。设计了大量的程序用于一个原子接着一个原子“生长”配基[参见例如GENSTAR(Pearlman et al.L(1993)J.Comput.Chem.141184)，LEGEND(Nishibata et al.(1993)J.Med.Chem.362921-2928)，MCDNLG(Rotstein et al.(1993)J.Comput-AidedMol.Des.723-43)，CONCEPTS(Gehlhaar et al.(1995)J.MedChem 38466-472]或者一个片段接着一个片段“生长”配基[参见例如GROUPBUILD(Rotsein et al.(1993)J.Med.Chem.361700-1710)，SPROUT(Gillet et al.(1993)J.Comput.Aided Mol.Des.7127-153)，LUDI(Bohm(1992)J.Comput.Aided Mol.Des.661-78)，BUILDER(Roe(1995)J.Comput.Aided Mol.Des.9269-282)，和SMOG(DeWitte et al.(1996)J.Am.Chem.Soc.11811733-11744]。对于一个特定蛋白的配基的评分方法是已知的，其可以将少量的能够结合蛋白质结构的分子与大量的非结合物区别开来。参见，例如，Agagyan et al.(2001)同上，关于通过虚拟配基对驳和筛选方法鉴定出的大量成功配基的报告。例如，Nishibata et al.(1993)J.Med.Chem 362921-2928描述了一个结构构建程序根据一个分子(二氢叶酸还原酶)活性位点的三维结构产生抑制性分子的能力。该程序能够预测具有与四个已知的酶抑制剂相似结构的分子，提供有力的支持，即为使用靶三维结构的知识获得新型先导化合物提供了有力支持。类似地，Gilletet al.(1993)J.Computer Aided Mol.Design 7127-153描述了通过基于空间限制的人工智能技术(SPROUT)产生的结构。通过本发明的筛选方法鉴定的因子本发明提供了鉴定以高度亲和性与mRNA干扰酶(例如MazF或PemK)或mRNA干扰酶抑制剂(例如MazE或PemI)结合的因子(例如候选化合物或者测试化合物)的方法。通过本发明的方法鉴定出的因子可以作为抗过度增生性疾病和抗细菌治疗方法的候选因子。因子、候选化合物或者测试化合物的示例包括，但是不止限于，核酸(例如DNA和RNA)、糖、脂、蛋白质、肽、肽模拟物、小分子以及其他药物。可以使用本领域内已知的组合库中多种方法中的任何一种方法得到因子，包括生物文库，空间可定位平行固相或者液相文库；需要进行反卷积的合成文库方法；“一珠一化合物(one-head one-compound)”文库方法；以及使用亲和层析选择的合成文库方法。生物文库方法限于肽文库，而其他四种方法可以用于肽、非肽寡聚物或者小分子化合物文库(Lam(1997)Anticancer Drug Des.12145；美国专利编号5,738,996；和美国专利编号5,807,683,在这里分别以其整体引用作为参考)合成分子文库的方法的示例可以在本领域内找到，例如在DeWitt et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906909；Erbet al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9111422；Zuckermannet al.(1994)J.Med.Chem.372678；Cho et al.(1993)Science2611303；Carrell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332059；Carell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332061；以及Gallop et al.(1994)J.Med.Chem.371233中，每一个文献在这里以其整体引用作为参考。化合物文库可以存在于例如溶液中(例如Houghten(1992)Bio/Techniques 13412-421)，或存在于珠上(Lam(1991)Nature35482-84)、存在于芯片上(Fodor(1993)Nature 364555-556)、存在于细菌中(美国专利编号5,223,409)、存在于孢子中(美国专利编号5,571,698；5,403,484；和5,223,409)、存在于质粒中(Cull et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 891865-1869)或者存在于噬菌体中(Scott and Smith(19900 Science249386-390；Devlin(1990)Science 249404-406；Cwirla et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 876378-6382；and Felici(1991)J.Mol.Biol.222301-310)，每一个文献在这里以其整体引用作为参考。筛选试验通过上面描述的虚拟配基对驳和筛选方法鉴定的小分子，进一步进行体外和体内试验。在一个实施方案中，通过基于细胞的检测系统鉴定出与mRNA干扰酶(例如MazF或PemK)或者mRNA干扰酶抑制剂如MazE或PemI相互作用(即结合)的因子。为了清楚和简洁的目的，使用MazF和MazF片段描述这些检测的剩余部分，但是应当理解这些检测/方法还可以应用于其他的mRNA干扰酶及其片段，例如MazE和MazE片段，PemK和PemK片段，以及PemI和PemI片段。根据该实施方案，表达MazF或者其功能性片段的细胞与候选化合物或者对照化合物接触，测定候选化合物与MazF相互作用的能力。如果需要，可以用这种检测来筛选多个(例如一个文库)的候选化合物。细胞可以是原核来源的(例如大肠杆菌)或者真核来源的(例如酵母或者哺乳动物)。而且，细胞可以内源表达MazF或者其片段，或者经过基因工程改造表达MazF或者其片段。在某些情况中，MazF或者MazF片段被标记，例如使用放射性标记(例如32P，35S或者125I)，或者使用荧光标记(例如异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红素、藻蓝素、别藻蓝素、邻苯二醛或者荧光胺)，使得MazF和候选化合物之间的相互作用能够被检测到。候选化合物与MazF的相互作用使用本领域内技术人员已知的方法进行测定。例如候选化合物与MazF的相互作用可以使用细胞流式仪、闪烁检测法、免疫沉淀或者Western印迹分析。在另一个实施方案中，使用无细胞的检测系统，鉴定与MazF或者其相关片段相互作用(即结合)的因子。根据该实施方案，天然或者重组的MazF或者其片段与候选化合物或者对照化合物接触，测定候选化合物与MazF相互作用的能力。如果需要，可以用这种检测来筛选多个(例如一个文库)候选化合物。在一个实施方案中，首先将MazF或者其片段固定化(通过例如与特异识别并且结合MazF或者其片段的固定化抗体接触，或者通过使纯化的MazF或者其片段的制备物与一个设计用于结合蛋白的表面接触)。MazF或者其片段可以部分或者完全纯化(即部分或者完全没有其他多肽)或者是细胞裂解物。此外，MazF或者其片段可以是融合蛋白，该融合蛋白包含MazF或者其生物活性部分以及结构域例如谷胱甘肽-S-转移酶。或者MazF或其生物活性部分可以使用本领域内技术人员众所周知的方法进行生物素化(例如生物素化试剂盒，Pierce Chemicals；Rockford，IL)。候选化合物结合MazF的能力使用本领域内技术人员已知的方法进行测定。在另一个实施方案中，在动物模型中鉴定调节MazF活性的因子。适宜动物的示例包括，但是不止限于，小鼠、大鼠、兔、猴子、豚鼠、狗以及猫。优选地，使用的动物代表过度增生性疾病的模型。根据该实施方案，向适宜的动物给服待测化合物或者对照化合物(例如口服、直肠给药、非肠道给药例如腹膜内或者静脉内)，测定对活性水平的效果。E.能够结合mRNA干扰酶的因子或者mRNA干扰酶抑制剂的治疗性用途本发明提供了通过给予使用以上描述的方法鉴定的治疗性化合物，治疗过度增生性疾病。这种化合物包括，但是不止限于，蛋白质、肽、蛋白质或肽的衍生物或者类似物、抗体、核酸和小分子。本发明提供了治疗受到过渡增殖疾病困扰的患者的方法，该方法包括向受试对象施用有效量的通过本发明的方法鉴定的化合物。在一个优选的方面，化合物是基本纯化的(例如基本没有限制该化合物的作用或者产生不希望的副作用的物质)。受试对象优选是动物，包括但是不止限于，奶牛、猪、马、鸡、猫、狗等等，优选是哺乳动物，最优选是人。在一个特定的实施方案中，非人的哺乳动物是受试对象。当化合物包含核酸时可以使用的制剂和给药方法如上面所描述；其他适当的制剂和给药途径在下面描述。已知各种不同的递送系统可以用于施用本发明的化合物，例如包裹在脂质体、微粒、微胶囊中，能够表达化合物的重组细胞，受体介导的细胞内吞作用(参见例如Wu and Wu(1987)J.Biol.Chem.2624429-4432)，以及将核酸构建为逆转录病毒或者其他载体的一部分。导入方法可以是肠内或者肠胃外的途径，包括但是不止限于，皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。化合物可以通过任何方便的途径进行施用，例如灌注或者弹丸式注射，通过经上皮或者粘膜层(例如口腔粘膜、直肠粘膜和小肠粘膜等)的吸收，也可以与其他的生物活性因子一同施用的。给药可以是全身或者局部的。此外，可能需要将本发明的药物组合物通过任何适宜的途径引入中枢神经系统中，包括心室内和鞘内注射；可以通过例如与一个贮器(如Ommaya贮器)相连的心室内导管帮助心室内注射。也可以使用肺部给药，例如通过使用吸入器或者雾化器，和具有气溶胶化试剂的制剂。在一个特定的实施方案中，可能需要将本发明的药物组合物局部给药，例如通过在手术中的局部灌注，局部应用，例如通过注射，借助于导管，借助于移植物，所述的移植物是多孔的、非多孔的或者明胶状的材料，包括膜如sialastic膜，或者纤维)。在一个实施方案中，给药可以通过直接注射到CSF中或者在肿瘤部位(例如，在CNS组织中)。在另一个实施方案中，可以用载体，特别是脂质体递送化合物(参见Langer(1990)Science 2491527-1533；Treat等人，Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein和Fidler(eds.)，Liss，New York，pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein，同上，pp.317-327；参见一般的，同上)在另一个实施方案中，化合物可以在受控释放系统中递送。在一个实施方案中，可以使用泵(参见Langer，见前；Sefton(1987)CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14201；Buchwald等人(1980)Surgery 88507；Saudek等人，1989，N.Engl.J.Med.321574)。在另一个实施方案中，可以使用聚合物材料(参见MedicalApplications of Controlled Release，Langer和Wise(eds.)，CRCPres.，Boca Raton，Florida(1974)；Controlled DrugBioavailability，Drug Product Design and Performance，Smolen和Ball(eds.)，Wiley，New York(1984)；Ranger和Peppas，J.，1983，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.2361；还参见Levy等人(1985)Science 228190；During等人(1989)Ann.Neurol.25351；Howard等人(1989)J.Neurosurg.71105)。在另一个实施方案中，可以将受控释放系统置于治疗靶(即靶组织或者肿瘤)附近，这样需要的剂量只是全身剂量的一部分(参见例如Goodson，MedicalApplications of Controlled Release，见前，vol.2，pp.115-138(1984))。其他的受控释放系统在Langer的综述(1990，Science 2491527-1533)中有讨论。F.药物组合物本发明还提供了药物组合物。这种组合物包含治疗有效量的因子以及药物上可以接受的载体。在一个特殊的实施方案中，术语“药物上可以接受的”意思是由联邦或者州政府的管理机构批准或者在美国药典或者其他一般承认的药典中列出用于动物，更为特别地用于人类。术语“载体”指的是与治疗药物一同施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或者载体(Vehide)。这些药物载体可以是无菌的液体，例如水或者油，包括石油、动物油、植物油或者合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。当药物组合物通过静脉内施用时，水是优选的载体。盐溶液和含水的葡萄糖和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是对于注射用的溶液。适宜的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠，干的脱脂奶、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等等。如果需要的话，组合物还可以含有少量的润湿剂或者乳化剂或者pH缓冲剂。这些组合物的形式可以是溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释制剂等等。组合物还可以配制为栓剂，带有传统的粘合剂和载体如三甘油酯。口服制剂可以包括标准的载体，例如药物级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等等。适宜的药物载体的示例在E.W.Martin的″Remington′s PharmaceuticalSciences″中有所描述，在这里以其整体引用作为参考。这些组合物含有药物有效量的组合物，优选以纯化的形式，以及适宜量的载体，以提供用于向受试对象正确给药的形式。制剂应当适合于给药的方式。在一个优选的实施方案中，组合物根据常规的步骤配制为适于向人进行静脉注射的药物组合物。通常用于静脉给药的组合物是在无菌等渗含水缓冲剂中的溶液。在必要的时候，组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂如利多卡因以缓解注射部位的疼痛。一般的，这些成分分开供应或者混合在一起以单位剂量形式供应，例如以密封在标明活性因子量的气密型容器(如安瓿或者小药囊(sachette))的干燥冻干粉末或者无水浓缩物的形式。如果组合物通过灌注给药时，可以使用含有无菌的药物级别的水或者盐水的输液瓶进行配药。如果组合物通过注射给药时，可以提供一安瓿的注射用无菌水或者盐水，以使成分可在给药前混合。本发明的化合物可以配制成中性或者盐的形式。药物上可以接受的盐包括那些由游离氨基基团形成的盐，例如盐酸盐、磷酸盐、乙酸盐、草酸盐、酒石酸盐等等，以及那些由游离羧基基团形成的盐，其例如为源自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺，2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等等的盐。可以通过基于本描述的标准临床技术确定对于治疗过度增生性疾病(例如癌症)有效的本发明化合物的量。此外，还可以可选地进行体外测定，帮助确定最佳的剂量范围。在制剂中使用的精确剂量还取决于给药途径以及疾病或者病症的严重程度，应该根据医师的判断以及每一个受试对象的情况确定。但是，用于静脉内给药的适宜剂量范围一般是每千克体重大约20-500微克的活性化合物。用于鼻内给药的适宜剂量范围一般是每千克体重大约0.01皮克-1毫克。栓剂含有的活性成分的范围一般是0.5重量％-10重量％；口服制剂优选地含有10％-95％的活性成分。可以根据来自体外或者动物模型测试系统的剂量-响应曲线外推出有效的剂量。核酸本发明提供了鉴定能够结合mRNA干扰酶(例如MazF或者PemK)的因子以实现mRNA干扰酶的核糖核酸内切酶活性增加的方法。因此，本发明包括施用核酸，该核酸编码mRNA干扰酶或者其直向同源物的肽或蛋白质激活剂，以及能够干扰mRNA干扰酶(例如MazE或PemI)或者其直向同源物的内源抑制剂表达的反义序列或者催化性RNA。在一个实施方案中，所施用的核酸包含的序列编码能够竞争结合mRNA干扰酶的肽或者蛋白质。本领域内可利用的任何用于施用核酸序列的适宜方法都可以根据本发明进行使用。施用和表达核酸序列的方法在基因治疗领域中一般是已知的。对于基因治疗方法的一般性综述，参见Goldspiel et al.(1993)Clinical Pharmacy 12488-505；Wu and Wu(1991)Biotherapy 387-95；Tolstoshev(1993)Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32573-596；Mulligan(1993)Science 260926-932；以及Morgan andAnderson(1993)Ann.Rev.Biochem.62191-217；May(1993)TIBTECH 11(5)155-215.重组DNA技术领域中通常已知的、可以用于本发明的方法在Ausubel et al.(eds.)，1993，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY；和Kriegler(1990)Gene Transfer and Expression，A LaboratoryManual，Stockton Press，NY，中予以描述。在一个特殊方面，化合物包含的核酸编码能够结合mRNA干扰酶以实现mRNA干扰酶核糖核酸内切酶活性增加的肽或者蛋白质，这种核酸是在适宜的宿主中表达肽或者蛋白质的表达载体的一部分。特别地，这种核酸具有与编码区域有效连接的启动子，所述的启动子是可诱导的或者是组成型的(以及选择性地，组织特异的)。在另一个特别的实施方案中，使用了核酸分子，其中的编码序列和任何其他所需的序列被促进在染色体中的所需位点处发生同源重组的区域包围，这样提供了核酸的染色体内表达(Koller和Smithies(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935；Zijlstra et al.(1989)Nature 342435-438)。可以直接将核酸递送到受试对象的体内，这时受试对象与核酸或者携带核酸的载体直接接触，这种方式被称为体内基因治疗。可选择地，核酸递送到受试对象的体内是间接的，这时首先在体外用核酸转化细胞，然后将细胞移植到受试对象体内，这被称为“离体基因治疗”。在另一个实施方案中，核酸在体内直接施用，在体内其表达产生编码的产物。这可以通过本领域内已知的多种方法中的任何一种来实现，例如通过将核酸构建为适当的核酸表达载体的一部分并施用之，这样核酸就成为细胞内的，例如通过使用缺陷的或者减毒的逆转录病毒或者其他病毒载体感染(参见美国专利号4,980,286)；通过使用裸露的DNA直接感染；通过使用微粒轰击(例如基因枪；Biolistic，Dupont)；通过使用脂类、细胞表面受体或者转染剂包被；通过使用脂质体、微粒或者微胶囊包裹；通过将核酸连接在已知进入到细胞核内的肽上；或者将核酸与配基连接，该配基会经历受体介导的内吞作用(参见例如Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.2624429-4432)，这可以用于靶向特异表达该受体的细胞类型。在另一个实施方案中，可以形成核酸-配基复合物，其中的配基包含融合病毒肽，以破坏内体，使核酸避免被溶酶体降解。在另一个实施方案中，可以通过靶向一个特异的受体，在体内使得核酸能够达到细胞特异的摄取和表达(参见例如PCT出版物WO 92/06180，1992-4-16(Wu et al.)；WO92/22635，1992-12-23(Wilson et al.)；WO92/20316，1992-11-26(Findeis et al.)；WO93/14188，1993-7-22(Clarke et al.)，WO93/20221，1993-10-14(Young))。可选择地，将核酸引入细胞内，通过同源重组整合在宿主细胞DNA中以用于表达(Koller和Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA868932-8935；Zijlstra et al.(1989)Nature 342435-438)。在另一个实施方案中，可以使用逆转录病毒载体(参见Miller et al.(1993)Meth.Enzymol.217581-599)。已经对这些逆转录病毒载体进行了修饰，删除了病毒基因组包装和整合进入宿主细胞DNA中不必需的逆转录病毒序列。编码将要在基因治疗中使用的mRNA干扰酶的核酸被克隆到载体中，这有利于将基因递送到受试对象中。关于逆转录病毒载体的更多细节可以在Boesen et al.(1994)Biotherapy 6291-302中找到，它描述了使用逆转录病毒载体将mdr1基因递送到造血干细胞中，目的是使干细胞对化疗更有抵抗力。阐释逆转录病毒载体在基因治疗中的用途的其他参考文献有Clowes et al.(1994)J.Clin.Invest.93644-651；Kiem et al.(1994)Blood831467-1473；Salmons和Gunzberg(1993)Human Gene Therapy 4129-141；以及Grossman和Wilson(1993)Curr.Opin.in Geneticsand Devel.3110-114。还可以在基因治疗中有效地使用腺病毒。腺病毒在将基因递送到呼吸道上皮方面是有特别有吸引力的载体。腺病毒天然感染呼吸道上皮并导致轻度疾病。基于腺病毒的递送系统的其他靶标有肝脏、中枢神经系统，上皮细胞和肌肉。腺病毒的优点是能够感染非分裂细胞。Kozarsky和Wilson(1993)Current Opinion in Genetics andDevelopment 3499-503综述了基于腺病毒的基因治疗。Bout et al.(1994)Human Gene Therapy 53-10证明了腺病毒载体对于将基因转移到恒河猴的呼吸道上皮中的用途。在基因治疗中使用腺病毒的其他实例可以在以下文献中找到Rosenfeld et al.(1991)Science 252431-434；Rosenfeld et al.(1992)Cell 68143-155；Mastrangeliet al.(1993)J.Clin.Invest.91225-234；PCT出版物WO94/12649；和Wang，et al.(1995)Gene Therapy 2775-783。已经有人建议将腺伴随病毒(AAV)用于基因治疗(Walsh et al.(1993)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204289-300；美国专利号5,436,146)。另一个基因治疗的适宜方式包含通过诸如电穿孔、脂转染、磷酸钙介导的转染或者病毒感染的方法将转移到组织培养的细胞中。通常，转移的方法包括将选择标记转移到细胞中。然后将细胞置于选择压力下，以分离那些摄取并表达了转移的基因的细胞。然后将那些细胞递送到受试对象中。在该实施方案中，将核酸引入到细胞中，然后将得到的重组细胞进行体内施用。这种核酸的引入可以通过本领域内任何已知的方法进行，包括但是不止限于，转染、电穿孔、微注射、使用含有核酸序列的病毒或者噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合等等。对于将外源基因引入细胞中，在本领域内已知有许多技术(参见例如Loeffler和Behr(1993)Meth.Enzymol.217599-618；Cohen et al.(1993)Meth.Enzymol.217618-644；Cline(1985)Pharmac.Ther.2969-92)，它们可以根据本发明使用，条件是受体细胞必需的发育和生理功能不受到破坏。该技术应该将核酸稳定转移至细胞中，这样核酸可以被细胞表达，优选地，可被该细胞的后代继承和表达。可以通过本领域内已知的各种不同方法将产生的重组细胞递送到受试对象中。在一个优选的实施方案中，例如通过皮下注射上皮细胞。在另一个实施方案中，将重组皮肤细胞作为皮肤移植物施加到受试对象上；重组血细胞(例如造血干细胞或者始祖细胞)优选地通过静脉内施用。预计使用的细胞量取决于所需的作用、受试对象的状况等等，并且可以由本领域的技术人员确定。可以将核酸引入以用于基因治疗的细胞包括任何所需的，可获得的细胞类型，包括但是不止限于神经元细胞、神经胶质细胞(例如少突胶质细胞、星形胶质细胞)、上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、肝细胞；血细胞例如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红粒细胞、巨核细胞、粒细胞；各种不同的干细胞或者始祖细胞，特别是造血干细胞或者始祖细胞，例如从骨髓、脐带血、外周血或者胎儿肝脏中获得的那些。在一个优选的实施方案中，用于基因治疗的细胞是接受治疗的受试对象的自体细胞。在另一个实施方案中，将要引入以用于基因治疗的核酸可以包含与编码区域有效连接的可诱导启动子，使得核酸的表达可以通过调整适当的转录诱导物的浓度来控制。直接注射编码能够结合mRNA干扰酶的肽或蛋白质的DNA或者能够干扰mRNA干扰酶(例如，MazE或PemI，或其直向同源物)的内源抑制剂表达的因子，可以根据例如美国专利号5,589,466中描述的技术进行。这些技术包括注射“裸露的DNA”，即除了适宜的载体以外没有脂质体、细胞或者任何其他材料的分离的DNA分子。注射编码蛋白质并与适宜的启动子有效连接的DNA，使该蛋白质在邻近注射部位的细胞中产生。G.试剂盒本发明还提供了药物包或者试剂盒，该药物包或者试剂盒包含一个或者多个容器，容器中装有本发明药物组合物的一种或者多种成分。这种容器可选地附带的可以是管理药物或者生物制品的生产、使用或者销售的政府机构规定的通告，通告上表明(a)经过生产、使用和销售的机构批准，用于人体施用，(b)使用说明，或两者。提出以下的实施例，为本领域内具有普通技术的人员提供关于如何制备和使用本发明的检测、筛选以及治疗方法的完整的公开和描述，并不是要限制发明者所认为的他们的发明的范围。已经投入力量确保所用数目(例如量，温度等等)的准确性，但是应当解释一些实验错误和偏差出现的原因。除非有其他说明，份是重量份，分子量是平均分子量，温度是摄氏度，压力为大气压或者接近大气压。提供以下的实验方案，以有助于本发明的实施。
