新的具有取代活化序列的经修饰的corin分子及其用途的利记博彩app

专利名称：新的具有取代活化序列的经修饰的corin分子及其用途的利记博彩app
本申请是一项非临时性申请，基于35 U.S.C§119要求享有申请日为2003年6月11日的临时申请No.60/477,683的优先权发明领域本发明涉及新的经修饰的corin分子或其片段或衍生物，其含有取代活化序列。
背景技术：
丝氨酸蛋白酶对于包括食物消化、激素加工、凝血、补体激活、伤口愈合和胚胎发育在内的多种生物学过程而言必不可少(Davie，E.W.等人(1991)Biochemistry 3010463-10370；Kraut，J.(1977)Annu.Rev.Biochem.46331-358；Neurath，H.(1986)J.Cell Biochem.3235-49；和Stroud，R.M.(1974)Sci.Am.231-74-88)。多数胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶是分泌蛋白质，但是现在已经描述了有一些在胞外C-末端含有胰蛋白酶样蛋白酶结构域的II型跨膜蛋白(Hooper，J.D.等人(2001)J.Biol.Chem.276857-860)。
Corin是胰蛋白酶超家族的II型跨膜丝氨酸蛋白酶类成员，由多个结构上不同的结构域组成(Yan，W.等人(1999)J.Biol.Chem.27414926-14935)。成熟的corin是一种1042个氨基酸的多肽，其由在N末端的胞质尾区、其后的跨膜区(TM，第46位至66位氨基酸)、由两个卷曲样半胱氨酸富集结构域(CRD，第134位至259位氨基酸和第450位至573位氨基酸)组成的主干区、8个低密度脂蛋白受体重复序列(LDLR，第268位至415位氨基酸和第579位至690位氨基酸)、巨噬细胞清道夫受体样结构域(Scavenger Receptor-like domain，SRCR，第713位至800位氨基酸)、和在其C末端的丝氨酸蛋白酶催化结构域(CAT，氨基酸802至1042)(Yan，W.等人(1999)同上)组成。Corin的整体拓扑结构与其它例如hepsin(Leytus，S.P.等人(1988)Biochemistry 271067-1074)和肠激酶(Kitamoto，Y.等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 917588-7592)这样的II型跨膜丝氨酸蛋白酶相似；然而corin中的结构域结构的组合看上去是独特的。
Corin含有两个LDLR基序和一个SRCR基序，其中一个LDLR基序有5个重复序列，另一个有3个重复序列。在其它II型跨膜丝氨酸蛋白酶例如肠激酶、matriptase和TMPRSS2-4中也发现了这种LDLR和SRCR基序(Hooper，J.D.等人(2001)同上)。作为目前唯一的含有卷曲样半胱氨酸富集结构域的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，corin有两个这种CRD重复序列，每一个约有120个氨基酸长且其中含有10个保守半胱氨酸残基。Corin中的CRD、LDLR和SRCR基序的功能仍然有待研究。
Corin的蛋白酶催化结构域与其他胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶类似。Corin和激肽释放酶原(Chung，D.W.等人(1986)Biochemistry 252410-2417)、凝血因子XI(Fujikawa，K.等人(1986)Biochemistry 252417-2424)和hepsin(Leytus，S.P.等人(1988)同上)之间的氨基酸序列同一性是38-40％。胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的本质特征是保守的，包括，催化三元组残基His843、Asp892和Ser985和形成底物特异性口袋，的残基Asp979、Gly1007和Gly1008(Yan，W.等人(1999)同上)。预测Corin的底物特异性偏好碱性残基处于P1位置处。Arg801-Ile802-Leu803-Gly804-Gly805或RILGG的序列代表保守的活化切割位点，这表明Arg801和Ile802之间的肽键的蛋白水解切割对于产生催化活性的corin酶是必需的。残基Cys790和Cys912的存在表明corin的催化结构域在Arg801处的活化切割之后仍然通过二硫键连结到细胞表面。在体内生理状态下造成corin活化的酶未知。
天然corin显示为SDS-PAGE和蛋白质印迹分析中～130kDa的主要条带(Hooper，J.D.等人(2001)同上)，与经计算的在胞外结构域中含有19个潜在的N-连结的糖基化位点的重组人corin的分子量大小116kDa一致(Yan，W.等人(1999)同上)。
心钠肽(ANP)和脑钠肽(BNP)分别是主要由心房和心室中的心肌细胞产生的循环肽类激素(Levin，E.R.等人(1998)N.Engl.J.Med.339321-328；Wilkins，M.R.等人(1997)Lancet 3491307-1310)。在靶器官例如肾和周围血管中，这些肽类激素结合至它们的受体并刺激这些受体固有的鸟苷酸环化酶活性，导致细胞内cGMP的产生。ANP和BNP的生物学作用是促进盐的排泄，减少血容量以及减少血管阻力，从而降低血压(de Bold，A.J.等人(1981)Life Sci.2889-94；Inagami，T.(1989)J.Biol.Chem.2643043-3046；Brenner，B.M.等人(1990)Physiol.Rev.70665-699；Rosenzweig，A.和Seidman，C.E.(1991)Annu.Rev.Biochem.60229-255；Wilkins，M.R.等人(1997)同上；Stein，B.C.and Levin，R.1.(1998)Am.Heart J.135914-923；Liang，F.等人.(1997)J.Biol.Chem.27228050-28056)。BNP在心脏中也具有局部的抗纤维化效果(Tamura，N.等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 974239-4244)。ANP介导的途径在维持正常血压中的生物学重要性已经在许多研究中得以证实。例如在敲除小鼠中，ANP或其受体的缺陷导致特发性高血压(John，S.W.等人(1995)Science267679-681；John，S.W.等人.(1996)Am.J.Physiol.271R109-R114；Lopez，M.J.等人.(1995)Nature 37865-68)。
ANP和BNP在心肌细胞中被合成为前肽前体(pre-pro-peptide)，蛋白水解切割对于将前体转化为生物活性肽类激素是必需的(Shields，P.P.and Glembotski，C.C.(1988)J.Biol.Chem.2638091-8098；Ito，T.等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA858365-8369)。响应容量超负荷或过度生长信号，心脏提高这些激素的释放量，它们依次降低血容量并降低血压。ANP和BNP释放量的增加是ANP前体(pro-ANP)和BNP前体(pro-BNP)的合成增加的结果(McBride，K.and Nemer，M.(2001)Can.J.Physiol.Pharmacol.79673-681)。
在心肌细胞中，ANP被合成为126个氨基酸的前肽前体(Schwartz，D.等人(1985)Science 229397-400；Thibault，G.等人(1987)Biochem.J.241265-272)。在除去信号肽后，ANP前体存储在细胞的致密颗粒中。在从致密颗粒分泌后，ANP前体就通过在Arg98处的蛋白水解切割在心肌细胞的表面上获得活化，产生一种N-末端前肽和一种生物活性的成熟的26个氨基酸的C-末端肽(Shields，P.P.andGlembotski，C.C.(1988)同上；Ito，T.等人(1988)同上)。BNP也被合成为前肽前体，并且切割对于产生成熟的活性肽是必需的。BNP前体中的活化切割序列与ANP前体相似，其蛋白水解切割位于Arg76。一些研究表明与心肌细胞膜相关的高分子量胰蛋白酶样酶是ANP前体的活化切割的原因(Seidah，N.G.等人.(1986)Biosci.Rep.6835-844；Imada，T.等人.(1988)J.Biol.Chem.2639515-9519；Sei，C.A.等人(1992)Mol.Endocrinol.6309-319)。
Corin cDNA是首先通过在基因数据库中对与胰蛋白酶样蛋白酶有同源性的表达序列标签(EST)进行检索识别出的，接着从人心脏文库中将其克隆出来(Yan，W.等人(1999)同上)。Northern印迹和原位杂交分析显示corin mRNA在产生ANP和BNP肽的组织中高度表达，突出地是在心脏的心房和心室中(Yan，W.等人(1999)同上)。在功能研究中(Yan，W.等人.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 978525-8529；Wu，F.等人(2002)J.Biol.Chem.27716900-16905)，重组corin以高序列特异方式将ANP前体转化成生物活性ANP，这表明corin是ANP前体的转化酶。此外，重组corin将BNP前体加工成BNP(Yan，W.等人(2000)同上)。
充血性心力衰竭(CHF)是一种危及生命的疾病，使大约480万名美国人遭受痛苦。每一年，在美国约有550,000个新病例被诊断。代偿失调症状是CHF患者因左心室心脏收缩功能失调而住院治疗的最常见的原因。最常见的症状包括主要由肺静脉充血以及心输出量的减少造成的呼吸困难和疲劳。通常用利尿剂、收缩剂、血管扩张剂和β阻滞剂治疗代偿失调性CHF患者(Braunwald，E.等人(1997)inHeart DiseaseA Textbook of CardiovascularMedicine，Braunwald，E.，ed.，W.B.Saunders，Philadelphia，pp.445-470)。治疗的目的在于提高钠和液体的排泄、降低心脏充盈压，、减小外周血管阻力、并提高心输出量。用于治疗CHF的各种药通常减轻症状，但是每一种治疗都有固有限制。例如，收缩剂提高心肌收缩性和受损心脏的氧消耗，但也增加心律失常的发病率并且可能增加死亡率。重复和延长使用硝化甘油(最初由Alfred Nobel在130多年前生产以制备炸药的血管扩张剂)引起硝酸盐耐受性导致随时间推移临床效力丧失，使得患者容易受到新的局部缺血性发作的攻击。
尽管对CHF的病理生理学的理解不断深入，然而对重症的有效治疗是有限的，而且发病率和死亡率仍然很高。目前对于CHF的长期治疗的方法目标在于肾素-血管紧张素系统(血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂)、交感神经系统(β-阻滞剂)、内皮缩血管肽-1(ET-1)(ET-1受体拮抗剂)和利尿钠肽系统(ANP、BNP、和中性肽链内切酶(NEP)抑制剂)(McMurray，J.and Pfeffer，M.A.(2000a)Circulation 1052099-2106；McMurray，J.and Pfeffer，M.A.(2000b)Circulation 1052223-2228；Corti，R.等人(2001)Circulation 1041856-1862)。临床上，在CHF患者中发现高血浆浓度的ANP和BNP。这些利尿钠肽的水平常与心室功能障碍的程度和心律失常的进程相关(Burnett，J.C.，Jr.等人(1986)Science 2311145-1147；Gottleib，S.S.等人(1989)J.Am.Coll.Cardiol.131534-1539)。BNP通常被用作CHF的诊断和预后症状标记(Gottleib，S.S.等人(1989)同上；Maisel，A.S.等人.(2002)N.Engl.J.Med.347161-167)。一种人BNP的重组形式，Natrecor，在美国已获得批准用于代偿失调性CHF的短期住院治疗。BNP的输注已经显示出比硝化甘油更为有效，这体现在CHF患者中血流动力学和心脏和肾功能获得改善(Colucci，W.S.等人(2001)同上)。在日本已经使用ANP来治疗CHF和肾衰竭患者(Hayashi，M.等人(2001)同上；Mizuno，O.等人(2001)J.Am.Cardiol.88863-866；Allgren，R.L.等人(1997)N.Engl.J.Med.336828-834)。ANP和BNP的结果表明基于利尿钠肽的治疗在解除患有严重的CHF患者的症状以及改善其血流动力学和心脏功能方面是有效的。
Corin的发现提供了一种将重组corin用作提高体内ANP和BNP产量的生物剂的机会。基于Corin的治疗可以比单独用ANP或BNP治疗代偿失调性CHF更为有效。此外，corin可以提供优于必须要通过连续的静脉注入来给药的ANP或BNP的药物代谢动力学好处。本申请就是作为代偿失调性CHF的生物学疗法的corin的一种新的可溶性形式。
发明概述本发明提供了新的经修饰的corin分子或其片段或衍生物，其包含与野生型人corin活化序列不同的取代活化序列，并且提供了编码、表达和使用稳定的经修饰的corin分子的方法。
在一个实施方案中，所述经修饰的corin分子是经修饰的corin酶原或其片段或其衍生物，包含与野生型人corin活化序列不同的取代活化序列。
在另一个实施方案中，所述经修饰的corin分子是活化的被修饰的corin或其片段或其衍生物，其中与野生型人corin活化序列不同的取代活化序列被切割从而给予corin活性。
本发明提供融合分子，其包含与非corin分子融合的经修饰的corin分子或其片段或衍生物。在一个实施方案中，所述非corin分子是一种表位标记或一种报告分子。本发明进而提供了编码、表达和使用经修饰的corin融合分子的方法。
本发明提供了嵌合分子，其包含与从不同的第二来源分离的corin分子的一部分融合的从第一来源分离的corin分子的一部分。本发明进而提供了编码、表达和使用嵌合corin分子的方法。
本发明提供了一种宿主载体系统，其包含一种导入到合适的宿主细胞中的编码经修饰的corin分子的核苷酸序列，或其片段或衍生物。本发明进而提供了制备和使用所述宿主载体系统的方法。
本发明提供了一种药物组合物，其包含一种药物学可接受的载体和一种本发明的组合物。在一个实施方案中，所述药物组合物包含一种与本发明的经修饰的corin分子混合的药物学可接受的载体。
本发明提供鉴定本发明的组合物的体外和体内检测。
包含组合物的试剂盒也同样包含在本发明中。在一个实施方案中，在筛选检测中使用含有一种或多种本发明的组合物的试剂盒以鉴别corin配体或抑制剂。在另一个实施方案中，在筛选检测中使用含有一种或多种本发明的组合物的试剂盒以鉴别活化的corin分子。本发明还提供了使用本发明的组合物的方法。所述组合物可以被用于治疗与corin的过度表达、不足表达和/或异常表达相关的疾病。在一个实施方案中，所述组合物可以被用于治疗与升高的血压相关的心血管疾病。
附图的简要说明

图1.人corin编码区域的核酸序列(SEQ ID NO1)。所述编码序列长度为3129个核苷酸，起始于第1-3位的蛋氨酸起始密码子ATG，终止于第3127-3129位的翻译终止密码子TAA。
图2.人corin多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。人corin的全长为1042个氨基酸，包括一个N-末端胞质尾区、接着是一个跨膜结构域(第46至66位氨基酸)、两个卷曲样半胱氨酸富集结构域(第134至259位氨基酸和第450至第573位氨基酸)、8个低密度脂蛋白受体重复序列(第268至415位氨基酸和第579至690位氨基酸)、一个巨噬细胞清道夫受体样结构域(第713至800位氨基酸)，以及一个C末端的丝氨酸蛋白酶催化结构域(第802至1042位氨基酸)。全长corin多肽的结构图解描述于图3中。
图3.跨膜人corin缺失突变体的结构图解。人corin内部缺失突变体的构建描述于实施例1中。缺失1缺少第124至267位氨基酸，缺失2缺少第124至448位氨基酸，缺失3缺少第124至576位氨基酸，缺失4缺少第124至712位氨基酸，缺失5缺少第124至788位氨基酸，缺失6缺少第269至414位氨基酸，和缺失7缺少第450至568位氨基酸。
图4.在表达人corin的鼠HL-5细胞中重组ANP前体的加工。如实施例3所述，用指定的对照、ANP前体、或全长人corin表达质粒转染鼠HL-5细胞。通过采用抗-V5抗体的蛋白质印迹在条件培养基中检测ANP前体、ANP和corin。
图5.从表达人corin的鼠HL-5细胞获得的条件培养基刺激细胞内cGMP产生。如实施例3所述，用全长人corin表达质粒转染人293细胞和鼠HL-5细胞，并测量条件培养基中cGMP-刺激活性。HL-5细胞中的cGMP-刺激活性由于重组人corin的表达而显著提高。
图6.由含有跨膜的经修饰的人corin缺失突变体对ANP前体的加工。全长人corin表达载体和一系列人corin内部缺失突变体表达载体，与一种ANP前体表达载体一起转染到人293细胞中。通过采用抗-V5抗体的蛋白质印迹在条件培养基中检测ANP前体，ANP和corin。
图7.可溶性人corin多肽的结构图解(A)全长野生型人corin(B)SolCorin-EK，其缺少跨膜结构域；和(C)SolCorinPD-EK，其仅含有丝氨酸蛋白酶催化结构域。如实施例1所述，导入肠激酶活化切割序列DDDDK取代SolCorin-EK和SolCorinPD-EK的天然corin活化切割序列。
图8.由肠激酶对可溶性经修饰的人corin的活化。如图所示，将SolCorin-EK或SolCorinPD-EK表达载体转染到人293细胞中。用指示量的重组肠激酶处理条件培养基，通过采用抗-V5抗体的蛋白质印迹检测可溶性corin的活化。
图9.通过肠激酶活化的可溶性经修饰的人corin对ANP前体的切割。如图所示，将SolCorin-EK或SolCorinPD-EK表达载体转染到人293细胞中。用指示量的重组肠激酶处理条件培养基，并且将肠激酶耗尽的条件培养基暴露于从经ANP前体表达载体转染的293细胞获得的条件培养基。通过采用抗-V5抗体的蛋白质印迹法检测corin、肠激酶活化的corin、ANP前体和ANP。
图10.可溶性经修饰的人corin多肽SolCorin-EK的核酸序列。SolCorin-EK的核酸序列(SEQ ID NO33)由N-末端ATG起始密码子和Igκ分泌信号序列(第1至108位)、Leu-Glu(第109至114位)、人corin第124至796位氨基酸(第115至2133位)、肠激酶活化切割序列(第2134至2148位)、人corin第802至1042位氨基酸(第2149至2871位)、C-末端病毒V5和6xHis表位标记(第2871至2973位)、和一个TGA终止密码子(第2974至2976位)组成。
图11.可溶性经修饰的人corin多肽SolCorin-EK的氨基酸序列。SolCorin-EK的氨基酸序列(SEQ ID NO34)由N-末端ATG起始密码子和Igκ分泌信号序列(第1至36位氨基酸)、Leu-Glu(第37至38位氨基酸)、人corin第124至796位氨基酸(第39至711位氨基酸)、肠激酶活化切割序列(下划线，第712至716位氨基酸)、人corin第802至1042位氨基酸(第717至957位氨基酸)、C-末端病毒V5和6xHis表位标记(第958至991位氨基酸)、和一个TGA终止密码子组成。
图12.可溶性经修饰的人corin刺激患心肌病仓鼠的利尿和钠尿。如实施例6所述，在人293细胞中表达SolCorin-EK，、将其纯化、通过暴露于重组肠激酶使其活化、并检测其在BIO 14.6 CM仓鼠中增加尿量和尿钠的能力。如图所示，在静脉给予SolCorin-EK(Corin)或载体之前(基线)和之后(峰值响应)测定尿量和尿钠。
发明详述A.定义除非另有说明，本申请中的所有科学和技术术语具有本领域普遍所使用的含义。本申请所使用的下列词或短语具有所指定的含义。