实施例I正如这里描述的，使用甲苯处理使大肠杆菌细胞通透化，并将这些细胞用于证明MazF抑制翻译，但是对RNA合成或者DNA复制没有抑制。而且显示出，MazF在ACA序列的A和C残基之间以不依赖于核糖体的方式特异切割mRNA。因此，本发明证明了MazF通过在特异位点切割mRNA而干扰mRNA的功能。因此，本发明的发明者发现MazF是新型的核糖核酸内切酶，在这里将其命名为“mRNA干扰酶”。材料和方法菌株和质粒。使用了大肠杆菌BL21(DE3)、BW25113(Datsenko和Wanner，Proc Natl Acad Sci USA 97，6640-5(2000))和MRE600(Swaney et al.，Antimicrob Agents Chemother 42，3251-5(1998))。从质粒pET-21cc(Novagen)构建质粒pET-21cc-MazEF，其被修饰成在T7启动子的控制下表达MazE和MazF(His)6。但是Shine-Dalgarno(SD)序列来自mazEF操纵子。使用pET-28a(Novagen)构建质粒pET-28a-MazE，以表达(His)6MazE。使用pBAD(Guzman et al.，J Bacteriol 177，4121-30(1995))构建pBAD-MazF，以在加入0.2％阿拉伯糖后严谨地调控mazF的表达。甲苯处理的细胞中的蛋白质、DNA和RNA合成的检测。50毫升含有质粒pBAD-MazF的大肠杆菌BW25113培养物在甘油-M9培养基中于37摄氏度生长。当培养物的OD600达到0.6时，加入阿拉伯糖使终浓度为0.2％。于37摄氏度孵育10分钟后，用1％甲苯处理细胞(Halegoua et al.，Eur J Biochem 69，163-7(1976))。根据以前的描述使用35S-甲硫氨酸进行蛋白质合成(Halegoua et al.，JBacteriol 126，183-91(1976))。甲苯处理的细胞在室温下用0.05M磷酸钾缓冲液(pH 7.4)洗一次，然后重悬于同一缓冲液中，以根据以前的描述用[α-32P]dTTP检查DNA的合成(Moses和Richardson，ProcNatl Acad Sci USA 67，674-81(1970))。对于RNA合成的检测，甲苯处理的细胞在室温下用0.05M Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)洗一次，然后重悬于同一缓冲液中，以根据以前的描述测量[α-32P]UTP向RNA中的掺入(Peterson et al.，J Bacteriol 107，585-8(1971))。体内蛋白质合成的检测。含有pBAD-MazF的大肠杆菌BW25113细胞生长在甘油-M9培养基中。当培养物的OD600达到0.6时，将其分成两等份。其中一份中加入阿拉伯糖至终浓度为0.2％，第二份中加入水。以在图2D中所示的不同时间间隔，取出1毫升的培养物至含有2μCi35S-甲硫氨酸的试管中，混合物在37摄氏度孵育1分钟。然后将50微升反应混合物施加于一个滤纸盘(Whatman 3mm，2.3厘米直径)上。根据以前的描述(Hirashima和Inouye，Nature 242，405-7(1973))用5％TCA溶液处理滤纸，并用液闪计数器定量测定放射性。剩余的500微升反应混合物加入到含有25微升100％TCA溶液和100微克/毫升非放射性甲硫氨酸的冷却的试管中。混合物在冰浴上孵育60分钟。离心后收集沉淀，通过将混合物在沸水浴中孵育30分钟而溶解在50微升的SDS-PAGE上样缓冲液中。除去不溶的物质以后，将上清液(10微升)通过SDS-PAGE进行分析。MazF(His)6和(His)6MazE蛋白的纯化。从携带pET-21cc-MazEF的菌株BL21(DE3)中纯化C末端标记的MazF(His)6。首先用Ni-NTA树脂纯化MazF(His)6和MazE复合物。用6M盐酸胍将MazE从MazF(His)6上解离下来以后，在Ni-NTA树脂上重新纯化，并通过逐步透析而使蛋白质重折叠。从携带pET-28a-MazE的菌株BL21(DE3)中纯化N端标记的(His)6MazE。MazF对于原核和真核无细胞系统中蛋白质合成的影响。使用大肠杆菌T7 S30提取物系统(Promega)进行原核无细胞蛋白质合成。反应混合物由10微升S30预混合物、7.5微升S30提取物和2.5微升的氨基酸混合物(除甲硫氨酸以外，每种氨基酸1mM)。1微升35S-甲硫氨酸、以及不同量的MazF(His)6和(His)6MazE组成，终体积为24微升。反应混合物在37摄氏度孵育10分钟，通过加入1微升pET-11a-MazG质粒-DNA(0.16微克/微升)开始检测(Zhang和Inouye，J Bacteriol 184，5323-9(2002))。反应在37摄氏度进行1小时，用丙酮沉淀蛋白，并通过SDS-PAGE进行分析。使用用于PCR DNA兔网织红细胞裂解物系统TNT T7 Quick(Promega)进行真核无细胞蛋白质合成。使用编码人蛋白并在T7启动子控制下的DNA片段作为mRNA转录的模板。反应在37摄氏度进行1小时，用丙酮沉淀蛋白，并通过SDS-PAGE进行分析。多核糖体分布图。含有pBAD-MazF质粒的大肠杆菌BW25113的过夜培养物用新鲜的甘油-M9培养基稀释50倍。37摄氏度孵育5小时后，加入阿拉伯糖至终浓度为0.2％。诱导MazF10分钟后加入氯霉素至终浓度为100微克/毫升。离心收集细胞沉淀，重悬于含有10mM MgCl2、60mM NH4Cl、1mM DTT和1毫克/毫升溶菌酶的1毫升10mM Tris-HCl(pH 7.8)中。液氮冻融两次后，在Beckman TLA100.3转子中以24000rpm将裂解物离心20分钟。上清液(300微升)加入到5-40％蔗糖梯度中以获得多核糖体分布图。不加阿拉伯糖进行相似的实验。通过OD280检查核糖体图谱(pattern)，梯度从左(40％)到右(5％)。所指示处加入春日霉素至终浓度为500微克/毫升。大肠杆菌70S核糖体的制备。根据以前的描述(Aoki etal.，Antimicrob Agents Chemother 46，1080-5(2002)；Du和Babitzke，J Biol Chem 273，20494-503(1998)；Hesterkamp et al.，JBiol Chem 272，21865-71(1997))从大肠杆菌MRE 600中制备70S核糖体，有少量改动。细菌细胞(2克)悬浮于缓冲液A[10mM Tris-HCl(pH 7.4)，含有10mM MgCl2，60mM NH4Cl和6mM 2-巯基乙醇]中。用弗氏压碎器裂解细胞。与无RNA酶的DNA酶孵育(0摄氏度30分钟)之后，在Beckman 50Ti转子中以30000rpm于4摄氏度离心30分钟两次以去除细胞碎片。上清液(上面的3/4)加入到等体积的缓冲液B(含有0.5M NH4Cl的缓冲液A)中的1.1M蔗糖中，在Beckman50Ti转子中以45000rpm于4摄氏度离心15小时。核糖体沉淀用缓冲液A漂洗之后，重悬于缓冲液A中，并施加至缓冲液A制备的10-30％(重量/体积)线性蔗糖梯度中，在Beckman SW40Ti转子中以20000rpm于4摄氏度离心15小时。将梯度按级分离，混合70S核糖体级分，并在Beckman 50Ti转子中以45000rpm于4摄氏度离心20小时以使其沉淀。70S核糖体沉淀重悬于缓冲液A中，-80摄氏度储存。引物延伸抑制(趾纹法)检测。根据以前的描述(Moll和Blasi，Biochem Biophys Res Commun 297，1021-1026(2002))进行趾纹法，有小的调整。用于引物模板退火的混合物含有mazG mRNA和32P-末端标记的DNA引物，它与mazG mRNA的65-85碱基互补。将该混合物在65摄氏度孵育5分钟，然后缓慢冷却至室温。核糖体结合混合物含有2微升10×缓冲液[100mM Tris-HCl(pH 7.8)，含有100mM MgCl2，600mM NH4Cl和10mM DTT]，不同量的MazF(His)6，0.375mMdNTP，0.5μM 70S核糖体亚基，2.5μM tRNAfMet和2微升的退火混合物，终体积为20微升。最终的mRNA浓度为0.05μM。核糖体结合混合物在37摄氏度孵育10分钟，然后加入2U逆转录酶。cDNA的合成于37摄氏度进行15分钟。加入12微升测序上样缓冲液来终止反应。样品在90摄氏度孵育5分钟，然后在6％聚丙烯酰胺测序凝胶上进行电泳。使用T7 RNA聚合酶从含有T7启动子的173-bp DNA片段中体外合成mazGmRNA。由T7启动子和从+1至+153的mazG mRNA构成的DNA片段通过使用pET-11a-MazG质粒作为DNA模板的PCR扩增而得到。酚抽提后的mazG mRNA的趾纹法。实验按照以上描述的方法进行，唯一区别是省掉了70S核糖体和tRNAfMet。在引物延伸之前用酚抽提反应混合物以除去蛋白质。突变体质粒的构建。使用pET-11a-MazG质粒作为DNA模板进行定点诱变。通过DNA序列分析对突变进行确证。RNA分离和Northern印迹分析。含有pBAD-MazF的大肠杆菌BW25113在甘油-M9培养基中于37摄氏度生长。OD600值达到0.8时，加入阿拉伯糖至终浓度为0.2％。以如图4D所示的不同间隔取样。根据以前的描述(Sarmientos et al.，Cell 32，1337-46(1983))，使用热酚法分离总RNA。根据以前的描述(Baker和Mackie，MolMicrobiol 47，75-88(2003))进行Northern印迹分析。有关附图的具体的方法学细节如图1A所示，MazF的表达对细胞有毒性作用。使用质粒pBAD-MazF，pBAD-MazF R29S或pBAD-MazF R86G分别转化大肠杆菌BW25113(ΔaraBAD)细胞。细胞涂布在含有和没有阿拉伯糖(0.2％)的甘油-M9平板上，接种了的平板在37摄氏度孵育24小时。图1B显示了大肠杆菌(Escherichi coli)(NP_289336.1)的MazF和耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)(NP_244588.1)，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)(AAG23809.1)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(NP_372592.1)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)(1NE8_A)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)(NP_266040.1)，摩氏摩根氏菌(Morganella morgani)(AAC82516.1)以及结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(NP_217317.1)的MazF的序列比对。图2A显示MazF的表达对35S-Met向甲苯处理的细胞中掺入的影响。具体地，含有pBAD-MazF的大肠杆菌BW25113于37摄氏度在甘油-M9培养基中生长。当培养物的OD600达到0.6时，加入阿拉伯糖至终浓度为0.2％。37摄氏度孵育10分钟后，细胞用甲苯处理(Halegoua et al.，J Bacteriol 126，183-91(1976))。根据以前的描述(Halegoua et al.，Eur J Biochem 69，163-7(1976))，使用甲苯处理的细胞，用35S-甲硫氨酸进行蛋白质合成。图2B显示了MazF对[α-32P]dTTP向甲苯处理的细胞中掺入的影响(Moses和Richardson，Proc Natl Acad Sci USA 67，674-81(1970))。图2C显示了MazF对[α-32P]UTP向甲苯处理的细胞中掺入的影响(Peterson et al.，J Bacteriol 107，585-8(1971))。图2D显示了MazF对35S-Met体内掺入的影响。根据所标明的、在MazF诱导后的不同时刻，测量35S-Met向含有pBAD-MazF的大肠杆菌BW25113细胞中的掺入。图2E显示MazF诱导后体内蛋白质合成的SDS-PAGE分析。在图2E中使用的培养物与图2D中使用的相同。图3A显示了MazF对多核糖体分布图的影响。通过OD260检测核糖体图谱，梯度从左(40％)到右(5％)。70、50和30S核糖体的位置予以标明。图3B阐明了MazF(His)6对原核无细胞蛋白质合成的影响，使用的是大肠杆菌T7 S30提取物系统(Promega)。泳道C，没有MazF(His)6；泳道1-5分别加入77、154、231、308和384nM的MazF(His)6；泳道6-10384nM MazF(His)6，(His)6MazE和MazF(His)6的比例分别是0.1、0.2、0.4、0.8和1.2。图3C显示MazF(His)6对真核无细胞蛋白质合成的影响，使用的是用于PCR DNA的兔网织红细胞裂解物系统TNT T7 Quick(Promega)。泳道1，没有(His)6MazE和MazF(His)6；泳道2，0.66μM MazF(His)6；泳道3，0.9μM(His)6MazE和0.66μM MazF(His)6，(His)6MazE和MazF(His)6的比例是1.2∶1。图4A显示MazF存在时的mazG mRNA的趾纹分析。mRNA从含有T7启动子的173-bp DNA片段，使用T7 RNA聚合酶体外合成。使用pET-11a-MazG质粒DNA经PCR扩增获得所述DNA片段(T7启动子和从+1至+153的mazG mRNA)。泳道1，没有MazF(His)6和70S核糖体；泳道2，有2.6μM MazF(His)6，没有70S核糖体；泳道3，有0.5μM 70S核糖体，没有MazF(His)6；泳道4-8，0.5μM 70S核糖体以及分别含有0.35μM、0.7μM、1.4μM、2.1μM和2.6μM的MazF(His)6。图4B显示了酚抽提后的mazG mRNA的趾纹分析。实验方法与图4A的泳道1和泳道2中描述的方法相同，区别在于反应产物使用酚抽提，以便在引物延伸之前去除蛋白质。泳道1，没有MazF(His)6；泳道2，有2.6μM MazF(His)6。图4C显示了MazE对对mazG mRNA的MazF切割的影响。泳道1，没有MazF(His)6和(His)6MazE；泳道2，有8.8μM(His)6MazE；泳道3，有2.2μM MazF(His)6；泳道4-7，有2.2μM MazF(His)6，(His)6MazE与MazF(His)6的比例分别为0.25，0.4，0.8和1.0。图4D显示MazF在体内对细胞mRNA的影响。在加入阿拉伯糖后的不同时刻(如所标明的)从含有pBAD-MazF的大肠杆菌BW25113细胞中提取总细胞RNA，并进行Northern印迹分析，使用放射性标记的ompA和lpp ORF DNA作为探针。图5表明了春日霉素对多核糖体分布图的影响。根据以上的描述进行实验。通过OD260检测核糖体图谱，梯度从左(40％)到右(5％)。70、50和30S核糖体的位置予以标明。图6显示核糖体对mazG mRNA的MazF切割的抑制。反应根据以上的描述进行。泳道1，没有MazF(His)6和70S核糖体；泳道2，有2.6μM MazF(His)6，但是没有70S核糖体；泳道3，有0.5μM 70S核糖体，但是没有MazF(His)6；泳道4，mazG mRNA和70S核糖体在37摄氏度孵育10分钟，然后向该混合物中加入2.2μMMazF(His)6，并在37摄氏度再孵育10分钟，之后进行引物延伸；泳道5，首先混合70S核糖体和MazF(His)6，并在37摄氏度孵育10分钟，之后加入mazG mRNA，继续在37摄氏度孵育10分钟，之后进行引物延伸；泳道6，mazG mRNA和MazF(His)6混合并在37摄氏度孵育10分钟后，向混合物中加入70S核糖体，继续在37摄氏度孵育10分钟，之后进行引物延伸。FL，全长的mazG mRNA；TP(s)，由于二级结构暂停的位置；TP(F)，由于MazF切割的趾纹位置；TP(r)，由于核糖体与mazG mRNA的结合造成的趾纹位置。图7阐明了mazG mRNA的Shine-Dalgarno序列发生GGAG到UUUG的突变对MazF功能的影响。反应根据上面的描述进行。泳道1-4，野生型mazG mRNA；泳道5-8，突变体mazG mRNA，在Shine-Dalgarno序列发生GGAG到UUUG的突变。泳道1和5，没有MazF(His)6和70S核糖体；泳道2和6，2.6μM MazF(His)6，但是没有70S核糖体；泳道3和7，0.5μM 70S核糖体，没有MazF(His)6；泳道4和8，0.5μM 70S核糖体和2.2μM MazF(His)6。标记的注释在左侧，同图6。图8显示mazG mRNA起始密码子的突变对MazF功能的影响。反应根据以上的描述进行。泳道1-4，野生型mazG mRNA；泳道5-8，突变体mazG mRNA，其起始密码子变为GUG；泳道9-12，突变体mazG mRNA，其起始密码子变为AGG。泳道1、5和9，没有MazF(His)6和70S核糖体；泳道2、6和10，2.6μM MazF(His)6，但是没有70S核糖体；泳道3、7和11，0.5μM 70S核糖体，但是没有MazF(His)6；泳道4、8和120.5μM 70S核糖体和2.2μM MazF(His)6。标记的注释在左侧，同图6。图9显示UACAU(U1A2C3A4U5)切割序列的突变对MazF功能的影响。反应混合物根据以上的描述进行。泳道1和2使用野生型mazGmRNA作为对照。所有的突变由箭头标明。泳道1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29和31，没有MazF(His)6；泳道2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30和32，有2.6μM的MazF(His)6。标记的注释在左侧，同图6。图10显示MazF和MazE对16S和23S rRNA的切割的影响。反应在以下的体系中进行10mM Tris-HCl(pH 7.8)，含有10mMMgCl2，60mM NH4Cl，1mM DTT，0.5微升人胎盘RNA酶抑制剂(Roche)，5.6μM MazF(His)6和/或17.6μM(His)6MazE，总体积是10微升。37摄氏度孵育10分钟后，加入2微升上样缓冲液以终止反应。样品在3.5％的丙烯酰胺凝胶上进行分析。泳道1，没有MazF(His)6；泳道2，有5.2μM MazF(His)6；泳道3，有17.6μM(His)6MazE；泳道4，有5.2μM MazF(His)6和17.6μM(His)6MazE.23S和16S rRNA和tRNA的位置用箭头表示。结果mazF基因被克隆到可以用阿拉伯糖诱导的pBAD质粒(Guzman et al.，J Bacteriol 177，4121-30(1995))中。携带pBAD-MazF的大肠杆菌BW25113在阿拉伯糖(0.2％)存在的条件下在甘油-M9平板上不生长(参见图1A)。当MazF同源物中高度保守的残基Arg29或Arg86被分别替换为Ser或Gly后(图1B)，对阿拉伯糖的敏感性被消除了(图1A)。结果表明观察到的细胞生长的抑制是由于野生型MazF的生存力成的。在液体培养基中，加入阿拉伯糖5分钟后，细胞的生存力降低了104。为了确定被MazF抑制的细胞功能，使用了由携带pBAD-MazF的大肠杆菌BW25113制备的无细胞系统，细菌经甲苯处理而被通透化(Halegoua et al.，J Bacteriol 126，183-91(1976)；Halegoua et al.，Eur J Biochem 69，163-7(1976)。当在甲苯处理以前，细胞在阿拉伯糖存在的条件下预孵育10分钟时，ATP依赖的35S_甲硫氨酸掺入被完全抑制(图2A)。但是在类似的条件下，[α-32P]dTTP(Moses和Richardson，Proc Natl Acad Sci USA 67，674-81(1970))(图2B)和[α-32P]UTP(Peterson et al.，J Bacteriol 107，585-8(1971))(图2C)的掺入却没有受到影响。这些结果表明MazF抑制了蛋白质合成，但是不抑制DNA复制或者RNA合成。使用没有经过甲苯处理的细胞，加入阿拉伯糖后，35S-甲硫氨酸的体内掺入(Hirashima和Inouye，Nature 242，405-7(1973)被显著地抑制(图2D)。加入阿拉伯糖后不同时刻对总细胞蛋白合成所进行的SDS-PAGE分析(图2E)显示，MazF是蛋白质合成的一个一般性的抑制剂，它基本上影响所有的细胞蛋白质。有趣的是，较大的蛋白比较小的蛋白更易受到MazF的毒害。阿拉伯糖诱导10分钟后，使用蔗糖密度梯度对携带pBAD-MazF的大肠杆菌BW25113细胞进行多核糖体图谱的分析。如图3A所示，在这种细胞中，多核糖体完全消失了，同时70S核糖体级分升高，30S或50S核糖体级分没有显著改变。当使用春日霉素处理细胞时，多核糖体图谱出现了类似的改变(图5)，春日霉素是抑制翻译起始的抗生素。这些发现提示MazF通过抑制翻译起始或者通过降解mRNA而导致核糖体从mRNA上释放。还在大肠杆菌无细胞RNA/蛋白质合成系统中检查了纯化的MazF(His)6对候选蛋白质MazG合成的影响。从共同表达MazE和MazF(His)6的细胞中纯化出MazF(His)6。使用大肠杆菌T7 S30提取物系统(Promega)从质粒pET-11a-MazG合成MazG(30kD)(Hirashimaand Inouye，Nature 242，405-7(1973))，合成在37摄氏度下进行1小时，并在没有MazF(His)6存在或者有浓度逐步升高的MazF(His)6存在的情况下(图3B)。MazF(His)6浓度在231nM以上时，MazG的合成被完全抑制。同时研究了MazE抗毒素对这个观察到的由MazF介导的对MazG合成的抑制的作用。有趣的是，同时加入抗毒素(His)6MazE，以剂量依赖的方式挽救了MazG的合成(图3B)。MazF(His)6还能够抑制真核无细胞蛋白质合成系统(图3C，泳道2)，蛋白质的合成在同时加入(His)6MazE时也得到恢复(泳道3)。由于MazF抑制了MazG的合成(图3B)，对抑制发生的时间进行了分析。为了确定抑制是否影响了翻译起始步骤，采用了趾纹(TP)技术，其使用70S核糖体和MazG mRNA(Moll和Blasi，BiochemBiophys Res Commun 297，1021-1026(2002))。只对mazG mRNA进行趾纹分析产生了全长的条带(FL)和可能是由于mazG mRNA的5′末端的二级结构而形成的条带TP(s)(图4A，泳道1)。在70S核糖体存在下，检测到了起始密码子下游的趾纹条带[TP(r)](泳道3)。当MazF(His)6与70S核糖体一同加入时，出现了一个新的条带TP(F)，它对应的是Shine-Dalgarno(SD)序列和起始密码子之间的区域(泳道4-8)。随着MazF(His)6浓度的升高，TP(r)条带的强度逐渐降低，在MazF(His)6浓度为3.75μM时，TP(r)条带几乎完全消失了(泳道7)。令人惊奇的是，甚至在没有70S核糖体时也检测到了TP(F)条带(泳道2)，这表明MazF能够不依赖于70S核糖体与mRNA结合，或者MazF是在A和C残基之间切割的核糖核酸内切酶(图4A)。为了区别这些可能性，mazG mRNA与经过酚抽提除去蛋白质的MazF(His)6共同孵育，用于图4B所示的引物延伸。即使在酚抽提以后还能够观察到TP(F)条带(泳道2)，表明MazF(His)6的确切割mazG mRNA。当MazE共同加入时，mazG mRNA的切割被再次阻断(图4C，泳道4-7)。注意(His)6MazE单独地对于mRNA没有可检测到的作用(泳道2)。该结果表明MazE的抗毒性作用是由于对MazF核糖核酸内切酶活性的抑制。在MazF(His)6之前加入70S核糖体，抑制了MazF(His)6对mRNA的切割，很可能是由于mazG mRNA中SD序列和ACA序列位置接近(图6)。相反，RelE的毒性作用需要核糖体(Pedersen et al.，见前，(2003))。表I显示了在检查的不同mRNA转录物中的MazF切割序列。保守的切割序列加上了下划线。 (YeeW第一行SEQ ID NO84；YeeW第二行SEQ ID NO90；EnvZSEQ ID NO91；lacZSEQ ID NO92)为了测定MazF切割的特异性，将mazG-mRNA的SD序列从GGAG突变为UUUG，将起始密码子AUG突变为GUG或AGG。这些突变中没有一个影响MazF(His)6对mazG mRNA的切割(图7和图8)。当yeeW，envZ和lacZ的mRNA被用作底物时，每一个都在预期的mRNA转录物的ACA序列处被切割，而与SD序列和起始密码子无关(表I)。在这些mRNA中，ACA序列的5′端是G、A或T，3′端是C或者T。考虑到这些发现，对切割位点处具有UACAU序列的mazG mRNA进行突变，使5′和3′端的U残基突变为G、A或C。这些突变中没有一个影响切割(图9)。但是，当中央的ACA序列被改变为GCA，CCA，TCA；AGA，ATA，AAA；ACC，ACG或ACT时，没有观察到切割(图9)，表明MazF是一个高度序列特异的、识别ACA序列的核糖核酸内切酶。总之，以上的结果表明MazF作为高度序列特异的核糖核酸内切酶起作用，它在ACA位点处切割细胞mRNA，因而阻断了细胞中全部蛋白质的合成(图2E)。为了进一步测试这一发现，使用以阿拉伯糖诱导MazF之后的不同时间间隔提取的总细胞RNA进行Northern印迹分析(Baker和Mackie，Mol Microbiol 47，75-88(2003)；Sarmientos et al.，Cell 32，1337-46(1983))。ompA和lpp mRNA都被降解(图4C)。观察到的这两个mRNA的半寿期的差异与mRNA中存在的ACA序列的总数以及mRNA的长度有关。例如322bp的lpp mRNA(Nakamura和Inouye，Cell 18，1109-17(1979))只有一个ACA序列，而1229bp的ompA mRNA(Movva et al.，J Mol Biol 143，317-28(1980))有21个ACA序列。这一相关性提示较长的mRNA比较短的mRNA对MazF介导的切割更为敏感。有趣的是，在mazF ORF内总共有9个ACA序列，其中4个簇集于ORF的中央，这提示mazF的表达可能被其自身的基因产物负地自调控。应当注意MazF(His)6能够将16S和23S rRNA切割为较小的片段，而在(His)6MazE存在时此切割不能发生(图10)。结论是，MazF是一个新型的核糖核酸内切酶，它通过切割独特的三联体序列ACA而特异地抑制mRNA的功能。由于其干扰mRNA功能的能力，这类核糖核酸内切酶在这里被命名为“mRNA干扰酶”。正如这里给出的结果所强调的，其他具有不同序列特异性的mRNA干扰酶也有可能存在。除了新发现的这类核糖核酸内切酶，已知还有一些其他机制对mRNA的功能有干扰。这些机制中的一个涉及了micRNA(mRNA干扰性互补RNA)，它原来被作为是大肠杆菌中特异基因表达的RNA阻遏物(Mizuno et al，Proc Natl Acad Sci USA 81，1966-70(1984))。更近来一段时间，在真核生物中已经发现了类似的RNA元件，称为miRNA(Zeng和Cullen，RNA 9，112-23(2003)和siRNA(Billy etal.，Proc Natl Acad Sci USA 98，14428-33(2001))。存在引人兴趣的可能性，即这种通过mRNA干扰酶破坏mRNA功能的新机制(正如在本研究中对于大肠杆菌所证实的)也可能与真核生物有关。这对于许多(如果不是全部的)活的生物体的细胞生理学而言将有许多意义。而且，高度序列特异的mRNA干扰酶可以作为治疗工具，用于治疗人类疾病，以及作为生化工具进行RNA的结构研究。引人注意的是，2∶4MazE/MazF复合物的晶体结构最近被发表了(Kamada et al.，Mol Cell11，875-884(2003))。晶体结构中储存的信息可能帮助确定MazF如何特异地识别ACA序列并且切割之。
实施例II重要的是，在本发明的发现之前，MazF的细胞靶标还没有被鉴定。正如这里所显示的，MazF作为高度序列特异的核糖核酸内切酶起作用，它在ACA位点处切割细胞mRNA。这种活性可能在细胞中实现对蛋白质合成的部分或者全部抑制。依据四种核苷酸中的任何一种掺入到ACA序列中三个核苷酸位置的每一个位置的可能性是相同的原理进行标准的计算，基于这一标准的计算，ACA序列出现在RNA转录物中的预测频率是1/64。应当理解，与预测频率比较，一些RNA转录物中包含较低或者较高频率的ACA序列。因此，特定RNA转录物或者相关的RNA转录物家族对于被MazF核糖核酸内切酶切割的敏感性取决于ACA序列或者MazF靶序列在转录物中的频率。而且，本领域内具有普通技术的人员能够根据RNA转录物的序列预测转录物对于MazF介导的切割的敏感性。