本申请使用的“corin”指的是具有细胞质、跨膜和带有活化位点的细胞外结构域(这里也称为ectodomain)的跨膜多肽分子，或其片段或其衍生物。术语“corin”包括野生型corin，包括corin酶原、活化的corin分子和其片段或衍生物；和经修饰的corin分子，包括经修饰的corin酶原、经修饰的活化的corin分子和其片段或衍生物。
本申请使用的“野生型”指的是分别与天然存在的分子具有相同的核苷酸和/或氨基酸序列的核酸或多肽分子。野生型corin多肽分子具有图1和Yan，W.等人(1999)同上所示的天然存在的corin的氨基酸序列，或其任何片段或一部分。野生型corin被合成为一种酶原，即酶的前体，它的活化基于其位于胞外结构域的活化位点的切割。
本申请使用的术语“活性”指的是具有功能或作用的分子。活性包括酶活性，其中所述分子是酶，例如识别、结合、切割和/或修饰底物的蛋白酶。
本申请使用的术语“酶原”指的是具有活化序列的前体多肽分子，其基于同源蛋白酶的切割产生出活化的分子。酶原的一个实例是经修饰的corin酶原，其包括肠激酶取代活化序列，其通过由肠激酶进行的切割被活化。
本申请使用的术语“活化序列(activation sequence)”指的是由同源蛋白酶切割并且在切割后产生生物活性例如蛋白酶活性的分子。在活化的分子中，活化序列被切割。Corin分子中的活化的序列的一个实例是R-ILGG。
本申请使用的术语“取代活化序列”指的是取代野生型分子中的活化序列的氨基酸序列。取代活化序列的一个实例是DDDDK-ILGG，其被用于取代corin中天然存在的活化序列R-ILGG。
本申请使用的术语“经修饰的”指的是氨基酸或核苷酸序列不同于天然存在的即野生型的氨基酸或核苷酸序列的分子。例如，经修饰的corin分子可以包括取代活化序列。经修饰的分子可以保持野生型分子的功能或活性。
本申请使用的术语“衍生”意味着一种野生型分子的任何修饰或改变。衍生包括但不限于氨基酸和/或核苷酸序列分子中的保守的或非保守的取代，其包括由其它氨基酸、核苷酸、氨基酸类似物或核苷酸类似物进行的取代；一个或多个氨基酸和/或核苷酸的缺失；一个或多个氨基酸和/或核苷酸的插入；以及翻译前修饰和/或翻译后修饰。衍生的分子可与其母体分子具有序列相似性和/或活性。
本申请使用的术语“蛋白酶”指的是一类识别分子并切割该分子中的活化序列的酶。所述蛋白酶可以是切割内部肽键的内肽酶。或者，所述蛋白酶可以是自肽或蛋白分子的N-末端或C-末端开始水解肽键的外肽酶。所述蛋白酶折叠成一种构象以形成催化位点，所述位点接受并切割活化序列。
本申请使用的术语“催化位点”指的是折叠蛋白酶中接受和切割活化序列的区域。
本申请使用的术语“配体”指的是与corin相互作用的任何分子。配体可以是识别和结合corin的分子。或者，配体可以是由corin识别和结合的分子。例如，corin结合并切割的底物可以是一种配体。在另一个实例中，结合且切割corin的分子可以是一种配体。抗-corin抗体也可以是一种配体。
本申请使用的术语“丝氨酸蛋白酶”指的是一类蛋白酶，其特征在于存在形成该酶催化位点一部分的独特的丝氨酸残基。一般而言，每一个丝氨酸蛋白酶成员具有不同的底物特异性。
在本申请中，当第一核苷酸或氨基酸序列和第二核苷酸或氨基酸序列的比较显示出它们完全相同时，第一核苷酸或氨基酸序列分别被称为与第二核苷酸或氨基酸序列具有序列“同一性”。
在本申请中，当第一核苷酸或氨基酸序列和第二核苷酸或氨基酸序列的比较显示出它们具有很少的序列差异时(即，第一和第二序列几乎完全相同)，第一核苷酸或氨基酸序列被称为与第二序列“相似”。例如，当两条序列间不同的核苷酸或氨基酸的百分比在大约60％至99.99％之间时两个序列被认为相互近似。
本申请使用的术语“互补”指的是具有嘌呤和嘧啶核苷酸碱基的核酸分子，其具有通过氢键键合而缔合以形成碱基对从而调节双链核酸分子形成的能力。互补中涉及下面的碱基对鸟嘌呤和胞嘧啶；腺嘌呤和胸腺嘧啶；以及腺嘌呤和尿嘧啶。互补适用于包括两条单链核酸分子在内的所有碱基对或包括一条自身折叠的单链核酸分子的所有碱基对。
本申请使用的术语“保守的”指的是用一个氨基酸残基取代另一个具有相似化学性质的不同的氨基酸残基。保守的氨基酸取代包括用任何疏水性(例如，非极性的)氨基酸取代其它任何疏水性氨基酸；或者用任何亲水性氨基酸(极性的，不带电荷)取代其它任何亲水性氨基酸；或者用任何带正电荷的氨基酸取代其它任何带正电荷的氨基酸；或者用任何带负电荷的氨基酸取代其它任何带负电荷的氨基酸(Creighton，T.E.(1993)Proteins，W.H.Freeman and Company，NewYork)。这些氨基酸取代包括但不限于用异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、和亮氨酸(L)的任何一种取代这些疏水氨基酸的任何其它一种；用天冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)且反之亦然；谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)且反之亦然；以及用丝氨酸(S)取代苏氨酸(T)且反之亦然。其它取代也可被认为是保守的，这取决于特定氨基酸的环境及其在蛋白质三维结构中的作用。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)，或甘氨酸(G)和丝氨酸(S)可以如同丙氨酸(A)和缬氨酸(V)般频繁地互换。相对疏水的蛋氨酸(M)可以频繁地与亮氨酸和异亮氨酸互换，有时与缬氨酸(V)互换。在氨基酸残基的显著特征为其电荷的位置，赖氨酸(K)和精氨酸(R)可频繁地互换，这两种氨基酸残基的pK值的差异不显著。在特定的环境中其它的改变仍可被认为是保守的。
本申请使用的术语“非保守的”指的是用一个氨基酸残基取代另一个具有不同化学性质的氨基酸残基。这种非保守性取代包括但不限于以甘氨酸(G)取代天冬氨酸(D)；以赖氨酸(K)取代天冬酰胺(N)；或以精氨酸(R)取代丙氨酸(A)。
本申请使用的术语“可溶性的”是指不结合或附着于细胞上的任何分子或其片段或衍生物。可溶性的分子可以是循环的。一种可溶性的分子通常缺少跨膜结构域。可溶性的分子通常包括一个胞外结构域。
氨基酸残基的单个或三个字母的代码包括下列A＝Ala＝丙氨酸，R＝Arg＝精氨酸，N＝Asn＝天冬酰胺，D＝Asp＝天冬氨酸，C＝Cys＝半胱氨酸，Q＝Gln＝谷氨酰胺，E＝Glu＝谷氨酸，G＝Gly＝甘氨酸，H＝His＝组氨酸，I＝Ile＝异亮氨酸，L＝Leu＝亮氨酸，K＝Lys＝赖氨酸，M＝Met＝蛋氨酸，F＝Phe＝苯丙氨酸，P＝Pro＝脯氨酸，S＝Ser＝丝氨酸，T＝Thr＝苏氨酸，W＝Trp＝色氨酸，Y＝Tyr＝酪氨酸，和V＝Val＝缬氨酸。
本申请使用的术语“哺乳动物”包括人和驯养动物，如猫、狗、猪、牛、绵羊、山羊、马、家兔等等。
本申请使用的术语“治疗有效量”指的是对所需患者给药时，本发明的蛋白质的量足以影响对如下所定义的例如充血性心力衰竭或急性心肌梗塞的治疗。构成“治疗有效量”的本发明的经修饰的corin分子的量根据所述蛋白质、病症和病症的严重性以及待治疗患者的年龄的不同而改变，但可以由本领域的普通技术人员根据其自身掌握的知识以及本说明书所公开的内容常规地确定。
本申请使用的术语“处理”或“治疗”包括哺乳动物优选人的病状的治疗，其中所述病状的特征在于血压上升，并且包括(i)防止病症在人中出现，尤其是当该人易患该病症但还没有被诊断出患有该疾病时；(ii)抑止所述病症，即阻止其发展；或(iii)减缓所述病症，即使所述病症消退。
B.本发明的经修饰的Corin多肽分子本发明的经修饰的corin分子包括经修饰的corin酶原和活化的经修饰的corin分子，或其片段或衍生物。这些经修饰的corin分子由于包含取代的活化序列所以是有用的，所述活化序列在切割后活化该经修饰的corin分子。本发明的经修饰的corin分子是稳定的。
本发明在各个方面提供了经修饰的corin分子，包括经修饰的corin酶原、活化的经修饰的corin、或其片段或衍生物；编码该经修饰的corin分子的核酸分子、或其片段或衍生物；重组DNA分子；经转化的宿主细胞；宿主-载体系统；使用本发明的组合物的方法；生产本发明的组合物的方法；测试；经修饰的corin的抑制剂；和基于核酸的测试。
经修饰的Corin分子corin分子的活化可以通过切割天然存在的活化序列Arg801-Ile802-Leu803-Gly804-Gly805或R-ILGG中Arg801与Ile802间的肽键以产生催化活性的酶即活性的corin来进行。
包括经修饰的corin酶原、活化的经修饰的corin、或其片段或衍生物在内的本发明的所述经修饰的corin分子，其含有取代活化序列。
在经修饰的corin分子中，所述取代活化序列提供一种已知的活化序列，其能够允许所述经修饰的corin分子被蛋白酶，例如同源蛋白酶切割，产生经修饰的活化corin分子。在一个实施方案中，该经修饰的corin分子含有由肠激酶特异识别的取代活化序列，其包含氨基酸序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys或DDDDK，取代氨基酸Arg801。用肠激酶例如重组肠激酶与酶原形式的经修饰的corin分子接触，切割所述取代活化序列并产生出活化形式的经修饰的corin分子。
取代活化序列的实例描述于下文。对所述取代活化序列的序列和长度进行选择以使得经修饰的corin酶原被所希望的同源蛋白酶切割，从而产生活化的经修饰的corin。
本发明的活化的经修饰的corin分子呈现出天然存在的野生型活化的corin的功能活性。天然存在的野生型活化corin的功能活性是识别并切割蛋白质底物例如ANP前体或BNP前体上的序列Arg-Ser以产生生物活性的ANP或BNP(Yan，W.等人(2000)同上)。以类似的方式，所述活化的经修饰的corin可以具有蛋白酶功能并能够识别和切割与野生型活化的corin相同的底物。
根据本发明的实践，本发明经修饰的corin分子可以具有折叠结构，该结构与天然存在的野生型corin分子相同或相似。例如，活化的经修饰的corin可以折叠成允许催化位点接受并切割野生型活化的corin所识别的底物的构象。
全长的天然存在的人corin分子(图1)(Yan，W.等人(1999)同上，和公开的PCT专利申请WO 99/64608)包括下列1)细胞质结构域，包括第1至45位氨基酸残基；2)跨膜结构域，包括第46至66位氨基酸残基；和3)胞外结构域，包括第67-1042位氨基酸残基，并且包括两个卷曲样半胱氨酸-富集结构域、8个低密度脂蛋白受体重复序列、一个巨噬细胞清道夫受体样结构域、一个活化序列和一个丝氨酸蛋白酶催化结构域。
本发明提供经修饰的corin分子，包括天然存在的corin分子的片段或其衍生物。所述经修饰的corin分子的片段或衍生物可以包括以任何组合或顺序联合和/或连接的上述结构域的任何部分。
在一个实施方案中，经修饰的corin分子包括天然存在的人corin分子的胞外结构域，所述胞外结构域包括图1所示序列的第67-1042位残基或其部分。在另一个实施方案中，经修饰的corin分子包括天然存在的corin分子的胞外结构域或其部分，其被修饰成包括肠激酶或其它蛋白酶识别序列，例如肠激酶识别序列。由于它们缺少跨膜结构域，因此这些实施方案通常是可溶性分子。
本发明提供经修饰的corin分子，或其片段或衍生物，它们衍生自或分离自任何来源，无论是天然的、合成的、半合成的或是重组的。
来源包括原核或真核。真核来源包括动物、植物、真菌或原生动物。动物来源包括哺乳动物例如牛、猪、鼠(PCT专利申请WO99/64608)、马、犬、猫、猿、人(Yan、W.等人(1999)同上)、绵羊、鱼、鸟或昆虫。
本发明经修饰的corin分子，或其片段或衍生物可以作为在原核或真核宿主细胞中产生的重组分子被表达，或作为合成的分子被产生。在一个实施方案中，重组的经修饰的corin分子可以分离自细菌宿主细胞，其产生包含经修饰的corin分子的内含体(inclusion body)。也可以用其它可供选择的方法分离corin分子。在另一个实施方案中，可以从杆状病毒感染的昆虫细胞中分离出经修饰的corin分子。
经修饰的corin分子的纯化可以通过现有技术公知的技术纯化本发明经修饰的corin分子，或其片段或衍生物。这些纯化方法包括使用与所述经修饰的corin分子选择性结合的抗体的亲合层析法；使用与连接到所述经修饰的corin分子的表位标记例如6xHis标记、V5标记或其它公知的标记选择性结合的抗体的亲合层析法(Marchak，D.R.等人(1996)inStrategies for Protein Purification and Characterization，Cold SpringHarbor Press，Plainview，N.Y.)；离子交换色谱法；以及凝胶过滤色谱法。分离和纯化的性质和程度依赖于预先计划的用途。例如，纯化的经修饰的corin分子将会基本上不含有削弱配体或抗体与所述经修饰的corin分子结合的其它蛋白质或分子。
融合分子本申请提供融合分子或其片段或衍生物，其包括一种与非corin分子编码序列融合的经修饰的corin分子。
本发明的融合分子包括与一种表位标记融合的经修饰的corin分子，所述表位标记例如组氨酸(6xHis)标记或V5标记、FLAG标记、流感病毒血凝素(HA)标记、Myc标记、VSV-G标记、或硫氧还蛋白(Trx)标记。这些与表位标记融合的分子可用于所述经修饰的corin分子的分离和/或纯化(Marchak，D.R.等人(1996)同上)。
本发明的融合分子包括一种与报告分子融合的经修饰的corin分子。所述报告分子可以是全长蛋白质或其片段或衍生物。一般使用的报告分子包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、和包括蓝色荧光蛋白(BFP)在内的自发荧光蛋白。
其它融合分子构建可以包括麦芽糖结合蛋白(MBP)、S-标记、LexA DNA结合结构域(DBD)融合、GAL4 DNA结合结构域融合、和单纯疱疹病毒(HSV)BP16蛋白融合。
融合分子也可以被工程化为包括一个位于经修饰的corin分子和非corin分子间的切割位点，以使得所述经修饰的corin分子可以被切割并被纯化而与所述非corin分子分离。所述切割位点可以包括下列酶的识别序列肠激酶、hepsin、MT-SP/matryptase、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、人类呼吸道胰蛋白酶样蛋白酶(HAT)、肥大细胞类胰蛋白酶、弹性蛋白酶、纤维蛋白溶酶、激肽释放酶、TMPRSS2、MBL-关联的丝氨酸蛋白酶(MASP-1和MASP-2)、Stubble-stubbloid、弗林蛋白酶、凝血酶、或者Xa因子。
嵌合多肽本发明提供嵌合分子或其片段或衍生物，包括与从不同的第二来源分离的corin分子的片段融合的从第一来源分离的corin分子的片段。
所述第一和第二来源可以是任何来源，包括哺乳动物例如牛、猪、鼠、马、犬、猫、猴、猿、绵羊或人，或其它来源例如鱼、鸟或昆虫。
一个或多个用于形成嵌合经修饰的corin分子的corin片段可被修饰成例如包括肠激酶活化序列。在一个实施方案中，嵌合的经修饰的corin分子包括与从第二来源分离的corin分子的细胞质结构域融合的从第一来源分离的corin分子的胞外结构域，所述胞外结构域包括取代活化序列。在另一个实施方案中，嵌合的经修饰的corin分子包括与另一个从第二来源分离的corin分子的胞外结构域的片段融合的从第一来源分离的corin分子的胞外结构域的片段，其中这样形成的所述嵌合corin分子包括取代活化序列。
氨基酸类似物和改变的多肽本发明进而提供经修饰的corin分子，或其片段或衍生物，其包含氨基酸类似物。所述氨基酸类似物可以是化学合成的，并且包括右旋或左旋形式或肽模拟物(peptidomimetics)。
本发明还提供例如通过翻译后途径或通过化学合成改变的经修饰的corin分子，包括N-或O-糖基化的氨基酸残基。多肽的N-末端可被改变成包括酰化的或烷基化的残基。多肽的C-末端可以改变成包括酯化的或酰胺化的残基。非末端氨基酸残基可以被改变，包括但不限于氨基酸精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、组胺酸和半胱氨酸的改变。
序列变体本发明提供经修饰的corin分子或其片段或衍生物，其包括天然存在的corin分子的胞外结构域中的序列变异。本领域技术人员理解，任何数量的氨基酸可以被单独改变或与其它氨基酸一起被改变且经修饰的corin分子仍然会保持它们的功能活性(例如被同源蛋白酶切割和/或切割其底物)。经修饰的corin分子的胞外结构域的序列变体包括氨基酸取代、氨基酸插入、氨基酸缺失、突变形式、等位基因形式、同系物和直向同源物。
氨基酸取代经修饰的corin分子或其片段或衍生物可以包括氨基酸取代。经修饰的corin分子的胞外结构域可以有保守性或非保守性氨基酸取代。可以根据天然存在的corin分子的性质确定经修饰的corin分子的胞外结构域中有哪些和有多少氨基酸残基可以被取代。这些性质包括变性的或折叠构象中的氨基酸长度和物理长度。这些性质可以从预测(例如，基于氨基酸序列)和/或试验(例如，基于X射线晶体分析法)中获得。选择被取代的氨基酸以使得变异的经修饰的corin分子的性质与天然存在的corin分子相同或相似。
突变型本发明还提供经修饰的corin分子或其片段或衍生物，其具有corin分子的胞外结构域的突变形式。所述突变变体具有与野生型corin分子的胞外结构域氨基酸序列不同的氨基酸序列。所述突变包括氨基酸取代、缺失、插入、添加、截短或蛋白质的加工或切割错误。所述突变变体可以具有与野生型corin分子相同或相似的功能活性。
等位基因变体本发明提供经修饰的corin分子或其片段或衍生物，其包括天然存在的corin分子的等位基因变体。等位基因变体是由位于相同的染色体基因座的不同基因编码的分子。
同系物本发明提供经修饰的corin分子或其片段或衍生物，其包括天然存在的corin分子的同系物。同系物是由由相同基因座但是在不同染色体上的核苷酸序列编码的分子。所述同系物可以具有相同或相似的功能活性。
直向同源物本发明提供经修饰的corin分子或其片段或衍生物，其包括天然存在的corin分子的直向同源物。直向同源物是由来自于不同物种的核苷酸序列编码的corin分子。所述直向同源物可以具有与野生型corin分子相同或相似的功能性活性。
取代活化序列本发明提供经修饰的corin分子或其片段或衍生物，其每一个均包括取代天然存在的活化序列的取代活化序列。所述取代活化序列与corin分子的天然存在的活化序列不同。例如，人的天然存在的活化序列，corin分子包括氨基酸序列R-ILGG(Yan，W.等人(1999)同上；Yan，W.等人(2000)同上)。所述取代活化序列由同源蛋白酶识别和切割。
所述取代活化序列可以是一种由来自于任何物种尤其是哺乳动物来源，包括牛、猪、鼠、马、犬、猫、猿、绵羊或人，或其它来源例如鱼、鸟或昆虫的蛋白酶识别和切割的氨基酸序列。
取代活化序列可以是由蛋白酶识别和切割的氨基酸序列，所述蛋白酶包括任何丝氨酸蛋白酶、胰蛋白酶家族的任何成员、任何胰蛋白酶样蛋白酶和任何II型跨膜蛋白酶。
所述活化序列可以是由下列酶识别和切割的氨基酸序列(Barrett，A.J.等人(eds)(1998)Handbook of Proteolytic Enzymes，AcademicPress，London)肠激酶；凝血酶；凝血因子Xa；弗林蛋白酶；胰蛋白酶；胰凝乳蛋白酶；弹性蛋白酶；血纤维蛋白溶酶；激肽释放酶；针依瓦菊素(aerosin)；人类呼吸道胰蛋白酶样蛋白酶(HAT)(Yamaoka，K.等人(1998)J.Biol.Chem.27311895-11901)；肥大细胞类胰蛋白酶；MBL-关联的丝氨酸蛋白酶(MASP-1 and MASP-2)(Matsushita，M.等人.(2000)J.Immunol.1642281-2284)；hepsin(Torres-Rosado，A.等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 907181-7185)；MT-SP1/matryptase(Takeuchi，T.等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9611054-11061；Lin，C.Y.等人(1999)J.B ol.Chem.27418231-18236)；TMPRSS2(Paoloni-Giacobina，A.等人(1997)Genomics 44309-320)；或Stubble-stubbloid(Appel，L.F.等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 904937-4941)。
在一个实施方案中，所述取代活化序列可以是由一种TMPRSS3蛋白酶或epitheliasin蛋白酶识别并切割的氨基酸序列，例如LKTPR-VVGG序列(SEQ ID NO38)(Paoloni-Giacobino，A.等人(1997)同上；Lin，B.等人(1999)Cancer Res.594180-4184)；或由一种MT-SP1蛋白酶或epithin蛋白酶识别和切割的氨基酸序列，例如TRQAR-VVGG序列(SEQ ID NO39)(Kim，M.等人(1999)Immunogenetics 49420-428)。
在另一个实施方案中，所述取代活化序列可以是由肠激酶蛋白酶识别和切割的氨基酸序列，例如DDDDK-IVGG序列(SEQ ID NO40)(Kitamoto，Y.等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 917588-7592；La Vallie，E.R.等人(1993)J.Biol.Chem.26823311-23317)。在另一个实施方案中，所述取代活化序列是由人或牛肠激酶识别和切割的氨基酸序列，其包括氨基酸序列DDDDK-I(SEQ ID NO41)。
变异的取代活化序列本发明还提供了经修饰的corin分子或其片段或衍生物，其包括具有上述取代活化序列的序列变异的取代活化序列。所述取代活化序列可以有保守性氨基酸取代，其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学性质。变体可以有非保守性改变。变异的取代活化序列被选择为使得折叠的经修饰的corin分子能被同源蛋白酶切割，从而产生活化的经修饰的corin分子。
取代活化序列的长度本发明提供经修饰的corin分子，其包括长度为大约2个至大约10个氨基酸残基的取代活化序列。在一个实施方案中，所述取代活化序列长度为大约2个至大约6个氨基酸。
可选择出与折叠的野生型corin分子中的活化序列跨越相同或相似的距离的取代活化序列。在一个实施方案中，所述取代活化序列不会影响经修饰的corin分子的功能活性。
可以根据在折叠的经修饰的corin分子中的活化序列跨越的距离确定所述取代活化序列中有哪些和有多少氨基酸残基可以改变。可以根据野生型corin分子的氨基酸序列预测出和/或根据野生型corin分子的X-射线晶体结构通过实验获得折叠的野生型corin分子中的活化序列所跨越的距离。
例如，野生型人corin的氨基酸序列(Yan，W.等人(1999)同上)可用作预测折叠的人野生型corin分子中的活化序列所跨越距离的基础。包含残基RILGG的野生型人corin分子的活化序列跨越5个氨基酸残基的线性长度(图2)。
C.本发明的经修饰的corin核酸分子编码经修饰的corin分子的核酸分子本发明提供了各种分离和重组的核酸分子或其片段或衍生物，其包括编码本发明经修饰的corin分子的多核苷酸序列，本文中称为“经修饰的corin多核苷酸序列”、“corin序列”、“corin分子序列”或“本发明的核酸分子”。本发明还提供了编码这些经修饰的corin分子的片段或衍生物的多核苷酸序列。本发明进而提供了相关的多核苷酸分子，例如互补的经修饰的corin多核苷酸序列或其一部分，以及与本发明的核酸分子杂交的多核苷酸分子。
所述经修饰的corin多核苷酸序列优选为分离形式，包括但不限于DNA、RNA、DNA/RNA杂交体以及相关分子及它们的片段。特别包括天然来源的或合成的基因组DNA、cDNA、核酶和反义RNA或DNA分子、以及基于其他主链或包括其他碱基的核酸分子。
本发明的核酸分子编码本发明的经修饰的corin分子和/或其片段或衍生物，其中所编码的经修饰的corin分子呈现出与天然存在的corin分子相同或相似的功能活性。
在一个实施方案中，分离的编码可溶性经修饰的corin分子的核苷酸序列示于图10，其起始于第115位的密码子GAT并终止于第2871位的密码子AAC。图10第2134至2148位的核酸序列编码肠激酶活化切割序列DDDDK。此外，图10的第1至108位的核酸序列编码用于蛋白质分泌的Igκ信号序列，第2871至2973位的核酸序列编码病毒V5和6xHis表位标记序列。
根据本发明的实践，本发明的核酸分子可以是分离的经修饰的corin核酸序列的全长或部分长度的分子或寡聚物。本发明的corin序列可以编码本发明的经修饰的corin分子的全部或部分，包括细胞质结构域、跨膜结构域和/或细胞外结构域。所述细胞外结构域包括两个卷曲样半胱氨酸富集区、8个低密度脂蛋白受体重复序列、一个巨噬细胞清道夫受体样结构域、一个取代活化序列和一个丝氨酸蛋白酶催化结构域。
分离的核酸分子本发明的核酸分子优选是分离的形式，其中所述核酸分子基本上从序列不同于经修饰的corin分子序列的杂质核酸分子中分离出来。本领域技术人员能够容易地应用核酸分离程序以获得分离的经修饰的hepsin分子序列，参见例如Sambrook，J.E.等人(1989)inMolecular Cloning，Cold Spring Harbor Press，N.Y.)。本发明还提供了通过重组DNA技术或化学合成方法产生的分离的经修饰的corin分子序列。本发明还提供了分离自各种哺乳动物物种的核苷酸序列，所述哺乳动物物种包括牛、猪、鼠，、马、犬、猫、猿、绵羊或人，或者其它来源例如鱼、鸟或昆虫。
所述被分离的核酸分子包括DNA、RNA、DNA/RNA杂交体及相关分子、与编码经修饰的corin分子的经修饰的corin分子核苷酸序列互补的核酸分子或其片段或衍生物、以及与编码所述经修饰的corin分子的核酸分子杂交的核酸分子。优选的核酸分子具有与本申请所公开的核苷酸序列相同或相似的核苷酸序列。特别包括基因组DNA、RNA例如小干扰RNA、cDNA、核酶和反义分子。
相同或相似的核苷酸序列本发明提供了多核苷酸序列与本发明所公开的经修饰的corin分子序列相同或相似的分离的核酸分子。因此，所述多核苷酸序列可与特定的经修饰的corin分子序列相同，例如图10所示。或者，所述寡核苷酸序列可以与所公开的序列相似。
本发明的一个实施方案提供了与经修饰的corin分子核苷酸序列显示出序列同一性或相似性的核酸分子，例如与如图10所示的本发明的序列具有至少60％-99.9％的序列相似性和最多100％序列同一性的分子。另一个实施方案提供了呈现出约75％至99.9％之间的序列相似性的核酸分子，另一个实施方案提供了约86％至99.9％之间的序列相似性的分子。而另一个实施方案提供了与图10所示的本发明的经修饰的corin分子序列具有100％序列同一性的分子。
互补的核苷酸分子本发明还提供了与图1和10所示序列互补的核酸分子。互补可以是完全互补或是部分互补。完全互补的核苷酸序列是与图1和10任一所示的完整的corin序列互补的核苷酸序列。部分互补的核苷酸序列是仅与图1和10任一所示的序列的一部分互补的核苷酸序列。所述互补分子包括反义核酸序列。反义分子可用于RNA干扰(RNAi)、DNA干扰、抑止表达天然存在或经修饰的corin分子的细胞的生长或使其致死(Yan，W.等人(1999)同上)。所述互补分子也包括小干扰RNA(siRNA)(Elbashir，S.M.等人(2001)Nature 411494-498；Hammond，S.M.等人(2001)Nat.Rev.Genet 2110-119)。
杂交核酸分子本发明进而提供了具有与图1和图10任一所示的本发明的经修饰的corin分子核苷酸序列选择性杂交的多核苷酸序列的核酸分子。所述杂交的核酸分子可以在高严格杂交条件下杂交。典型地，在标准高严格条件下的杂交将出现在序列互补性差异为约70％至约100％的两条互补的核酸分子间。对于本领域技术人员而言显而易见的是，两条核酸分子间的高严格杂交取决于例如，同一性的程度、杂交的严紧度和杂交链的长度。用于构建高严格杂交的方法和配方在现有技术中是已知的，并且可以在例如Sambrook，J.E.等人(1989)同上)中找到。
一般而言，严格杂交条件是(1)使用低离子强渡和高温洗涤，例如50℃下0.015M NaCl/0.0015M柠檬酸钠(sodium titrate)/0.1％SDS；或(2)杂交时使用一种变性剂如甲酰胺，例如42℃下加有0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/pH 6.5的50mM磷酸钠缓冲液以及750mM NaCl，75mM柠檬酸钠的50％(vol/vol)甲酰胺。
严格条件另一个实例包括42℃下使用50％甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×Denhardt′s溶液、经超声波降解的鲑精DNA(50mg/ml)、0.1％SDS、和10％葡聚糖硫酸酯，并在42℃下的0.2×SSC和0.1％SDS中洗涤。熟练的技术人员能够容易地确定和改变适于获得清楚且可被检测的杂交信号的严格条件。
核酸片段本发明进而提供了具有本发明的经修饰的corin分子序列的片段的核酸分子，例如本申请公开的以及图1和10任一所示经修饰的corin分子序列的一部分。片段的大小可根据其所计划的用途来确定。例如，如果该片段是选作编码一种包含天然存在的野生型corin分子的细胞外结构域的经修饰的corin分子，所述细胞外结构域含有取代活化序列，那么本领域技术人员就会选择出大到足以编码所述结构域的多核苷酸片段。如果所述片段被用作核酸探针或PCR引物，那么将片段长度选择成在探测或扩增过程中获得相对少的假阳性的长度。
本发明的核酸分子、其片段和探针及引物对于各种分子生物学技术有用，包括例如文库的杂交筛选，或者作为一种基因转录和/或表达的分析方法的mRNA转录物的检测和定量。所述探针和引物可以是DNA、RNA、或者DNA或RNA分子的衍生物。经理论和实践的考虑所建议的探针或引物长度为至少15个碱基对(Wallace，B.andMiyada，G.(1987)Methods Enzymol.152432-442)。
作为选择性杂交探针或PCR引物格外有用的经修饰的corin分子核苷酸序列的片段可采用现有技术已知方法从经修饰的corin分子核苷酸序列中容易地鉴别出来。例如，结合和/或检测经修饰的corin分子转录物的一部分的PCR引物系列可以通过美国专利No.4,965,188中描述的方法制备。本发明的探针和引物可以通过本领域技术人员公知的方法制备(Sambrook，J.E.等人(1989)同上)。这些探针和引物可以通过化学合成方法合成(Gait，M.J.，ed.(1984)inOligonucleotide Synthesis，IRL Press，Oxford，England)。
本发明的一个实施方案提供了与经修饰的corin分子序列互补的核酸引物，其使得本发明的核酸分子或其任何部分的特异扩增得以进行。另一个实施方案提供了用于与所述经修饰的corin分子序列或其任何部分选择性或特异性杂交的互补的核酸探针。
或者，所述经修饰的corin分子序列的片段可以被用于构建一种具有与非corin分子序列融合的经修饰的corin分子序列的重组融合基因。
融合基因序列本发明提供了融合基因序列，其包括与非corin分子序列融合(例如，连接或结合)的经修饰的corin分子序列。所述经修饰的corin分子序列以符合读码框地被可操纵地与非corin分子序列融合。
本发明的融合基因序列包括编码与表位标记融合的经修饰的corin分子的核苷酸序列，所述表位标记包括但不限于组氨酸(6xHis)标记、V5标记、FLAG标记、流感病毒血凝素(HA)标记、Myc标记、VSV-G标记、及硫氧还蛋白(Trx)标记。
本发明的融合基因序列包括与全长或部分长度报告基因序列融合的编码经修饰的corin分子的核苷酸序列，所述报告基因包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶，、β-葡糖苷酸酶、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、和包括蓝色荧光蛋白(BFP)在内的自发荧光蛋白。
本发明的融合基因序列包括与编码结合DNA分子或结合其它细胞分子的蛋白质或蛋白质片段的基因序列融合的编码经修饰的corin分子的核苷酸序列，所述细胞分子包括但不限于麦芽糖结合蛋白(MBP)、S-标记、Lex A DNA结合结构域(DBD)融合、GAL4 DNA结合结构域融合、和单纯疱疹病毒(HSV)BP16蛋白融合。
本发明的融合基因序列包括与编码切割位点部分的基因序列融合的编码经修饰的corin分子的核苷酸序列。所述切割位点可以位于经修饰的corin分子编码序列和切割序列之间。所述切割位点部分包括但不限于hepsin、凝血酶、和因子Xa识别序列。
嵌合的核苷酸序列本发明提供了编码重组嵌合经修饰的corin分子的嵌合基因序列。所述嵌合的核苷酸分子编码与从不同的第二来源分离的corin分子的一部分融合的从第一来源分离的corin分子的一部分。所述嵌合的分子编码符合读码框地被可操纵地融合的嵌合多肽。
在一个实施例中，嵌合核苷酸分子编码与来源于第二来源的corin分子的细胞质结构域融合的来源于第一来源的corin分子的细胞外结构域，其中所述细胞外结构域包括取代活化序列。在另一个实施例中，嵌合核苷酸分子编码与来源于第二来源的corin分子的细胞外结构域的剩余部分融合的来源于第一来源的corin分子的细胞外结构域的一部分，其中所述嵌合分子包括具有取代活化序列的细胞外结构域。
密码子选择变体(codon usage variants)本发明提供了不同于所公开的经修饰的corin分子核苷酸序列却不改变所编码的经修饰的corin分子的推测的多肽序列或生物活性的分离的密码子选择变体。例如，许多氨基酸是由多于一种的三联体密码子所指定。由于遗传密码的简并性，指定相同的氨基酸的密码子可能存在。实例包括编码氨基酸精氨酸(R)的核苷酸密码子CGU、CGG、CGC、和CGA；或编码氨基酸天冬氨酸(D)的密码子GAU和GAC。因此，一种蛋白质可以由一种或多种具体核苷酸序列不同但仍然编码具有相同序列的蛋白质分子的核酸分子编码。氨基酸编码序列如下
所述密码子选择变体可以通过重组DNA技术产生。根据宿主细胞使用密码子的频率，可以对密码子进行选择以优化特定的原核或真核表达宿主中经修饰的corin分子转录物或经修饰的corin分子的产生水平。改变编码经修饰的corin分子的可供选择的理由包括生产具有更理想的性质的RNA转录物，所述更理想的性质例如延长的半衰期或提高的稳定性。作为遗传密码简并性的结果，可以分离出许多编码各个经修饰的corin分子的经修饰的corin分子核苷酸序列的变体。因此，本发明提供了选择每个可能的三联体密码子以产生编码所公开的经修饰的corin分子或编码具有经修饰的corin分子的生物活性的分子的核苷酸序列的每一种可能的组合。该特定的实施方案中提供了与图1和10任一所示序列不同的经分离的核苷酸序列，以便每一种变异的核苷酸序列编码一种与图2和图11所示氨基酸序列具有序列同一性的分子。
变异的核苷酸序列本发明提供了含有编码任何本发明的经修饰corin分子的变异形式的多核苷酸序列的核酸分子。所述变异的核苷酸序列编码经修饰的corin分子的细胞外结构域的变体形式。所述变异的核苷酸序列编码位于本发明的经修饰corin分子中的取代活化序列的变异形式。在一个实施方案中，所述变异的核苷酸序列编码一种与天然存在的野生型corin分子具有相同或相似功能活性的变异的经修饰的corin分子。
本发明的这些变异的核苷酸序列包括保守的或非保守的氨基酸取代。变异的核苷酸序列包括突变例如氨基酸取代、缺失、插入、添加、截短或蛋白质的加工或切割错误。所述变异的核苷酸序列包括天然存在的corin分子的等位基因变体、同系物变体、或直系同源物变体。
衍生的核酸分子本发明的核酸分子还包括与DNA或RNA分子不同的衍生的核酸分子以及反义分子。衍生的分子包括肽核酸(PNAs)和包括硫代磷酸酯、磷酸三酯、磷酰胺和甲基膦酸酯分子在内的以依赖于碱基对的形式与单链DNA或RNA结合的非核酸分子(Zamecnik，P.C.等人(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75280284；Goodchild，P.C.等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 834143-4146)。肽核酸分子包含加入了氨基酸残基如赖氨酸和氨基的核酸寡聚物。这些小分子，也称为导rDNA复制的复制子。或者，所述载体指导所述重组载体整合到宿主细胞中。也可以使用各种病毒载体，例如，许多已知的逆转录病毒和腺病毒载体(Berkner，K.L.(1988)BioTechniques 6616-629)。
本发明的载体使得所述经修饰的corin分子或其片段或衍生物能够在原核或真核宿主细胞中表达。所述载体可以是含有表达控制元件例如启动子序列的表达载体，其使得插入的经修饰的corin分子核苷酸序列能够转录而且其能够被用于调节所连接的经修饰的corin分子序列在适当的宿主细胞中的表达(例如转录和/或翻译)。
所述表达控制元件可以是各种来源，包括天然存在的以及合成的。天然存在的元件可以是细胞或病毒来源的。表达控制元件在现有技术中已知，其包括但不限于可诱导的启动子、组成型启动子、分泌信号、增强子、转录终止子和其它转录调节元件。
翻译中涉及的其它的表达控制元件在现有技术中是已知的，包括SD(Shine-Dalgarno)序列(例如，原核宿主细胞)以及起始密码子和终止密码子。外源转录元件和起始密码子可以是各种来源，包括天然和合成的。
启动子可以是可诱导型的，其受环境刺激或细胞的生长培养基调节，包括从编码热激蛋白、醇脱氢酶2、异细胞色素C(isocytochromeC)、酸性磷酸酶、与氮分解代谢相关的酶以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的基因获得启动子。
启动子可以是组成型的，包括酵母β-因子、醇氧化酶、巨细胞病毒和PGH。综述参见Ausubel，F.M.等人(1987)in CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，N.Y.)和Bitter，G.A.等人(1987)Methods Enzymol.153516-544。
转录的效率可通过包含适于所使用的细胞系统的增强子来增强(Scharf，D.等人(1994)Results Probl.Cell.Differ.20125-162；Bitter，G.A.等人(1987)同上)。病毒启动子包括SV40早期启动子或包含在逆转录病毒载体的LTR中的启动子。其它病毒启动子包括巨细胞病毒启动子(Boshart，M.等人(1985)Cell 41521-530)。
通常使用的在表达载体中使用的真核控制序列包括与哺乳动物抗基因剂，通过与其核酸互补链(模板)结合阻止转录物的延伸(Nielsen，P.E.等人(1993)Anticancer Drug Des 853-63)。DNA、RNA、以及它们的类似物的合成方法的综述可以在Eckstein，E.等人，eds.(1991)in Oligonucleotides and Analogues，IRL Press，New York；and Gait，M.J.，ed.(1984)in Oligonucleotide Synthesis，IRL Press，Oxford，England中找到。此外，反义RNA技术的方法描述于美国专利Nos.5,194,428和5,110,802中。熟练的技术人员使用本申请描述的经修饰的hepsin分子多核苷酸序列能够容易地获得这些类的衍生的核酸分子，参见例如Egholm，M.等人(1992)Innovative andPerspectives in Solid Phase Synthesis，pp.325-328，或美国专利No.5,539,082。
标记的核酸分子本发明提供了用可检测的标记连接或标记的本发明的核酸分子。可检测的标记的实例包括但不限于放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶。生产标记的核酸分子的技术是公知的，参见例如Sambrook，J.E.等人(1989)同上。
D.重组的经修饰的Corin核酸分子本发明提供了包括编码经修饰的corin分子或其片段或衍生物的核苷酸序列的重组DNA分子(rDNA)，如本文所描述的。本申请使用的rDNA分子是一种已经被用于体外分子操作的DNA分子。生产重组DNA分子的方法在现有技术中是公知的，例如参考Sambrook，J.