实施例III正如以上描述的，在大肠杆菌中，程序性细胞死亡被认为是通过“上瘾组件”系统介导的，所述组件系统的每一个由一对共同表达的基因组成，这对基因编码稳定的毒素和不稳定的抗毒素。它们的表达通过毒素/抗毒素复合物或者只通过抗毒素自动调控。当共表达被抑制时，抗毒素被蛋白酶迅速降解，使毒素作用于其靶标。在大肠杆菌中，染色体外元件是细菌程序性细胞死亡的主要遗传系统。研究最多的染色体外上瘾组件是噬菌体P1上的phd-doc(Lehnherr et al.(1993)J Mol Biol 233，414-428；Lehnherr和Yarmolinsky(1995)Proc Natl Acad Sci USA 92，3274-3277；Magnuson和Yarmolinsky(1998)J Bacteriol 180，6342-6351；Gazit和Sauer(1999)J BiolChem 274，16813-16818；Gazit和Sauer(1999)J Biol Chem274，2652-2657)，F因子上的ccdA-ccdB(Tam和Kline(1989)JBacteriol 171，2353-2360；Van Melderen et al.(1994)MolMicrobiol 11，1151-1157；Bahassi et al.(1999)J Biol Chem274，10936-10944；Loris et al.(1999)J Mol Biol 285，1667-1677；Afif et al.(2001)Mol Microbiol 41，73-82；Dao-Thi et al.(2002)J Biol Chem 277，3733-3742；Van Melderen(2002)Int J MedMicrobiol 291，537-544)，以及质粒R100上的pemI-pemK(Tsuchimotoet al.(1988)J Bacteriol 170，1461-1466；Tsuchimoto和Ohtsubo.(1989)Mol Gen Genet 215，463-468；Tsuchimoto et al.(1992)JBacteriol 174，4205-4211；Tsuchimoto and Ohtsubo.(1993)MolGen Genet 237，81-88)。有趣的是，大肠杆菌染色体也含有几种上瘾组件系统，例如relBE系统和mazEF系统，它们在这里以上有所描述。mazEF系统由两个相邻的基因mazE和mazF组成，位于大肠杆菌染色体上relA基因的下游。序列分析显示它们与位于质粒pR100上的pemI和pemK基因部分同源(Masuda et al.(1993)JBacteriol 175，6850-6856)。如上面的描述，mazEF系统表现出上瘾组件的性质MazF具有毒性而MazE具有抗毒性；MazF是稳定的而MazE是在体内被ATP依赖的ClpA丝氨酸蛋白酶降解的不稳定蛋白质(Aizenman et al.(1996)见前)；MazE和MazF共同表达，相互作用形成一个复合物；mazEF的表达被MazE和MazE-MazF复合物负地自调控(Marianovsky et al.(2001)J Biol Chem 276，5975-5984)。如这里上面所描述的，mazEF介导的细胞死亡可以被极端的氨基酸饥饿以及胸腺嘧啶饥饿所引发(Sat et al.(2003)见前)，被毒性蛋白Doc引发(Hazan et al.(2001)J Bacteriol 183，2046-2050)，以及被一些抗生素所引发，这些抗生素是转录和/或翻译的一般性抑制剂，例如利福平、氯霉素和壮观霉素(Sat et al.(2001)见前)。如下面所述，对MazE、MazF以及mazEF启动子DNA之间的相互作用进行研究，发现了MazE中负责结合mazEF启动子DNA以及负责与MazF相互作用的功能性结构域。证明，MazE在其N端具有一个DNA结合结构域，MazE中的从38到75的区域对于结合MazF是需要的，其中Leu55和Leu58残基是必需的。这里给出的数据还提示溶液中的MazE-MazF复合物可以包含一个MazE二聚体和两个MazF二聚体。材料和方法试剂和酶——核苷酸、氨苄青霉素以及卡那霉素来自Sigma。用于克隆的限制性内切酶和DNA修饰酶来自New EnglandBiolabs。Pfu DNA聚合酶来自Stratagene。放射性的核苷酸来自Amersham Pharmacia Biotech。质粒的构建——使用大肠杆菌基因组DNA作为模板，通过PCR扩增出mazEF基因(包括其Shine-Dalgarno序列区域)，将其克隆到pET11a的XbaI-NheI位点中，产生质粒pET11a-EF。通过PCR扩增出mazEF基因(包括其Shine-Dalgarno序列区域)，将其克隆到pET21cc的XbaI-XhoI位点中，形成按照阅读框的翻译，在MazF的C端有一个(His)6标签。该质粒命名为pET21cc-EF(His)6。通过PCR扩增出mazE基因，将其克隆到pET28a的NdeI-Hind III位点中。该质粒命名为pET28a-(His)6E。MazE作为一个融合蛋白表达，N端有一个(His)6标签(命名为(His)6MazE)，之后有一个凝血酶切割位点。通过PCR产生全长的mazE基因和各种不同的mazE基因N端与C端缺失构建体(参见图17)，并且克隆到pGAD-C1载体的EcoRI-PstI位点中，与Gal4转录激活结构域形成按照阅读框的翻译融合。这些质粒被命名为pGAD-MazE，pGAD-MazEΔ(1-13)，pGAD-MazEΔ(1-24)，pGAD-MazEΔ(1-37)，pGAD-MazEΔ(1-46)，pGAD-MazEΔ(68-82)和pGAD-MazEΔ(76-82)。通过PCR产生全长mazF基因以及各种不同的mazF基因N端与C端缺失构建体，并且克隆到pGBD-C1载体的EcoRI-BglII位点中，与Gal4DNA结合结构域形成按照阅读框的翻译融合。这些质粒被命名为pGBD-MazF，pGBD-MazFΔ(1-14)，pGBD-MazFΔ(1-25)，pGBD-MazFΔ(72-111)和pGBD-MazFΔ(97-111)。蛋白质纯化——将pET11a-EF引入到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中。使用1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导MazE和MazF的共表达4小时。离心收集细胞并使用弗氏压碎器裂解。细胞裂解物在37摄氏度保存30分钟以最大程度地降解MazE，8000g离心10分钟以沉淀细胞碎片和未裂解的细胞，之后10000g超速离心1小时以去除膜和不溶性级分。接下来通过硫酸铵分级、Sephadex G-100柱上的凝胶过滤、DEAE-Sepharose和羟基磷灰石柱层析来纯化MazF。混合并浓缩含有MazF蛋白的级分。通过使用SuperduxTM200柱(Pharmacia Biotech)的凝胶过滤使MazF进一步纯化。对于(His)6MazE的纯化，将pET28a-(His)6E引入到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，并使用1mM IPTG诱导(His)6MazE表达4小时。立即用Ni-NTA(QIAGEN)亲和层析纯化(His)6MazE蛋白。也将pET21cc-EF(His)6引入到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中。使用1mM IPTG诱导MazE和MazF(His)6的共表达4小时。MazE-MazF(His)6复合物立即用Ni-NTA(QIAGEN)亲和层析纯化，并进一步用凝胶过滤纯化。为了从纯化的MazE-MazF(His)6复合物中纯化MazF(His)6，在6M盐酸胍中将纯化的MazE-MazF(His)6复合物中的MazE与MazF(His)6解离。通过Ni-NTA树脂(QIAGEN)重新捕获MazF(His)6，并通过分步透析进行重折叠。重折叠的产率大约是80％。使用大肠杆菌T7 S30提取物系统(Promega))，就蛋白质合成抑制，测定MazF(His)6的生化活性。电泳迁移率变动分析(EMSA)——合成两个单链的寡核苷酸，5′-GCTCGTATCTACAATGTAGATTGATATATACTGTATCTACATATGA TAGC-3′(SEQ ID NO12)和3′-CGAGCATAGATGTTACATCTAACTATATATGACATAGATGTATACTATCG-5′(SEQ ID NO13)，将其退火产生含有mazEF启动子序列的50-bp双链DNA。该50-bpDNA片段经T4多核苷酸激酶用[γ-32P]ATP进行末端标记，用于在EMSA中检测蛋白质与DNA的结合。结合反应在4摄氏度进行30分钟，反应体系20微升，含有纯化的蛋白质，2微升100微克/毫升的poly(dI-dC)和2微升标记的DNA片段，结合缓冲液是50mM Tris-HCl(pH 7.5)，5mM MgCl2，1mM二硫苏糖醇和5％甘油。在TAE缓冲液中，于100V，在6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。电泳后，干燥凝胶，对X光片曝光。非变性PAGE——在结合缓冲液[50mM Tris-HCl(pH 7.5)，5mM MgCl2，1mM DTT和5％甘油]中，于4摄氏度混合不同量的(His)6MazE和MazF30分钟，然后加入2×上样溶液[40mM Tris-HCl(pH7.5)，80mM β-巯基乙醇，0.08％溴酚蓝和8％甘油]至混合物中，然后上样于非变性胶上。浓缩胶的组成是5％丙烯酰胺-双丙烯酰胺(acrylamide-bis)(29∶1)，在62.5mM Tris-HCl(pH 7.5)中；分离胶的组成是10％丙烯酰胺-双丙烯酰胺(29∶1)，在187.5mMTris-HCl(pH8.9)中。走样缓冲液含有82.6mM Tris-HCl(pH 9.4)和33mM甘氨酸。于4摄氏度在恒定电压(150V)下进行电泳。通过考马斯亮蓝显现蛋白质条带。通过tricine SDS-PAGE分辨低分子量的蛋白——根据以前描述的方法(Schagger和von Jagow，G.(1987)Anal Biochem166，368-379)进行tricine SDS-PAGE，略有改动如下浓缩胶，5％丙烯酰胺-双丙烯酰胺(48∶1.5)，在0.75M Tris-HCl(pH 8.45)中，以及0.075％SDS；成层胶，10％丙烯酰胺-双丙烯酰胺(48∶1.5)，在1.0M Tris-HCl(pH 8.45)中，以及0.1％SDS；分离胶，16.5％丙烯酰胺-双丙烯酰胺(48∶1.5)，在1.0M Tris-HCl(pH 8.45)中，以及0.1％SDS。阳极走样缓冲液是0.2M Tris-HCl(pH 8.9)，阴极走样缓冲液是0.1M Tris碱、0.1M tricine和0.1％SDS。在恒定电流(20毫安)下于室温电泳后，通过考马斯亮蓝呈现蛋白质条带。在酵母双杂交系统中检测MazE-MazF相互作用——使用酵母双杂交报告菌株PJ69-4A[MATa trp1-901 leu2-3，112 ura3-52his3-200 gal4 gal80LYS2::GAL1-HIS3 GAL2-ADE2 met::GAL7-lacZ]以及载体pGAD-C1和pGBD-C1，用于双杂交分析(James et al.(1996)Genetics 144，1425-1436)。为了在MazE中定位MazF结合区域，在pGAD-C1中构建了一系列的N端和C端缺失的mazE基因，并与pGBD-MazF质粒共转化到PJ69-4A细胞中。参见图17。为了在MazF中定位MazE结合区域，在pGBD-C1中构建了一系列的N端和C端缺失的mazF基因，并与pGAD-MazE质粒共转化到PJ69-4A细胞中。通过监测共转化子在合成的dropout(SD)基本培养基(Clontech)(没有Trp、Leu、His和腺嘌呤(Ade))上的生长情况来进行相互作用的检测。该培养基中添加1mM 3-氨基-1，2，4-三唑(3-AT)，并于30摄氏度孵育5天。
0303]有关附图的具体的方法学细节在图11中，泳道的上样如下泳道1，蛋白质分子量标准；泳道2，MazE-MazF(His)6复合物；泳道3，MazF；泳道4，(His)6MazE。在图12A和12B中，(His)6MazE和MazF按照所示的摩尔比混合。混合物在4摄氏度孵育30分钟，然后进行非变性PAGE。将对应于复合物的凝胶切下来，在还原性缓冲液[20mM Tris-HCl(pH7.5)，100mM NaCl和50mM β-巯基乙醇]中于室温孵育30分钟，然后进行第二维的15％SDS-PAGE电泳。如下方的图中的凝胶所显示的，复合物中的(His)6MazE和MazF被分开。每一个泳道中相对蛋白量通过光密度测定法确定，使用(His)6MazE和MazF作为对照。在图12A中，向20微升的2μM MazF溶液中加入不同量的(His)6MazE。泳道1-5，(His)6MazE∶MazF的比例分别是1∶1，2∶1，4∶1，6∶1和8∶1。在图12B中，向20微升的2μM(His)6MazE溶液中加入不同量的MazF。泳道1-5，(His)6MazE∶MazF的比例分别是1∶2，1∶4，1∶6和1∶8。图12A和12B上方的图显示了非变性PAGE的结果。箭头a表明了(His)6MazE-MazF复合物的位置。图12A和12B下方的图显示了第二维电泳的SDS-PAGE结果。纯化的(His)6MazE(40pmol)和MazF(40pmol)上样于第一和第二泳道作为对照。在图13中，通过使用Superdex 200柱的凝胶过滤确定了MazF和MazE-MazF(His)6复合物的分子量。蛋白质分子量标准曲线包括了甲状腺球蛋白(669kDa)，脱铁铁蛋白(443kDa)，β-淀粉酶(200kDa)，BSA(66kDa)，卵清蛋白(45kDa)和碳酸酐酶(29kDa)。标准曲线上的垂直箭头表明了MazF和MazE-MazF(His)6复合物的位置。在图14A，14B，和14C中，将含有mazEF启动子区域的[32P]-标记的50-bp DNA片段与浓度不断增加的(His)6MazE共同孵育(图14A)，与浓度不断增加的MazF共同孵育(图14B)，或者以1∶2的恒定(His)6MazE/MazF比例与浓度不断增加的(His)6MazE和MazF共同孵育(图14C)。在图15中，使用ClustalW程序进行比对分析。在8个不同的蛋白质中，相同的残基用黑框表示。相似的残基用灰框表示。引入了间隙(用长划号表示)，以使比对最优化。序列有耐放射异常球菌(Deinococcus radiodurans)的MazE(GenBank登录编号NP_294139)；耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)的MazE(GenBank登录号NP_244587)；质粒R100上的PemI(GenBank登录号NP_052993)；质粒R466b上的PemI(GenBank登录号AAC82515)；大肠杆菌的MazE(GenBank登录号NP_289337)；大肠杆菌的ChpB(GenBank登录号NP_290856)；恶臭假单孢菌(Pseudomonasputida)KT2440的MazE(GenBank登录号NP_742931)；Photobacterium profundum的MazE(GenBank登录号AAG34554)。数字对应于氨基酸残基的位置。在图16A和16B中，通过EMSA，使用50bp的[32P]标记的含有mazEF启动子区域的DNA片段测定蛋白质与DNA的结合。在图16A中，DNA片段与1μM所示的每一种复合物在20μl的混合物中于4摄氏度孵育30分钟。泳道1，无蛋白的对照；泳道2，MazE-MazF(His)6复合物；泳道3，MazE(K7A)-MazF(His)6复合物；泳道4，MazE(R8A)-MazF(His)6复合物；泳道5，MazE(S12A)-MazF(His)6复合物；泳道6，MazE(R16A)-MazF(His)6复合物；泳道7，MazE(I43N)-MazF(His)6复合物；泳道8，MazE(E57Q)-MazF(His)6复合物。在图16B中，DNA片段与4μM所示的(His)6MazE或者(His)6MazE突变体在20μl的混合物中于4摄氏度孵育30分钟。泳道1，无蛋白的对照；泳道2，野生型(His)6MazE蛋白；泳道3，(His)6MazE(K7A)突变体；泳道4，(His)6MazE(R8A)突变体；泳道5，(His)6MazE(S12A)突变体；泳道6，(His)6MazE(R16A)突变体。在图17中，在pGAD-C1中构建全长的mazE基因和截短的mazE基因。数字指的是MazE中氨基酸的位置，这些质粒与pGBD-MazF共同转化酵母PJ69-4A细胞。在SD培养基(Clontech)平板(含有1mM3-AT，没有Trp、Leu、His和Ade)上检测蛋白质-蛋白质相互作用。+，表示在5天内形成的可见的菌落；-表示5天内没有形成可见的菌落。在图18A中，通过非变性PAGE测定了MazF和(His)6MazE或者(His)6MazE突变体之间的相互作用。泳道1，野生型(His)6MazE；泳道2，MazF；泳道3，野生型(His)6MazE和MazF；泳道4，(His)6MazE L55A/L58A突变体和MazF；泳道5，(His)6MazER48A突变体和MazF；泳道6，(His)6MazE E57Q突变体和MazF；泳道7，(His)6MazE F53A突变体和MazF。在图18B中，通过EMSA，使用50bp的[32P]标记的含有mazEF启动子区域的DNA片段测定MazF和(His)6MazE或者(His)6MazE L55A/L58A突变体之间的相互作用。泳道1，无蛋白的对照；泳道2，4μM野生型(His)6MazE；泳道3，4μM(His)6MazEL55A/L58A突变体；泳道4，2μM野生型(His)6MazE和4μM MazF；泳道5，2μM(His)6MazE L55A/L58A突变体和4μM MazF。图19描绘了MazE-MazF复合物的X射线结构，在该图中显示了对于MazE功能必需的保守氨基酸残基。只显示了MazF2-MazE2-MazF2复合物的一部分，其中一个MazE分子(蓝色)与MazF同源二聚体的两个MazF分子(紫色和红色)相互作用。在MazE分子中，N-box和Hp-box分别用绿色和黄色表示。显示出N-box中的Lys7、Arg8、Ser12和Arg16的位置，以及Hp-box中的Leu55和Leu58的位置。正如这里所显示的，这些替代突变导致了MazE功能的丧失。结果MazE和MazF可以以1∶2的比例形成复合物。纯化的MazE-MazF(His)6，MazF和(His)6MazE的tricine SDS-PAGE图样分别在图11的泳道2、3和4中显示。(His)6MazE和MazF的大小分别与理论分子量11.4kDa和12.0kDa相符(图11，泳道3和4)。MazE-MazF(His)6复合物分开成了9.3kDa的MazE和13.2kDa的MazF(His)6(图11，泳道2)，使用光密度测定仪确定MazF(His)6与MazE的比例约为2。将(His)6MazE和MazF混合在一起进行非变性PAGE时，在靠近胶顶部的位置出现了一个新的条带(图12中的位置a)。将对应于新条带的凝胶切下来，在还原缓冲液[20mM Tris-HCl(pH 7.5)，100mM NaCl和50mM β-巯基乙醇]中于室温孵育30分钟，然后将胶置于SDS-PAGE凝胶的顶部，进行第二维的电泳，以分析蛋白质组分。在使用考马斯亮蓝对凝胶进行染色之后，观察到对应于(His)6MazE和MazF的两条带，在SDS-PAGE上(His)6MazE的迁移比MazF的迁移要慢。这些结果证明新的条带是包含(His)6MazE和MazF的复合物。如果从非变性PAGE上切下来的凝胶没有在还原缓冲液中处理，则SDS-PAGE后观察到3个蛋白质条带，即(His)6MazE，MazF和MazF二聚体(数据未显示)。在非变性PAGE中，经纯化的MazF有三条带，但是使用HPLC检测纯化的MazF蛋白只观察到一个峰(数据未显示)。进行其他的实验以确定在复合物中(His)6MazE与MazF的比例是否是稳定的。如图12A所示，向含有恒定浓度的MazF(2μM)的相同溶液中加入不同量的(His)6MazE，产生一系列溶液，其中(His)6MazE∶MazF的比例从1∶1，到2∶1，到4∶1，到6∶1，到8∶1。如图12B所示，向含有恒定浓度的(His)6MazE(2μM)的相同溶液中加入不同量的MazF，产生一系列溶液，其中(His)6MazE∶MazF的比例是1∶1，1∶2，1∶4，1∶6和1∶8。以上混合物在4摄氏度孵育30分钟，用非变性PAGE进行分析。将对应于新条带(位置a)的凝胶切下来，在还原缓冲液中于室温孵育30分钟，然后进行15％SDS-PAGE。第二维的凝胶用考马斯亮蓝染色以检测蛋白质条带。每一个泳道中的相对蛋白质含量使用光密度仪测定，纯化的(His)6MazE和MazF作为对照。当所述混合物中(His)6MazE或者MazF过量时，复合物中MazF与(His)6MazE的比例几乎保持恒定在1.8(图12)。如上提及，MazE-MazF(His)6复合物通过tricine SDS-PAGE分离为MazE和MazF(His)6，MazF(His)6对MazE的比例大约为2(图11，泳道2)。通过使用SuperduxTM200柱(Pharmacia Biotech)的凝胶过滤测定纯化的MazE-MazF(His)6复合物和MazF的分子量为76.9kDa和27.1kDa(图13)。从MazE-MazF(His)6复合物中纯化出MazF(His)6。MazF(His)6能够抑制大肠杆菌无细胞系统(大肠杆菌T7 S30提取物系统，Promega)中的蛋白质合成，而蛋白质的合成通过同时加入(His)6MazE而被拯救(数据未显示)。使用光散射测定MazF(His)6的分子量为28.3kDa，提示MazF(His)6以二聚体形式存在。MazE的结构被证明是二聚体(Lah et al.(2003)J Biol Chem278，14101-14111)。因此，MazE-MazF(His)6复合物(76.9kDa)可能由一个MazE二聚体(预测分子量为18.6kDa，因为MazE的分子量是9.3kDa)和两个MazF(His)6二聚体(56.6kDa)组成。MazF提高了MazE与mazEF启动子的结合——根据这里的描述制备50bP的mazEF启动子片段，通过T4多核苷酸激酶用[γ-32p]ATP进行末端标记。使用电泳迁移率变动分析(EMSA)，分别测定(His)6MazE、MazF和MazE-MazF(His)6复合物与mazEF启动子DNA片段结合的能力。2μM或者更高浓度的(His)6MazE能够使mazEF启动子片段发生移动(图14A，泳道7)。(His)6MazE浓度为0.4-1.0μM时，未观察到不连续的迁移率改变的条带，尽管DNA片段的信号向上开始变得模糊不清(图14A，泳道3-6)，表明在这些浓度下形成了一些不稳定的(His)6MazE-DNA复合物。(His)6MazE浓度为2-20μM时，观察到不连续的迁移率改变的复合物，它们在更高浓度的(His)6MazE下移动更为缓慢(图14A，泳道7-12)，提示在较高浓度的MazE存在下与DNA片段结合的(His)6MazE分子的数目增加。很可能在50bp的mazEF启动子片段中有一个以上的(His)6MazE结合位点。与此相反，即使在20μM的浓度时，MazF蛋白也不能够结合50bp的mazEF启动子DNA(图14B)。增加(His)6MazE和MazF蛋白的量，同时将(His)6MazE/MazF的比例保持恒定为1∶2。与(His)6MazE单独加入相比，MazF显著提高了(His)6MazE与mazEF启动子的结合。在这些条件下，50bp的mazEF启动子片段在(His)6MazE的浓度低到0.2μM时发生移动(图14C)，更高浓度的(His)6MazE-MazF复合物存在下观察到超级迁移，这表明在较高的浓度下更多的(His)6MazE-MazF复合物结合到DNA片段上，证明在mazEF启动子中有多个(His)6MazE-MazF复合物结合位点。MazE同源物中的保守氨基酸序列——通过BLAST搜索找到了MazE的同源物，它们氨基酸序列的比对在图15中显示。尽管通常，MazE在细菌中并不是高度保守的，但是在MazE同源物中仍有保守的区域。首先，MazE的N端区域比MazE中的其他区域更为保守。MazE是一个pI为4.7的酸性蛋白，但是其N端区域仍有少许几个保守的碱性残基(K7，R8和R16)，被称为N-box(图15)。因为MazE能够结合mazEF启动子DNA，所以N-box可能负责DNA的结合。第二，有一个保守的C端区域，称为Hp-box(图15)，它含有几个保守的疏水残基。MazE的N-box负责MazE以及MazE-MazF复合物与DNA的结合——在质粒pET21cc-EF(His)6中的mazE基因中构建多种不同的定点突变，将N-box中的保守氨基酸残基转变为Ala。纯化由MazE突变体蛋白和MazF(His)6形成的复合物。通过EMSA分别检测这些复合物与mazEF启动子结合的能力。如图16A所示，由在N-box中具有突变(K7A，R8A，S12A或者R16A)的MazE突变体与MazF(His)6形成的复合物不能结合mazEF启动子DNA(图16A，泳道3，4，5和6)。但是在N-box以外的保守氨基酸的替换突变，例如MazE，不影响包含这些突变蛋白的复合物与DNA结合的能力(图16A，分别是泳道7和8)。在质粒pET28a-(His)6E中的mazE基因中还构建了其他替换突变。所有在N-box中具有替换突变(K7A，R8A，S12A或者R16A)的(His)6MazE突变体丧失了其结合DNA的能力(分别对应于图16B，泳道3，4，5和6)，而野生型的(His)6MazE保持了其结合mazEF启动子的能力(图16B，泳道2)。相反，在N-Box以外发生替换突变(R48A，F53A，L55A/L58A和E57Q)的(His)6MazE突变体能够与mazEF启动子DNA结合(数据未显示)。这些结果表明MazE-MazF复合物的DNA结合能力是由于复合物中的MazE蛋白，而N-box负责MazE与DNA的结合。MazE和MazF之间的相互作用——进行酵母双杂交检测检查MazE和MazF之间的相互作用。为了证明MazE中哪一个区域对于其与MazF的相互作用是必需的，通过PCR产生全长的mazE基因和mazE基因的各种不同的N端及C端缺失构建体(参见图17)，将它们克隆到pGAD-C1载体的EcoRI-PstI位点中，与Gal4转录激活结构域形成按照阅读框的翻译融合，这些质粒中的每一个都与pGBD-MazF共转化到PJ69-4A酵母细胞中。带有pGAD-MazE，pGAD-MazEΔ(1-13)，pGAD-MazEΔ(1-24)，pGAD-MazEΔ(1-37)或pGAD-MazEΔ(76-82)与pGBD-MazF的共转化子能够在缺少Trp、Leu、His和Ade的合成培养基(SD培养基，Clontech)上生长，而带有pGAD-MazEΔ(1-46)或pGAD-MazEΔ(68-82)与pGBD-MazF的共转化子不能够生长。这些数据证明全长的MazE、MazEΔ(1-13)、MazEΔ(1-24)、MazEΔ(1-37)和MazEΔ(76-82)能够与MazF相互作用，而进一步的N端缺失突变体MazEΔ(1-46)和进一步的C端缺失突变体MazEΔ(68-82)不能。这些结果表明MazE的38-75残基的区域负责与MazF的相互作用。在pGBD-C1中构建一系列从MazF的C末端和N末端的截短突变体，并与pGAD-MazE共转化到PJ69-4A细胞中。所有的这些共转化的酵母细胞都不能在在缺少Trp、Leu、His和Ade的完全合成培养基上生长，表明所有这些MazF突变体都不能与MazE相互作用。因此MazF的N端和C端区域可能都参与了与MazE的相互作用，或者产生的缺失突变破坏了对与MazE相互作用有利的MazF的结构构象。在质粒pET28a-(His)6E中还产生了定点突变，以构建(His)6MazE R48A、F53A、L55A/L58A和E57Q突变体。用非变性PAGE检查用这些(His)6MazE突变体和MazF的复合物形成。如图18A所示，(His)6MazE突变体R48A、F53A和E57Q能够与MazF形成复合物(分别如图18A泳道5，6和7所示)，而(His)6MazE L55A/L58A突变体不能与MazF形成复合物(图18A泳道4)。使用EMSA证明野生型(His)6MazE和(His)6MazE L55A/L58A突变体能够结合mazEF启动子DNA(分别示于图18B，泳道2和3)。加入MazF时，野生型(His)6MazE能够与MazF相互作用形成复合物，与仅仅使用野生型(His)6MazE的游道(图18B，泳道2)相比在靠近凝胶顶部的位置产生了超级移动的条带(图18B，泳道4)。但是向(His)6MazE L55A/L58A中加入MazF不能造成出现超级移动的DNA片段，确证了(His)6MazE L55A/L58A突变体不能与MazF相互作用形成复合物。讨论大肠杆菌中的mazEF上瘾系统由两个基因mazE和mazF组成，它们分别编码不稳定的抗毒素MazE和稳定的毒素MazF。MazF的毒性作用由ppGpp激活，ppGpp是应对氨基酸饥饿(Aizenman et al.(1996)见前)，由于某些抗生素(Sat et al.(2001)见前)，以及由于毒性蛋白Doc(Hazan et al.(2001)见前)而由RelA蛋白产生的信号。在这些情况下，不稳定的MazE的降解导致了游离的稳定MazF的出现，MazF可以对细胞施加毒性作用。因此对MazE的细胞浓度的调控是细胞死亡的主要决定因素。简而言之，通过与MazF形成复合物，MazE抑制了MazF的毒性作用。而且，MazE还通过与mazEF启动子的结合，参与mazEF表达的自调控(Marianovsky et al.(2001)见前)。正如这里所示的，MazE包含至少两个功能结构域DNA结合结构域和MazF结合结构域。融合蛋白(His)6MazE能够与MazF相互作用并且结合在mazEF启动子上。与MazF相似，MazF(His)6形成二聚体，抑制体外蛋白质合成，这种蛋白质合成的抑制通过同时加入(His)6MazE而被挽救(数据未显示)。因此，在体外，与野生型MazE和MazF相比，His标记的融合蛋白看起来表现出相似的功能活性。使用高度纯化的(His)6MazE和MazF，证明了(His)6MazE能够自身结合mazEF启动子，这个相互作用通过加入MazF而被增强。实际上，MazF使(His)6MazE与mazEF启动子DNA的结合增强了10倍以上。在更高浓度的(His)6MazE或者(His)6MazE-MazF复合物下，在电泳迁移率变动分析中观察到超级移动的包含mazEF启动子DNA的复合物，表明(His)6MazE和(His)6MazE-MazF复合物在mazEF启动子DNA上都有一个以上的结合位点。值得注意的是，以前的研究提示在mazEF启动子区域中可能有三个MazE结合位点(Lah et al.(2003)J Biol Chem 278，14101-14111)。有趣的是，由EMSA观察到的条带并不是逐步移动的。在MazE的保守N-box中的定点突变(K7A、R8A、S12A和R16A)破坏了(His)6MazE和MazE-MazF(His)6复合物的DNA结合能力(图16)，提示MazE负责MazE-MazF(His)6复合物的DNA结合能力，而且在MazE中的高度保守的N端区域是DNA结合结构域。进行酵母双杂交检测以确定负责MazE-MazF相互作用的区域。发现与MazF结合需要MazE C端的残基38到75。值得注意的是，MazE中有一个保守的C端区域，称为Hp-box，它富含疏水残基。MazEHp-box中保守氨基酸Leu55和Leu58的突变(L55A/L58A)破坏了(His)6MazE和MazF之间的相互作用。酵母双杂交试验还表明MazF蛋白的整个结构对于其与MazE的相互作用可能是必需的，因为从MazF的N末端或者C末端的缺失破坏了MazE和MazF之间的相互作用。通过凝胶过滤测定出MazE-MazF(His)6复合物的分子量为76.9kD。纯化的MazE-MazF(His)6复合物进行tricine SDS-PAGE电泳时，发现MazE与MazF(His)6的比例大约是1∶2(图11，泳道2)。即使在过量(His)6MazE或MazF的存在下，在(His)6MazE-MazF复合物中MazE与MazF的比例仍然稳定地保持在大约1∶1.8(图12)。由于MazE(Lah et al.(2003)见前)和MazF(His)6均以二聚体形式存在，所以MazE-MazF(His)6复合物(76.9kDa)可能由一个MazE二聚体(预测其大小约为18.6kD，因为MazE的分子量是9.3kD)和两个MazF(His)6二聚体(预测其大小约为56.6kDa，因为MazF(His)6二聚体的分子量是28.3kDa)组成。如上所述，Kamada等人((2003)见前)测定了MazE-MazF复合物的晶体结构。MazE-MazF复合物的晶体结构在几个方面确证了这里所列的结果，包括1)发现MazE和MazF形成一个2∶4的异源六聚体，由交替的MazF和MazE同源二聚体组成(MazF2-MazE2-MazF2)。重要的是注意，MazE和MazF之间按照2∶4的化学计量形成的复合物看上去是非常稳定的，因为在(His)6MazE-MazF复合物中(His)6MazE和MazF的比例不因为两种蛋白质中哪个大大过量而发生改变(图12)。2)MazE的C端区域与MazE-MazF复合物结构中的MazF同源二聚体相互作用。本研究中发现的Hp-box参与了表面上看来最稳定的MazE和MazF之间的界面(图19)。3)根据MazE和其他上瘾组件解毒剂的相似性，以及MazE和MazF的静电表面上碱性区域的分布，Kamada等人((2003)见前)提出MazE中的Lys7和Arg8是MazE-MazF复合物中的首要DNA锚定位点。正如这里所证明的，(His)6MazE以及MazE-MazF(His)6复合物的DNA结合能力不仅仅由于Lys7和Arg8的定点突变而被破坏，而且还因为N-box内的其他保守氨基酸残基(Ser12和Arg16)的突变而被破坏(图19)。很可能的是，由于MazE以二聚体存在，因而MazE二聚体中的两个N-box一同参与了与DNA的结合。