E.等人(1989)同上。在一个实施方案中，本发明的重组DNA分子被可操纵地与一个或多个表达控制序列和/或载体序列连接。
载体本发明的核酸分子可以是重组分子，其每个都含有编码经修饰的corin分子的多核苷酸序列或其片段或衍生物，其与载体连接以产生重组载体分子。
术语载体包括但不限于质粒、粘粒、BAC、YAC、PAC和噬菌粒。所述载体可以是自主复制的载体，其包含在适当的宿主细胞内指细胞相容的启动子和控制序列，例如，CMV启动子和鸟肉瘤病毒(ASV)(πLN载体)。其它通常使用的启动子包括猿猴病毒40(SV40)的早期和晚期启动子(Fiers，W.等人(1978)Nature 273113-120)，或者其它病毒启动子例如从多瘤病毒、腺病毒2和牛乳头瘤病毒获得的启动子。也可以使用可诱导的启动子例如hMTII(Karin，M.等人(1982)Nature 299797-802)。
酵母载体的转录控制序列包括用于合成糖酵解酶的启动子(Hess，B.等人(1968)J.Adv.Enzyme Reg.7149；Holland，M.J.andHolland，J.P.(1978)Biochemistry 174900-4097)。现有技术中已知的其它启动子包括CDM8载体中提供的CMV启动子(Toyama，R.和Okayama，H.(1990)FEBS Lett.268217-221)；3-磷酸甘油酸激酶的启动子(Hitzeman，R.A.等人(1980)J.Biol.Chem.25512073-12080)和其它糖酵解酶的启动子。
对于经修饰的corin分子序列的有效翻译也需要特异的翻译起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻的序列。天然corin分子的ATG起始序列或上游序列可被插入到适当的表达载体中。或者，可以使用合成的ATG起始密码子和其它序列。ATG起始密码子必须在正确的读码框中以确保插入序列的翻译。
表达控制元件可以被置于编码序列的3′端。这些序列可以起到稳定信使RNA的作用。这些终止子在位于几个源于酵母和哺乳动物基因的编码序列后的3′未翻译区中发现。
表达载体可以包括至少一种选择性标记基因，所述标记基因编码的基因产物提供抗药性，例如对卡那霉素、氨苄青霉素或四环素的抗性。
表达载体可以包括任何标记基因。它们包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler，M.等人(1977)Cell 11223-232)和腺苷酸转磷酸核糖基酶(Lowy，I.等人(1980)Cell 22817-823)基因，它们可以分别用于tk-阴性或aprt-阴性细胞中。而且，也可以将抗代谢物抗性、抗生素抗性或除草剂抗性用作选择基础；例如，可提供氨甲蝶呤抗性的dhfr(Wigler，M.等人(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 773567-3570)；提供氨基糖苷类新霉素和G-418抗性的npt(Colbere-Garapin，F.等人(1981)J.Mol.Biol.1501-14)和分别提供氯磺隆(chlorsulfuron)和膦丝菌素乙酰基转移酶抗性的als或pat(Murry，L.E.(1992)in McGraw Yearbook of Science and Technology，McGraW Hill，New York，N.Y.，pp 191-196)。其它的选择性基因已经被描述了，例如trpB，其使得细胞利用吲哚从而替代色氨酸，或者hisD，其使得细胞利用组氨醇(histinol)从而替代组氨酸(Hartman，S.C.and Mulligan，R.C.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 858047-8051)。近来，可见标记的使用获得了普遍性，这些标记例如花青素、β-葡糖醛酸糖苷酶及其底物GUS和萤光素酶及其底物荧光素，这些标记不仅被广泛用于鉴别转化体，也被用于对特定载体系统的短暂或稳定的蛋白质表达定量(Rhodes，C.A.等人(1995)Methods Mol.Biol.55121-131)。
所述载体还包括多个能够使外源DNA序列方便地插入的核酸内切酶限制性位点。产生编码本发明的经修饰的corin分子的重组表达载体的方法是现有技术中公知的(Sambrook，J.E.等人(1989)同上；Ausubel，F.M.等人(1989)同上)。
用于产生经修饰的corin分子的表达载体与真核宿主细胞相容。所述载体可以与脊椎动物细胞相容。这些载体可以包括表达控制元件例如从哺乳动物基因或哺乳动物病毒中获得的启动子和/或增强子。其它表达载体可以包括从哺乳动物基因或哺乳动物病毒中获得的组织-或细胞-特异性启动子和/或增强子。
所述表达载体可以与其它的真核宿主细胞相容，包括昆虫、植物或酵母细胞。所述表达载体可包括表达控制元件，例如用于在昆虫细胞中表达的杆状病毒多角体蛋白启动子。也可以使用来源于植物细胞(例如热激蛋白、RUBISCO、储备蛋白(storage protein)基因)、病毒启动子或前导序列的启动子和/或增强子或来源于植物病毒的启动子和/或增强子。
真核细胞表达载体在现有技术中是公知的，并且可以从几个商业来源获得，所述载体包括PSVL和pKSV-10(Pharmacia)、pBPV-1/pML2d(International Biotechnologies，Inc.)、pTDT1(ATCC，#31255)、以及相似的真核表达载体。用于真核宿主细胞的表达载体的实例包括但不限于用于哺乳动物宿主细胞的载体，如BPV-1；pHyg；pRSV；pSV2；pTK2；pIRES(Clontech)；pRc/CMV2；pRc/RSV；pSFV1(Life Technologies)；pVPakc载体；pCMV载体；pSG5载体(Stratagene)；逆转录病毒载体(例如pFB载体(Stratagene))；pCDNA-3(Invitrogen)或其经修饰的形式；腺病毒载体；腺相关病毒载体；杆状病毒载体。其它用于真核宿主细胞的表达载体包括用于酵母的pESC载体(Stratagene)和用于在昆虫细胞中表达的pFastBac(Gibco/BRL，Rockville，MD)。
所述表达载体可以包括用于在细菌宿主细胞中表达的表达控制元件。这些表达控制元件可受环境条件例如热激诱导，或受添加异丙基-β-D硫代半乳糖苷(例如IPTG)这样的试剂所诱导(Yamaguchi，N.等人.(2002)J.Biol.Chem.2776806-6812)。原核细胞表达载体在现有技术中是公知的，并且可以从一些商业来源获得。例如，pGEX载体(Promega，Madison，WI)、pTrcHisB载体(Invitrogen)、pET载体(e.g.，pET-21，Novagen Corp.)、BLUESCRIPT噬菌粒(Stratagene，LaJolla，CA)、pSPORT(Gibco BRL，Rockville，MD)、或ptrp-lac杂合体可用于在细菌宿主细胞中表达所述经修饰的corin分子。
E.经修饰的corin宿主-载体系统本发明进而提供了宿主-载体系统，其包括转导入合适的宿主细胞的含有经修饰的corin分子核苷酸序列或其片段或衍生物的载体、质粒、噬菌粒、BAC、PAC、YAC或粘粒。
所述宿主-载体系统可被用于转录和/或表达(例如，产生)本发明的经修饰的corin分子。可以使用各种表达载体/宿主系统来携带和表达所述经修饰的corin分子序列。所述宿主细胞可以是真核或原核细胞。
真核宿主细胞合适的真核宿主细胞的实例包括昆虫细胞、酵母细胞、植物细胞或动物细胞例如哺乳动物细胞。
一种可用于表达经修饰的corin分子的表达系统是昆虫系统。在一个这样的系统中，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)可被用作在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)昆虫细胞或粉纹夜蛾(Trichoplusia)幼虫中表达外源基因的载体。可将编码经修饰的corin分子的序列克隆到所述病毒的非必要区域例如多角体蛋白基因中，并将其置于多角体蛋白启动子的控制之下。经修饰的corin分子核苷酸序列的成功插入会使得多角体蛋白基因失活并产生缺少衣壳蛋白的重组病毒。然后这些重组病毒可用于感染可表达经修饰的corin分子的草地夜蛾细胞或粉纹夜蛾幼虫(Smith，G.E.等人(1983)J.Virol.46584-593；Engelhard，E.K.等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 913224-3227)。
在哺乳动物宿主细胞中，可以使用许多基于病毒的表达系统。当采用腺病毒作为表达载体时，可以将经修饰的corin分子核苷酸序列连接到带有晚期启动子和三联前导序列(tripartite leader sequence)的腺病毒转录/翻译载体中。病毒基因组的非必要E1或E3区内的插入产生能够在被感染的宿主细胞中表达经修饰的corin分子的有活性的病毒(Logan，J.and Shenk，T.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 813655-3659)。此外，也可以使用像劳氏肉瘤病毒(RSV)增强子这样的转录增强子增加在哺乳动物宿主细胞中的表达。
在以前的一项研究中，利用脂转染试剂(Lipofectin)介导的转染步骤将一种含有人corin cDNA的质粒转染进人胚肾(HEK)293细胞。经转染的HEK293细胞表达人corin，其活化ANP前体(Yan，W.等人(2000)同上)。
在酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，可以使用许多包括组成型或可诱导型启动子的载体，所述启动子例如β-因子/醇氧化酶和PGH。综述参见Ausubel，F.M.等人(1989)同上and Bitter，G.A.等人(1987)同上。
在使用植物表达载体时，编码经修饰的corin分子的序列的表达可由多种启动子中的任何一种来启动。例如，可以单独使用像CaMV的35S和19S启动子这样的病毒启动子(Brisson，N.等人(1984)Nature310511-514)，或者与来自TMV的Ω前导序列联合使用(Takamatsu，N.等人(1987)EMBO J.6307-311)。或者，可以使用植物启动子例如RUBISCO的小亚基(Coruzzi，G.等人(1984)EMBO J.31671-1680；Broglie，R.等人(1984)Science 224838-843)；或热激启动子(Winter，J.and Sinibaldi，R.M.(1991)Results Probl.Cell Differ.1785-105)。
此外，可选择一种能够调节插入的经修饰的corin分子核苷酸序列表达或能够以希望的方式加工表达的蛋白质的宿主细胞株。表达的经修饰的corin分子的这些修饰包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化、以及酰化。切割蛋白质前体形式(例如pre-pro-蛋白质)的翻译后加工对于正确插入、折叠和/或功能也是重要的。不同的宿主细胞例如CHO、HeLa、MDCK、293、WI38等等对于这种翻译后活性具有特异的细胞系统和特性机制，可被选择以确保所导入的外源蛋白的正确修饰和加工。
原核宿主细胞合适的原核宿主细胞的实例包括来自于像埃希氏菌属(Escherichia)、杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链球菌属(Streptococcus)、和链霉菌属(Streptomyces)这样的属的细菌菌株。例如像Epicurian coli XL-1 Blue细胞(Stratagene)这样的细菌细胞，以前用于产生天然hepsin(Kazama，Y.等人(1995)J.Biol.Chem.27066-72)，也可以用于产生所述经修饰的corin分子。
在细菌系统中，许多表达载体可以根据经修饰的corin分子所希望的用途进行选择。例如，当需要大量经修饰的corin分子时，例如用于诱导抗体，那么就希望指导可溶性且容易纯化的融合蛋白高水平表达的载体。这种载体包括但不限于多功能大肠杆菌克隆和表达载体例如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中经修饰的corin分子核苷酸序列可与半乳糖苷酶的氨基端Met及随后7个残基的序列被符合读码框地连接到载体中以便产生杂化蛋白质。其它载体包括pIN载体(VanHeeke，G.and Schuster，S.M.(1989)J.Biol.Chem.2645503-5509)等等。也可以使用pGEX载体(Promega，Madison Wis.)以与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合蛋白形式表达外源蛋白。一般而言，这种融合蛋白是可溶的，并且可以通过吸附到谷胱甘肽-琼脂糖珠上，然后在游离的谷胱甘肽存在下洗脱而从溶解的细胞中将其纯化。这些系统中制备的蛋白质被设计为包括hepsin、凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点以便所克隆的目的蛋白质可以在需要时从GST部分中释放。
将经修饰的corin核酸序列导入宿主细胞的方法将经修饰的corin分子核苷酸序列导入宿主细胞的方法是公知的方法，其取决于所使用的载体类型和所使用的宿主系统。
例如，在脊椎动物细胞中，采用各种方法用载体将所述核酸序列导入，包括磷酸钙介导的DNA转染(Graham，F.L.and Van der Eb，A.J.(1973)Virology 52456-467；Wigler，M.等人(1977)同上)或其它阳离子介导的转染方法、电穿孔(Neuman，E.等人(1982)EMBO J.1841-845)、显微注射(Anderson，W.F.等人1(980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 775399-5403；Cappechi，M.R.(1980)Cell 22479-488；Graessman，A.等人(1979)J.Virol.32989-994)、或包括在脂质囊泡中包裹DNA的脂质方法(Schaefer-Ridder，M.(1982)Science 215166-168)。其它方法包括基因枪方法。其它方法包括利用含有晚期启动子和三联前导序列的腺病毒转录/翻译载体。核酸序列可以插入进腺病毒基因组的非必要E1或E3区以产生能够表达由该核酸序列所编码的蛋白质的有存活能力的病毒(Logan，J.and Shenk，T(1984)同上)。或者，还可以使用逆转录病毒转移法(Gilboa，E.等人(1986)BioTechniques 4504-512)。
植物细胞可通过直接DNA转化或病原体介导的转染而被导入。这些技术的综述参见Hobbs，S.(1992)in McGraw Yearbook of Scienceand Technology，McGraw Hill，New York，N.Y.，pp 191-196 andWeissbach，A.and Weissbach，H.(1988)in Methods for Plant MolecularBiology，Academic Press，New York，N.Y.，pp 421-463。或者，可通过利用金属颗粒的基因枪法导入植物细胞。
通过电穿孔或盐处理法将核酸分子导入(例如，转化)到原核宿主细胞中(Cohen，S.N.et a/.(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 692110-2114；Sambrook，J.E.等人.(1989)同上)。
转化的细胞的选择导入了经修饰的corin分子核苷酸序列的细胞可以通过现有技术中公知技术鉴别。可以对这些细胞进行选择、溶解并利用DNA凝胶印迹法或类似的方法检测其DNA内容物中所导入的序列的存在(Southern，E.M.(1975)J.Mol.Biol.98503-517；Berent，S.L.等人(1985)Biotechniques 3208-220)。或者，由本发明的细胞产生的蛋白质可以通过生物化学检测或免疫学方法进行检测。
可以使用许多选择系统来重新获得被导入的(例如转化的或转染的)细胞。可以基于分别可使用于tk-阴性或aprt-阴性细胞的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler，M.等人(1977)同上)或腺苷酸转磷酸核糖基酶(Lowy，I.等人(1980)Cell 22817-23)基因的表达选择被导入的细胞。也可以使用抗代谢物抗性、抗生素抗性或除草剂抗性作为选择的基础；例如，提供氨甲蝶呤抗性的dhfr(Wigler，M.等人(1980)同上)；提供氨基糖苷类新霉素和G-418抗性的npt(Colbere-Garapin，F.等人(1981)同上)和分别提供氯磺隆(chlorsulfuron)和膦丝菌素乙酰基转移酶抗性的als或pat。另外的选择性基因已经被描述了，例如trpB，其使得细胞利用吲哚从而替代色氨酸，或者hisD，其使得细胞利用组氨醇(histinol)替代组氨酸(Hartman，S.C.and Mulligan，R.C.(1988)同上)。近来，可见标记的使用更加普遍，这些标记例如花青素、β-葡糖醛酸糖苷酶及其底物GUS和萤光素酶及其底物萤光素，这些标记不仅被广泛用于识别转化体，也被用于对特定载体系统的短暂或稳定的蛋白质表达定量(Rhodes，C.等人(1995)同上)。
F.细胞和基因治疗本发明的经修饰的corin分子可根据本发明通过称为“细胞治疗”的方法在体内表达这些经修饰的corin分子从而得以利用。因此，例如，可以用编码经修饰的corin分子的多核苷酸(DNA或RNA)对细胞进行回体(ex vivo)工程化，然后被工程化的细胞被提供给要用经修饰的corin分子治疗的患者。这些方法在现有技术中是公知的。例如，可采用现有技术中公知的方法利用含有编码本发明的经修饰的corin分子的RNA的逆转录病毒颗粒对细胞进行工程化。
本发明的经修饰的corin分子还可根据本发明通过称为“基因治疗”的方法在体内表达这些经修饰的corin分子从而得以利用。因此，例如，可以用编码经修饰的corin分子的多核苷酸(DNA或RNA)对病毒进行工程化，然后被工程化的病毒被提供给要用经修饰的corin分子治疗的患者。这些方法在现有技术中是公知的。例如，可采用现有技术中公知的方法对重组腺病毒进行工程化，使其含有编码本发明的经修饰的corin分子的DNA。
利用细胞或基因治疗的本发明的经修饰的corin分子的局部输送可给目的区域(内衬血管的内皮细胞)提供治疗剂。
本发明包括体内和体外的细胞和基因治疗方法。将潜在的治疗基因转移到规定的细胞群的一些方法是公知的，参见例如Mulligan，R.C.(1993)Science 260926-932。这些方法包括直接基因转移(参见，例如Wolff，J.A.等人(1990)Science 2471465-1468)、脂质体介导的DNA转移(参见，例如Caplen，N.J.等人(1995)Nature Med.339-46；Crystal，R.G.(1995)Nature Med.115-17；Gao，X.and Huang，L.(1991)Biochem.Biophys.Res.Comm.179280-285)、逆转录病毒介导的DNA转移(参见，例如Kay，M.A.等人(1993)Science 262117-119；Anderson，W.F.(1992)Science 256808-813)；和DNA病毒介导的DNA转移。这些DNA病毒包括腺病毒(优选基于Ad2或Ad5的载体)、疱疹病毒(优选基于单纯疱疹病毒的载体)和细小病毒(优选基于“有缺陷的”或非自主性细小病毒的载体，更优选基于腺相关病毒的载体，最优选基于AAV-2的载体)。参见，例如Ali，M.等人(1994)Gene Therapy 1367-384；并入本文作为参考的美国专利4,797,368，以及并入本文作为参考的美国专利5,139,941。
用于转移目的基因的特定的载体系统的选择取决于各种因素。一个重要的因素是靶细胞群的特性。尽管逆转录病毒载体已经被广泛地研究，并被应用于许多基因治疗中，这些载体一般不适于感染非分裂细胞。此外，逆转录病毒具有致癌性的可能。然而，在慢病毒载体领域中的最新发展可能超越这些限制。参见Naldini，L.等人(1996)Science 272263-267。
由上文提到的逆转录病毒质粒载体获得的逆转录病毒可以来源于包括但不限于莫洛尼氏鼠白血病毒、脾坏死病毒、逆转录病毒例如劳氏肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽白血病病毒、长臂猿猿白血病病毒(Gibbon ape leukemia virus)、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳癌病毒。在一个实施方案中，所述逆转录病毒质粒载体源自于莫洛尼氏鼠白血病毒。
腺病毒的优点在于它们宿主范围广，能够感染休眠或终末分化的细胞，例如神经元或肝细胞，并且本质上呈现非致瘤性。参见，例如Ali，M.等人(1994)，同上。腺病毒看来并不整合到宿主基因组中。由于它们存在于染色体外，因而插入突变的风险大大减小了(Ali，M.等人(1994)，同上)。
腺相关病毒显示与基于腺病毒的载体相似的优点。然而，AAVs显示出在人染色体19上位点特异性整合(Ali，M.等人(1994)，同上)。
在一个优选的实施方案中，编码本发明的经修饰的corin分子的DNA被用于心血管疾病的细胞或基因治疗中，所述疾病包括但不限于心力衰竭、高血压、心脏肥大、心肌病、心脏纤维化、局部缺血性心脏病、瓣膜性心脏病、心肌炎和先兆子痫。
根据该实施方案，用编码本发明的经修饰的corin分子的DNA进行的细胞或基因治疗在诊断同时或诊断后立即被提供给需要的患者。
熟练的技术人员会理解根据该实施方案可以使用含有编码本发明的经修饰的corin分子的DNA或编码本发明的经修饰的corin分子的片段或衍生物的DNA的任何合适的基因治疗载体。构建这种载体的技术是已知的，参见例如Anderson，W.F.(1998)Nature 39225-30；Verma，I.M.and Somia，N.(1998)Nature 389239-242。可以使用已知技术完成含有经修饰的corin分子DNA的载体向靶位点的导入。
细胞或基因治疗载体包括一个或多个启动子。可以使用的合适的启动子包括但不限于逆转录病毒LTR；SV40启动子；和描述于Miller，A.D and Rosman，G.J.(1989)Biotechniques 7980-990的人巨细胞病毒(CMV)启动子，或其它任何启动子(例如，细胞启动子例如真核细胞启动子，包括但不限于组蛋白、pol III和β-肌动蛋白启动子)。其它可以使用的病毒启动子包括但不限于腺病毒启动子、胸苷激酶(TK)启动子和B19细小病毒启动子。基于本文包含的教导，合适的启动子的选择对于本领域技术人员而言是显而易见的。
编码本发明的经修饰的corin分子的核酸序列处于合适的启动子的控制之下。可使用的合适的启动子包括但不限于腺病毒启动子，例如腺病毒主要晚期启动子；或异源启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子；呼吸道合胞病毒(RSV)启动子；可诱导的启动子，例如MMT启动子，金属硫蛋白启动子；热激启动子；白蛋白启动子；ApoAI启动子；人球蛋白启动子；病毒胸苷激酶启动子，例如单纯性疱疹胸苷激酶启动子；逆转录病毒LTRs(包括上述经修饰的逆转录病毒LTRs)；β-肌动蛋白启动子；和人生长激素启动子。
逆转录病毒质粒载体被用于转导包装细胞系以形成生产细胞系。可被转染的包装细胞系的实例包括但不限于全文并入本文作为参考的Miller，A.D.(1990)Hum.Gene Ther.15-14中所述的PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X；VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+#-86、GP+envAm12和DAN细胞系。所述载体可以通过现有技术中已知的任何方法转导包装细胞。这些方法包括但不限于电穿孔、使用脂质体和CaPO4沉淀。或者，逆转录病毒质粒载体可以被包含在一种脂质体中，或被偶联到脂质上，然后施用于宿主。生产细胞系产生传染性的逆转录病毒载体颗粒，其包括编码所述多肽的核酸序列。然后可将这些逆转录病毒载体颗粒用于在体外或体内转导真核细胞。所转导的真核细胞会表达编码所述多肽的核酸序列。可以被转导的真核细胞包括但不限于胚胎干细胞、胚胎瘤细胞和造血干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、角质形成细胞、内皮细胞和支气管上皮细胞。
基因治疗的一种不同的方法是“transkaryotic治疗”，其中患者的细胞被回体处理以诱导休眠染色体基因从而在重导入患者后生产出目的蛋白。Transkaryotic治疗假设个体具有对于活化所必需的基因的正常互补体。Transkaryotic治疗包括将能够活化初生基因的启动子或其它外源调节序列导入到回体患者细胞的染色体DNA中、培养和选择活化的蛋白质生产细胞、然后将活化的细胞重导入到患者中以使它们能够得以完全确立。然后“基因活化”的细胞在相当长的时间内生产目的蛋白质，可能是患者的一生。美国专利5,641,670和5,733,761具体公开了这个概念，并且将它们并入本文作为参考。
G.药物组合物本发明提供了包含与一种本领域技术人员公知的可接受的载体或佐剂混合的本发明的分子的药物组合物。所述药物组合物优选包含合适的载体和佐剂，其包括当与本发明的分子结合时保持分子活性并且与患者的免疫系统不反应的任何材料。这些载体和佐剂包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白例如人血清白蛋白、缓冲物质例如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和的植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳剂(例如油/水乳剂)、盐或电解质例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅胶、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质和聚乙二醇。其它的载体还可包括无菌溶液、片剂包括包衣片和胶囊。典型的是这些载体包括赋形剂例如淀粉、奶、糖(例如蔗糖、葡萄糖、麦芽糖)、粘土的某些形式、明胶、硬脂酸或其盐、硬脂酸镁或硬脂酸钙、滑石粉、植物脂肪或油类、树胶、乙二醇或其它已知的赋形剂。这些载体还可以包括调味剂和着色剂或其它成分。通过公知的常规方法配制含有这些载体的组合物。这些组合物也可以被配制于各种脂质组合物中，例如脂质体和各种聚合组合物如聚合物微球。
H.试剂盒本发明进而涉及用于研究或诊断的试剂盒。试剂盒通常包括一种或多种含有本发明的经修饰的corin分子的容器。在一个优选实施方案中，所述试剂盒包括含有处于适于与第二分子一起衍生的形式的经修饰的corin分子的容器。在一个更优选的实施方案中，所述试剂盒包括含有SEQ ID NO34的经修饰的corin分子的容器。本发明进而提供含有处于游离形式或药物可接受形式的本发明的组合物的试剂盒。所述试剂盒可以包括其实施的用法说明。本发明的试剂盒可以用于本发明的任何方法中。
在另一个实施方案中，所述试剂盒可含有编码本发明的经修饰的corin分子的DNA序列。优选地编码这些经修饰的corin分子的DNA序列被提供到适于转染到宿主细胞并由宿主细胞表达的质粒中。所述质粒可含有启动子(往往是可诱导的启动子)以调节所述DNA在宿主细胞中的表达。所述质粒还可含有适当的限制性位点以利于其它DNA序列插入所述质粒中从而生产出各种经修饰的corin分子。所述质粒还可以含有许多其它的元件以利于被编码的蛋白质的克隆和表达。这些元件对于本领域技术人员而言是公知的，例如选择性标记、起始密码子、终止密码子等等。在一个更为优选的实施方案中，试剂盒包括含有SEQ ID NO33所示的DNA序列的容器。
I.本发明的经修饰的corin分子的应用本发明的经修饰的corin分子可用于治疗任何病原学的心血管疾病，这些疾病包括但不限于心力衰竭、高血压、心脏肥大、心肌病、心脏纤维化、局部缺血性心脏病、瓣膜性心脏病、心肌炎和先兆子痫。
J.本发明经修饰的corin分子的测试本发明经修饰的corin分子的体外利用可以在实施例3至5描述的测定中以及在新生大鼠心肌肥大模型中进行测试(van Rooij，E.等人(2002)J.Biol.Chem.27748617-48626 and Liang，F.等人(2003)J.Biol.Chem.27815073-15083)。
可以在实施例6描述的测定中以及在冠状动脉结扎后的小鼠心肌梗塞模型(Feng，Q.等人(2001)Circulation 104700-704)中、在进行了通过横向胸主动脉结扎进行的主动脉收缩后的小鼠压力超负荷模型(Meguro，T.等人(1999)Circ. Res.84735-740)中、小鼠压力超负荷模型(Rockman，H.A.等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888277-8281)中、小鼠遗传模型(Beggah，A.T.等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci USA 997160-7165)中、心肌症仓鼠低体温心脏麻痹模型(Hoshijima，M.等人(2002)Nature Med.8864-871 and Ikeda，Y.等人(2002)Circulation 105502-508)中、和狗起搏心力衰竭模型(Shen，W.等人(2002)J.Pharmacol.Exp.Ther.303673-680 andShen，W.等人(1999)Circulation 1002113-2118)中对本发明经修饰的corin分子的体内利用进行测试。
K.本发明的经修饰的corin分子的给药本发明的经修饰的corin分子或其药物学可接受的盐以纯化形式或以适当的药物组合物形式的给药可以通过任何一种可接受的给药模式或通过用于相似用途的物质实现。因此，给药可以是例如，经口、鼻、肠胃外、局部、经皮或直肠，以固体、半固体、冻干粉末或液体剂型形式给药，例如片剂、栓剂、丸剂、弹性软胶囊和硬质明胶胶囊、粉末、溶液、混悬剂、或气雾剂等等，优选以适于精确剂量单一给药的单位剂型给药。所述组合物会包括一种常规的药物载体或赋形剂以及作为活性剂的一种本发明的经修饰的corin分子，此外还可包括其它药剂、药物剂、载体、佐剂等等。
一般而言，依赖于所希望的给药形式，药物学可接受的组合物会含有约1％至约99％重量百分比的本发明的经修饰的corin分子，或其药物学可接受的盐，以及约99％至1％重量百分比的适当的药物赋形剂。优选地，所述组合物是约5％至75％重量百分比的本发明的经修饰的corin分子，或其药物学可接受的盐，剩下的是适当的药物赋形剂。
一种优选的给药途径是口服，其采用一种方便的日给药方案，可根据待治疗的病状的严重程度进行调节。对于这种口服给药，一种含有本发明的经修饰的corin分子或其药物学可接受的盐的药物学可接受的组合物是通过掺入任何一般使用的赋形剂来形成的，所述赋形剂例如各种药物等级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、预胶凝淀粉、硬脂酸镁、糖钠(sodium saccharine)、滑石粉、纤维素醚衍生物、葡萄糖、明胶、蔗糖、柠檬酸盐、没食子酸丙酯等等。这些组合物采取溶液、混悬液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、持续释放剂型等等形式。
优选地，这些组合物采取胶囊、薄膜衣片(caplet)或片剂形式，因此也含有一种稀释剂例如乳糖、蔗糖、磷酸二钙等等；一种崩解剂例如交联羧甲基纤维素钠或其衍生物；一种润滑剂例如硬脂酸镁等等；和一种粘合剂例如淀粉、阿拉伯树胶、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、纤维素醚衍生物等等。
给药的另一种优选的途径是肠胃外给药，例如静脉内、皮下或肌内给药，其中本发明的经修饰的corin分子可被用于药物组合物中。因此，上述经修饰的corin分子优选与一种可接受的无菌的药物载体组合，所述药物载体例如百分之五的葡萄糖、乳酸盐林格液、生理盐水、无菌水或任何其它商业制备的用于静脉注入的生理缓冲溶液。应当理解的是载体溶液以及组合物的剂量和给药的选择根据患者和特定的临床设置的不同而改变，并且由标准医学程序所控制。
所述融合蛋白质的给药可以通过一种快速静脉注射、定速静脉内注入或这两种途径结合来给药。或者，或除此之外，与适当的赋形剂混合的融合蛋白质可从肌肉内或皮下位点被吸收到循环中。本领域普通技术人员可以容易地确定出用于静脉内、皮下或肌内给药的典型的药物组合物。给药量显然是具有蛋白质特异性的，并取决于其效力和药物代谢动力学性质。目前用于制备可肠胃外给药的组合物的方法对于本领域技术人员而言已知的或是显而易见的，像Remington′sPharmaceutical Science，18th Ed.(Mack Publishing Company，Easton，PA，1990)这样的出版物中对其有更为详细的描述。所述组合物的单一或多次给药可以依赖于患者所需以及可以忍受的剂量和频率进行。无论如何，所述组合物应该提供足够量的本发明的蛋白质以有效治疗患者。
本发明的经修饰的corin分子或其药物学可接受的盐也可配制成一种栓剂，其中利用例如约0.5％至约50％置于一种在体内缓慢溶解的载体中的活性成分，所述载体例如聚氧乙烯基二醇和聚乙二醇(PEG)，如PEG 1000(96％)和PEG 4000(4％)。
可以通过例如将本发明的经修饰的corin分子(约0.5％至约20％)或其药物学可接受的盐以及任选的药物佐剂在载体中进行溶解、分散等而形成溶液或混悬液以制备液体药物学可给药的组合物，所述载体例如水、盐水、水性葡萄糖、甘油、乙醇等等。
如果希望，本发明的药物组合物也可含有较少量的辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂、抗氧化剂等等，例如柠檬酸、失水山梨醇单月桂酸酯(sorbitan monolaurate)、三乙醇胺油酸酯、丁基化羟基甲苯等等。
制备这些剂型的现实方法对于本领域技术人员而言是已知的或是显而易见的；例如，参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，18thEd.，(Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，1990)。根据本发明的教导，用于给药的组合物无论如何应含有治疗有效量的本发明经修饰的corin分子或其药物学可接受的盐以治疗特征在于血压升高的病状。
以治疗有效量给予本发明经修饰的corin分子或其药物学可接受的盐，所述治疗有效量根据各种因素而改变，所述因素包括所使用的特异的经修饰的corin分子的活性；所述经修饰的corin分子的代谢稳定性和作用持续时间；患者的年龄、体重、全身的健康状况、性别以及饮食；给药模式和时间；排泄率；药剂组合；特定病状的严重性；和接受治疗的宿主。一般而言，一种治疗有效日剂量是每天约0.14mg至约14.3mg/kg体重的本发明的经修饰的corin分子或其药物学可接受的盐；优选地每天约0.7mg至约10mg/kg体重；最优选的是每天约1.4mg至约7.2mg/kg体重。例如，对一名体重为70kg的患者给药，剂量范围在每天约10mg至约1.0克的本发明的经修饰的corin分子或其药物学可接受的盐，优选每天约50mg至约700mg，最优选为每天约100mg至约500mg。
L.优选的实施方案如发明概述中所述的本发明的经修饰的corin分子中，有几组经修饰的corin分子是尤为优选的。
在一个优选实施方案中，本发明经修饰的corin分子包含corin或其片段或衍生物的细胞外结构域，以及替换野生型corin活化序列RILGG的取代活化序列。
在一个更为优选的实施方案中，本发明经修饰的corin分子包含corin或其片段或衍生物的细胞外结构域，以及替换野生型corin活化序列RILGG的取代活化序列DDDDKILGG。
在一个更为优选的实施方案中，本发明经修饰的corin分子包含corin或其片段或其衍生物的细胞外结构域，以及替换野生型corin活化序列RILGG的取代活化序列DDDDKILGG，而且还含有N末端Igκ信号序列和C末端表位标记。
SEQ ID NO34所示的经修饰的corin分子是本发明的一个优选实施方案。
*****下面这些具体的实施例是作为一种用以帮助实施本发明的指导而提供的，并非意欲限制本发明的范围。
实施例1人Corin表达载体的构建为了检验corin在体外对前肽的加工，构建出编码全长人corin多肽及其衍生物的哺乳动物表达载体。
全长人corin表达载体的构建从人心脏cDNA文库中克隆出野生型人corin cDNA(Yan，W.等人(1999)同上)。全长人corin cDNA序列长度为4933个核苷酸，包括翻译起始蛋氨酸密码子和翻译终止密码子在内的人corin编码序列长度为3129个核苷酸(参见图1，SEQ ID NO1)。野生型corin多肽序列由1042个氨基酸(see Figure 2，SEQ ID NO2)组成，经计算的分子量为～116kDa(Yan，W.等人(1999)同上)。
一种含有全长人corin cDNA的质粒构建体按所述方式产生(Yan，W.等人(2000)同上)。使用正向引物(5′-ATGAAACAGTCTCCTGCCCTCGCTCCGGAAGAGC-3′；SEQ IDNO3)和反向引物(5′-GTTTAGGAGAAAGGTCTGGATGTA-3′；SEQID NO4)，通过PCR扩增出人corin编码区域，即自第94位的翻译起始密码子至第3219位的C末端氨基酸。然后将其插入到哺乳动物表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO(Invitrogen)的PCR产物位点中。利用这种表达载体产生的重组corin含有C末端病毒V5表位和6xHis标记，因此利于由抗-V5或抗-His抗体对所述重组蛋白的检测。经限制性酶消化和DNA测序证实所得质粒pcDNA3.1Corin表达重组corin，其由人corin第1-1042位氨基酸和其后的C末端V5表位和6xHis标记构成。
含有跨膜的人corin缺失突变体表达载体的构建为了便于含有内部缺失的重组corin分子的产生，通过如下PCR方法在全长人cDNA序列中导入一个XhoI限制性位点。使用pcDNA3.1Corin作为DNA模板(参见上文)，用正向引物Cor/TMa(5′-GGGGGAATTCATGAAACAGTCTCCTGCCCTCGCTCCGGAAGAGC-3′；SEQ ID NO5)和反向引物Cor/TMb(5′-GGGGCTCGAGCGTAGTCCAGGCTGGAACGTGTTGGTCG-3′；SEQID NO6)通过PCR扩增人corin的N末端区域，即SEQ ID NO1的第1至369位，其对应于SEQ ID NO2的第1至123位氨基酸。用EcoRI和XhoI(New England Biolabs)消化PCR产物，插入到pcDNA4/HisMaxC(Invitrogen)的EcoRI和XhoI位点。这种中间质粒为pcDNA4NCorin1。再次使用pcDNA3.1Corin作为DNA模板，用正向引物CorFL(5′-GGGGCTCGAGGATGCTTCTCTCCCAGGGGACCAAAGTCACAGG-3′；SEQ ID NO7)和反向引物CorEnd(5′-GGGGGGGCCCTTAGTTTAGGAGAAAGGTCTGGATGTAAATCTG-3′；SEQ ID NO8)通过PCR扩增人corin的C末端区域，即SEQ IDNO1的第370至3129位，其对应于SEQ ID NO2的第124至1042位氨基酸。用XhoI和ApaI(New England Biolabs)消化PCR产物，插入到pcDNA4NCorin1的XhoI和ApaI位点。获得的质粒pcDNA4FLCorin表达重组corin，其由人corin氨基酸第1-123位、由导入XhoI位点(CTCGAG)带来的1个两个氨基酸的插入(Leu-Glu)、以及人corin第124-1042位氨基酸组成(SEQ ID NO9)。
通过下述PCR方法以人corin的跨膜形式产生内部缺失突变体1至5。以pcDNA3.1Corin作为DNA模板，用正向引物CorDel I(5′-GGGGCTCGAGCTCTGTGGAAGGGGTGAGAACTTTCTGTGTGC-3′；SEQ ID NO10)、CorDel II(5′-GGGGCTCGAGCTGAATAACTGTAGTCAATGTGAACC-3′；SEQID NO11)、CorDel III(5′-GGGGCTCGAGGTGGAAGAATGCTCACCTAGTCATTTCAAG-3′；SEQ ID NO12)、CorDel IV(5′-GGGGCTCGAGGTGTGTGCAGATGGCTGGCAGGAGATATTG-3′；SEQ ID NO13)和CorDel V(5′-GGGGCTCGAGGACTGTGGGCGCCGCCCTGCTGCCCGAATG-3′；SEQ ID NO14)，和反向引物CorEnd(SEQ ID NO8)通过PCR扩增人corin的C末端区域。用XhoI和ApaI消化各个PCR产物，插入到pcDNA4NCorin1的XhoI和ApaI位点。获得的质粒表达重组corin，其由人corin第1-123位氨基酸、1个两个氨基酸的插入(Leu-Glu)、及人corin第268至1042位氨基酸(缺失1，SEQ ID NO15)、第449至1042位氨基酸(缺失2，SEQ ID NO16)，第577至1042位(缺失3，SEQ ID NO17)、第713至1042位氨基酸(缺失4，SEQ ID NO18)或第789至1042位氨基酸(缺失5，SEQ ID NO19)组成。