实施例IV如这里所示，由“pemI-pemK上瘾组件”编码的毒素--纯化的PemK蛋白，抑制了大肠杆菌无细胞系统中蛋白质的合成，而加入抗PemK的抗毒素PemI恢复了蛋白质的合成。进一步的研究显示PemK是一个序列特异的核糖核酸内切酶，它切割mRNA，抑制蛋白质合成，而PemI阻断了PemK的核糖核酸内切酶活性。正如这里所描述的，PemK对单链RNA的切割优选出现在UAX序列(其中X是C、A或U)中A核苷酸的5′或3′端。在诱导之后，PemK切割细胞mRNA，有效地阻断了大肠杆菌中蛋白质的合成。因此，本发明证明了PemK通过在特异位点切割mRNA，干扰mRNA的作用。因此，本发明的发明者发现了PemK是一个新型的核糖核酸内切酶，在这里将其命名为“mRNA干扰酶”。已经在许多细菌的基因组中发现了PemK同源物。
提出PemK及其同源物形成一个新型核糖核酸内切酶家族，它们通过序列特异的方式切割细胞mRNA，而干扰mRNA的功能。还请参见图33和34。材料和方法菌株和质粒根据这里的描述使用大肠杆菌BL21(DE3)和BW25113细胞。使用质粒R100作为模板，通过PCR扩增pemIK基因，将其克隆到pET21cc(Novagen)的NdeI-XhoI位点中，在PemK的C端与(His)6标签融合产生按照阅读框的翻译。将该质粒命名为pET21cc-IK(His)6。将pemI基因克隆到pET28a(Novagen)的NdeI-BamHI位点中，产生质粒pET28a-(His)6I。PemI作为一个融合蛋白表达，其N端有(His)6标签，之后是凝血酶切割位点，其被称为(His)6PemI。pemK基因被克隆到pBAD(Guzman et al.(1995)JBacteriol 177，4121-4130)，产生质粒pBAD-K。大肠杆菌mazG基因克隆到pET11a(New England Biolabs)的NdeI-BamHI位点中，产生质粒pET11a-MazG。mazG基因克隆到pINIII载体(Nakano et al.(1987)J Virol 61，302-307)中，产生质粒pIN-MazG。大肠杆菌era基因克隆到pET28a的ScaI-XhoI位点中，产生质粒pET28a-Era。era基因也克隆到pINIII载体中产生质粒pIN-Era。蛋白质纯化对于(His)6PemI的纯化，将pET28a-(His)6I引入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，使用1mM IPTG诱导(His)6PemI的表达4小时。使用Ni-NTA(QIAGEN)纯化(His)6PemI蛋白。将pET21cc-IK(His)6也引入到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中。在1mM IPTG诱导下，PemI和PemK(His)6共表达4小时。使用Ni-NTA(QIAGEN)纯化PemI-PemK(His)6复合物。为了从PemI-PemK(His)6复合物中纯化PemK(His)6，将PemI-PemK(His)6复合物在5M盐酸胍中解离，从PemK(His)6上释放PemI。用Ni-NTA树脂(QIAGEN)重新捕获PemK(His)6，然后洗脱并且通过分步透析重折叠。体内蛋白质和DNA合成的检测含有pBAD-K的大肠杆菌BW25113在改良的M9培养基(加入0.5％甘油，没有葡萄糖，以及每种1mM的氨基酸混合物，没有甲硫氨酸)中生长。当培养物的OD600达到0.6时，加入阿拉伯糖至终浓度为0.2％，诱导PemK的表达。在所示的时刻取出细胞培养物(1毫升)，与5uCi[35S]-甲硫氨酸混合(用于分析蛋白质的合成)或者与2uCi甲基-3H-胸腺嘧啶(用于分析DNA的合成)混合。37摄氏度掺入1分钟后，根据以前的描述测定DNA复制和蛋白质合成的速率(Pedersen et al.(2002)Mol Microbiol45，501510)。为了制备用于分析总细胞蛋白质合成的SDS-PAGE分析的样品，在所示的不同时刻取出500微升[35S]-甲硫氨酸掺入反应混合物，加入到含有25微升100％TCA和100微克/毫升非放射性甲硫氨酸的预冷试管中。离心收集细胞沉淀，进行SDS-PAGE后自显影。引物延伸分析使用T7引物(5′-AGATCTCGATCCCGCAAATTAAT-3′)(SEQ ID NO14)和G6引物(5′-TTAGAGATCAATTTCCTGCCGTTTTAC-3′)(SEQ ID NO15)，以pET11a-MazG作为模板，PCR扩增出含有T7启动子和mazG基因的DNA片段。使用同上的T7引物和E5引物(5′-TTAAAGATCGTCAACGTAACCG-3′)(SEQ IDNO16)，以pET28a-Era为模板，PCR扩增出包含T7启动子和era基因的另一个DNA片段。使用T7大规模转录试剂盒(Promega)，从这两个DNA片段中分别制备mazG mRNA和era mRNA。使用PemK(His)6，部分切割RNA底物，37摄氏度作用15分钟。切割反应混合物(20微升)含有4微克RNA底物，0.2微克PemK(His)6，1微升RNA酶抑制剂，20mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM NaCl和1mM DTT。部分切割产物使用RNAeasy柱(QIAGEN)纯化，去除PemK(His)6蛋白。使用引物G1(5′-TGCTCTTTATCCCACGGGCAGC-3′)(SEQ ID NO17)，G2(5′-GCCCAGTTCACCGCGAAGATC GTC-3′)(SEQ ID NO18)，G3(5′-GGTTTTGATTTGCTCCCAACGGGCAAG-3′)(SEQ ID NO19)，G4(5′-CATTTCCT CCTCCAGTTTAGCCTGGTC-3′)(SEQ ID NO20)，和G5(5′-TTGCCAGACTTCTTCCATTGTTTCG AG-3′)(SEQ ID NO21)进行mazG RNA的引物延伸分析；使用引物E1(5′-GATCCCCACAATGCGGTGACGAGT-3′)(SEQ ID NO22)，E2(5′-CACGTTGTCCACTTTGTTCACC GC-3′)(SEQ IDNO23)，E3(5′-CAGTTCAGCGCCGAGGAAACGCAT-3′)(SEQ ID NO24)，和E4(5′-GCGTTCGTCG TCGGCCCAACCGGA-3′)(SEQ ID NO25)进行era RNA的引物延伸分析。使用T4多核苷酸激酶，对引物的5′端标记[γ-32P]ATP。引物延伸反应在42摄氏度进行1小时。除了PemK(His)6不加入到切割反应混合物中以外，使用相同条件进行对照实验。引物延伸产物在6％的测序凝胶上分析，在产物的旁边是使用相同引物制备的DNA测序梯度条带。合成的RNA被PemK切割30个碱基的RNA 5′-UAAGAAGGAGAUA UACAUAUGAAUCAAAUC-3′(SEQID NO11)，反义RNA 5′-GAUUUGAUUCAUAUGUAUAU CUCCUUCUUA-3′(SEQID NO26)以及互补DNA5′-GATTTGATTCATATGTATATC TCCTTCTTA-3′(SEQ ID NO27)商业合成。使用T4多核苷酸激酶，对30碱基的RNA5′端标记[γ-32P]ATP，将其作为PemK(His)6的底物。30个碱基的RNA切割产物上样于20％测序胶上(含有7M尿素)，同时上一个RNA梯度条带，它是根据以前的描述(Smith and Roth.(1992)J Biol Chem267，15071-15079)，通过对5′端标记的30碱基RNA进行部分碱性水解得到的。根据以前的描述(Zhang et al.(2003)同上)，测定RNA-RNA双链和RNA-DNA双链的形成对PemK介导的RNA切割的影响。PemK在体内对mRNA的作用的Northern印迹和引物延伸分析将pIN-MazG和pIN-Era质粒转化到包含pBAD-K的大肠杆菌BW25113细胞中，分别产生BW25113/pBAD-K/pIN-MazG和BW25113/pBAD-K/pIN-Era菌株。细胞在含有氨苄青霉素(50ug/ml)和氯霉素(20ug/ml)的LB培养基上37摄氏度生长。OD600数值达到0.4时，加入IPTG至终浓度为1mM，诱导mazG或者era mRNA的合成。在37摄氏度继续孵育30分钟后，加入阿拉伯糖至终浓度为0.2％，诱导PemK的表达。PemK诱导后在不同的时间间隔取样。根据以前的描述(Sarmientos et al.(1983)Cell 32，1337-1346)，使用热苯酚法提取总细胞RNA。使用含有全长mazG或者era基因ORF的DNA片段分别制备两个放射性标记的探针，将其用于Northern印迹分析。使用引物G2(用于mazG mRNA)或者E1(用于era mRNA)进行引物延伸分析。为了检测lpp mRNA，加入阿拉伯糖以后不同时刻从大肠杆菌BW25113/pBAD-K中提取总细胞RNA，进行Northern印迹分析，使用放射性标记的lpp ORF DNA片段作为探针。使用引物lpp-C(5′-AGAATGTGCGCC ATTTTTCACT-3′)(SEQ ID NO28)进行lpp mRNA的引物延伸分析。关于附图的特定方法学细节图26，PemK对体内DNA和蛋白质合成的影响。(A)PemK对DNA合成的影响。含有pBAD-K的大肠杆菌BW25113细胞于37摄氏度生长在M9培养基中，甘油作为碳源。当培养物的OD600达到0.6时，加入阿拉伯糖至终浓度为0.2％，诱导PemK的表达。通过在PemK诱导后不同时刻检测甲基-3H-胸腺嘧啶的掺入，测定DNA的复制速率，根据材料和方法中的描述进行。(B)PemK对蛋白质合成的影响。通过在PemK诱导后不同时刻检测[35S]-甲硫氨酸的掺入，测定蛋白质的合成速率，根据材料和方法中的描述进行。(C)PemK诱导后总细胞蛋白质合成的SDS-PAGE分析。在PemK诱导后所示的时刻取出细胞培养物(1毫升)，与5uCi[35S]-甲硫氨酸混合。37摄氏度掺入1分钟后，将[35S]-甲硫氨酸掺入反应混合物(500微升)加入到含有25微升100％TCA溶液和100微克/毫升非放射性甲硫氨酸的预冷试管中。离心收集细胞沉淀，进行SDS-PAGE后自显影。用箭头表示的条带是PemK。图27，PemK和PemI对无细胞蛋白质合成的影响。(A)PemK对无细胞蛋白质合成的抑制。蛋白质合成在大肠杆菌T7 S30提取物系统(Promega)中37摄氏度进行1小时。从pET11a-MazG中表达MazG，从质粒pET28a-Era中表达(His)6Era。泳道1，未加入PemK的对照；泳道2-5，分别加入0.125，0.25，0.5，和1微克PemK(His)6。(B)PemI对由PemK介导的无细胞系统中蛋白质合成抑制的解除。泳道1，没有加入PemK(His)6的对照；泳道2，加入1微克PemK(His)6；泳道3-5，1微克PemK(His)6与0.5，1，2微克(His)6PemI分别共同加入。(C)无细胞系统与PemK预孵育对于蛋白质合成的影响。在加入pET28a-Era质粒以前，无细胞系统与PemK(His)6或者不加入PemK(His)6，37摄氏度预孵育15分钟。在37℃孵育下，使蛋白质合成再进行1小时。反应产物使用SDS-PAGE进行分析，之后进行自显影。泳道1，不与PemK(His)6预孵育的对照；泳道2，与1微克的PemK(His)6预孵育，之后加入pET28a-Era质粒；泳道3，与1微克的PemK(His)6预孵育，之后一起加入pET28a-Era质粒和1微克(His)6PemI；泳道4，与1微克的PemK(His)6和1微克的(His)6PemI一起共同孵育，之后加入pET28a-Era质粒。图28，PemK的核糖核酸内切酶活性。(A)PemK对mazG mRNA的切割以及PemI对PemK介导的RNA切割的抑制作用。泳道1，对照，仅有mazG mRNA；泳道2，mazG mRNA(1.5微克)与0.2微克PemK(His)6共同孵育；泳道3-6，mazG mRNA(1.5微克)与0.2微克PemK(His)6以及0.05，0.1，0.2和0.4微克(His)6PemI分别共同孵育；泳道7，mazG mRNA(1.5微克)与0.4微克(His)6PemI共同孵育。反应在37摄氏度进行15分钟，之后反应产物用3.5％的非变性PAGE进行分析，使用TAE缓冲液。(B)，(C)，(D)和(E)，mazG mRNA和era mRNA中PemK切割位点的引物延伸分析。根据材料和方法中的描述进行引物延伸实验。每一个引物延伸产物在6％的测序凝胶上分析，在产物的旁边是使用相同引物制备的DNA测序梯度条带。与PemK(His)6切割位点周围的DNA序列梯度条带互补的RNA序列在右侧显示，切割位点由箭头显示。在本图中显示的是使用引物G1(B)和G2(C)检测到的mazG mRNA中的PemK(His)6切割位点，以及使用引物E1(D)和E4(E)检测到的era mRNA中的PemK(His)6切割位点。图29，通过RNA/RNA的形成抑制PemK核糖核酸内切酶活性。合成一个30碱基的RNA，其序列与mazG mRNA中PemK(His)6切割位点周围的序列相同(表II，第二行)。(A)30碱基RNA上的PemK切割位点。使用T4多核苷酸激酶用[γ-32P]-ATP对30碱基RNA的5′端标记，然后与PemK(His)6在37摄氏度下孵育15分钟。切割产物在20％的测序胶上分析。泳道1，5′端标记[32P]的11碱基RNA大小标记；泳道2，根据以前的描述(Smith and Roth.(1992)J Biol Chem267，15071-15079)，使用部分碱性水解从5′端标记[32P]的30碱基RNA制备的RNA梯度条带；泳道3，未使用PemK(His)6处理的5′端标记[32P]的30碱基RNA；泳道4，5′端标记[32P]的30碱基RNA使用PemK(His)6切割的切割产物。泳道1和4中的每一个条带的大小以其总核苷酸的数目表示。(B)RNA-RNA双链的形成对PemK核糖核酸内切酶活性的影响。泳道1，仅有标记[32P]的30碱基RNA(1pmol)；泳道2，标记[32P]的30碱基RNA(1pmol)与0.2微克PemK(His)6在37摄氏度孵育15分钟；泳道3-7，标记[32P]的30碱基RNA(1pmol)与其30碱基的反义RNA按照所示的不同比例发生退火，然后与0.2微克PemK(His)6在37摄氏度孵育15分钟。反应产物使用15％的PAGE进行分析，然后进行自显影。图30，Northern印迹和引物延伸分析PemK对体内各种不同mRNA的作用。(A)Northern印迹分析PemK在体内对mazG，era和lpp mRNA的作用。在1mM IPTG存在下，分别从pIN-MazG和pIN-Era制备mazG mRNA和era mRNA，30分钟后加入阿拉伯糖(至终浓度0.2％)，以诱导PemK的表达。从大肠杆菌染色体上转录lpp mRNA。PemK诱导之后，在所示的不同时刻提取总细胞RNA，用于Northern印迹分析。对照实验在相同条件下进行，没有PemK的诱导。(B)，(C)和(D)，在体内mazG、era和lpp mRNA中PemK切割位点的引物延伸分析。在所示的不同时刻提取总细胞RNA，用于引物延伸实验。引物延伸产物在6％的测序凝胶上分析，在产物的旁边是使用相同引物制备的DNA测序梯度。与PemK切割位点周围的DNA序列梯度互补的RNA序列在右侧显示，切割位点由箭头显示。在本图中显示的是使用引物G2(B)检测到的mazG mRNA中的PemK切割位点；使用引物E1(C)检测到的eramRNA中的PemK切割位点，以及使用引物lpp-C(D)检测到的lpp mRNA中的PemK切割位点。结果PemK对体内DNA和蛋白质合成的影响pemK基因被克隆到pBAD载体(Guzman et al.(1995)J Bacteriol 177，4121-4130)中产生质粒pBAD-K，将其转化到大肠杆菌BW25113中。通过加入阿拉伯糖至终浓度0.2％诱导PemK在BW25113/pBAD-K中的表达。PemK诱导之后，如图26A和B所示，在不同时刻测定DNA复制和蛋白质合成的速率。DNA的复制和蛋白质的合成都因为PemK的诱导而受到影响，但是DNA复制受到的影响程度显著低于蛋白质合成受到的影响。PemK被诱导10分钟之后，蛋白质的合成被迅速地降低大约50％，而DNA复制的抑制达到类似的水平需要大约100分钟。如图26C所示，PemK诱导之后不同时刻总细胞蛋白合成的SDS-PAGE分析表明，PemK是细胞蛋白质合成的一般抑制剂。PemK诱导之后0-30分钟条带(由箭头指明)的深度增加，然后降低。根据其分子量和诱导动力学，这个条带代表的是被诱导的PemK蛋白质。PemK抑制无细胞系统中的蛋白质合成根据材料和方法的描述，从共表达PemI和PemK(His)6的大肠杆菌菌株BL21(DE3)/pET21cc-IK(His)6中纯化PemK(His)6(C端有标签)。从大肠杆菌菌株BL21(DE3)/pET28a-(His)6I中纯化(His)6PemI(N端有标签)。在以下的体外实验中，PemK(His)6和(His)6PemI被分别称为PemK和PemI。为了确定PemK是否抑制蛋白质的合成，对纯化的PemK对大肠杆菌无细胞RNA/蛋白质合成系统中MazG和(His)6Era合成的作用进行了检测。MazG从质粒pET11a-MazG合成，(His)6Era从质粒pET28a-Era合成，两个合成均在37摄氏度下进行1小时，使用大肠杆菌T7 S30提取物系统(Promega)，在没有PemK(图27A，泳道1)或者PemK含量不断增加(图27A，泳道2-5)的条件下进行。PemK以剂量依赖的形式抑制了MazG和(His)6Era的合成(图27A)。这些结果表明PemK抑制了蛋白质合成，这与在体内观察到的PemK介导的蛋白质合成的抑制(图26B和26C)是一致的。在体内观察到的PemK介导的DNA复制抑制的延迟则被推测是由于细胞蛋白质合成受到抑制的次级效应。有趣的是，加入抗毒素PemI阻断了PemK介导的蛋白质合成的抑制，恢复了MazG和(His)6Era的合成，这也是以PemI剂量依赖的形式出现的(图27B)。应当注意的是，如果PemI和质粒DNA在大肠杆菌无细胞系统与PemK在37摄氏度预孵育15分钟后一起加入反应体系，则预孵育对(His)6Era的合成没有显著的负面影响(比较图27C中的泳道1和3)。但是在没有PemI的情况下，没有蛋白质产生(图27C，泳道2)。显然，不论PemI是在与PemK在体系内预孵育15分钟后加入(图27C，泳道3)，还是PemI与PemK在预孵育时一同加入(图27C，泳道4)，(His)6Era的合成都被恢复了。这些结果提示PemK的第一靶标是mRNA，而不是tRNA、核糖体以及在无细胞系统中蛋白质合成所需要的其他因子。PemK的核糖核酸内切酶活性使用质粒pET11a-MazG作为模板，根据材料和方法中的描述，通过PCR扩增得到包含T7启动子和mazG基因的DNA片段。类似地，使用pET28a-Era作为模板，得到另一个含有T7启动子和era基因的DNA片段。使用T7大规模转录试剂盒(Promega)，从这两个DNA片段中分别制备mazG mRNA和era mRNA。与PemK在37摄氏度下孵育15分钟，将mazG mRNA消化成小片段(图28A，泳道2)，而PemI的加入以剂量依赖的方式抑制了mazG mRNA的切割(图28A，泳道3-6)。PemI自身对于mazG mRNA没有作用(图28A，泳道7)。使用era mRNA作为底物得到类似的结果。这些结果证明PemK是切割mRNA抑制蛋白质合成的核糖核酸内切酶，PemI的作用是抗毒素，它阻断了PemK的核糖核酸内切酶活性。mazG mRNA被PemK切割的产物在3.5％聚丙烯酰胺凝胶上形成清楚的条带(图28A)，这一事实表明PemK在RNA的特异位点上发生切割。根据材料和方法，用PemK部分切割mazG mRNA，然后进行引物延伸，使用了5个不同的寡脱氧核糖核苷酸引物，G1到G5。与进行平行处理但是没有用PemK处理的对照相比，使用PemK处理的产物在6％的测序胶上电泳检测出沿着mazG mRNA有许多特异的切割位点。根据材料和方法，部分被PemK消化的era mRNA也进行了引物延伸反应，使用4个不同的引物，E1到E4，以检测沿着era mRNA的PemK切割位点。为了确定PemK切割位点周围的确切序列，每一个引物延伸的产物都在6％的测序胶上进行分析，使用用相同引物制备的DNA测序梯度条带(图28B-E)。表II显示了在PemK切割位点周围的mRNA序列。显示了mazG mRNA(来自pET11a-MazG)，era mRNA(来自pET28a-Era)以及lpp mRNA(来自大肠杆菌染色体DNA，参见图30D)上PemK切割位点(用箭头表示)周围的mRNA序列。保守的UA 核苷酸用粗体显示。将起始密码子AUG中的A残基编号为+1，则编号显示的是mRNA中核苷酸的位置。 表II显示了在mazG mRNA、era mRNA以及lpp mRNA(lppmRNA参见图30D)的主要切割位点周围的序列，这由引物延伸实验测定。这些发现表明UA二核苷酸在除了一个切割位点以外的所有切割位点中是共有的，且主要的切割出现在UAX(X是C、A或者U)序列中A残基的5′或者3′端，只有一个例外，即切割出现在UGC序列中U和G残基之间(表II，第七行)。在18个测定的切割位点中，UAC序列出现在其中的11个中。根据mazG mRNA中一个PemK切割位点周围的序列设计了一个30碱基的RNA底物，包含UAC序列(表II，第二行)。使用T4多核苷酸激酶，用[γ-32P]ATP对RNA的5′端进行标记。在使用全长mazGmRNA的引物延伸实验中，UAC序列只在A残基的5′端切割(图28B)。但是30碱基的RNA在其中的UAC序列中A残基(在30碱基中第15号碱基)的5′和3′端都切割得很好(图29A)。在15％的非变性PAGE中，30碱基RNA底物的切割产物其迁移是一条带(图29B，泳道2)。如果在加入PemK之前，用反义RNA与30碱基RNA底物以不同比例退火，则反义RNA以剂量依赖的方式抑制了RNA的切割(图29B，泳道3-7)。当使30碱基RNA与其互补DNA形成双链时，得到相似的结果。这些结果表明30碱基RNA底物的PemK的切割位点在RNA-RNA以及RNA-DNA双链中得到保护。因此可以得出结论，PemK是针对单链RNA的序列特异的核糖核酸内切酶。PemK诱导之后的体内mRNA切割为了检查PemK在体内对mRNA的作用，根据材料和方法的描述，在PemK诱导之后的不同时刻提取总细胞RNA，进行Northern印迹和引物延伸分析。16S和23S rRNA在体内对PemK是稳定的，因为通过1％琼脂糖凝胶检查总细胞RNA样品，在PemK诱导以后的60分钟时间内，没有观察到它们条带深浅的显著改变。这表明在体内16S和23S rRNA都受到很好的保护，没有被PemK切割。图30A显示了PemK诱导或者未诱导下，在不同时刻mazG、era和lpp mRNA Northern印迹的结果。mazG和era mRNA分别从pIN-MazG和pIN-Era制备，用1mM的IPTG诱导30分钟，之后加入阿拉伯糖(终浓度是0.2％)以诱导PemK的表达。lpp mRNA从大肠杆菌染色体转录。所有这三个mRNA在PemK表达诱导后10分钟都被降解了，而在没有PemK诱导的情况下，在60分钟的孵育时间内没有观察到任何的变化(图30A)，与mazG和lpp mRNA相比，era mRNA大部分被转化为更小的清楚的条带，该条带在PemK诱导后的60分钟内相对稳定。这一稳定的mRNA切割产物的性质还未知。还进行了引物延伸实验，确定了体内mRNA中的PemK切割位点。mazG、era和lpp mRNA中的各一个切割位点分别示于图30B、C和D中。在所有的情况下，PemK诱导后10分钟就出现了一个条带(图30B、C和D的泳道2)，其深度在PemK诱导后60分钟的孵育时间内逐步增强(泳道2-6)。值得注意的是，该条带在0分钟时几乎无法检测到(泳道1)，清楚地表明观察到的切割是由于PemK的诱导造成的。mazG和lpp mRNA的切割是在UAC序列中的A和C残基之间发生的，而era mRNA的切割是在U和A残基之间发生的。mazG mRNA在体内和体外的切割位点相同(比较图28C和图30B)。在体外使用相同的引物检测时在相同的位点也出现了era的体内切割(比较图28D和图30C)。mazG和era mRNA中被切割的UAC序列是在两个ORF的阅读框之内的，分别编码Try41(MazG)和Tyr7(Era)，而在lpp mRNA中被切割的UAC序列位于两个相邻的密码子即编码Ala73的GCU和编码Thr74的ACU之间。PemK在体内对mRNA的切割是非常特异的，因为没有检测到其他切割事件，如图30B、C和D所示。因此，与RelE(它促进密码子特异的mRNA切割，发生在核糖体的A位点上)(Pedersen et al.(2003)Cell 112，131-140；Hayes and Sauer.(2003)Mol Cell 12，903-911)不同的是，PemK是序列特异的核糖核酸内切酶，能够通过切割mRNA抑制蛋白质的合成，切割的方式与核糖体和密码子的阅读无关。结论本发明部分地涉及了一个新的发现，即由pemI-pemK上瘾组件编码的毒素PemK，是一个序列特异的核糖核酸内切酶。体外和体内的研究表明PemK通过在特异位点处切割mRNA，抑制了蛋白质的合成。在大肠杆菌无细胞系统中，纯化的PemK抑制了蛋白质的合成，而加入PemI能够阻断PemK的抑制作用，恢复蛋白质的合成。而且，在这里证明了mRNA是被PemK降解的，且PemK介导的mRNA切割被PemI抑制。因此PemI的作用是抗毒素，它通过与PemK形成复合物，抑制了PemK的核糖核酸内切酶活性。就核糖核酸内切酶活性而言，PemI-PemK复合物是没有活性的。这里显是PemK对于单链RNA是高度特异的，因为当RNA底物与其反义RNA或者互补DNA形成RNA-RNA或者RNA-DNA双链时，PemK介导的RNA的切割被阻断。这里的结果还表明PemK优选在UAX序列(X是C、A或者U)中A残基的5′或者3′端切割。这里提出的结果还显示PemK对RNA的切割与核糖体无关，这与由relBE上瘾组件编码的RelE显然不同。RelE不能切割游离的RNA，而是以高度的密码子特异性促进核糖体A位点处mRNA的降解(Christensen and Gerdes.(2003)Mol Microbiol 48，1389-1400；Pedersen et al.(2003)Cell112，131-140；Hayes and Sauer.(2003)Mol Cell 12，903-911)。在前面在kis-kid系统(它是一个与pemI-pemK相同的上瘾组件)中进行的研究中，有报导显示Kid(PemK)在体外抑制了ColE1起始阶段的复制，但是对于P4DNA的复制则没有显著影响。DnaB被认为是Kid(PemK)抑制作用的靶标(Ruiz-Echevarria et al.(1995)JMol Biol 247，568-577)。但是没有数据支持Kid(PemK)和DnaB之间的相互作用。有趣的是，注意到ColE1复制是由RNAII起始而被RNAI抑制的(Cesareni et al.(1991)Trends Genet 7，230-235；Davison.(1984)Gene 28，1-15)，而P4DNA的复制主要受到α蛋白质的调控(Briani et al.(2001)Plasmid 45，1-17)。参与RNAI和RNA II代谢的RNA酶预计在控制ColE1质粒的复制中起到重要作用(Jung andLee.(1995)Mol Biol Rep 22，195-200)。RNA II含有多个UAC序列，其中两个存在于第一和第二茎环的环区(Tomizawa and Itoh.(1982)Cell 31，575-583；Tomizawa.(1984)Cell 38，861-870)。因此ColE1 DNA复制被Kid(PemK)的抑制可能是由于RNA II被Kid(PemK)的核糖核酸内切酶活性降解所致。而且，细菌内的毒素Kid(PemK)抑制各种不同真核细胞生长的事实(de la Cueva-Mendezet al.(2003)Embo J22，246-251)，可以通过其针对细胞mRNA的核糖核酸内切酶活性，而不是其与DnaB的相互作用而容易地得到解释。在许多细菌中都已经发现了PemK的同源物。MazF(ChpAK)和ChpBK是大肠杆菌中的两个类PemK蛋白(Santos Sierra et al.(1998)FEMS Microbiol Lett 168，51-58；Masuda et al.(1993)JBacteriol 175，6850-6856；Christensen et al.(2003)J Mol Biol332，809-819)。由mazEF上瘾组件编码的毒素MazF(ChpAK)，与PemK有25％的一致性；由chpB上瘾组件编码的毒素ChpBK，与PemK有41％的一致性。值得注意的是，已知MazF(ChpAK)和ChpBK通过与RelE类似的方式切割mRNA，抑制翻译(Christensen et al.(2003)同上)。但是本发明的发明者最近证明，MazF是核糖核酸内切酶，它通过在特异序列处切割单链mRNA抑制蛋白质的合成(Zhang et al.(2003)MolCell 12，913-923)，其作用不依赖于核糖体。MazF优选地在ACA序列的A和C残基之间切割mRNA(Zhang et al.(2003)同上)。Kid(PemK)蛋白的晶体结构已经被确定为同源二聚体(Hargreaves等人(2002)Structure(Camb)10，1425-1433；Hargreaves et al.(2002)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr58，355-358)。尽管MazF的结构还没有被确定，Kamada et al(2003)已经报导了MazE-MazF复合物(MazF2-MazE2-MazF2)的晶体结构，复合物是由两个MazF同二聚体和一个MazE同二聚体形成的。有趣的是，Kid(PemK)同二聚体的结构与MazE-MazF复合物中MazF同二聚体的结构相似。但是在结合了MazE的MazF同二聚体中，β链S1和S2之间的保守环(称为S1-S2环)伸向溶剂中，大部分无规排列，而在Kid(PemK)同二聚体中两个相应的环形成“紧密的”构象(Kamada etal.(2003)Mol Cell 11，875-884)。在Kid(PemK)同二聚体结构中的S1-S2环，形成了一个类似空洞的结构，包括了碱性的表面和保守的疏水口袋。保守的疏水口袋在MazE-MazF复合物的形成中对于MazE的识别起重要所用(Kamada et al.(2003)同上)。本发明的发明者已经提出，携带大量负电荷的MazE的C端延伸可能模拟了单链RNA，它结合在MazF同二聚体中的S1-S2环之间(Zhang et al.(2003)同上)。PemI被认为以非常类似的方式与PemK结合，阻断了PemK的核糖核酸内切酶活性。本发明的发明者已经对PemK和MazF进行了性质研究，它们被确定为对单链RNA序列特异的核糖核酸内切酶，但是它们的生理功能看起来仍然与其他已知的核糖核酸内切酶，如RNA酶E，A和T1有明显区别。PemK和MazF通过干扰细胞mRNA的功能而成为一般的蛋白质合成抑制剂。众所周知小的RNA，如micRNA(mRNA-干扰互补RNA)(Mizuno et al.(1984)Proc Natl Acad Sci USA 81，1966-1970)，miRNA(Ambros.(2001)Cell 107，823-826)和siRNA(Billy et al.(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98，14428-14433)，干扰特异靶标RNA的功能。核酶也特异地作用于靶标RNA上，干扰其功能(Puerta-Fernandez et al.(2003)FEMS Microbiol Rev 27，75-97)。本发明的发明者提出PemK及PemK的同源物(包括MazF)形成一个新的核糖核酸内切酶家族，它们具有新的mRNA干扰机制，使得mRNA在特异的序列处被切割。因此它们在这里被命名为“mRNA干扰酶”。如以前所报导的，Kid(PemK)引发人类癌细胞的凋亡，而Kis(PemI)抑制Kid(PemK)的毒性作用(de la Cueva-Mendez et al.(2003)同上)。因此，这一新的可调控mRNA干扰系统，有可能会在人类疾病的治疗性处理(例如基因治疗)中发挥作用。