通过下述PCR方法在人corin的跨膜形式中产生内部缺失6。以pcDNA3.1Corin作为DNA模板，用正向引物Cor/TMa(SEQ ID NO5)和反向引物Del 62(5′-GGGGCTCGAGAGGTGAGAAGCAAATTCTGCTGACATTGC-3′；SEQ ID NO20)通过PCR扩增人corin的N末端区域，即自SEQ IDNO1的第1至777位，其对应于SEQ ID NO2的第1至259位氨基酸。用EcoRI和XhoI(New England Biolabs)消化PCR产物，插入到pcDNA4/HisMaxC(Invitrogen)的EcoRI和XhoI位点。这种中间质粒为pcDNA4NCorin2。使用pcDNA3.1Corin作为DNA模板，用正向引物Del 61(5′-GGGGCTCGAGAGCGTCATTCAGACTTCATGTCAAGAAGG-3′；SEQ ID NO21)和反向引物CorEnd(SEQ ID NO8)通过PCR扩增人corin的C末端区域，即SEQ ID NO1的第1247至3129位，其对应于SEQ ID NO2的第415至1042位氨基酸。用XhoI和ApaI(NewEngland Biolabs)消化PCR产物，插入到pcDNA4Ncorin2的XhoI和ApaI位点。获得的质粒表达一种重组corin，其由人corin第1-259位氨基酸、Leu-Glu、以及人corin第415-1042位氨基酸组成(缺失6，SEQ ID NO22)。
通过下述PCR方法在人corin的跨膜结构中产生内部缺失7。以pcDNA3.1Corin作为DNA模板，用正向引物Cor/TMa(SEQ ID NO5)和反向引物Del 72(5′-GGGGCTCGAGAGGTGAGAAGCAAATTCTGCTGACATTGC-3′；SEQ ID NO23)通过PCR扩增人corin的N末端区域，即自SEQ IDNO1的第1至1347位，其对应于SEQ ID NO2的第1至449位氨基酸。用EcoRI和XhoI(New England Biolabs)消化PCR产物，插入到pcDNA4/HisMaxC(Invitrogen)的EcoRI和XhoI位点。这种中间质粒为pcDNA4NCorin3。使用pcDNA3.1Corin作为DNA模板，用正向引物Del 71(5′-GGGGCTCGAGACCTGCCTGATGCCTGATGAATATGTGG-5′，SEQ ID NO24)和反向引物CorEnd(SEQ ID NO8)通过PCR扩增人corin的C末端区域，即SEQ ID NO1的第1705至3129位，其对应于SEQ ID NO2的第569至1042位氨基酸。用XhoI和ApaI(NewEngland Biolabs)消化PCR产物，插入到pcDNA4NCorin3的XhoI和ApaI位点。获得的质粒表达一种重组corin，其由人corin氨基酸第1-449位、Leu-Glu、以及人corin氨基酸第569-1042位组成(缺失7，SEQ ID NO25)。
全长人corin以及含有跨膜的人corin内部缺失突变体的示意性结构描述于图3中。它们是缺失1，其缺少了CRD1结构域(第124至267位氨基酸)；缺失2，其缺少了CRD1和LDLR1-5结构域(第124至448位氨基酸)；缺失3，其缺少了CRD1、LDLR1-5和CRD2结构域(第124至576位氨基酸)；缺失4，其缺少了CRD1、LDLR1-5、CRD2和LDLR6-8结构域(第124至712位氨基酸)；缺失5，其缺少了CRD1、LDLR1-5、CRD2、LDLR6-8和SRCR结构域(第124至788位氨基酸)；缺失6，其缺少了LDLR1-5结构域(第260至414位氨基酸)；和缺失7，其缺少了CRD2结构域(第450至568位氨基酸)。
含有跨膜的经修饰的人corin表达载体的构建与大多数胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶类似，corin被合成为酶原(Yan，W.等人(1999)同上；Yan，W.等人(2000)同上)。Corin中的预测的活化切割序列位于氨基酸Arg801与Ile802之间。目前，corin的生理激活物质是未知的。为产生具有酶活性的corin，本文描述的基于细胞的检测依赖于未知的表达于HL-5或293细胞的丝氨酸蛋白酶。另一种产生具有酶活性的corin的方法是导入一种由已知的丝氨酸蛋白酶特异性识别的活化切割序列，例如被肠激酶所识别的肽序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(DDDDK)(Kitamoto，Y.等人(1994)同上)。
使用一种诱变试剂盒(Stratagene)按下述方式通过PCR方法生产表达含有跨膜的经修饰的人corin质粒构建体。以pcDNA4FLCorin作为DNA模板，采用以下两组引物通过PCR扩增人corin的C末端区域(1)正向引物EntPCR1a(5′-CAACACGTTCCAGCCTGGACTACGCTC-3′；SEQ ID NO26)和反向引物EntPCR1b(5′-CCTCCAAGGATCTTATCGTCATCGTCCCCACAGTCTTGTTTAGTACA-3′；SEQ ID NO27)，它们跨越人corin第116至791位氨基酸、肠激酶活化切割序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(DDDDK)、和人corin第802至805位氨基酸；和(2)正向引物EntPCR2a(5′-GGTTTAAACGGGCCCTTAGTTTAGGAG-3′，SEQ ID NO28)和反向引物EntPCR2b(5′-GACGATGACGATAAGATCCTTGGAGGTCGGACGAGTCG-3′，SEQ ID NO29)，它们跨越肠激酶活化序列和人corin第802第1042位氨基酸。所使用的PCR条件为95℃下2分钟；95℃下30秒；56℃下30秒；72℃下2分钟；30个循环；和72℃下10分钟。用XhoI和ApaI消化PCR产物，插入到pcDNA4FLCorin的XhoI和ApaI位点。获得的质粒pcDNA4FLCorin-EK表达一种重组corin多肽，其由人corin第1-123位氨基酸、Leu-Glu、以及人corin第124-791位氨基酸、Asp-Asp-Asp-Asp-Lys、和人corin第802至1042位氨基酸组成(FLCorin-EK，SEQ ID NO30)。
可溶性经修饰的人corin表达载体的构建据预测II型跨膜丝氨酸蛋白酶的N末端跨膜结构域是将蛋白酶的活性限制在细胞表面特异位点的调节机制的一部分(Hooper，J.D.eta/.(2001)同上)。然而，由于重组可溶性肠激酶(Lu，D.et a/.(1997)J.Biol.Chem.27231293-31300)和matriptase(Lin，C.Y.等人(1997)J.Biol.Chem.2729147-9152；Takeuchi，T.等人(2000)J.Biol.Chem.27526333-26342)已经显示出具有催化活性，因此该跨膜结构域看来对于II型跨膜丝氨酸蛋白酶的酶活性而言并不需要。
预测的人corin的N末端跨膜结构域包含第46至66位氨基酸残基(Yan，W.等人(1999)同上)。因此，人corin的细胞外结构域包含图2中的第67至1042位氨基酸残基，对应于图1中的第199至3129位。按下述PCR方法生产表达缺少跨膜结构域且含有肠激酶活化切割序列的可溶性人corin的质粒构建体。以pcDNA4FLCorin-EK作为DNA模板，用正向引物CorFL-1(5′-GGGGCTCGAGGATGCTTCTCTCCCAGGGGACCAAAGTCACAGG-3′；SEQ ID NO31)和反向引物CorSol2Apa2(5′-GGGGGGGCCCGTTTAGGAGAAAGGTCTGGATGTAAATCTG-3′，SEQ ID NO32)通过PCR扩增缺少跨膜结构域且含有肠激酶活化切割序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的人corin区域，所述区域跨越人corin第124至1024位氨基酸以及肠激酶活化切割序列。所使用的PCR条件是95℃下2分钟；95℃下30秒；56℃下2分钟；72℃下3分钟；30个循环；和72℃下15分钟。PCR产物插入到pSecTag/FRT/V5-His-TOPO(Invitrogen)中。获得的质粒表达一种重组corin多肽SolCorin-EK(核酸序列SEQ ID NO33，氨基酸序列SEQ IDNO34)，其由N末端Igκ分泌信号序列(第1至36位氨基酸)、Leu-Glu(第37至38位氨基酸)、人corin第124至796位氨基酸(第39至711位氨基酸)、肠激酶活化切割序列(第712至716位氨基酸)、人corin第802至1042位氨基酸(第717至957位氨基酸)和一个C末端病毒V5和6xHis表位标记(第958至991位氨基酸)组成。
人corin的丝氨酸蛋白酶结构域是第802至1042位氨基酸(Yan，W.等人(1999)同上)。按下述方式通过PCR产生表达含有肠激酶活化切割序列和丝氨酸蛋白酶催化结构域的可溶性人corin的质粒构建体。以pcDNA3.1Corin作为DNA模板，用两条正向引物SolCat1(5′-CTGCTGCCGACGATGACGATAAGATCCTTGGAGGTCGGACGAGTCG-3′，SEQ ID NO35)和SolCat2(5′-AAACAAGACTGTGGGCGCCGCCCTGCTGCCGACGATGACGATAAG-3′，SEQ ID NO36)，和反向引物CorSol2Apa2(SEQ ID NO32)，通过PCR扩增人corin的丝氨酸蛋白酶结构域，所述丝氨酸蛋白酶结构域跨越人corin氨基酸第787至796位、Asp-Asp-Asp-Asp-Lys、和人corin第802至1042位氨基酸。所使用的PCR条件是95℃下2分钟；95℃下30秒；58℃下1分钟；72℃下1分钟；30个循环；和72℃下15分钟。PCR产物插入到pSecTag/FRT/V5-His-TOPO(Invitrogen)中。获得的质粒表达一种重组corin多肽SolCorinPD-EK(氨基酸序列SEQ ID NO37)，其由N末端Igκ分泌信号序列(第1至36位氨基酸)、人corin第787至796位氨基酸(第37至46位氨基酸)、肠激酶活化切割序列(第47至51位氨基酸)、人corin第802至1042位氨基酸(第52至292位氨基酸)和一个C末端病毒V5和6xHis表位标记(第293至326位氨基酸)组成。
SolCorin-EK和SolCorinPD-EK的示意性结构描述于图7中。SolCorin-EK的核酸和氨基酸序列分别示于图10和11中。
实施例2
ANP前体和BNP前体表达载体的构建为了检验corin在体外对前肽的加工，构建出编码人ANP前体和BNP前体的哺乳动物表达载体。
按所述方式产生出表达人野生型ANP前体或人野生型BNP前体的质粒构建体(Yan，W.等人(2000)同上)。从人心脏cDNA文库中通过PCR扩增出人ANP前体(Oikawa，S.等人(1984)Nature 309724-726)和人BNP前体的编码区域(Sudoh，T.等人(1989)Biochem.Biophys.Res.Commun.1591427-1434)，然后将它们一个一个单独地插入到pcDNA3.1/V5-His-TOPO(Invitrogen)中。利用这种表达载体产生的重组ANP前体和BNP前体含有C末端病毒V5表位和6xHis表位标记，因此利于由抗-V5或抗-His抗体对所述重组蛋白的检测。经限制性酶切和DNA测序对所得质粒进行了证实。
实施例3由corin对前肽的体外加工为了在体外检验corin对前肽的加工，用一种corin表达载体和一种前肽表达载体共转染培养的哺乳动物细胞。通过使用针对重组corin或前肽连接的肽标记的抗体的蛋白质印迹法分析前肽的切割。
细胞培养在含有10％FBS、15μg/ml胰岛素、50μg/ml内皮生长添加物(Upstate Biotechnology Institute)、1μM视黄酸、0.1mM去甲肾上腺素、100μg/ml青霉素/链霉素、292μg/ml L-谷氨酰胺和0.1mM MEM非必需氨基酸的Ex-Cell 320培养基(JRH Biosciences)中培养鼠HL-5心肌细胞。人293细胞被培养于添加有10％FBS和1％L-谷氨酰胺的α-MEM(Life Technologies，Inc.)中。幼仓鼠肾(BHK)细胞被培养于添加有10％FBS的EMEM(Life Technologies，Inc.)中。所有的细胞都培养于37℃下充有5％CO2和95％空气的湿润培养箱中。
转染和蛋白质印迹分析按照生产商的说明利用Lipofectin(Invitrogen)在HL-5细胞中进行瞬时转染。按照生产商的说明利用Lipofectin 2000(LifeTechnologies，Inc.)在293细胞中进行瞬时或稳定转染。用对照表达载体(pcDNA)或重组corin表达载体(pcDNA3.1Corin)与重组ANP前体表达载体(pcDNApro-ANP)共转染。转染48或72小时后收集条件培养基。为了分析ANP前体加工，通过一种抗V5抗体(Invitrogen)免疫沉淀条件培养基中的重组ANP前体及其衍生物，以及重组corin。通过SDS-PAGE分离蛋白质，并通过使用一种与抗V5抗体(Invitrogen)缀合的辣根过氧化物酶的蛋白质印迹法对其进行分析。如图4所示，ANP前体的加工在只被ANP前体表达载体转染的HL-5细胞中被检测到。然而，重组corin的表达进而增强了HL-5细胞中ANP前体的加工。
cGMP测定为了检测经加工的重组ANP的活性，使用一种酶免疫测定(EIA)试剂盒(Biotrak，Amersham Biosciences，Inc.)进行cGMP测定。在该测定中，幼仓鼠肾(BHK)细胞于补充有10％FBS和1％L-谷氨酰胺的MEM培养基中在96孔板中生长。用无血清培养基清洗汇合的细胞。在每孔中加入从被感染的人293细胞或鼠HL-5细胞中获得的含有重组ANP前体及其衍生物的条件培养基(180μl)，于37℃下温育10分钟。通过加入20μl含有2％十二烷基三甲铵和50mM醋酸钠，pH 5.8的溶解缓冲液溶解细胞。用Biotrak EIA试剂盒测定经ANP刺激的BHK细胞中的细胞内cGMP浓度。每一种实验条件都是一式四份进行测定的。如图5所示，从未经全长人corin表达载体转染或经其转染的293细胞获得的条件培养基没有提高BHK细胞中的cGMP水平。从未经转染的HL-5细胞获得的条件培养基促进细胞内cGMP的产生；这种产生通过使用从经全长人corin表达载体转染的HL-5细胞获得的条件培养基获得提高。
实施例4在体外由Corin内部缺失突变体对ANP前体的加工为了在体外检验前肽加工对人corin的各个结构域的需求，用一种全长人corin表达载体或一系列人corin内部缺失突变体表达载体(参见实施例1)与一种前肽表达载体共转染培养的哺乳动物细胞。通过使用针对与重组corin和前肽连接的标记的抗体的蛋白质印迹法分析前肽的切割。
按照生产商的说明利用Lipofectamine 2000将pcDNApro-ANP和表达全长人corin和各种人corin内部缺失突变体的质粒共转染人293细胞。24小时后收集含有重组人ANP前体及其衍生物的条件培养基，并通过使用一种抗V5抗体的免疫沉淀以及随后的SDS-PAGE以及使用一种与HRP缀合的抗V5抗体的蛋白质印迹法分析ANP前体的加工。图6显示了全长人corin多肽和缺少了CRD1结构域的缺失1能够加工ANP前体，而缺失2至5在该测定中均没有活性。缺失6和7在该测定中也没有活性(数据未显示)。从经转染的293细胞中制备的细胞提取物的蛋白质印迹法证实了所有的内部缺失突变构建体表达预期大小的corin多肽(图6以及数据未示出)。
实施例5在体外由肠激酶对经修饰的corin的加工为了在体外检验由肠激酶对经修饰的corin的加工，用一种corin表达载体共转染培养的哺乳动物细胞。通过使用针对与重组corin连接的肽标记的抗体的蛋白质印迹法分析corin的切割。
细胞培养和转染在含有10％FBS和1％L-谷氨酰胺的α-MEM培养基(LifeTechnologies，Inc.)中培养人293细胞。按照生产商的说明利用Lipofectin 2000(Life Technologies，Inc.)在293细胞中进行瞬时或稳定转染。
由肠激酶对经修饰的Corin的活化重组SolCorin-EK或SolCorinPD-EK在稳定转染的人293细胞中获得表达。收集含有SolCorin-EK或SolCorinPD-EK的条件培养基(0.5ml)，并与0、2、10、20或40单位的纯化的肠激酶(Calbiochem)一起于25℃下培养4小时。为了分析corin的活化，将20μl试样用于进行SDS-PAGE，然后进行使用抗V5抗体(Invitrogen)的蛋白质印迹法。如图8所示，通过暴露于肠激酶，长型(SolCorin-EK)和短型(SolCorinPD-EK)可溶性经修饰的人corin以剂量依赖性方式被切割。
由肠激酶活化的经修饰的corin对人ANP前体的活化按照生产商的说明利用Lipofectamine 2000(Life Technologies，Inc.)将重组人ANP前体瞬时转染到人293细胞中。24小时后收集含有ANP前体的条件培养基，将其置于冰上用于后续使用。由经稳定转染的人293细胞中获得的条件培养基中的SolCorin-EK或SolCorinPD-EK的活化按上述方式进行。为了除去肠激酶，使用了一种肠激酶切割捕获试剂盒(Enterokinase Cleavage Capture Kit)(Calbiochem)。将条件培养基的每份试样与100μl EKapture琼脂糖小珠一起于25℃下温育30分钟，并经旋转过滤器过滤。将对照OPTI-MEM(Life Technologies，Inc.)或肠激酶耗竭的条件培养基(250μl)与1ml含有ANP前体的条件培养基一起于4℃下温育3小时。通过利用抗V5抗体的免疫沉淀以及随后的SDS-PAGE以及使用一种与HRP缀合的抗V5抗体的蛋白质印迹法分析ANP前体的加工。由于含有C末端病毒V5表位标记，因此重组corin在蛋白质印迹试验中也被这种抗V5抗体所识别。如图9所示，在体外ANP前体被长型可溶性经修饰的人corin加工成ANP(SolCorin-EK)，而不能被短型可溶性经修饰的人corin(SolCorin-PD-EK)加工成ANP。
实施例6可溶性经修饰的人Corin的体内活性为了检验可溶性经修饰的人Corin的体内活性，在哺乳动物细胞中表达重组SolCorin-EK、将其纯化、用肠激酶使其活化、然后检测其对仓鼠的利尿和钠尿的刺激能力。
重组SolCorin-EK或SolCorinPD-EK的纯化重组SolCorin-EK被表达于经稳定转染的人293细胞中(参见实施例5)。由SolCorin-EK表达细胞中获得的条件培养基经Opticab 4包膜一次性筒式过滤器(Opticab 4 capsule disposable cartridge filter)(Millipore)过滤、浓缩约10倍、并且于20mM Tris-HCl，pH 7.5，300mM NaCl中渗滤。然后通过Zeta PlusBioCap过滤器(Cuno)的过滤除去脂类。
将经浓缩和渗滤的含有SolCorin-EK的条件培养基调节至10mM咪唑，然后经0.45μm醋酸纤维素滤膜过滤，然后上样到用20mMTris-HCl，pH 7.5，300mM NaCl平衡的Ni-NTA-Superflow(Qiagen)柱上。用20mM Tris-HCl，pH 7.5，300mM NaCl，20mM咪唑清洗该柱，以20mM至250mM的咪唑梯度将蛋白质从20mM Tris-HCl，pH7.5，300mM NaCl中的柱上洗脱下来。
将含有SolCorin-EK的Ni-NTA的洗脱液上样到以20mMTris-HCl，pH 7.5平衡的Poros 50聚乙烯亚胺(PI)(PerseptiveBiosystems)阴离子交换柱上。以20mM Tris-HCl，pH 7.5，300mMNaCl清洗该柱以除去聚合的蛋白，用具有300mM至1M的NaCl梯度的20mM Tris-HCl，pH 7.5将蛋白质从柱上洗脱下来。
含有SolCorin-EK的PI洗脱液稀释至约50mM NaCl，以10kDa截留值(cut-off)(Millipore)的超滤进行浓缩，然后上样到经20mMTris-HCl，pH 7.5平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow(Pharmacia)阴离子交换柱上。用20mM Tris-HCl，pH 7.5清洗该柱，用20mM Tris-HCI，1M NaCl将蛋白质从柱上洗脱下来。含有SolCorin-EK的洗脱液按1∶2被20mM Tris-HCl，pH 7.5稀释。
经由分析的大小排阻色谱法所确定，SolCorin-EK制备物的纯度为约94％。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶色谱法以及随后的考马斯蓝染色确证了SolCorin-EK的大小和完整性。
由肠激酶对SolCorin-EK的活化通过在20mM Tris-HCl，pH 7.5，约260mM NaCl，2mM CaCl2中以每50μg蛋白质1单位肠激酶的比例室温下将纯化的SolCorin-EK暴露于重组肠激酶(Novagen)4小时而活化。通过在Eppendorf微型离心管中10,000rpm离心10分钟除去凝聚蛋白质。活化的SolCorin-EK被分成1mg等分试样，在干冰/乙醇水浴中迅速冷冻，保存于-80℃。
SolCorin-EK对心肌症仓鼠的利尿和钠尿作用
BIO14.6心肌症(CM)仓鼠是一种常染色体隐性品系，其在δ-肌聚糖基因中存在突变(Nigro，V.等人(1997)Hum.Mol.Genet 6601-607).BIO14.6仓鼠逐渐获得伴随着肥大的特征和心力衰竭的严重的心肌症，但是显示出相对温和的骨骼肌表型。研究已经显示根据减少的利尿和钠尿判断，BIO 14.6CM仓鼠在ANP活性方面有缺陷，然而ANP的产生、释放和/或活化可被诱导(Dlouha，H.andMcBroom，M.J.(1986)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.181411-415)。
按以下方式准备正常仓鼠(F1B)和BIO 14.6CM仓鼠。在异氟烷(1-2％)麻醉下，将导管插入膀胱和右侧颈静脉以分别进行尿采集和给药。当需要测量血压时，将压力转换器(transducer pressure)插入左侧颈动脉。在约30分钟的包含外科手术所需时间的时期后，以35μl/分钟开始5％葡萄糖溶液输注，以10分钟的周期收集尿液，并在整个实验中一直持续进行上述输注和尿液收集。在尿液输出量稳定之后(自葡萄糖输注1小时后)，以大鼠ANP、SolCorin-EK或载体对仓鼠静脉内给药，快速注射到颈静脉中。将1mg/ml大鼠ANP储液(Sigma)稀释于0.9％NaCl中，并以固定的100μl体积，以1、3、10、和30μg/kg的剂量对F1B仓鼠给药，以10、30和100μg/kg对BIO 14.6CM仓鼠给药。每只动物以3mg/kg的剂量，以约300μl体积给予处于20mMTris-HCl、pH 7.5、约260mM NaCl、2mM CaCl2、45.9单位/ml肠激酶中的SolCorin-EK储液，所述SolCorin-EK储液的浓度为1.27或1.39mg/ml，所述约300μl体积根据溶液浓度和体重的不同而改变。以每只动物约300μl的体积给予载体(20mM Tris-HCl，pH 7.5，260mM NaCl，2mM CaCl2，45.9单位/ml肠激酶)，根据体重的不同而改变。
通过计算尿量和尿钠分别测定仓鼠中的利尿和钠尿。在静脉注射ANP、SolCorin-EK或载体前(基线)和注射后(峰值响应(peak response))根据10分钟周期收集的尿计算出表示为μl.kg-1.min-1的尿量，以及表示为μEq.kg-1.min-1的尿钠(Na+)。在采用BIO 14.6CM仓鼠的对照实验中(未显示)，在前10分钟大鼠ANP提高了尿量和尿钠的排泄，峰值响应。如图12所示，SolCorin-EK提高了BIO 14.6CM仓鼠的尿量和尿钠的峰值响应。与经corin处理的动物的基线和经载体处理的动物的峰值响应相比，这种提高在统计学上是显著的(p＜0.05)。因此，可溶性经修饰的人corin能够在心肌症仓鼠体内诱导ANP的活性。
实施例7本实施例阐述了用于口服给药的代表性的药物组合物的制备，所述药物组合物含有本发明经修饰的corin分子或其药物学可接受的盐A.
成分％重量/重量本发明经修饰的corin分子 20.0％乳糖79.5％硬脂酸镁0.5％混合上述成分，配制成硬壳明胶胶囊，其中每个胶囊含100mg，一个胶囊大约就是每天的总剂量。
B.
成分％重量/重量本发明经修饰的corin分子 20.0％硬脂酸镁0.9％淀粉8.6％乳糖69.6％PVP(聚乙烯吡咯烷酮) 0.9％将上述成分除了硬脂酸镁外进行组合，并用水作为粒化液使之成粒。然后将该配制品干燥，与硬脂酸镁混合，并用一种合适的压片机制片。
C.
成分本发明经修饰的corin分子 0.1g丙二醇 20.0g聚乙二醇400 20.0g
聚山梨酸酯80 1.0g水 加水直至100ml将本发明经修饰的corin分子溶于丙二醇、聚乙二醇400和聚山梨酸酯80中。然后一边搅拌一边加入足够量的水直至溶液体积为100ml，将其过滤并装瓶。
D.
成分 ％重量/重量本发明经修饰的corin分子 20.0％花生油78.0％失水山梨糖醇单硬脂酸酯60 2.0％将上述成分熔化、混合、装入弹性软胶囊中。
E.
成分 ％重量/重量本发明经修饰的corin分子 1.0％甲基或羧甲基纤维素2.0％0.9％盐水 q.s.加水直至100ml将本申请的经修饰的corin分子溶于纤维素/盐水溶液，将其过滤并装瓶备用。
实施例8本实施例阐述了用于肠胃外给药的代表性的药物组合物的制备，所述药物组合物含有本发明经修饰的corin分子或其药物学可接受的盐成分本发明经修饰的corin分子 0.02g丙二醇 20.0g聚乙二醇400 20.0g聚山梨酸酯80 1.0g0.9％盐水溶液q.s.加水直至100ml将本发明的经修饰的corin分子溶解于丙二醇、聚乙二醇400和聚山梨酸酯80。然后一边搅拌一边加入足够量的0.9％盐水溶液直至提供100ml静脉内(I.V.)溶液，经0.2μm薄膜过滤器过滤，并在无菌条件下包装。
实施例9本实施例阐述了栓剂形式的代表性的药物组合物的制备，所述药物组合物含有本发明经修饰的corin分子或其药物学可接受的盐成分％重量/重量本发明经修饰的corin分子 1.0％聚乙二醇100074.5％聚乙二醇400024.5％将各成分溶和在一起，并在蒸气浴上混合，灌入含有2.5g总重量的模具中。
实施例10本实施例阐述了用于吹入法的代表性的药物配制品的制备，所述配制品含有本发明经修饰的corin分子或其药物学可接受的盐成分％重量/重量微粉化的本发明经修饰的corin分子 1.0％微粉化的乳糖99.0％将这些成分碾碎、混合、并包装入一种装有给药泵(dosing pump)的吹入器中。
实施例11本实施例阐述了喷雾形式的代表性的药物配制品的制备，所述配制品含有本发明经修饰的corin分子或其药物学可接受的盐成分 ％重量/重量本发明经修饰的corin分子0.005％水 89.995％乙醇 10.000％
将本发明的经修饰的corin分子溶于乙醇中，与水混合。然后将该配制品包装于一种装有给药泵(dosing pump)的喷雾器中。
实施例12本实施例阐述了气溶胶形式的代表性的药物配制品的制备，所述配制品含有本发明经修饰的corin分子或其药物学可接受的盐成分 ％重量/重量本发明经修饰的corin分子0.10％推进剂11/1298.90％油酸 1.00％将本发明的经修饰的corin分子分散于油酸和推进剂中。然后将所得混合物灌入装有计量阀(metering valve)的空气溶胶容器中。
*****尽管本发明参考其具体的实施方案进行描述，但是本领域技术人员应当理解的是可以在不离开本发明的真实精神和范围条件下进行各种变化，及进行等价物替换。此外，可进行多种修饰以使特定的情况、材料、物质的组合、加工、加工步骤适应本发明的目的、精神和范围。所有的修饰视为包含在所附权利要求书的范围内。
序列表<110>舍林股份公司<120>新的具有取代活化序列的经修饰的corin分子及其用途<130>53103A<140>US 60/477,683<141>2003-06-11<150>US 60/477,683<151>2003-06-11<160>41<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>3129<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1atgaaacagt ctcctgccct cgctccggaa gagcgctacc gcagagccgg gtccccaaag 60ccggtcttga gagctgatga caataacatg ggcaatggct gctctcagaa gctggcgact 120gctaacctcc tccggttcct attgctggtc ctgattccat gtatctgtgc tctcgttctc 180ttgctggtga tcctgctttc ctatgttgga acattacaaa aggtctattt taaatcaaat 240gggagtgaac ctttggtcac tgatggtgaa atccaagggt ccgatgttat tcttacaaat 300acaatttata accagagcac tgtggtgtct actgcacatc ccgaccaaca cgttccagcc 360tggactacgg atgcttctct cccaggggac caaagtcaca ggaatacaag tgcctgtatg 420aacatcaccc acagccagtg tcagatgctg ccctaccacg ccacgctgac acctctcctc 480tcagttgtca gaaacatgga aatggaaaag ttcctcaagt ttttcacata tctccatcgc 540ctcagttgct atcaacatat catgctgttt ggctgtaccc tcgccttccc tgagtgcatc 600attgatggcg atgacagtca tggactcctg ccctgtaggt ccttctgtga ggctgcaaaa 660gaaggctgtg aatcagtcct ggggatggtg aattactcct ggccggattt cctcagatgc 720tcccagttta gaaaccaaac tgaaagcagc aatgtcagca gaatttgctt ctcacctcag 780caggaaaacg gaaagcaatt gctctgtgga aggggtgaga actttctgtg tgccagtgga 840atctgcatcc ccgggaaact gcaatgtaat ggctacaacg actgtgacga ctggagtgac 900gaggctcatt gcaactgcag cgagaatctg tttcactgtc acacaggcaa gtgccttaat 960tacagccttg tgtgtgatgg atatgatgac tgtggggatt tgagtgatga gcaaaactgt1020gattgcaatc ccacaacaga gcatcgctgc ggggacgggc gctgcatcgc catggagtgg1080
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aagctgcaag agggagaggt ccgcattatt tctctggaac attgtcagtc ctactttgac2880atgaagacca tcaccactcg gatgatatgt gctggctatg agtctggcac agttgattca2940tgcatgggtg acagcggtgg gcctcttgtt tgtgagaagc ctggaggacg gtggacatta3000tttggattaa cttcatgggg ctccgtctgc ttttccaaag tcctggggcc tggcgtttat3060agtaatgtgt catatttcgt cgaatggatt aaaagacaga tttacatcca gacctttctc3120ctaaactaa3129<210>2<211>1042<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Lys Gln Ser Pro Ala Leu Ala Pro Glu Glu Arg Tyr Arg Arg Ala1 5 10 15Gly Ser Pro Lys Pro Val Leu Arg Ala Asp Asp Asn Asn Met Gly Asn20 25 30Gly Cys Ser Gln Lys Leu Ala Thr Ala Asn Leu Leu Arg Phe Leu Leu35 40 45Leu Val Leu Ile Pro Cys Ile Cys Ala Leu Val Leu Leu Leu Val Ile50 55 60Leu Leu Ser Tyr Val Gly Thr Leu Gln Lys Val Tyr Phe Lys Ser Asn65 70 75 80Gly Ser Glu Pro Leu Val Thr Asp Gly Glu Ile Gln Gly Ser Asp Val85 90 95Ile Leu Thr Asn Thr Ile Tyr Asn Gln Ser Thr Val Val Ser Thr Ala100 105 110His Pro Asp Gln His Val Pro Ala Trp Thr Thr Asp Ala Ser Leu Pro115 120 125Gly Asp Gln Ser His Arg Asn Thr Ser Ala Cys Met Asn Ile Thr His130 135 140Ser Gln Cys Gln Met Leu Pro Tyr His Ala Thr Leu Thr Pro Leu Leu145 150 155 160
Ser Val Val Arg Asn Met Glu Met Glu Lys Phe Leu Lys Phe Phe Thr165 170 175Tyr Leu His Arg Leu Ser Cys Tyr Gln His Ile Met Leu Phe Gly Cys180 185 190Thr Leu Ala Phe Pro Glu Cys Ile Ile Asp Gly Asp Asp Ser His Gly195 200 205Leu Leu Pro Cys Arg Ser Phe Cys Glu Ala Ala Lys Glu Gly Cys Glu210 215 220Ser Val Leu Gly Met Val Asn Tyr Ser Trp Pro Asp Phe Leu Arg Cys225 230 235 240Ser Gln Phe Arg Asn Gln Thr Glu Ser Ser Asn Val Ser Arg Ile Cys245 250 255Phe Ser Pro Gln Gln Glu Asn Gly Lys Gln Leu Leu Cys Gly Arg Gly260 265 270Glu Asn Phe Leu Cys Ala Ser Gly Ile Cys Ile Pro Gly Lys Leu Gln275 280 285Cys Asn Gly Tyr Asn Asp Cys Asp Asp Trp Ser Asp Glu Ala His Cys290 295 300Asn Cys Ser Glu Asn Leu Phe His Cys His Thr Gly Lys Cys Leu Asn305 310 315 320Tyr Ser Leu Val Cys Asp Gly Tyr Asp Asp Cys Gly Asp Leu Ser Asp325 330 335Glu Gln Asn Cys Asp Cys Asn Pro Thr Thr Glu His Arg Cys Gly Asp340 345 350Gly Arg Cys Ile Ala Met Glu Trp Val Cys Asp Gly Asp His Asp Cys355 360 365Val Asp Lys Ser Asp Glu Val Asn Cys Ser Cys His Ser Gln Gly Leu370 375 380Val Glu Cys Arg Asn Gly Gln Cys Ile Pro Ser Thr Phe Gln Cys Asp385 390 395 400
Gly Asp Glu Asp Cys Lys Asp Gly Ser Asp Glu Glu Asn Cys Ser Val405 410 415Ile Gln Thr Ser Cys Gln Glu Gly Asp Gln Arg Cys Leu Tyr Asn Pro420 425 430Cys Leu Asp Ser Cys Gly Gly Ser Ser Leu Cys Asp Pro Asn Asn Ser435 440 445Leu Asn Asn Cys Ser Gln Cys Glu Pro Ile Thr Leu Glu Leu Cys Met450 455 460Asn Leu Pro Tyr Asn Ser Thr Ser Tyr Pro Asn Tyr Phe Gly His Arg465 470 475 480Thr Gln Lys Glu Ala Ser Ile Ser Trp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Ala485 490 495Leu Val Gln Thr Asn Cys Tyr Lys Tyr Leu Met Phe Phe Ser Cys Thr500 505 510Ile Leu Val Pro Lys Cys Asp Val Asn Thr Gly Glu Arg Ile Pro Pro515 520 525Cys Arg Ala Leu Cys Glu His Ser Lys Glu Arg Cys Glu Ser Val Leu530 535 540Gly Ile Val Gly Leu Gln Trp Pro Glu Asp Thr Asp Cys Ser Gln Phe545 550 555 560Pro Glu Glu Asn Ser Asp Asn Gln Thr Cys Leu Met Pro Asp Glu Tyr565 570 575Val Glu Glu Cys Ser Pro Ser His Phe Lys Cys Arg Ser Gly Gln Cys580 585 590Val Leu Ala Ser Arg Arg Cys Asp Gly Gln Ala Asp Cys Asp Asp Asp595 600 605Ser Asp Glu Glu Asn Cys Gly Cys Lys Glu Arg Asp Leu Trp Glu Cys610 615 620Pro Ser Asn Lys Gln Cys Leu Lys His Thr Val Ile Cys Asp Gly Phe
625 630 635 640Pro Asp Cys Pro Asp Tyr Met Asp Glu Lys Asn Cys Ser Phe Cys Gln645 650 655Asp Asp Glu Leu Glu Cys Ala Asn His Ala Cys Val Ser Arg Asp Leu660 665 670Trp Cys Asp Gly Glu Ala Asp Cys Ser Asp Ser Ser Asp Glu Trp Asp675 680 685Cys Val Thr Leu Ser Ile Asn Val Asn Ser Ser Ser Phe Leu Met Val690 695 700His Arg Ala Ala Thr Glu His His Val Cys Ala Asp Gly Trp Gln Glu705 710 715 720Ile Leu Ser Gln Leu Ala Cys Lys Gln Met Gly Leu Gly Glu Pro Ser725 730 735Val Thr Lys Leu Ile Gln Glu Gln Glu Lys Glu Pro Arg Trp Leu Thr740 745 750Leu His Ser Asn Trp Glu Ser Leu Asn Gly Thr Thr Leu His Glu Leu755 760 765Leu Val Asn Gly Gln Ser Cys Glu Ser Arg Ser Lys Ile Ser Leu Leu770 775 780Cys Thr Lys Gln Asp Cys Gly Arg Arg Pro Ala Ala Arg Met Asn Lys785 790 795 800Arg Ile Leu Gly Gly Arg Thr Ser Arg Pro Gly Arg Trp Pro Trp Gln805 810 815Cys Ser Leu Gln Ser Glu Pro Ser Gly His Ile Cys Gly Cys Val Leu820 825 830Ile Ala Lys Lys Trp Val Leu Thr Val Ala His Cys Phe Glu Gly Arg835 840 845Glu Asn Ala Ala Val Trp Lys Val Val Leu Gly Ile Asn Asn Leu Asp850 855 860