实施例V正如这里所显示的，PemK的功能是高度序列特异的核糖核酸内切酶，它在UAX序列处切割细胞mRNA，其中X是C、A或者U。这种活性可以实现对细胞中蛋白质合成部分或者完全的抑制。依据四种核苷酸中的任何一种掺入到前两个核苷酸位置的每一个位置的可能性是相同的原理以及所示的三个核苷酸中的任一个将会整合到第三个核苷酸位置，根据标准的计算，UAX序列(其中X是C、A、U)出现在RNA转录产物中的预测频率是3/64。应当理解，与预测频率比较，一些RNA转录产物中包含较低或者较高频率的UAX序列。因此，特异RNA转录产物或者相关RNA转录产物被PemK核糖核酸内切酶切割的敏感性取决于UAX序列或者PemK靶标序列在转录产物中的频率。而且，本领域内具有普通技术的人员能够根据RNA转录产物的序列预测转录产物对于PemK介导的切割的敏感性。
实施例VI一般地，RNA干扰酶以及本发明的特异RNA干扰酶还可以有利地用于体内和体外蛋白质生产系统的组分，在这些生产系统中背景(非特异的)蛋白质的产生大大降低或者被去除，这样产生了“单一蛋白”合成系统。使用“单一蛋白”合成系统表达的蛋白基本上没有污染的蛋白，因此对于最好或者必须使用“纯化”蛋白制备物的应用而言是有用的。这些应用包括，但是不止限于，无需纯化的蛋白质的核磁共振(NMR)分析以及其他蛋白结构测定，包括涉及膜蛋白的结构测定。关于膜蛋白的结构分析，使用本发明的方法产生的蛋白质制备物对于涉及固态NMR的实验方案是非常适宜的。在一个优选的方面，本发明的方法可以有利地用于使用放射性同位素在细胞背景中专门标记特异的膜蛋白。被标记的膜蛋白接下来通过内源细胞机制掺入到适当的细胞膜中，在那里被标记的蛋白质可以很容易地根据其标记的性质被检测到。为了构建用于体内或者体外应用的单一蛋白质合成系统，使用mRNA干扰酶(例如PemK和/或MazF)对该系统进行预处理，所述mRNA干扰酶切割内源mRNA，阻断蛋白质从这些mRNA的合成。为了在体内实现这种预处理，将mRNA干扰酶的可调控基因引入细胞或者组织中，诱导其表达。将外源基因引入细胞和/或组织中并表达的方法，在以上有所描述，并且是本领域内已知的。为了实现体外的mRNA干扰酶预处理，将纯化的mRNA干扰酶加入到体外的翻译系统中。在本领域中已知各种不同的体外翻译系统，包括，但是不止限于，兔网织红细胞、小麦胚芽以及大肠杆菌的提取物。对于在这些体内或者体外系统的任何一个中生产“单一蛋白”，对编码所需蛋白的遗传构建体进行工程化，转录出其中所有mRNA干扰酶靶序列都已经被去除的mRNA。该步骤产生的mRNA对于向“单一蛋白”表达系统中加入的mRNA干扰酶的核糖核酸内切酶活性不敏感。这样经过工程化的本发明mRNA转录产物在这里可以被称为“抗干扰酶的mRNA”。通过从例如工程化的构建体中诱导其表达，从而表达抗干扰酶的mRNA。抗干扰酶的mRNA被翻译为蛋白质，而基本上没有其他对mRNA干扰酶活性敏感的蛋白质的翻译，这样实际上产生的是单一蛋白质样品。该方法可以用于原核或者真核系统。应当理解使用mRNA干扰酶处理也可以同时与抗干扰酶mRNA的表达/诱导或者添加同时进行。这种方法可以与涉及单一蛋白合成的本发明的体外或者体内(基于细胞的)系统共同使用。基于细胞的表达系统因为MazF是一个序列特异(ACA)的核糖核酸内切酶，它只对单链RNA起作用(zhang et al.2003，同上)，所以开发基于细胞的“单一蛋白质”合成系统，示例MazF在这些应用中的用途。这样，开发出单一蛋白质合成系统，以在细菌细胞中合成成熟的人类嗜酸性粒细胞趋化蛋白。为了达到这一目的，合成编码野生型嗜酸性粒细胞趋化蛋白氨基酸序列的新型核酸序列。从该新型核酸序列转录的RNA分子没有ACA序列。参见图35，SEQ ID NO30-31(分别是成熟的人类嗜酸性粒细胞趋化蛋白的核酸和氨基酸序列)。这个编码成熟人类嗜酸性粒细胞趋化蛋白的核酸被克隆到冷激载体(pCOLDI)中，该载体在低温下孵育，在IPTG存在时表达蛋白。参见图36。该表达系统的显著优势是低的非特异性蛋白表达背景。应当理解编码目标多肽的核酸序列可以使用各种不同的方法产生。这些方法包括设计和产生能够编码目的多肽的合成核酸序列，其中的核酸序列没有ACA序列；以及分离能够编码目的多肽的核酸序列和将其中的每一个ACA序列突变为另一个三联体序列，其中这些突变就改变核酸所编码的氨基酸序列而言是沉默突变。材料和方法使用pCold I载体进行冷激诱导由于pCold I载体包含lac操纵子，所以加入1mM IPTG诱导由这个调控元件控制的基因的表达。对于一些蛋白，优选在细胞达到对数中期(OD600＝0.4-0.7)时在15摄氏度诱导，以提高蛋白质的折叠。为了确定适于最佳蛋白质产量的条件，在诱导后不同的时间间隔取样，用SDS-PAGE分析。一般地，在表达被诱导时，细胞在LB培养基中培养，但是在需要使用放射性同位素，例如15N或者13C标记蛋白质时，要使用M9或者MJ9培养基。在这里下面显示了从pColdI载体的SD位点到多克隆位点的核苷酸序列。表达的蛋白质在N端包含15个残基的可删除序列，它由一个下游盒子(DB，它是翻译增强顺式元件)、His6标签和Xa因子位点组成，之后是多克隆位点。
GAGG SDTAATACACC SD下游的序列(SEQ ID NO29)ATGAATCACAAAGTGDB(SEQ ID NO30)CATCATCATCATCATCAT His6(SEQ ID NO31)ATCGAAGGTAGG 因子Xa位点(SEQ ID NO32)CATATGGAGCTCGGTACCCTCGAG GGATCCNdeI SacI KpnI XhoI BamHIGAATTCAAGCTTGTCGACCTGCAGTCTAGA 多克隆位点(SEQ ID NO33)EcoRI □HindIII SalI PstI XbaI为了构建pCold(SP)嗜酸性粒细胞趋化蛋白(这里也称为pSPSeotaxin)，以上所示的两个用粗斜体显示的ACA序列被改变为ATA，以去除MazF干扰酶的识别位点。应当理解本发明的方法能够用于任何表达载体或者表达载体系统(例如pET载体)。pCold I载体作为示例性载体提出，且以上实施例的目的不是限制本发明的范畴。关于附图的特异方法学细节图37，包含pACYCmazF的大肠杆菌BL21(DE3)或者包含pACYCmazF和pCold(SP)eotaxin的大肠杆菌BL21(DE3)在含有适当抗生素的M9-葡萄糖培养基中培养。当培养物的OD600达到0.5时，培养物转移到15摄氏度中培养15分钟，向其中加入1mM IPTG。在所示的时间间隔，取出1毫升培养物，加入到含有10uCi35S-甲硫氨酸的试管中，在15分钟孵育(脉冲)之后，加入0.2毫升50毫克/毫升甲硫氨酸，孵育5分钟(追踪)。使用M9-葡萄糖培养基漂洗标记的细胞，然后重悬于100微升的SDS-PAGE上样缓冲液中。每个样品取10微升用SDS-PAGE进行分析，之后进行自显影。结果包含编码成熟人类嗜酸性粒细胞趋化蛋白的新型核酸序列的pCOLDI被用作模板。参见图36。产生的质粒被命名为pCold(SP)eotaxin。使用包含T7启动子控制下的mazF基因的质粒pACYCmazF，诱导MazF的表达。包含pACYCmazF自身或者pACYCmazF以及pCold(SP)eotaxin的大肠杆菌BL21(DE3)细胞在含有适当抗生素的M9-葡萄糖培养基中培养。当培养物的OD600达到0.5时，培养物转移到15摄氏度中培养15分钟，向其中加入1mM IPTG。在所示的时间间隔，取出1毫升培养物，加入到含有10uCi35S-甲硫氨酸的试管中，在标记存在下孵育(脉冲)15分钟之后，加入0.2毫升50毫克/毫升甲硫氨酸，孵育5分钟(追踪)。使用M9-葡萄糖培养基漂洗标记的细胞，然后重悬于100微升的SDS-PAGE上样缓冲液。每个样品中取10微升用SDS-PAGE进行分析，之后进行自显影。正如以前所报导的(Zhang et al.2003，同上)，mazF基因的表达抑制了BL21(DE3)细胞中蛋白质的合成。但是成熟人类嗜酸性粒细胞趋化蛋白(由不包含ACA序列的mRNA编码)的合成不被mazF的表达抑制。参见图37。该结果证明可以使用本发明的单一蛋白制备方法获得大量的单一蛋白。重要的是，进行了平行的实验，其中只包含pCold(SP)eotaxin的大肠杆菌BL21(DE3)细胞在含有适当抗生素的M9-葡萄糖培养基中培养。这些实验显示了MazF表达在该系统中的作用。当携带pCold(SP)eotaxin的细胞在没有MazF诱导而被冷激时，与人类嗜酸性粒细胞趋化蛋白同时产生了大量的背景大肠杆菌蛋白。正如这里所描述的，当MazF与嗜酸性粒细胞趋化蛋白一同被诱导时，细胞蛋白质背景被显著降低。在3小时MazF诱导之后，背景蛋白质的表达几乎被完全去除了，产生了能够持续只表达单一蛋白即人类嗜酸性粒细胞趋化蛋白的细胞。嗜酸性粒细胞趋化蛋白的表达持续至少72小时，在前36小时嗜酸性粒细胞趋化蛋白的产生速率没有改变，表明细胞蛋白质合成的能力在几乎3天中没有受到MazF表达的影响。这证明，蛋白质合成所需要的核糖体、tRNA、所有其他细胞组分都没有受到MazF诱导的影响。这些结果还意味着能量代谢和核苷酸合成以及氨基酸的生物合成，基本上不受MazF表达的影响。还值得注意的是，在MazF表达被诱导的细胞培养物的72小时孵育过程中，OD600(0.5)没有增加，表明在MazF诱导之后细胞的生长被完全抑制，而细胞保持了完好的蛋白质合成能力。但是在没有MazF诱导的情况下，OD600在15摄氏度的72小时孵育时间中从0.5升高到1.2，这可以从背景细胞蛋白的产生看出。为了确定在以上表达系统中嗜酸性粒细胞趋化蛋白的产生水平，分离相同量的培养物，用SDS-PAGE进行分析。冷激后36小时，出现了一条清晰染色的嗜酸性粒细胞趋化蛋白条带，占总细胞蛋白的大约5％。这些结果是使用以上描述的M9基本培养基获得的。使用M9培养基对于使用13C葡萄糖和15N氯化铵进行蛋白质的同位素富集是重要的。但是如果需要的是大量生产未标记的蛋白质，可以使用营养培养基，例如LB培养基。的确，本发明的发明者已经发现，在LB培养基中孵育的培养物，嗜酸性粒细胞趋化蛋白的产量可以高达总细胞蛋白的20％或者40毫克/升培养物(1克每25升培养物)。重要的是注意到在M9或者LB培养基中孵育的细胞产生的嗜酸性粒细胞趋化蛋白是完全可溶的，没有形成包含体。如上面所表明的，在孵育过程中细胞质量没有增加，因为在冷激孵育中细胞生长被完全抑制了。因此细胞机器被完全用于本发明的单一蛋白生产系统(SPP)中冷激之后pCold载体中克隆的基因的生产。因此，在MazF诱导之后，可以将细胞培养物浓缩到在出现细胞生长的条件下与细胞维持存活不一致的程度。的确，本发明的发明者已经测定，可以将指数生长的培养物浓缩至少4倍(OD600从0.7到2.8)而不影响克隆基因产物的产量。这意味着可以使用出现细胞生长的正常培养物所用培养基25％的培养基。换言之，有可能仅仅使用6.5升的LB培养基生产出1克的人嗜酸性粒细胞趋化蛋白。这是本发明的SPP系统有特别重大意义的优势，因为这个特点明显降低了表达大量蛋白或者用于NRM结构研究的富集了同位素的蛋白所需的成本。无细胞表达系统兔网织红细胞、小麦胚芽和大肠杆菌的提取物包括最常使用的无细胞翻译系统。所有的提取物都制备为粗提取物，包含外源RNA翻译所必需的大分子组分(70S或者80S核糖体、tRNA、氨酰tRNA合成酶、起始、延伸和终止因子等等)。一般向每一种提取物中补充氨基酸、能量来源(ATP，GTP)、能量再生系统(对于真核系统是磷酸肌酸和肌酸磷酸激酶，对于大肠杆菌裂解物为磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸激酶)以及其他的辅助因子(例如Mg2+，K+，等)以保证有效的翻译。所使用的遗传物质(例如RNA或者DNA)决定了两种体外蛋白质合成的方法中哪一种是有用的。标准的翻译系统，例如网织红细胞裂解物使用RNA作为模板，而“偶联的”和“连接的”系统使用DNA模板转录为RNA，然后再翻译RNA。兔网织红细胞裂解物兔网织红细胞裂解物是用于外源RNA(天然的或者工程化的)翻译的有效的体外真核蛋白合成系统。网织红细胞是高度特化的具核细胞，它们的体内功能主要是血红蛋白的合成，而血红蛋白占据网织红细胞合成蛋白的90％以上。这些未成熟的红细胞具有制备大量球蛋白所必需的所有机器，包括足量的球蛋白mRNA和细胞翻译系统的组分(这里以上详述并且在本领域内已知的)。可以通过与Ca2+依赖的微球菌核酸酶共同孵育，去除内源球蛋白mRNA，之后通过加入EGTA螯合Ca2+使微球菌核酸酶失活。这种核酸酶处理的裂解物表现出低的背景和即使在低浓度下对外源RNA的有效利用。外源蛋白合成的速率与在完整的网织红细胞内观察到的合成速率相近。可以使用处理或者未处理的网织红细胞裂解物，从加帽或者未加帽的RNA(真核的或者病毒的)合成更大的蛋白质。小麦胚芽提取物由于内源mRNA水平低，使得小麦胚芽提取物具有最低的背景整合，因此它是兔网织红细胞提取物的一个便利的代替。小麦胚芽提取物有效地翻译来自各种不同生物体的外源RNA，包括那些来源于病毒、酵母、高等植物以及哺乳动物的RNA。在翻译含有双链RNA小片段或者抑制兔网织红细胞裂解物的氧化硫醇的RNA时，它是优选的系统。加帽或者未加帽的RNA模板网织红细胞裂解物和小麦胚芽提取物是翻译体外转录的RNA或者从细胞或组织中提取的RNA的有效系统。在使用体外合成的RNA时，5′帽子结构的存在可能提高翻译活性。与网织红细胞裂解物提取物相比，使用小麦胚芽提取物的翻译一般更依赖于帽子。如果认为RNA帽子是必需的，则可以将编码序列亚克隆到原核载体中，其可以直接从大肠杆菌无细胞系统的DNA模板直接表达，从而实现RNA加帽。在标准的翻译反应中，纯化的RNA用作翻译的模板。而另一方面，“连接的”或者“偶联的”系统使用DNA作为模板。RNA转录自DNA，并且随后被翻译而无需任何纯化。这种系统通常需要模板DNA以及原核的噬菌体聚合酶启动子(T7，T3，或SP6)。RNA聚合酶(例如原核噬菌体的RNA聚合酶)将DNA转录为RNA，真核或者原核的提取物将RNA翻译为蛋白质。用于转录翻译反应的DNA模板可以克隆到质粒载体中或者通过PCR产生。“连接的”系统是一个两步反应，包括使用噬菌体聚合酶的转录和接下来在兔网织红细胞或者小麦胚芽裂解物中的翻译。转录和翻译反应可以分别进行或者相偶联。大肠杆菌提取物与转录和翻译连续进行的真核系统不同的是，在大肠杆菌细胞中，转录和翻译同时发生。因此体外的大肠杆菌翻译系统涉及的是一步反应。在转录中，RNA的5′端可以用于核糖体的结合，然后用于翻译，而其3′端仍然在被转录。早先结合到RNA上的核糖体保持了转录产物的稳定性，并且促进了有效的翻译。因此，细菌的翻译系统非常适于快速表达原核或者真核的基因产物。在一个优选的实施方案中，Shine-Dalgarno核糖体结合位点被包括在所用的DNA模板起始密码子的上游，以引发高的蛋白质产量以及最佳的起始保真性。大肠杆菌翻译系统不需要真核RNA加帽子。大肠杆菌提取物还具有其他的益处，即交叉反应性或者其他与真核裂解物中的内源蛋白有关的问题被减少或者去除。而且，大肠杆菌S30提取物系统能够从包含天然大肠杆菌启动子序列(例如lac或者tac)的DNA载体中进行表达。大肠杆菌无细胞系统由富含内源mRNA的粗提取物组成。为了制备这一提取物用于转录/翻译，将其孵育，以翻译内源mRNA，接下来内源mRNA被降解。在这种制备的裂解物中产生的低水平内源mRNA使得能够发现外源合成的产物。真核翻译信号原核和真核mRNA转录产物之间存在一些显著的区别，应该予以考虑。真核mRNA一般具有两种转录后的修饰5′的7-甲基GTP帽子和3′poly(A)尾巴。这两种修饰的目的都是通过阻止未成熟降解而使mRNA稳定。5′的帽子结构还通过促进mRNA与真核核糖体的结合使mRNA的翻译增强，并且保证正确的AUG起始密码子被识别。保守序列，或者“Kozak”序列一般被认为是真核mRNA中最强的核糖体结合信号。为了有效地起始翻译，关键的元件是Kozak序列+1位的G残基和-3位的A残基。缺乏Kozak一致序列的mRNA在真核无细胞系统中有可能被有效翻译，如果该mRNA包含没有稳定二级结构的中等长度的5′非翻译区(UTR)。原核翻译信号在细菌中，通过被称为Shine-Dalgarno(SD)序列的富含嘌呤的区域将核糖体引到AUG起始位点上。该序列与30S核糖体亚基中的16S rRNA的3′端互补。SD区域，位于AUG起始密码子的上游，包含本领域中已知的一致序列。特异的mRNA在与16S rRNA的抗Shine-Dalgarno序列互补的核苷酸的数目上有很大的差异，从少至2个到9个或者更多。核糖体结合位点(RBS)相对于AUG起始密码子的位置(通常从起始位点A开始的-6到-10)对于翻译的效率而言是非常重要的。
实施例VII本发明还包含了制备大量小的单链RNA的方法，该方法涉及简单的生化步骤。开发这一方法使得例如不需要昂贵化学合成步骤的大量siRNA或者miRNA的生产成为可能。简而言之，使用T7RNA聚合酶合成包含多个串联的小的相同序列的RNA。RNA中的串联重复序列被三联体序列隔开，三联体序列可以被本发明的mRNA干扰酶，例如MazF(特异切割ACA序列)或者PemK(特异切割例如UAC序列)特异切割。接下来使用mRNA干扰酶对包含由干扰酶识别序列(即特异的三联体序列)隔开的串联重复序列的RNA进行处理，干扰酶识别掺入的位点，这样就会产生相同的小RNA。
实验方法21碱基的CAGGAGAUACCUCAAUGAUCA(SEQ ID NO34)的制备步骤1合成以下两个21碱基的DNA片段(5′端被磷酸化)11211 105′p-CTCAATGATCACAGGAGATAC-3′(SEQ ID NO35)3′-TCCTCTATGGAGTTACTAGTG-p 5′(SEQ ID NO36)步骤2连接以获得多聚体步骤3使用以下两个引物进行PCR1 12#1 5′-(T7启动子)-GGGACAGGAGATACCT-3′(SEQ ID NO37)#2 3′-TGTCCTCTATGGAGTTACTAGTG-5′(SEQ ID NO38)步骤4使用T7RNA聚合酶从步骤3的DNA片段产生RNA步骤5用MazF处理反应步骤4的RNA产物并且纯化21碱基的产物。对于一些应用，较好的可能是使用带His标签的T7RNA聚合酶和/或MazF，这样可以使用镍层析柱将它们从反应混合物中分离出来。技术人员会理解在目标RNA序列内部存在ACA三联体阻碍了使用MazF作为干扰酶消化RNA。在这种情况下，可以使用例如对于UAC(U或A)三联体序列特异的PemK，而不是MazF。总之，应该对所研究的RNA序列进行分析以确定存在什么样的(如果有的话)已知RNA干扰酶的识别位点。这样的分析对于评价何种RNA干扰酶能够用于涉及某一RNA的应用时是有用的。因此本发明描述了使用简单的生化方法制备大量高质量小RNA(例如siRNA或者miRNA)的方法。同样，该方法为昂贵且技术上复杂的化学合成小RNA的方法提供了成本划算的代替方法。
实施例VIII使用mRNA干扰酶诱导细胞死亡MazF和PemK在被诱导时以序列特异的方式切割细胞mRNA，并且有效地抑制蛋白质的合成，导致细胞生长的抑制和细胞的死亡。已经证明在酵母、非洲爪蟾和人细胞中PemK(Kid)的表达抑制了细胞的增殖。在这些细胞中共表达PemI(Kis)恢复了细胞增殖，因而将细胞从PemK的抑制中释放出来(dela Cueva-Mendez et al.，2003，同上)。如这里以下所描述的，检查了MazF诱导对人细胞的作用。尽管在该实施例中使用了T-Rex系统(Invitrogen)控制MazF的诱导，技术人员应当理解任何可诱导系统都可以用于本发明中。可诱导系统的选择取决于许多实验考虑，包括，但是不止限于，诱导要起作用的细胞类型，所需的表达水平以及诱导的动力学。质粒和细胞系大肠杆菌mazF基因克隆到pcDNA4/TO载体(Invitrogen)中，在四环素操纵子TetO2的控制下，产生质粒pcDNA4/TO-MazF。质粒pcDNA4/TO-MazF转化到T-Rex-293细胞(Invitrogen)中，产生T-Rex 293/MazF细胞系，在该细胞系中，加入四环素可诱导MazF的表达。大肠杆菌mazE基因克隆到pcDNA3载体中，产生质粒pcDNA3-MazE。将pcDNA3-MazE转化到T-Rex 293/MazF细胞中，产生T-Rex 293/MazF/MazE细胞系。MazF对人类细胞的毒性作用在四环素的存在下诱导MazF在T-Rex 293/MazF细胞中的表达。在不同的时刻，通过使用细胞活性染色剂(0.4％台盼兰溶液，Sigma)染色的方法对细胞群中的死细胞进行计数。同时在相同条件下平行进行对照实验，但是没有四环素。如图38所示，与对照(未诱导)细胞的形态相比较，被诱导表达MazF的T-Rex 293/MazF细胞的形态在MazF诱导的第一天就有显著改变。引人注意的是，大约有50％的被诱导表达MazF的细胞到第五天时已死亡，到第七天时有80％的诱导细胞死亡(图38)。这些结果表明MazF对于人细胞是有毒性的。本发明包括了对任何适宜的mRNA干扰酶的使用，这些mRNA干扰酶的表达对可诱导调控元件产生响应或者被这些元件调控。适宜的mRNA干扰酶包括那些在细胞中表达时能够介导毒性作用的mRNA干扰酶。在一个特定的实施方案中，表达mRNA干扰酶的细胞是哺乳动物细胞。本发明示例性的mRNA干扰酶包括大肠杆菌MazF的直向同源物和同源物。因此，本发明还包含在涉及基因治疗的应用中使用本发明的mRNA干扰酶。可以将被工程化而表达某分子(该分子在受试对象例如人受试者中有缺陷或者缺失)的细胞设计为通过本发明的mRNA干扰酶的掺入而自毁的细胞，干扰酶的表达被可诱导的调控元件控制。用于在基因治疗应用中破坏细胞的可诱导手段的整合提供了自动防故障的机制，通过这种机制，在这些细胞对受试对象产生了有益的作用后和/或在它们可能产生有害作用之前即被清除。
实施例IXMazF突变体的产生已经产生了MazF突变体(E24A)，其中的24位谷氨酸(Glu)被丙氨酸(Ala)取代。这个突变的结果是由合成底物测定的mRNA干扰酶活性降低了大约10倍。基于各种原因，MazF活性的降低是重要的。第一，由于突变，MazF(E24A)突变体对表达它的宿主细胞的毒性显著降低。毒性降低使细胞内MazF突变体的表达水平提高。在使用例如pET 28a系统时，已经得到了相当高的MazF产量(纯化后大约15毫克/升)。这一高表达水平对于得到相当大量的MazF是非常重要的，MazF可以被15N和13C进行双标记用于NMR结构测定。第二，突变体MazF的低mRNA干扰酶活性对于测定MazF二聚体上的RNA相互作用位点是重要的，通过将RNA底物加入到15N和13C标记的MazF样品中进行这一测定。第三，因为突变体MazF保持了mRNA干扰酶活性，突变体MazF的结构可能与野生型MazF二聚体的三维结构相似，其与RNA复合的结构预期会对MazF的mRNA干扰酶功能的分子机制提供信息。突变体MazF的表达使用pET 28a进行，这样产物含有N端20个残基的延伸(图39A)，延伸含有His标签和凝血酶切割位点。可以从融合蛋白上将N端延伸切下来，如图39B所示。图39A中的箭头显示了凝血酶切割位点。为了切割全长的MazF(E24A)融合蛋白，将0.04单位的凝血酶加入到10微克Ni-NTA纯化的(His)6MazF(E24A)中，在4摄氏度孵育8小时。使用Ni-NTA层析柱除去切下来的N端片段。图39显示了成功切割和切割的MazF融合蛋白的分离(泳道1，纯化的(His)6MazF(E24A)；泳道2，凝血酶切割后的(His)6MazF(E24A))。N端延伸去除前和去除后的异核单量子相关(heteronuclear single quantum coherence)(HSQC)谱线显示蛋白质在室温下一周内都是稳定的。此外，已经制备了Arg29被Ala替代的MazF突变体。发现该突变体(R29A)与野生型MazF相比毒性也有降低，这使其可以被过量表达。例如纯化的15N标记的MazF(R29A)已经制备出来，表达水平是10毫克/升。该突变体也得到了非常好的HSQC谱线。
实施例X致病细菌中的MazF同源物的鉴定和性质研究来自结核分枝杆菌的MazF同源物的鉴定和性质研究结核病是慢性传染性疾病，它每年导致200万以上的死亡。它可能是人类最古老的疾病之一，是由结核分枝杆菌引起的。本发明的发明者已经在结核分枝杆菌的染色体上鉴定出了一个基因(rv2801c)，该基因编码的蛋白与大肠杆菌MazF高度同源。特别地，本发明的发明者克隆了rv2801c基因并且确定该基因编码的含有118个氨基酸的蛋白与大肠杆菌MazF有40％的一致性。参见图41A。结核分枝杆菌MazF基因(这里命名为MazF-mt1)已经被克隆到pBAD中；对于阿拉伯糖诱导的响应，从pBAD载体中表达的MazF-mt1对于大肠杆菌是有毒性的。重要的是，在MazF-mt1诱导60分钟后细胞的菌落形成单位(CFU)减少了大约104倍。MazF-mt1还被克隆到pET28a中，并且成功表达了带有(His)6标签的MazF-mt1，并在Ni-NTA层析柱上纯化。如图40所示，MazF-mt1表现出在UAC序列处切割RNA的特异性，这与PemK的特异性相似。因此，MazF-mt1的确是mRNA干扰酶家族蛋白的一个成员。简而言之，使用T7RNA聚合酶合成era mRNA，根据本发明中上面的描述进行切割反应。使用相同的引物得到引物延伸和DNA梯度。MazF-mt1的切割位点用箭头表示。除了MazF-mt1基因以外，本发明的发明者还发现了另外四个由结核分枝杆菌染色体编码的MazF同源物，其基因组命名分别是Rv0456A，Rv1991C，Rv0659C和Rv1942C。参见图41B。这些基因与MazF的序列比对显示，这些序列中每一个都是大肠杆菌MazF的同源物，因此被鉴定为结核分枝杆菌的MazF同源物。由Rv1991c，Rv0456a，Rv0659c和Rv1942c编码的MazF同源物被分别命名为MazF-mt2，-mt3，-mt4和-mt5。MazF-mt1，mt2，-mt3，-mt4和-mt5的核酸和氨基酸序列在图43A-E和图44A-E中示出。编码MazF-mt2，-mt3，-mt4和-mt5的基因将被克隆到pBAD载体中，也将会根据前面对于MazF-mt1的描述进行检查在阿拉伯糖存在下诱导它们表达之后它们对大肠杆菌生长的影响。也会根据以上的详述，使用Northern印迹和引物延伸分析检查在结核分枝杆菌MazF同源物诱导后的体内mRNA切割。也会检查结核分枝杆菌MazF同源物存在下的体外和体内蛋白质合成。五个结核分枝杆菌MazF基因中的每一个都会被克隆到分枝杆菌表达载体pMIP12(Picardeau et al.(2003)FEMS MicrobiolLett 229，277-281)中，使它们在耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)(一个非致病菌、生长迅速的模型，属于分枝杆菌属)中表达，检测它们在不同生长条件下在该细菌中的毒性作用。特别有趣的是阐释MazF-mt的基因在结核分枝杆菌中是如何被调控的。结核杆菌的致病取决于肺部肉芽肿的形成，肉芽肿是结核菌在处于由于氧气和营养物质的限制所导致的非生长状态时存在的位置。理解结核菌在这个潜伏期的生理对于改进这种破坏性疾病的诊断和治疗是非常重要的。在不同生长条件下进行结核分枝杆菌基因的DNA微阵列分析，以确定在对这些条件产生应答时MazF-mt基因是如何被调控的。细菌的毒素-抗毒素对的冗余性提示它们在细胞生理中起着重要作用。已经研究了各种不同的生长条件，以发现编码这些分子的基因被诱导表达的体外条件。许多研究提示mazF被诱导的条件之一取决于ppGppp和严谨应答。例如，一个最早期的观察结果是大肠杆菌mazEF缺失突变体在人为升高ppGppp的水平之后并没有死亡(Aizenman et al.，1996，同上)。编码ppGpp合成酶的结核分枝杆菌的relA基因已经被克隆并且进行了性质研究，显示其在体外的长期存活中起作用(Primm et al.，2000，J Bacteriol 182，4889-4898)。那些研究人员证明在所有以下列举的条件下ppGpp(p)的水平升高。为了延伸这些发现，以研究MazF同源物对各种不同生长条件的转录应答，从毒性结核分枝杆菌(菌株H37Rv)中制备RNA，用以下列出的条件对RNA进行处理，进行定量聚合酶链式反应(Q-PCR)研究MazF同源物的转录应答。生长条件稳定期H37Rv细胞在通常的分枝杆菌培养基(Middlebrook 7H9，添加了0.2％葡萄糖，0.2％甘油，0.5％BSA第五级分以及0.1％Tween80)。在达到OD600后，(结核分枝杆菌的倍增时间是大约24小时)，是3天的稳定期，之后制备细胞的总RNA。这个实验的对照是对数中期生长的细胞的RNA。
叠氮化物中期对数生长的H37Rv细胞分成两个培养物一份使用5mM叠氮化钠处理2小时。
碳饥饿用无碳源的7H9培养基漂洗早期到中期对数生长期的H37Rv细胞，并用该培养基重悬24小时。
氨基酸下调H37Rv细胞在添加20种氨基酸的7H9培养基中生长至对数中期。培养物用无氨基酸的培养基充分漂洗，分成两份，分别加入新鲜的含有氨基酸和没有氨基酸的培养基，培养24小时。
氨基酸饥饿使用丝氨酸hydroxymate处理的大肠杆菌细胞使其对L-丝氨酸饥饿，已经显示这样的大肠杆菌被诱导表达mazEF基因座(Christensen et al.，2003，同上)。使用丝氨酸hydroxymate处理的结核分枝杆菌没有显示ppGpp(p)的升高，提示该物种可能对这个氨基酸类似物的毒性不敏感(Primm et al.，2000，同上)。将会对具有已经鉴定的毒性作用的氨基酸类似物诱导MazF-mt同源物的能力进行检测。
抗生素处理检测已知在结核分枝杆菌中影响蛋白质合成(链霉素)和RNA转录(利福平)的抗生素，在H37Rv中诱导MazF同源物的能力。
在全世界三分之一的人口中，结核分枝杆菌以潜伏状态存在，被封闭在肉芽肿中，推测其不能接触到营养物质或者氧气(Flynn andChan，2001，Annu Rev Immunol 19，93-129)。如果宿主的免疫系统由于某种原因受到损害(例如HIV状态、营养不良等)则疾病就会被重新激活。
引起警醒的是，在世界上受到HIV困扰的区域，潜伏的结核病例逐渐增多，这些病例对许多药物具有抗性，因此很难或者不可能治疗。因此，了解驾驭这些直接细菌生长控制内源机制的机制，对于开发出治疗这一破坏性疾病的新型疗法提供了巨大的希望。
因此，确定内源MazF-mt基因在潜伏和激活/重新激活状态中的作用，会为设计和/或发现替代性治疗因子提供有用的信息。本发明的发明者还使用了BLAST搜索，发现MazF同源物存在于许多原核生物体中，包括其他的病原体例如金黄色葡萄球菌和炭疽芽孢杆菌。参见图41。特别地，本发明的发明者已经在金黄色葡萄球菌中发现了MazF的同源物MV1993(MazF-sal)。参见图41B。金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性细菌，它是导致在医院中医源性感染的最为常见的革兰氏阳性病原体。大肠杆菌MazF和MazF-sal显示25％的一致性和44％的相似性。
此外，MazF同源物还在炭疽芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌中被发现。参见图41B。大肠杆菌MazF与其枯草芽孢杆菌中的同源物(MazF-bsl)显示32％的一致性和48％的相似性，与其炭疽芽孢杆菌中的同源物(MazF-bal)显示32％的一致性和48％的相似性。炭疽芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌都是革兰氏阳性细菌。MazF-bsl和MazF-bal之间只有7个氨基酸替代。图41B中显示了氨基酸序列和位置的差异，且在这里予以详述首先显示的是MazF-bsl残基的单字母缩写，然后是数字表示的位置，然后是MazF-bal残基的单字母缩写(A42V，R66K，D97E，E98V，D101I，K102R和A112G)。金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，炭疽芽孢杆菌中的MazF(类Pem)同源物的核酸和氨基酸序列，以及大肠杆菌ChpBK序列示于图45A-D和图46A-D中。
实施例XI大肠杆菌中SPP系统的优化可以通过改变不同的生长条件(以及其他的实验参数)，对本发明的大肠杆菌SPP系统进行优化，用于表达不同蛋白质。技术人员应当理解，关于这方面要达到的目标包括(a)MazF诱导后细胞蛋白质合成能力维持期的延长；(b)降低或者去除背景细胞蛋白的合成以及(c)所需蛋白表达水平的提高。还应当理解本发明的SPP系统可能包括非MazF的mRNA干扰酶的表达。也可以在SPP的背景下考虑可能有助于表达和/或产物稳定性的共表达因子，以使目标多肽获得改善或者优化的表达水平。
本发明的发明者已经改变了MazF诱导之后的许多培养条件，以优化目标蛋白质的生产。尽管这些实验的设计是优化人嗜酸性粒细胞趋化蛋白的表达，但是这些原理也同样很好地适用于其他蛋白的表达。开始，使用大肠杆菌偏好的密码子合成嗜酸性粒细胞趋化蛋白的基因，但是去除了基因中所有的ACA序列。合成的基因克隆到pColdI载体中，使得在冷激或者温度下移至15摄氏度诱导后能够表达嗜酸性粒细胞趋化蛋白。使用这个嗜酸性粒细胞趋化蛋白系统，改变条件，延长嗜酸性粒细胞趋化蛋白在MazF诱导之后的表达，如下面的描述。
本发明的发明者已经确定在37摄氏度诱导MazF之后15摄氏度诱导嗜酸性粒细胞趋化蛋白显著影响了嗜酸性粒细胞趋化蛋白的生产。特别地，15摄氏度诱导MazF和37摄氏度诱导MazF的比较显示，在较高温度下诱导MazF显著降低了由于一般细胞蛋白合成而造成的背景。这个发现的证据是几乎没有可以检测到的对应于细胞蛋白表达的蛋白条带。但是在这些实验条件下，嗜酸性粒细胞趋化蛋白的合成却显著下降。在更高的温度下，MazF可能会因为，例如在更高温度下核糖体/tRNA对MazF的核糖核酸酶活性更为敏感；和/或37摄氏度下蛋白质合成、核苷酸和氨基酸生物合成所需要的其他细胞组分稳定性的降低，以及37摄氏度下的能量产生等原因对细胞产生破坏。
由于这些因素不能在MazF诱导之后的细胞中产生，它们的丧失或者减少将导致嗜酸性粒细胞趋化蛋白生产能力的下降。
为了优化蛋白表达，可以改变一系列的实验参数，包括以下描述的实验参数。应当理解以下条件的描述涉及的是MazF和嗜酸性粒细胞趋化蛋白，但是也同样很好地适用于其他mRNA干扰酶和所需多肽的组合。携带pACYCmazF和pCold(SP)eotaxin的大肠杆菌BL21(DE3)在M9基本培养基(每一管15毫升培养物)中培养，37摄氏度生长至对数中期(OD600＝0.5到0.8)。然后在5个不同的温度37，30，25，20和15摄氏度下诱导MazF。在这些不同的温度下预孵育10分钟后，加入1mM IPTG诱导MazF表达5，10和15分钟。然后在15摄氏度下维持培养物，诱导嗜酸性粒细胞趋化蛋白。在冷激后的0，0.5，1，2，4，8，12，24，36，48，72和96小时用35S-甲硫氨酸标记细胞15分钟。总细胞蛋白的SDS-PAGE分析揭示了考虑到背景细胞蛋白合成、嗜酸性粒细胞趋化蛋白生产速率和嗜酸性粒细胞趋化蛋白生产持续性后的SPP系统的优选条件。对于这次检测和其他多肽的类似的分析，使用考马斯亮蓝染色估计在每一时刻产生的嗜酸性粒细胞趋化蛋白或者其他多肽的实际量。
细胞内蛋白酶例如Lon和ClpP的活性，也可以影响蛋白质的积累和稳定性。已经证明，例如clpP和lon中的突变(单突变或者双突变)显著降低了大肠杆菌菌株中细胞蛋白的降解(Kandror et al.，1994，Proc Natl Acad Sci USA 94，4978-4981)。根据这些发现，可以通过P1转导的方式，将这些突变转导入BL21(DE3)细胞中，构建具有这些突变(lon，clpP和lon-clpP)的菌株，改进SPP系统。因此，检查BL21(DE3)细胞中多肽的积累(在该细胞中这些蛋白酶基因的一个或者多个已经被删除)，可以发现在SPP系统中嗜酸性粒细胞趋化蛋白诱导之后3-4天，蛋白质产量的提高。这样，可以建立用于大肠杆菌SPP系统的特定条件，以得到嗜酸性粒细胞趋化蛋白的最高生产和最低背景的细胞蛋白合成。而且，如这里以上所描述的，这种实验方案同样很好地适用于使用了不同mRNA干扰酶和多肽的其他SPP系统。
另外一个降低背景细胞蛋白合成的措施是提高MazF的生产。这个目的可以通过去除mazF基因中的ACA序列达到，ACA序列的存在可能导致MazF转录产物的降解。令人惊奇的是，在编码111个残基蛋白的mazF ORF中总共有9个ACA序列。就根据随机可能性预测的频率而言，这一ACA序列的频率是非常高的。
这些ACA序列可能在MazF的自我调控中起作用，在自我调控中，MazF在其自身mRNA的这些ACA位点处切割，这样导致MazF蛋白产量的显著下降。根据这些考虑，设想将mazF ORF中的一些或者所有的ACA序列除去。参见图42。重要的是，在MazF中设想的碱基改变不会改变MazF的氨基酸序列。开始，使用基于PCR的方法改变MazF N端的前6个残基，产生的基因被命名为mazFa。
独立地改变C端的三个ACA序列，以及将编码Leu99的密码子从UUA改变为CUG，CUG是大肠杆菌更为偏好的亮氨酸密码子。产生的基因被命名为mazFb。mazFa和mazFb突变的组合产生了所有ACA序列都被除去的mazFa.b。
使用野生型mazF、mazFa(-6ACA)，mazFb(-3ACA)和mazFab(-9ACA)，可以在SPP系统中测定ACA序列从MazF中去除所产生的作用。在实验中，将pACYC mazF中的野生型mazF基因替换为mazFa，mazFb或mazFab。使用这四个质粒，就有可能检查从mazF中去除ACA序列如何有效地降低背景蛋白的合成。
为了使用SPP系统获得更高的蛋白质产量，优选地使用营养培养基例如LB，而不使用M9培养基。因此，实验参数的调整是用于优化在LB培养基中生长的条件。可以根据这里以上的描述，优化各种不同的生长条件用于在LB培养基中的培养。这些条件包括，但是不止限于，MazF诱导的最佳条件，MazF诱导的最佳时间长度，嗜酸性粒细胞趋化蛋白生产的最适温度以及得到最大嗜酸性粒细胞趋化蛋白产量的最佳孵育时间。
尽管对这些实验的描述是以它们使用嗜酸性粒细胞趋化蛋白生产作为模型系统，但是不同蛋白达到最高产量的最佳条件可能有所不同。因此对于每一个目标蛋白可能需要小的实验调整以获得最佳的表达水平。可以使用本领域技术人员已知的其他生长培养基与SPP系统联合使用，并且根据以上对M9和LB培养基的描述对在其他培养基中的表达进行优化。
正如以上所描述的，本发明的发明者已经发现了另外一个来自质粒R100的mRNA干扰酶称为PemK，它在UAC/A/U序列处切割mRNA。参见实施例IV。已经鉴定出了许多其他的mRNA干扰酶，包括大肠杆菌的ChpBK、来自结核分枝杆菌的5个不同的mRNA干扰酶以及来自炭疽芽孢杆菌的一个mRNA干扰酶。
所有上面列出的mRNA干扰酶是可能有用的候选者，可以有利地用于改善SPP系统。一旦它们的RNA切割特异性被研究清楚，可以测定它们在SPP系统中的有效性，并且与MazF的效果进行比较。因为这些mRNA干扰酶预期具有不同的RNA切割特异性，它们可能在降低背景细胞蛋白合成方面更为有效，因此比MazF对细胞的破坏要小。这些mRNA干扰酶不仅仅对于大肠杆菌中SPP系统的开发，而且对于在其他生物体包括酵母中SPP系统的开发也是有用的工具。
这里描述的大肠杆菌SPP系统使用了pColdI载体，它在低温下诱导蛋白的生产。低温下的蛋白生产对于许多蛋白来讲是有益的，因为在较低的温度下它们通常折叠得更为有效且稳定。
而且，共表达分子伴侣可以在SPP系统中进一步提高正确折叠的蛋白质的产量。对于这个目的，被称为触发因子(Kandror andGoldberg，1997，同上)的冷激分子伴侣的基因已经被克隆并且用于本发明的SPP系统中。因为触发因子被认为在低温下帮助蛋白的折叠，可以在SPP系统中利用共表达触发因子对于所需蛋白表达的影响。触发因子的基因以及GroEL和GroES(热激分子伴侣)也将被克隆到pColdI载体中，检查蛋白质的产量以及对所表达的蛋白质可溶性的影响。
尽管已经对本发明的某些优选实施方案进行了以上详细的描述和特别的阐释，但是目的不是将本发明限制在这些实施方案中。在不偏离如下面的权利要求所提出的本发明范畴和精神的情况下可以进行各种不同的改动。
序列表<110>Inouye，MasayoriZhang，JunjieZhang，Yong LongQing，GuoliangSuzuki，Motoo<120>mRNA干扰酶及其使用方法<130>University of Medicine & Dentistry of New Jersey(601-1-131PCT)<140>Not yet assigned<141>2004-06-14<150>60/543,693<151>2004-02-11<150>60/478,515<151>2003-06-13<160>92<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>336<212>DNA<213>大肠杆菌<400>1atggtaagcc gatacgtacc cgatatgggc gatctgattt gggttgattt tgacccgaca 60aaaggtagcg agcaagctgg acatcgtcca gctgttgtcc tgagtccttt catgtacaac 120aacaaaacag gtatgtgtct gtgtgttcct tgtacaacgc aatcaaaagg atatccgttc 180gaagttgttt tatccggtca ggaacgtgat ggcgtagcgt tagctgatca ggtaaaaagt 240atcgcctggc gggcaagagg agcaacgaag aaaggaacag ttgccccaga ggaattacaa 300ctcattaaag ccaaaattaa cgtactgatt gggtag 336<210>2<211>111<212>PRT<213>大肠杆菌<400>2Met Val Ser Arg Tyr Val Pro Asp Met Gly Asp Leu Ile Trp Val Asp1 5 10 15Phe Asp Pro Thr Lys Gly Ser Glu Gln Ala Gly His Arg Pro Ala Val20 25 30Val Leu Ser Pro Phe Met Tyr Asn Asn Lys Thr Gly Met Cys Leu Cys35 40 45Val Pro Cys Thr Thr Gln Ser Lys Gly Tyr Pro Phe Glu Val Val Leu50 55 60Ser Gly Gln Glu Arg Asp Gly Val Ala Leu Ala Asp Gln Val Lys Ser65 70 75 80Ile Ala Trp Arg Ala Arg Gly Ala Thr Lys Lys Gly Thr Val Ala Pro85 90 95Glu Glu Leu Gln Leu Ile Lys Ala Lys Ile Asn Val Leu Ile Gly100 105 110
<210>3<211>333<212>DNA<213>大肠杆菌<400>3atggaaagag gggaaatctg gcttgtctcg cttgatccta ccgcaggtca tgagcagcag 60ggaacgcggc cggtgctgat tgtcacaccg gcggccttta atcgcgtgac ccgcctgcct 120gttgttgtgc ccgtaaccag cggaggcaat tttgcccgca ctgccggctt tgcggtgtcg 180ttggatggtg ttggcatacg taccacaggt gttgtacgtt gcgatcaacc ccggacaatt 240gatatgaaag cacggggcgg aaaacgactc gaacgggttc cggagactat catgaacgaa 300gttcttggcc gcctgtccac tattctgact tga 333<210>4<211>110<212>PRT<213>大肠杆菌<400>4Met Glu Arg Gly Glu Ile Trp Leu Val Ser Leu Asp Pro Thr Ala Gly1 5 10 15His Glu Gln Gln Gly Thr Arg Pro Val Leu Ile Val Thr Pro Ala Ala20 25 30Phe Asn Arg Val Thr Arg Leu Pro Val Val Val Pro Val Thr Ser Gly35 40 45Gly Asn Phe Ala Arg Thr Ala Gly Phe Ala Val Ser Leu Asp Gly Val50 55 60Gly Ile Arg Thr Thr Gly Val Val Arg Cys Asp Gln Pro Arg Thr Ile65 70 75 80Asp Met Lys Ala Arg Gly Gly Lys Arg Leu Glu Arg Val Pro Glu Thr85 90 95Ile Met Asn Glu Val Leu Gly Arg Leu Ser Thr Ile Leu Thr100 105 110<210>5<211>249<212>DNA<213>大肠杆菌<400>5atgatccaca gtagcgtaaa gcgttgggga aattcaccgg cggtgcggat cccggctacg 60ttaatgcagg cgctcaatct gaatattgat gatgaagtga agattgacct ggtggatggc 120aaattaatta ttgagccagt gcgtaaagag cccgtattta cgcttgctga actggtcaac 180gacatcacgc cggaaaacct ccacgagaat atcgactggg gagagccgaa agataaggaa 240gtctggtaa 249<210>6<211>82<212>PRT<213>大肠杆菌<400>6Met Ile His Ser Ser Val Lys Arg Trp Gly Asn Ser Pro Ala Val Arg1 5 10 15Ile Pro Ala Thr Leu Met Gln Ala Leu Asn Leu Asn Ile Asp Asp Glu20 25 30Val Lys Ile Asp Leu Val Asp Gly Lys Leu Ile Ile Glu Pro Val Arg35 40 45Lys Glu Pro Val Phe Thr Leu Ala Glu Leu Val Asn Asp Ile Thr Pro50 55 60Glu Asn Leu His Glu Asn Ile Asp Trp Gly Glu Pro Lys Asp Lys Glu65 70 75 80Val Trp
<210>7<211>258<212>DNA<213>大肠杆菌<400>7atgcatacca cccgactgaa gagggttggc ggctcagtta tgctgaccgt cccaccggca 60ctgctgaatg cgctgtctct gggcacagat aatgaagttg gcatggtcat tgataatggc 120cggctgattg ttgagccgta cagacgcccg caatattcac tggctgagct actggcacag 180tgtgatccga atgctgaaat atcagctgaa gaacgagaat ggctggatgc accggcgact 240ggtcaggagg aaatctga 258<210>8<211>85<212>PRT<213>大肠杆菌<400>8Met His Thr Thr Arg Leu Lys Arg Val Gly Gly Ser Val Met Leu Thr1 5 10 15Val Pro Pro Ala Leu Leu Asn Ala Leu Ser Leu Gly Thr Asp Asn Glu20 25 30Val Gly Met Val Ile Asp Asn Gly Arg Leu Ile Val Glu Pro Tyr Arg35 40 45Arg Pro Gln Tyr Ser Leu Ala Glu Leu Leu Ala Gln Cys Asp Pro Asn50 55 60Ala Glu Ile Ser Ala Glu Glu Arg Glu Trp Leu Asp Ala Pro Ala Thr65 70 75 80Gly Gln Glu Glu Ile85<210>9<211>24<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>T54 to K77 fragment of E.coli MazE<400>9Thr Leu Ala Glu Leu Val Asn AspIle Thr Pro Glu Asn Leu His Glu1 5 10 15Asn Ile Asp Trp Gly Glu Pro Lys20<210>10<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>大肠杆菌MazE的N60-K77片段<400>10Asn Asp Ile Thr Pro Glu Asn Leu His Glu Asn Ile Asp Trp Gly Glu1 5 10 15Pro Lys
<210>11<211>30<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成的RNA底物<400>11uaagaaggag auauacauau gaaucaaauc 30<210>12<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>单链寡核苷酸<400>12gctcgtatct acaatgtaga ttgatatata ctgtatctac atatgatagc50<210>13<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>单链寡核苷酸<400>13cgagcataga tgttacatct aactatatat gacatagatg tatactatcg50<210>14<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>14agatctcgat cccgcaaatt aat 23<210>15<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>15ttagagatca atttcctgcc gttttac 27<210>16<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>16ttaaagatcg tcaacgtaac cg 22
<210>17<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>17tgctctttat cccacgggca gc 22<210>18<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>18gcccagttca ccgcgaagat cgtc 24<210>19<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>19ggttttgatt tgctcccaac gggcaag 27<210>20<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>20catttcctcc tccagtttag cctggtc27<210>21<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>21ttgccagact tcttccattg tttcgag27<210>22<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>22gatccccaca atgcggtgac gagt 24
<210>23<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>23cacgttgtcc actttgttca ccgc 24<210>24<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>24cagttcagcg ccgaggaaac gcat 24<210>25<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>25gcgttcgtcg tcggcccaac cgga 24<210>26<211>30<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义RNA<400>26gauuugauuc auauguauau cuccuucuua 30<210>27<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>互补DNA<400>27gatttgattc tatgtatat ctccttctta 30<210>28<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>28agaatgtgcg ccatttttca ct 22
<210>29<211>9<212>DMA<213>人工序列<220>
<223>DNA片段<400>29taatacacc 9<210>30<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>30atgaatcaca aagtg 15<210>31<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA片段<400>31catcatcatc atcatcat18<210>32<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA片段<400>32atcgaaggta gg 12<210>33<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>多克隆位点<400>33catatggagc tcggtaccct cgagggatcc gaattcaagc ttgtcgacct gcagtctaga 60<210>34<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>34caggagauac cucaaugauc a21
<210>35<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>35ctcaatgatc acaggagata c21<210>36<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>36tcctctatgg agttactagt g21<210>37<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>37gggacaggag atacc t 16<210>38<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>38tgtcctctat ggagttacta gtg 23<210>39<211>330<212>DNA<213>耐盐芽孢杆菌<400>39atgccagtac cggatagagg gaatcttgtt tatgtagact ttaacccaca atcgggtcat 60gaccaagccg ggacacgacc ggctattgtt ttgtccccta aattatttaa taaaaacaca 120ggttttgcgg tggtttgtcc aattaccaga caacaaaaag gttatccttt tgaaatagaa 180ataccaccgg ggttacctat tgaaggggtt attcttactg accaagtaaa aagtctggat 240tggagagcaa gaaactttca cattaaagga caagcaccag aggaaactgt tactgattgt 300ttacaactta ttcatacatt tttatcttaa 330<210>40<211>363<212>DNA<213>表皮葡萄球菌<400>40atgattagaa gaggagatgt ttatttagcg gatttatcac cagttcaagg gtctgaacaa 60gggggagtaa gacctgtagt tatcattcaa aatgatactg gtaataaata tagtccaact 120gtaattgtag ctgcgattac tgatgggatt aataaagcga aaataccaac ccacgtagaa 180
attgaaaaga aaaagtataa attagacaaa gattcagtta ttcttcttga acaaattaga 240acactagata aaaagcgttt aaaagaaaaa ttaacatttt tatcagagag taaaatgata 300gaggttgata atgccttaga tattagtttg ggattaaata actttgatca tcataaatct 360taa 363<210>41<211>411<212>DNA<213>金黄色葡萄球菌<400>41atgattagac gaggagatgt ttatttagca gatttatcac cagtacaggg atctgaacaa 60gggggagtca gacctgtagt cataattcaa aatgatactg gtaataaata tagtcctaca 120gttattgttg cggcaataac tggtaggatt aataaagcga aaataccgac acatgtagag 180attgaaaaga aaaagtataa gttggataaa gactcagtta tattattaga acaaattcgt 240acacttgata aaaaacgatt gaaagaaaaa ctgacgtact tatccgatga taaaatgaaa 300gaagtagata atgcactaat gattagttta gggctgaatg cagtagctca accagaaaaa 360ttaggcgtct attatatgta tttttcagag ataaataaaa tattgatata a 411<210>42<211>351<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌<400>42ttgattgtga aacgcggcga tgtttatttt gctgatttat ctcctgttgt tggctcagag 60caaggcgggg tgcgcccggt tttagtgatc caaaatgaca tcggaaatcg cttcagccca 120actgctattg ttgcagccat aacagcacaa atacagaaag cgaaattacc aacccacgtc 180gaaatcgatg caaaacgcta cggttttgaa agagattccg ttattttgct ggagcaaatt 240cggacgattg acaagcaaag gttaacggat aagattactc atctggatga tgaaatgatg 300gataaggttg atgaagcctt acaaatcagt ttggcactca ttgattttta g 351<210>43<211>324<212>DNA<213>脑膜炎奈瑟氏球菌<400>43atggatatgg tagtacgcgg cggaatctat ctggtctcct tagacccgac cgtaggaagc 60gaaatcaaaa agacacgtcc ttgtgtcgta gtctctcctc ctgaaataca caactatctc 120aagactgtgc tgatcgttcc catgacgagc ggaagccgtc ctgccccgtt ccgcgtcaat 180gtccgctttc aggataaaga cggtttgctt ttgcccgaac agattagggc tgtggataaa 240gccggattgg tcaaacatct tggcaattta gacaacagta cggctgaaaa actgtttgca 300gtattgcagg agatgtttgc ctga324<210>44<211>366<212>DNA<213>摩氏摩根氏菌<400>44atgcgccggc ggctggtcag gaggaaatct gacatggaaa gaggggaaat ctggcttgtc 60tcgcttgacc ctaccgcagg tcatgagcag cagggaacgc ggccggtact gattgtcacg 120ccggctgctt ttaaccgcgt gacccgcctg cctgttgttg tgcccgtgac cagcggaggt 180aattttgccc gcacagcagg ctttgctgtg tcgcttgacg gcgccggcat acgtaccacc 240ggcgttgtgc gttgcgatca accccggacg atcgatatga aagcccgcgg cggcaaacga 300ctcgaacggg tgccagagac tatcatggac gacgttcttg gccgtctggc caccatcctg 360acctga366<210>45<211>321<212>DNA<213>结核分枝杆菌<400>45gtggtgattc ggggagcggt ctacagggtc gacttcggcg atgcgaagcg aggccacgag 60
caacgcgggc ggcgctacgc cgtggtcatc agccccggct cgatgccgtg gagtgtagta 120accgtggtgc cgacgtcgac aagcgcccaa cctgcggttt tccgaccaga gctggaagtc 180atgggaacaa agacacggtt cctggtggat cagatccgga cgatcggcat cgtctatgtg 240cacggcgatc cggtcgacta tctggaccgt gaccaaatgg ccaaggtgga acacgccgtg 300gcacgatacc ttggtctgtg a 321<210>46<211>109<212>PRT<213>耐盐芽孢杆菌<400>46Met Pro Val Pro Asp Arg Gly Asn Leu Val Tyr Val Asp Phe Asn Pro1 5 10 15Gln Ser Gly His Asp Gln Ala Gly Thr Arg Pro Ala Ile Val Leu Ser20 25 30Pro Lys Leu Phe Asn Lys Asn Thr Gly Phe Ala Val Val Cys Pro Ile35 40 45Thr Arg Gln Gln Lys Gly Tyr Pro Phe Glu Ile Glu Ile Pro Pro Gly50 55 60Leu Pro Ile Glu Gly Val Ile Leu Thr Asp Gln Val Lys Ser Leu Asp65 70 75 80Trp Arg Ala Arg Asn Phe His Ile Lys Gly Gln Ala Pro Glu Glu Thr85 90 95Val Thr Asp Cys Leu Gln Leu Ile His Thr Phe Leu Ser100 105<210>47<211>120<212>PRT<213>表皮葡萄球菌<400>47Met Ile Arg Arg Gly Asp Val Tyr Leu Ala Asp Leu Ser Pro Val Gln1 5 10 15Gly Ser Glu Gln Gly Gly Val Arg Pro Val Val Ile Ile Gln Asn Asp20 25 30Thr Gly Asn Lys Tyr Ser Pro Thr Val Ile Val Ala Ala Ile Thr Asp35 40 45Gly Ile Asn Lys Ala Lys Ile Pro Thr His Val Glu Ile Glu Lys Lys50 55 60Lys Tyr Lys Leu Asp Lys Asp Ser Val Ile Leu Leu Glu Gln Ile Arg65 70 75 80Thr Leu Asp Lys Lys Arg Leu Lys Glu Lys Leu Thr Phe Leu Ser Glu85 90 95Ser Lys Met Ile Glu Val Asp Asn Ala Leu Asp Ile Ser Leu Gly Leu100 105 110Asn Asn Phe Asp His His Lys Ser115 120<210>48<211>136<212>PRT<213>金黄色葡萄球菌<400>48Met Ile Arg Arg Gly Asp Val Tyr Leu Ala Asp Leu Ser Pro Val Gln1 5 10 15Gly Ser Glu Gln Gly Gly Val Arg Pro Val Val Ile Ile Gln Asn Asp20 25 30Thr Gly Asn Lys Tyr Ser Pro Thr Val Ile Val Ala Ala Ile Thr Gly35 40 45Arg Ile Asn Lys Ala Lys Ile Pro Thr His Val Glu Ile Glu Lys Lys50 55 60
Lys Tyr Lys Leu Asp Lys Asp Ser Val Ile Leu Leu Glu Gln Ile Arg65 70 75 80Thr Leu Asp Lys Lys Arg Leu Lys Glu Lys Leu Thr Tyr Leu Ser Asp85 90 95Asp Lys Met Lys Glu Val Asp Asn Ala Leu Met Ile Ser Leu Gly Leu100 105 110Asn Ala Val Ala Gln Pro Glu Lys Leu Gly Val Tyr Tyr Met Tyr Phe115 120 125Ser Glu Ile Asn Lys Ile Leu Ile130 135<210>49<211>116<212>PRT<213>枯草芽孢杆菌<400>49Met Ile Val Lys Arg Gly Asp Val Tyr Phe Ala Asp Leu Ser Pro Val1 5 10 15Val Gly Ser Glu Gln Gly Gly Val Arg Pro Val Leu Val Ile Gln Asn20 25 30Asp Ile Gly Asn Arg Phe Ser Pro Thr Ala Ile Val Ala Ala Ile Thr35 40 45Ala Gln Ile Gln Lys Ala Lys Leu Pro Thr His Val Glu Ile Asp Ala50 55 60Lys Arg Tyr Gly Phe Glu Arg Asp Ser Val Ile Leu Leu Glu Gln Ile65 70 75 80Arg Thr Ile Asp Lys Gln Arg Leu Thr Asp Lys Ile Thr His Leu Asp85 90 95Asp Glu Met Met Asp Lys Val Asp Glu Ala Leu Gln Ile Ser Leu Ala100 105 110Leu Ile Asp Phe115<210>50<211>115<212>PRT<213>脑膜炎奈瑟氏球菌<400>50Met Tyr Ile Pro Asp Lys Gly Asp Ile Phe His Leu Asn Phe Asp Pro1 5 10 15Ser Ser Gly Lys Glu Ile Lys Gly Gly Arg Phe Ala Leu Ala Leu Ser20 25 30Pro Lys Ala Phe Asn Arg Ala Thr Gly Leu Val Phe Ala Cys Pro Ile35 40 45Ser Gln Gly Asn Ala Ala Ala Ala Arg Ser Ser Gly Met Ile Ser Thr50 55 60Leu Leu Gly Ala Gly Thr Glu Thr Gln Gly Asn Val His Cys His Gln65 70 75 80Leu Lys Ser Leu Asp Trp Gln Ile Arg Lys Ala Ser Phe Lys Glu Thr85 90 95Val Pro Asp Tyr Val Leu Asp Asp Val Leu Ala Arg Ile Gly Ala Val100 105 110Leu Phe Asp115
<210>51<211>121<212>PRT<213>摩氏摩根氏菌<400>51Met Arg Arg Arg Leu Val Arg Arg Lys Ser Asp Met Glu Arg Gly Glu1 5 10 15Ile Trp Leu Val Ser Leu Asp Pro Thr Ala Gly His Glu Gln Gln Gly20 25 30Thr Arg Pro Val Leu Ile Val Thr Pro Ala Ala Phe Asn Arg Val Thr35 40 45Arg Leu Pro Val Val Val Pro Val Thr Ser Gly Gly Asn Phe Ala Arg50 55 60Thr Ala Gly Phe Ala Val Ser Leu Asp Gly Ala Gly Ile Arg Thr Thr65 70 75 80Gly Val Val Arg Cys Asp Gln Pro Arg Thr Ile Asp Met Lys Ala Arg85 90 95Gly Gly Lys Arg Leu Glu Arg Val Pro Glu Thr Ile Met Asp Asp Val100 105 110Leu Gly Arg Leu Ala Thr Ile Leu Thr115 120<210>52<211>118<212>PRT<213>结核分枝杆菌<400>52Met Met Arg Arg Gly Glu Ile Trp Gln Val Asp Leu Asp Pro Ala Arg1 5 10 15Gly Ser Glu Ala Asn Asn Gln Arg Pro Ala Val Val Val Ser Asn Asp20 25 30Arg Ala Asn Ala Thr Ala Thr Arg Leu Gly Arg Gly Val Ile Thr Val35 40 45Val Pro Val Thr Ser Asn Ile Ala Lys Val Tyr Pro Phe Gln Val Leu50 55 60Leu Ser Ala Thr Thr Thr Gly Leu Gln Val Asp Cys Lys Ala Gln Ala65 70 75 80Glu Gln Ile Arg Ser Ile Ala Thr Glu Arg Leu Leu Arg Pro Ile Gly85 90 95Arg Val Ser Ala Ala Glu Leu Ala Gln Leu Asp Glu Ala Leu Lys Leu100 105 110His Leu Asp Leu Trp Ser115<210>53<211>243<212>DNA<213>耐放射异常球菌<400>53atgacgagtc aaattcagaa atggggcaac agcctcgcgc tccgcattcc caaagctctg 60gcgcagcagg tgggactgac gcagagttca gaagtggagc tgcttcttca ggacggtcag 120attgtcatcc ggccagttcc tgctcggcag tacgatctcg ccgcgctgct ggccgaaatg 180acacctgaaa atctgcatgg ggaaacagac tggggcgcac tggaaggacg cgaggaatgg 240taa 243
<210>54<211>246<212>DNA<213>耐盐芽孢杆菌<400>54gtgacactca tgactactat acaaaagtgg ggaaatagtt tagctgttcg tattccgaac 60cattatgcta aacatattaa cgttacgcaa ggatctgaaa ttgaactaag cttagggagt 120gatcaaacga ttattttaaa gcctaaaaaa agaaagccaa cattagagga attagtggca 180aaaatcactc ctgaaaacag acataacgaa attgatttcg ggagaacagg aaaggaattg 240ttgtaa246<210>55<211>258<212>DNA<213>大肠杆菌质粒R100<400>55atgcatacca cccgactgaa gagggttggc ggctcagtta tgctgaccgt cccaccggca 60ctgctgaatg cgctgtctct gggcacagat aatgaagttg gcatggtcat tgataatggc 120cggctgattg ttgagccgta cagacgcccg caatattcac tggctgagct actggcacag 180tgtgatccga atgctgaaat atcagctgaa gaacgagaat ggctggatgc accggcgact 240ggtcaggagg aaatctga 258<210>56<211>294<212>DNA<213>大肠杆菌质粒R466b<400>56atgttatatt taaatataac ttttatggag ggaaaaatgc ataccactcg actgaagaag 60gttggcggct cagtcatgct gaccgtccca ccggcactgc tgaatgcgct gtcgctgggt 120acagataatg aagttggcat ggtcattgat aatggccggc tgattgtgga gccgcacaga 180cgcccgcagt attcactggc tgagctgttg gcacagtgcg atccgaacgc tgaaatctcg 240gcagaagaac gtgaatggct ggatgcgccg gcggctggtc aggaggaaat ctga 294<210>57<211>258<212>DNA<213>大肠杆菌<400>57gtgcagatgc gtattaccat aaaaagatgg gggaacagtg caggtatggt cattcccaat 60atcgtaatga aagaacttaa cttacagccg gggcagagcg tggaagtgca ggtgagcaac 120aaccaactga ttctgacacc catctccagg cgctactcgc ttgatgaact gctggcacag 180tgtgacatga acgccgcgga acttagcgag caggatgtct ggggtaaatc cacccctgcg 240ggtgacgaaa tatggtaa 258<210>58<211>255<212>DNA<213>恶臭假单孢菌<400>58atgcagatca agattcaaca gtggggcaac agcgccgcga tccgcttgcc cgccgcagta 60ctcaagcaga tgcgcctcgg tgtcggctcc accctgagcc ttgacacaac gggtgagacg 120atggtgctca aacccgtcag gtcgaaaccc aagtacaccc ttgaggaact gatggcccag 180tgtgacctga gtgcaccgga gccagaggac atggccgact ggaatgccat gcgcccagtg 240gggcgtgaag tgtga 255
<210>59<211>260<212>DNA<213>Photobacterium profundum<400>59gtgcaatgag aactcagata agaaagatcg gtaactcact tggttcaatt attcctgcca 60cttttattcg tcagcttgaa ctggcagagg gcgcagaaat tgatgttaaa acggttgatg 120gaaaaattgt gattgagcca attagaaaaa tgaaaaaacg tttcccattc agtgagcgtg 180aattactaag tggattggat gcacacactg ctcatgctga cgaactggtt gtaatttcta 240cccaggagct aggcgaataa 260<210>60<211>80<212>PRT<213>耐放射异常球菌<400>60Met Thr Ser Gln Ile Gln Lys Trp Gly Asn Ser Leu Ala Leu Arg Ile1 5 10 15Pro Lys Ala Leu Ala Gln Gln Val Gly Leu Thr Gln Ser Ser Glu Val20 25 30Glu Leu Leu Leu Gln Asp Gly Gln Ile Val Ile Arg Pro Val Pro Ala35 40 45Arg Gln Tyr Asp Leu Ala Ala Leu Leu Ala Glu Met Thr Pro Glu Asn50 55 60Leu His Gly Glu Thr Asp Trp Gly Ala Leu Glu Gly Arg Glu Glu Trp65 70 75 80<210>61<211>81<212>PRT<213>耐盐芽孢杆菌<400>61Met Thr Leu Met Thr Thr Ile Gln Lys Trp Gly Asn Ser Leu Ala Val1 5 10 15Arg Ile Pro Asn His Tyr Ala Lys His Ile Asn Val Thr Gln Gly Ser20 25 30Glu Ile Glu Leu Ser Leu Gly Ser Asp Gln Thr Ile Ile Leu Lys Pro35 40 45Lys Lys Arg Lys Pro Thr Leu Glu Glu Leu Val Ala Lys Ile Thr Pro50 55 60Glu Asn Arg His Asn Glu Ile Asp Phe Gly Arg Thr Gly Lys Glu Leu65 70 75 80Leu<210>62<211>85<212>PRT<213>大肠杆菌PemI质粒R100<400>62Met His Thr Thr Arg Leu Lys Arg Val Gly Gly Ser Val Met Leu Thr15 10 15Val Pro Pro Ala Leu Leu Asn Ala Leu Ser Leu Gly Thr Asp Asn Glu20 25 30Val Gly Met Val Ile Asp Asn Gly Arg Leu Ile Val Glu Pro Tyr Arg35 40 45Arg Pro Gln Tyr Ser Leu Ala Glu Leu Leu Ala Gln Cys Asp Pro Asn50 55 60Ala Glu Ile Ser Ala Glu Glu Arg Glu Trp Leu Asp Ala Pro Ala Thr65 70 75 80
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<210>66<211>85<212>PRT<213>Photobacterium profundum<400>66Ala Met Arg Thr Gln Ile Arg Lys Ile Gly Asn Ser Leu Gly Ser Ile1 5 10 15Ile Pro Ala Thr Phe Ile Arg Gln Leu Glu Leu Ala Glu Gly Ala Glu20 25 30Ile Asp Val Lys Thr Val Asp Gly Lys Ile Val Ile Glu Pro Ile Arg35 40 45Lys Met Lys Lys Arg Phe Pro Phe Ser Glu Arg Glu Leu Leu Ser Gly50 55 60Leu Asp Ala His Thr Ala His Ala Asp Glu Leu Val Val Ile Ser Thr65 70 75 80Gln Glu Leu Gly Glu85<210>67<211>228<212>DNA<213>智人<400>67atgggtccag catctgttcc gactacctgt tgctttaacc tggcgaaccg caaaattccg 60ctgcagcgcc tggaaagcta tcgccgtatt acctctggca aatgcccgca gaaagcggtg 120atctttaaaa ccaaactggc gaaagatatt tgcgcggatc cgaaaaaaaa atgggtgcag 180gattctatga aatatctgga tcagaaatct ccgaccccga aaccgtaa 228<210>68<211>73<212>PRT<213>智人<400>68Gly Pro Ala Ser Pro Thr Thr Cys Cys Phe Asn Leu Ala Asn Arg Lys1 5 10 15Ile Pro Leu Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Ile Thr Ser Gly Lys20 25 30Cys Pro Gln Lys Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Leu Ala Lys Asp Ile35 40 45Cys Ala Asp Pro Lys Lys Lys Trp Val Gln Asp Ser Met Lys Tyr Leu50 55 60Asp Gln Lys Ser Pro Thr Pro Lys Pro65 70<210>69<211>357<212>DNA<213>结核分枝杆菌<400>69gtgatgcgcc gcggtgagat ttggcaggtc gatctcgacc ccgctcgagg tagcgaagcg 60aacaaccagc gccccgccgt cgtcgtcagc aacgaccggg ccaacgcgac cgccacgcgt 120cttgggcgcg gcgtcatcac cgtcgtgccg gtgacgagca acatcgccaa ggtctatccg 180tttcaggtgt tgttgtcggc caccactact ggtctccagg tcgactgcaa ggcgcaggcc 240gagcaaatca gatcgattgc taccgagcgg ttgctccggc caatcggccg agtttcagcc 300gccgaacttg cccagctcga tgaggctttg aaactgcatc tcgacttatg gtcgtag357
<210>70<211>282<212>DNA<213>结核分枝杆菌<400>70atgctgcgcg gtgagatctg gcaggtcgac ctggatccgg cccgcggcag cgcggcaaat 60atgcggcggc cagcggtaat tgtcagcaac gacagggcca acgctgccgc gatacgtctc 120gaccgaggcg tggtgccggt tgtcccggtt accagcaaca ccgaaaaggt ccccattcca 180ggtgttgttg ccggcagcga gcggtggcct ggccgtcgat tcgaaggcgc aggcccagca 240ggttggatcc gtcgctgcgc aacgtctccc ctgccgagct ga282<210>71<211>345<212>DNA<213>结核分枝杆菌<400>71gtggtgatta gtcgtgccga gatctactgg gctgacctcg ggccgccatc aggcagtcag 60ccggcgaagc gccgcccggt gctcgtaatc cagtcagatc cgtacaacgc aagtcgcctt 120gccactgtga tcgcagcggt gatcacgtcc aatacggcgc tggcggcaat gcccggcaac 180gtgttcttgc ccgcgaccac aacgcgactg ccacgtgact cggtcgtcaa cgtcacggcg 240attgtcacgc tcaacaagac tgacctcacc gaccgagttg gggaggtgcc agcgagcttg 300atgcacgagg ttgaccgagg acttcgtcgc gtactggacc tttga 345<210>72<211>309<212>DNA<213>结核分枝杆菌<400>72atgcggcgcg gtgaattgtg gtttgccgcc acacctggtg gtgacagacc agtacttgtc 60cttaccagag atccggtggc agaccgcatc ggcgcggtcg ttgtggtggc cctaacccgc 120acccgccgag gcctggtgtc ggaattggag ctcacggccg tcgaaaaccg tgttccgagc 180gactgcgtcg tcaacttcga caacattcat acgttgccac gcaccgcatt ccgacgccgc 240atcacccggc tgtccccggc ccgcctgcac gaagcctgtc aaacactccg ggcgagcacg 300gggtgttga 309<210>73<211>330<212>DNA<213>结核分枝杆菌<400>73gtgaccgcac ttccggcgcg cggagaggtg tggtggtgtg agatggctga gatcggtcgg 60cgaccagtcg tcgtgctgtc gcgcgatgcc gcgatccctc ggctgcgacg cgcacttgtc 120gcgccctgca ccacgaccat ccgagggcta gccagtgagg ttgttcttga acccggttcc 180gacccgatcc cgcgccgttc cgcggtgaat ttggactcag tcgaaagtgt ctcggtcgcg 240gtattggtga atcggcttgg ccgcctcgcc gacatccgga tgcgcgccat ctgcacggcc 300ctcgaggtcg ccgtcgattg ctctcgatga 330<210>74<211>118<212>PRT<213>结核分枝杆菌<400>74Met Met Arg Arg Gly Glu Ile Trp Gln Val Asp Leu Asp Pro Ala Arg1 5 10 15Gly Ser Glu Ala Asn Asn Gln Arg Pro Ala Val Val Val Ser Asn Asp20 25 30Arg Ala Asn Ala Thr Ala Thr Arg Leu Gly Arg Gly Val Ile Thr Val35 40 45Val Pro Val Thr Ser Asn Ile Ala Lys Val Tyr Pro Phe Gln Val Leu50 55 60
Leu Ser Ala Thr Thr Thr Gly Leu Gln Val Asp Cys Lys Ala Gln Ala65 70 75 80Glu Gln Ile Arg Ser Ile Ala Thr Glu Arg Leu Leu Arg Pro Ile Gly85 90 95Arg Val Ser Ala Ala Glu Leu Ala Gln Leu Asp Glu Ala Leu Lys Leu100 105 110His Leu Asp Leu Trp Ser115<210>75<211>93<212>PRT<213>结核分枝杆菌<400>75Met Leu Arg Gly Glu Ile Trp Gln Val Asp Leu Asp Pro Ala Arg Gly1 5 10 15Ser Ala Ala Asn Met Arg Arg Pro Ala Val Ile Val Ser Asn Asp Arg20 25 30Ala Asn Ala Ala Ala Ile Arg Leu Asp Arg Gly Val Val Pro Val Val35 40 45Pro Val Thr Ser Asn Thr Glu Lys Val Pro Ile Pro Gly Val Val Ala50 55 60Gly Ser Glu Arg Trp Pro Gly Arg Arg Phe Glu Gly Ala Gly Pro Ala65 70 75 80Gly Trp Ile Arg Arg Cys Ala Thr Ser Pro Leu Pro Ser85 90<210>76<211>114<212>PRT<213>结核分枝杆菌<400>76Met Val Ile Ser Arg Ala Glu Ile Tyr Trp Ala Asp Leu Gly Pro Pro1 5 10 15Ser Gly Ser Gln Pro Ala Lys Arg Arg Pro Val Leu Val Ile Gln Ser20 25 30Asp Pro Tyr Asn Ala Ser Arg Leu Ala Thr Val Ile Ala Ala Val Ile35 40 45Thr Ser Asn Thr Ala Leu Ala Ala Met Pro Gly Asn Val Phe Leu Pro50 55 60Ala Thr Thr Thr Arg Leu Pro Arg Asp Ser Val Val Asn Val Thr Ala65 70 75 80Ile Val Thr Leu Asn Lys Thr Asp Leu Tht Asp Arg Val Gly Glu Val85 90 95Pro Ala Ser Leu Met His Glu Val Asp Arg Gly Leu Arg Arg Val Leu100 105 110Asp Leu<210>77<211>102<212>PRT<213>结核分枝杆菌<400>77Met Arg Arg Gly Glu Leu Trp Phe Ala Ala Thr Pro Gly Gly Asp Arg1 5 10 15Pro Val Leu Val Leu Thr Arg Asp Pro Val Ala Asp Arg Ile Gly Ala20 25 30Val Val Val Val Ala Leu Thr Arg Thr Arg Arg Gly Leu Val Ser Glu35 40 45
Leu Glu Leu Thr Ala Val Glu Asn Arg Val Pro Ser Asp Cys Val Val50 55 60Asn Phe Asp Asn Ile His Thr Leu Pro Arg Thr Ala Phe Arg Arg Arg65 70 75 80Ile Thr Arg Leu Ser Pro Ala Arg Leu His Glu Ala Cys Gln Thr Leu85 90 95Arg Ala Ser Thr Gly Cys100<210>78<211>109<212>PRT<213>结核分枝杆菌<400>78Met Thr Ala Leu Pro Ala Arg Gly Glu Val Trp Trp Cys Glu Met Ala1 5 10 15Glu Ile Gly Arg Arg Pro Val Val Val Leu Ser Arg Asp Ala Ala Ile20 25 30Pro Arg Leu Arg Arg Ala Leu Val Ala Pro Cys Thr Thr Thr Ile Arg35 40 45Gly Leu Ala Ser Glu Val Val Leu Glu Pro Gly Ser Asp Pro Ile Pro50 55 60Arg Arg Ser Ala Val Asn Leu Asp Ser Val Glu Ser Val Ser Val Ala65 70 75 80Val Leu Val Asn Arg Leu Gly Arg Leu Ala Asp Ile Arg Met Arg Ala85 90 95Ile Cys Thr Ala Leu Glu Val Ala Val Asp Cys Ser Arg100 105<210>79<211>351<212>DNA<213>炭疽芽孢杆菌<400>79ttgattgtaa aacgcggcga cgtgtatttt gcagaccttt ccccagttgt tggttctgag 60caaggaggtg ttcgtccggt tcttgtcatt caaaatgaca tcggaaatcg ttttagtcca 120acggtgattg tagcggctat tactgcacag attcaaaaag cgaaattacc cactcatgtg 180gaaattgatg cgaaaaagta cggttttgag agagattctg ttattttact tgagcagatt 240cgaacaatcg ataagcagcg cttaacggac aaaatcactc acttagatga agtgatgatg 300attcgtgtag atgaagcgct acaaattagt ttaggactaa tagattttta a 351<210>80<211>116<212>PRT<213>炭疽芽孢杆菌<400>80Met Ile Val Lys Arg Gly Asp Val Tyr Phe Ala Asp Leu Ser Pro Val1 5 10 15Val Gly Ser Glu Gln Gly Gly Val Arg Pro Val Leu Val Ile Gln Asn20 25 30Asp Ile Gly Asn Arg Phe Ser Pro Thr Val Ile Val Ala Ala Ile Thr35 40 45Ala Gln Ile Gln Lys Ala Lys Leu Pro Thr His Val Glu Ile Asp Ala50 55 60Lys Lys Tyr Gly Phe Glu Arg Asp Ser Val Ile Leu Leu Glu Gln Ile65 70 75 80Arg Thr Ile Asp Lys Gln Arg Leu Thr Asp Lys Ile Thr His Leu Asp85 90 95Glu Val Met Met Ile Arg Val Asp Glu Ala Leu Gln Ile Ser Leu Gly100 105 110
Leu Ile Asp Phe115<210>81<211>348<212>DMA<213>恶臭假单孢菌<400>81gtgaaacggt tgaaattcgc caggggtgat attgttcgcg tcaacctgga cccaacagtc 60gggcgggaac agcagggctc cggccgacct gcactggtac ttactccggc tgcgttcaat 120gcttcaggcc tggctgtaat catcccgatc actcaaggtg gggatttcgc gaggcatgcg 180ggtttcgctg tcacgctcag cggtgcgggc acgcagactc agggggtgat gctttgcaac 240caggtgcgca cagtcgacct tgaagcacga tttgccaagc gcatagagtc ggtgcctgaa 300gctgtcatcc tggatgcact ggcgcgtgtg caaaccctat tcgattaa 348<210>82<211>345<212>DNA<213>隐藏分枝杆菌<400>82tgaattgctc tgacggaacg cggcgacatc tacatcgttt cgcttgaccc gacgtcggga 60catgagcaga gcggcacgcg cccagtattg gtcgtgtccc cgggcgcgtt taatcgcctg 120acgaaaacac cggtcgtgct acctataaca cgcggcggga actttgcccg aacggcaggg 180ttcgctgtct cgctgaccga tgcgggtact cgcaccgccg gcgtaatacg ctgcgatcag 240cctcgctcga ttgatatccg cgcccgtaaa ggccgcaagg ttgaacgtgt gccgtctggg 300gttcttgacg aagcgttggc caagctcgcc acgatcttga cttga 345<210>83<211>366<212>DNA<213>弗氏志贺氏菌2a st.301<400>83atggtaaagg cacggacgcc acatcgtggt gagatctggt attttaaccc tgatccggtt 60gccgggcatg aacttcaggg gccacattat tgcattgtgg taacggacaa aaaactcaac 120aatgttttaa aagttgctat gtgctgcccg atttcaacag gggcaaatgc agcacgttcc 180acaggggtga cggtgaacgt cctcccccgt gatacgcaaa ccggtaacct gcatggcgtt 240gtactttgtc accagctaaa agccgtcgat cttattgccc gtggcgctaa atttcatacc 300gttgccgatg aaaaattgat tagtgaagtt atcagtaaac tggtgaattt aatcgaccca 360caataa366<210>84<211>351<212>DNA<213>大肠杆菌<400>84atggtaaaga aaagtgaatt tgaacgggga gacattgtgc tggttggctt tgatccagca 60agcggccatg aacagcaagg tgctggtcga cctgcgcttg tgctctccgt tcaagccttt 120aatcaactgg gaatgacgct ggtggccccc attacgcagg gcggaaattt tgcccgttat 180gccggattta gcgttccttt acattgcgaa gaaggcgatg tgcacggcgt ggtgctggtg 240aatcaggtgc ggatgatgga tctacacgcc cggctggcaa agcgtattgg tctggctgcg 300gatgaggtgg tggaagaggc gttattacgc ttgcaggcgg tggtggaata a 351<210>85<211>115<212>PRT<213>恶臭假单孢菌<400>85Met Lys Arg Leu Lys Phe Ala Arg Gly Asp Ile Val Arg Val Asn Leu1 5 10 15
Asp Pro Thr Val Gly Arg Glu Gln Gln Gly Ser Gly Arg Pro Ala Leu20 25 30Val Leu Thr Pro Ala Ala Phe Asn Ala Ser Gly Leu Ala Val Ile Ile35 40 45Pro Ile Thr Gln Gly Gly Asp Phe Ala Arg His Ala Gly Phe Ala Val50 55 60Thr Leu Ser Gly Ala Gly Thr Gln Thr Gln Gly Val Met Leu Cys Asn65 70 75 80Gln Val Arg Thr Val Asp Leu Glu Ala Arg Phe Ala Lys Arg Ile Glu85 90 95Ser Val Pro Glu Ala Val Ile Leu Asp Ala Leu Ala Arg Val Gln Thr100 105 110Leu Phe Asp115<210>86<211>111<212>PRT<213>隐藏分枝杆菌<400>86Met Thr Glu Arg Gly Asp Ile Tyr Ile Val Ser Leu Asp Pro Thr Ser1 5 10 15Gly His Glu Gln Ser Gly Thr Arg Pro Val Leu Val Val Ser Pro Gly20 25 30Ala Phe Asn Arg Leu Thr Lys Thr Pro Val Val Leu Pro Ile Thr Arg35 40 45Gly Gly Asn Phe Ala Arg Thr Ala Gly Phe Ala Val Ser Leu Thr Asp50 55 60Ala Gly Thr Arg Thr Ala Gly Val Ile Arg Cys Asp Gln Pro Arg Ser65 70 75 80Ile Asp Ile Arg Ala Arg Lys Gly Arg Lys Val Glu Arg Val Pro Ser85 90 95Gly Val Leu Asp Glu Ala Leu Ala Lys Leu Ala Thr Ile Leu Thr100 105 110<210>87<211>121<212>PRT<213>弗氏志贺氏菌2a str.301<400>87Met Val Lys Ala Arg Thr Pro His Arg Gly Glu Ile Trp Tyr Phe Asn1 5 10 15Pro Asp Pro Val Ala Gly His Glu Leu Gln Gly Pro His Tyr Cys Ile20 25 30Val Val Thr Asp Lys Lys Leu Asn Asn Val Leu Lys Val Ala Met Cys35 40 45Cys Pro Ile Ser Thr Gly Ala Asn Ala Ala Arg Ser Thr Gly Val Thr50 55 60Val Asn Val Leu Pro Arg Asp Thr Gln Thr Gly Asn Leu His Gly Val65 70 75 80Val Leu Cys His Gln Leu Lys Ala Val Asp Leu Ile Ala Arg Gly Ala85 90 95Lys Phe His Thr Val Ala Asp Glu Lys Leu Ile Ser Glu Val Ile Ser100 105 110Lys Leu Val Asn Leu Ile Asp Pro Gln115 120
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<223>mRNA转录本<400>89aatgatgaca ctggaag17<210>90<211>17<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>mRNA转录本<400>90gtcgttgaca ttgatgg17<210>91<211>17<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>mRNA转录本<400>91atctcgaaca cgcagcc17<210>92<211>17<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>mRNA转录本<400>92tcgttttaca cccttga1权利要求
1.检测mRNA干扰酶或者其功能性片段的活性的方法，其中所述的活性是核糖核酸内切酶活性，所述的方法包含(a)提供编码所述mRNA干扰酶或者其功能性片段的核酸序列；(b)表达所述的核酸序列；(c)将步骤(b)表达的核酸序列与核糖核酸内切酶底物共同孵育；以及(d)测定所述底物的切割，其中所述底物的切割表明了核糖核酸内切酶活性并且提供了检测所述mRNA干扰酶或者其功能性片段的核糖核酸内切酶活性的手段。
2.鉴定能够调节mRNA干扰酶或者其功能性片段活性的因子的筛选方法，其中所述的活性是核糖核酸内切酶活性，所述的方法包含(a)提供编码所述mRNA干扰酶或者其功能性片段的核酸序列；(b)表达所述的核酸序列；(c)在能够促进核糖核酸内切酶活性的条件下将步骤(b)中表达的核酸序列与核糖核酸内切酶底物共同孵育；(d)加入至少一种因子，测定其是否能够调节所述mRNA干扰酶或者其功能性片段的核糖核酸内切酶活性；以及(e)测量所述底物的切割，其中所述底物的切割显示了核糖核酸内切酶活性并且提供了检测所述mRNA干扰酶或者其功能性片段的核糖核酸内切酶活性的手段，其中在所述至少一种因子存在的条件下被切割底物量的改变鉴定出了能够调节修饰所述mRNA干扰酶或者其功能性片段活性的因子。
3.权利要求2的方法，其中所述的方法在体外进行或者在细胞内进行。
4.权利要求2的方法，其中能够调节所述mRNA干扰酶或者其功能性片段的核糖核酸内切酶活性的因子使底物的切割增加。
5.权利要求2的方法，其中能够调节所述mRNA干扰酶或者其功能性片段的核糖核酸内切酶活性的因子使底物的切割降低。
6.调节mRNA干扰酶或者其功能性片段的活性的方法，其中所述的活性是核糖核酸内切酶活性，所述的方法包含(a)提供编码所述mRNA干扰酶或者其功能性片段的核酸序列；(b)表达所述的核酸序列；(c)在能够促进核糖核酸内切酶活性的条件下将步骤(b)中表达的核酸序列与核糖核酸内切酶底物共同孵育；(d)加入权利要求2的因子，所述的因子能够调节所述mRNA干扰酶或者其功能性片段的核糖核酸内切酶活性；以及(e)测量所述底物的切割，其中所述底物的切割显示了核糖核酸内切酶活性并且提供了检测所述mRNA干扰酶或者其功能性片段核糖核酸酶活性的手段，其中在所述因子存在的条件下被切割底物量的改变提供了调节所述mRNA干扰酶或者其功能性片段的核糖核酸内切酶活性的手段。
7.检测mRNA干扰酶或者其功能性片段的活性的方法，其中所述的活性是核糖核酸内切酶活性，所述的方法包含(a)提供所述mRNA干扰酶的氨基酸序列；(b)在能够促进核糖核酸内切酶活性的条件下将步骤(a)中的氨基酸序列与核糖核酸内切酶底物共同孵育；以及(c)测量所述底物的切割，其中所述底物的切割显示了核糖核酸内切酶活性并且提供了检测所述mRNA干扰酶或者其功能性片段的核糖核酸内切酶活性的手段。
8.鉴定能够调节mRNA干扰酶或者其功能性片段的活性的因子的筛选方法，其中所述的活性是核糖核酸内切酶活性，所述的方法包含(a)提供所述mRNA干扰酶的氨基酸序列；(b)在能够促进核糖核酸内切酶活性的条件下将步骤(a)的氨基酸序列与核糖核酸内切酶底物共同孵育；(c)加入至少一种因子，确定其是否能够调节所述mRNA干扰酶或者其功能性片段的核糖核酸内切酶活性；以及(d)测量所述底物的切割，其中所述底物的切割显示了核糖核酸内切酶活性并且提供了检测所述mRNA干扰酶或者其功能性片段的核糖核酸内切酶活性的手段，其中在所述至少一种因子存在时被切割底物量的改变鉴定出了能够调节所述mRNA干扰酶或者其功能性片段核糖核酸内切酶活性的因子。
9.权利要求8的方法，其中所述方法在体外或者在细胞内进行。
10.权利要求8的方法，其中能够调节所述mRNA干扰酶或者其功能性片段的核糖核酸内切酶活性的因子使底物的切割增加。
11.权利要求8的方法，其中能够调节所述mRNA干扰酶或者其功能性片段的核糖核酸内切酶活性的因子使底物的切割减少。
12.调节mRNA干扰酶或者其功能性片段的活性的方法，其中所述的活性是核糖核酸内切酶活性，所述的方法包含(a)提供所述mRNA干扰酶的氨基酸序列；(b)在能够促进核糖核酸内切酶活性的条件下将步骤(a)的氨基酸序列与核糖核酸内切酶底物共同孵育；(c)加入权利要求8的因子，所述的因子能够调节所述mRNA干扰酶或者其功能性片段的核糖核酸内切酶活性；以及(d)测量所述底物的切割，其中所述底物的切割显示了核糖核酸内切酶活性并且提供了检测所述mRNA干扰酶或者其功能性片段的核糖核酸内切酶活性的手段，其中在所述因子存在的条件下被切割底物量的改变提供了调节所述mRNA干扰酶或者其功能性片段的核糖核酸内切酶活性的手段。
13.用于治疗具有疾病的患者的方法，所述的方法包含向所述的患者施用治疗上有效量的组合物以减轻所述疾病的症状，所述组合物包含至少一个编码mRNA干扰酶或者其功能性片段的核酸序列以及药物上可以接受的缓冲剂。
14.权利要求13的方法，其中所述组合物的至少一个核酸序列的表达使核糖核酸内切酶底物的切割增加，以缓解所述疾病的症状。
15.权利要求14的方法，其中所述的疾病是细菌感染，所述的向所述的患者施用所述的治疗有效量的组合物，通过降低在所述患者体内细菌的数目而缓解细菌感染的症状。
16.权利要求15的方法，其中所述的细菌感染包含至少一种抗生素抗性细菌菌株。
17.权利要求14的方法，其中所述的疾病是过度增生性疾病，所述的向所述的患者施用所述的治疗有效量的组合物通过降低所述患者体内过度增生性疾病细胞的数目而缓解所述过度增生性疾病的症状。
18.治疗具有疾病的患者的方法，所述的方法包含向所述的患者施用治疗有效量的组合物以缓解所述疾病的症状，所述组合物包含mRNA干扰酶或者其功能性片段以及药物上可以接受的缓冲剂。
19.权利要求18的方法，其中所述组合物中的mRNA干扰酶或者其功能性片段提高了核糖核酸内切酶底物的切割，以缓解所述疾病的症状。
20.权利要求19的方法，其中所述的疾病是细菌感染，所述的向所述的患者施用所述的治疗有效量的组合物通过降低所述患者体内细菌的数目而缓解细菌感染的症状。
21.权利要求20的方法，其中所述的细菌感染包含至少一种抗生素抗性细菌菌株。
22.权利要求19的方法，其中所述的疾病是过度增生性疾病，所述的向所述的患者施用所述的治疗有效量的组合物通过降低所述患者体内过度增生性疾病细胞的数目而缓解所述过度增生性疾病的症状。
23.权利要求17或者22的方法，其中所述的增生性疾病选自以下疾病组成的组不同组织的发育异常和组织变形、炎性病症、自体免疫疾病、过度增生性皮肤疾病、牛皮癣、过敏/哮喘、动脉粥样硬化以及血管成形手术后的再狭窄。
24.在细胞中制备多肽的方法，所述的方法包含(a)用编码所述多肽的核酸序列转染所述的细胞，其中编码所述多肽的核酸序列被突变，以使用另外的三联体密码子替换mRNA干扰酶识别序列，其中由所述的突变核酸序列编码的所述多肽的氨基酸序列没有因为所述的突变而改变；(b)用编码mRNA干扰酶的核酸序列转染所述的细胞，其中所述的mRNA干扰酶识别所述的mRNA干扰酶识别序列；以及(c)在所述的细胞中表达步骤(a)和(b)的核酸序列，其中在所述的细胞中表达步骤(a)和(b)的核酸序列提供了在所述细胞中制备多肽的手段。
25.权利要求24的方法，其中mRNA识别序列是腺嘌呤-胞嘧啶-腺嘌呤(ACA)序列，mRNA干扰酶是包含SEQ ID NO2的MazF或者其功能性片段。
26.权利要求24的方法，其中的mRNA识别序列是尿嘧啶-腺嘌呤-X(UAX)序列，其中X是胞嘧啶(C)、A或者U，mRNA干扰酶是包含SEQ ID NO4的PemK或者其功能性片段。
27.权利要求25的方法，其中步骤(b)的核酸的表达降低或者抑制了由包含ACA序列的核酸序列编码的细胞多肽的合成。
28.权利要求26的方法，其中步骤(b)的核酸的表达降低或者抑制了由包含UAX序列的核酸序列编码的细胞多肽的合成。
29.权利要求24的方法，其中步骤(a)和(b)同时进行。
30.权利要求24的方法，还包含将所述的细胞在(c)步骤之前或者在(c)步骤中，在包含至少一种放射性标记同位素的培养基中孵育。
31.制备多肽的方法，所述的方法包含(a)提供编码所述多肽的核酸序列，其中编码所述多肽的核酸序列被突变，以用另外的三联体密码子替代mRNA干扰酶识别序列，其中由所述突变核酸序列编码的所述多肽的氨基酸序列没有由于所述的突变而被改变；(b)提供编码mRNA干扰酶的核酸序列，其中所述的mRNA干扰酶识别所述的mRNA干扰酶识别序列；以及(c)表达步骤(a)和(b)的核酸序列，其中步骤(a)和(b)的核酸序列的表达提供了生产该多肽的方法。
32.权利要求31的方法，其中mRNA识别序列是ACA序列，mRNA干扰酶是包含SEQ ID NO2的MazF或者其功能性片段；或者其中的mRNA识别序列是UAX序列，其中X是C、A或者U，mRNA干扰酶是包含SEQ ID NO4的PemK或者其功能性片段。
33.制备多个多核糖核苷酸序列的方法，所述的方法包含(a)提供第一和第二核酸序列，其中所述的第一核酸序列的一个区域与所述的第二核酸序列的一个区域互补，且所述的第一和第二核酸序列的两个互补区域都不包含与mRNA干扰酶识别位点互补的序列，且所述的第一和第二核酸序列在它们的5′末端都被磷酸化；(b)通过所述的第一和第二核酸序列的互补区域使所述的第一和第二核酸序列退火，形成双链的核酸序列，其包含侧翼为单链突出端的互补区域，其中每一个所述单链突出端包含至少一个与mRNA干扰酶识别位点互补的序列，且所述的单链突出端互相互补；(c)通过互补的单链突出端连接已经退火的第一和第二核酸序列，形成包含多个退火的第一和第二核酸序列串联重复序列的多联体；(d)使用包含T7启动子以及与所述的第一核酸序列互补的区域的第一引物和与所述的第二核酸序列互补的第二引物扩增所述的多联体，其中所述的扩增产生多个包含T7启动子的多联体； (e)使用T7 RNA聚合酶从所述的多个多联体转录出RNA分子，其中每一个所述的RNA分子包含多个侧翼为mRNA干扰酶识别位点的多核糖核苷酸序列的串联重复序列；以及(f)使用能够在所述的干扰酶识别位点处切割RNA的mRNA干扰酶消化所述的RNA分子，其中所述的消化产生多个所述多核糖核苷酸序列。
34.权利要求33的方法，其中mRNA识别序列是ACA序列，mRNA干扰酶是包含SEQ ID NO2的MazF或者其功能性片段；或者其中的mRNA识别序列是UAX序列，其中X是C、A或者U，mRNA干扰酶是包含SEQ ID NO4的PemK或者其功能性片段。
35.分离的核酸序列，该序列编码与mRNA干扰酶或者其功能性片段具有序列和/或结构同源性的多肽，其中所述的多肽能够表现出核糖核酸内切酶活性；包含所述分离核酸序列的表达载体以及包含所述表达载体的细胞；包含所述分离核酸序列的表达载体，其中所述的核酸序列与调控序列有效连接，以及包含所述表达载体的细胞；包含所述分离核酸序列的转基因动物，其中核酸序列在转基因动物的至少一个细胞中表达；分离的氨基酸序列，该序列包含的多肽与mRNA干扰酶或者其功能性片段具有序列和/或结构同源性，其中所述的多肽能够表现出核糖核酸内切酶活性；编码所述多肽的表达载体，以及包含所述表达载体的细胞；编码所述多肽的表达载体，其中所述多肽的表达在调控序列的控制下，以及包含所述表达载体的细胞；表达所述多肽的转基因动物，其中多肽在转基因动物的至少一个细胞中表达；包含所述分离核酸序列或者所述多肽和药物上可以接受的缓冲剂的组合物，以及所述两种组合物中任何一种的用途，用于治疗具有疾病的患者，以缓解所述疾病的症状；以及包含所述分离核酸序列、包含所述的多肽或者其功能性片段的分离氨基酸序列、与mRNA干扰酶活性相容的缓冲剂以及使用说明材料的试剂盒。
全文摘要
本发明涉及的是新型酶家族的发现，该家族在这里被命名为mRNA干扰酶家族，它们表现出核糖核酸内切酶活性。因此，本发明发明者的新发现，提出了新的应用，其中mRNA干扰酶核酸和氨基酸序列以及其组合物可以被有利地使用。本发明还包括筛选方法以鉴定能够调节mRNA干扰酶活性的化合物/因子以及使用这些化合物/因子的方法。还提供了包含mRNA干扰酶核酸和/或氨基酸序列、与mRNA干扰酶活性相容的缓冲液以及使用说明材料的试剂盒。
文档编号C12P19/00GK1839206SQ200480023092
公开日2006年9月27日 申请日期2004年6月14日 优先权日2003年6月13日
发明者M·伊诺耶, J·张, Y·L·张 申请人:新泽西内科与牙科大学