His Pro Ser Val Phe Met Gln Thr Arg Phe Val Lys Thr Ile Ile Leu865 870 875 880His Pro Arg Tyr Ser Arg Ala Val Val Asp Tyr Asp Ile Ser Ile Val885 890 895Glu Leu Ser Glu Asp Ile Ser Glu Thr Gly Tyr Val Arg Pro Val Cys900 905 910Leu Pro Asn Pro Glu Gln Trp Leu Glu Pro Asp Thr Tyr Cys Tyr Ile915 920 925Thr Gly Trp Gly His Met Gly Asn Lys Met Pro Phe Lys Leu Gln Glu930 935 940Gly Glu Val Arg Ile Ile Ser Leu Glu His Cys Gln Ser Tyr Phe Asp945 950 955 960Met Lys Thr Ile Thr Thr Arg Met Ile Cys Ala Gly Tyr Glu Ser Gly965 970 975Thr Val Asp Ser Cys Met Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu980 985 990Lys Pro Gly Gly Arg Trp Thr Leu Phe Gly Leu Thr Ser Trp Gly Ser995 10001005Val Cys Phe Ser Lys Val Leu Gly Pro Gly Val Tyr Ser Asn Val101010151020Ser Tyr Phe Val Glu Trp Ile Lys Arg Gln Ile Tyr Ile Gln Thr102510301035Phe Leu Leu Asn1040<210>3<211>34<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Forward Primer for Corin Polypeptide<400>3atgaaacagt ctcctgccct cgctccggaa gagc 34
<210>4<211>24<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Reverse Primer for Corin Polypeptide<400>4gtttaggaga aaggtctgga tgta 24<210>5<211>44<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Forward Primer Cor/TMa<400>5gggggaattc atgaaacagt ctcctgccct cgctccggaa gagc 44<210>6<211>38<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Reverse Primer Cor/TMb<400>6ggggctcgag cgtagtccag gctggaacgt gttggtcg 38<210>7<211>43<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Forward Primer CorFL<400>7ggggctcgag gatgcttctc tcccagggga ccaaagtcac agg43<210>8<211>43<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Reverse Primer CorEnd<400>8gggggggccc ttagtttagg agaaaggtct ggatgtaaat ctg43
<210>9<211>1044<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>Corin AA 1 to 123，Artificial XhoI Site，and Corin AA 124 to 1042<400>9Met Lys Gln Ser Pro Ala Leu Ala Pro Glu Glu Arg Tyr Arg Arg Ala1 5 10 15Gly Ser Pro Lys Pro Val Leu Arg Ala Asp Asp Asn Asn Met Gly Asn20 25 30Gly Cys Ser Gln Lys Leu Ala Thr Ala Asn Leu Leu Arg Phe Leu Leu35 40 45Leu Val Leu Ile Pro Cys Ile Cys Ala Leu Val Leu Leu Leu Val Ile50 55 60Leu Leu Ser Tyr Val Gly Thr Leu Gln Lys Val Tyr Phe Lys Ser Asn65 70 75 80Gly Ser Glu Pro Leu Val Thr Asp Gly Glu Ile Gln Gly Ser Asp Val85 90 95Ile Leu Thr Asn Thr Ile Tyr Asn Gln Ser Thr Val Val Ser Thr Ala100 105 110His Pro Asp Gln His Val Pro Ala Trp Thr Thr Leu Glu Asp Ala Ser115 120 125Leu Pro Gly Asp Gln Ser His Arg Asn Thr Ser Ala Cys Met Asn Ile130 135 140Thr His Ser Gln Cys Gln Met Leu Pro Tyr His Ala Thr Leu Thr Pro145 150 155 160Leu Leu Ser Val Val Arg Asn Met Glu Met Glu Lys Phe Leu Lys Phe165 170 175Phe Thr Tyr Leu His Arg Leu Ser Cys Tyr Gln His Ile Met Leu Phe180 185 190
Gly Cys Thr Leu Ala Phe Pro Glu Cys Ile Ile Asp Gly Asp Asp Ser195 200 205His Gly Leu Leu Pro Cys Arg Ser Phe Cys Glu Ala Ala Lys Glu Gly210 215 220Cys Glu Ser Val Leu Gly Met Val Asn Tyr Ser Trp Pro Asp Phe Leu225 230 235 240Arg Cys Ser Gln Phe Arg Asn Gln Thr Glu Ser Ser Asn Val Ser Arg245 250 255Ile Cys Phe Ser Pro Gln Gln Glu Asn Gly Lys Gln Leu Leu Cys Gly260 265 270Arg Gly Glu Asn Phe Leu Cys Ala Ser Gly Ile Cys Ile Pro Gly Lys275 280 285Leu Gln Cys Asn Gly Tyr Asn Asp Cys Asp Asp Trp Ser Asp Glu Ala290 295 300His Cys Asn Cys Ser Glu Asn Leu Phe His Cys His Thr Gly Lys Cys305 310 315 320Leu Asn Tyr Ser Leu Val Cys Asp Gly Tyr Asp Asp Cys Gly Asp Leu325 330 335Ser Asp Glu Gln Asn Cys Asp Cys Asn Pro Thr Thr Glu His Arg Cys340 345 350Gly Asp Gly Arg Cys Ile Ala Met Glu Trp Val Cys Asp Gly Asp His355 360 365Asp Cys Val Asp Lys Ser Asp Glu Val Asn Cys Ser Cys His Ser Gln370 375 380Gly Leu Val Glu Cys Arg Asn Gly Gln Cys Ile Pro Ser Thr Phe Gln385 390 395 400Cys Asp Gly Asp Glu Asp Cys Lys Asp Gly Ser Asp Glu Glu Asn Cys405 410 415Ser Val Ile Gln Thr Ser Cys Gln Glu Gly Asp Gln Arg Cys Leu Tyr420 425 430
Asn Pro Cys Leu Asp Ser Cys Gly Gly Ser Ser Leu Cys Asp Pro Asn435 440 445Asn Ser Leu Asn Asn Cys Ser Gln Cys Glu Pro Ile Thr Leu Glu Leu450 455 460Cys Met Asn Leu Pro Tyr Asn Ser Thr Ser Tyr Pro Asn Tyr Phe Gly465 470 475 480His Arg Thr Gln Lys Glu Ala Ser Ile Ser Trp Glu Ser Ser Leu Phe485 490 495Pro Ala Leu Val Gln Thr Asn Cys Tyr Lys Tyr Leu Met Phe Phe Ser500 505 510Cys Thr Ile Leu Val Pro Lys Cys Asp Val Asn Thr Gly Glu Arg Ile515 520 525Pro Pro Cys Arg Ala Leu Cys Glu His Ser Lys Glu Arg Cys Glu Ser530 535 540Val Leu Gly Ile Val Gly Leu Gln Trp Pro Glu Asp Thr Asp Cys Ser545 550 555 560Gln Phe Pro Glu Glu Asn Ser Asp Asn Gln Thr Cys Leu Met Pro Asp565 570 575Glu Tyr Val Glu Glu Cys Ser Pro Ser His Phe Lys Cys Arg Ser Gly580 585 590Gln Cys Val Leu Ala Ser Arg Arg Cys Asp Gly Gln Ala Asp Cys Asp595 600 605Asp Asp Ser Asp Glu Glu Asn Cys Gly Cys Lys Glu Arg Asp Leu Trp610 615 620Glu Cys Pro Ser Asn Lys Gln Cys Leu Lys His Thr Val Ile Cys Asp625 630 635 640Gly Phe Pro Asp Cys Pro Asp Tyr Met Asp Glu Lys Asn Cys Ser Phe645 650 655Cys Gln Asp Asp Glu Leu Glu Cys Ala Asn His Ala Cys Val Ser Arg
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Ile Val Glu Leu Ser Glu Asp Ile Ser Glu Thr Gly Tyr Val Arg Pro900 905 910Val Cys Leu Pro Asn Pro Glu Gln Trp Leu Glu Pro Asp Thr Tyr Cys915 920 925Tyr Ile Thr Gly Trp Gly His Met Gly Asn Lys Met Pro Phe Lys Leu930 935 940Gln Glu Gly Glu Val Arg Ile Ile Ser Leu Glu His Cys Gln Ser Tyr945 950 955 960Phe Asp Met Lys Thr Ile Thr Thr Arg Met Ile Cys Ala Gly Tyr Glu965 970 975Ser Gly Thr Val Asp Ser Cys Met Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val980 985 990Cys Glu Lys Pro Gly Gly Arg Trp Thr Leu Phe Gly Leu Thr Ser Trp995 10001005Gly Ser Val Cys Phe Ser Lys Val Leu Gly Pro Gly Val Tyr Ser101010151020Asn Val Ser Tyr Phe Val Glu Trp Ile Lys Arg Gln Ile Tyr Ile102510301035Gln Thr Phe Leu Leu Asn1040<210>10<211>42<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Forward Primer CorDel I<400>10ggggctcgag ctctgtggaa ggggtgagaa ctttctgtgt gc 42<210>11<211>36<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Forward Primer CorDel II
<400>11ggggctcgag ctgaataact gtagtcaatg tgaacc36<210>12<211>40<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Forward Primer CorDel III<400>12ggggctcgag gtggaagaat gctcacctag tcatttcaag40<210>13<211>40<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Forward Primer CorDel IV<400>13ggggctcgag gtgtgtgcag atggctggca ggagatattg40<210>14<211>40<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Forward Primer CorDel V<400>14ggggctcgag gactgtgggc gccgccctgc tgcccgaatg40<210>15<211>900<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>Corin AA 1 to 123，Artificial XhoI Site，and Corin AA 268 to 1042<400>15Met Lys Gln Ser Pro Ala Leu Ala Pro Glu Glu Arg Tyr Arg Arg Ala1 5 10 15Gly Ser Pro Lys Pro Val Leu Arg Ala Asp Asp Asn Asn Met Gly Asn20 25 30
Gly Cys Ser Gln Lys Leu Ala Thr Ala Asn Leu Leu Arg Phe Leu Leu35 40 45Leu Val Leu Ile Pro Cys Ile Cys Ala Leu Val Leu Leu Leu Val Ile50 55 60Leu Leu Ser Tyr Val Gly Thr Leu Gln Lys Val Tyr Phe Lys Ser Asn65 70 75 80Gly Ser Glu Pro Leu Val Thr Asp Gly Glu Ile Gln Gly Ser Asp Val85 90 95Ile Leu Thr Asn Thr Ile Tyr Asn Gln Ser Thr Val Val Ser Thr Ala100 105 110His Pro Asp Gln His Val Pro Ala Trp Thr Thr Leu Glu Leu Cys Gly115 120 125Arg Gly Glu Asn Phe Leu Cys Ala Ser Gly Ile Cys Ile Pro Gly Lys130 135 140Leu Gln Cys Asn Gly Tyr Asn Asp Cys Asp Asp Trp Ser Asp Glu Ala145 150 155 160His Cys Asn Cys Ser Glu Asn Leu Phe His Cys His Thr Gly Lys Cys165 170 175Leu Asn Tyr Ser Leu Val Cys Asp Gly Tyr Asp Asp Cys Gly Asp Leu180 185 190Ser Asp Glu Gln Asn Cys Asp Cys Asn Pro Thr Thr Glu His Arg Cys195 200 205Gly Asp Gly Arg Cys Ile Ala Met Glu Trp Val Cys Asp Gly Asp His210 215 220Asp Cys Val Asp Lys Ser Asp Glu Val Asn Cys Ser Cys His Ser Gln225 230 235 240Gly Leu Val Glu Cys Arg Asn Gly Gln Cys Ile Pro Ser Thr Phe Gln245 250 255Cys Asp Gly Asp Glu Asp Cys Lys Asp Gly Ser Asp Glu Glu Asn Cys260 265 270
Ser Val Ile Gln Thr Ser Cys Gln Glu Gly Asp Gln Arg Cys Leu Tyr275 280 285Asn Pro Cys Leu Asp Ser Cys Gly Gly Ser Ser Leu Cys Asp Pro Asn290 295 300Asn Ser Leu Asn Asn Cys Ser Gln Cys Glu Pro Ile Thr Leu Glu Leu305 310 315 320Cys Met Asn Leu Pro Tyr Asn Ser Thr Ser Tyr Pro Asn Tyr Phe Gly325 330 335His Arg Thr Gln Lys Glu Ala Ser Ile Ser Trp Glu Ser Ser Leu Phe340 345 350Pro Ala Leu Val Gln Thr Asn Cys Tyr Lys Tyr Leu Met Phe Phe Ser355 360 365Cys Thr Ile Leu Val Pro Lys Cys Asp Val Asn Thr Gly Glu Arg Ile370 375 380Pro Pro Cys Arg Ala Leu Cys Glu His Ser Lys Glu Arg Cys Glu Ser385 390 395 400Val Leu Gly Ile Val Gly Leu Gln Trp Pro Glu Asp Thr Asp Cys Ser405 410 415Gln Phe Pro Glu Glu Asn Ser Asp Asn Gln Thr Cys Leu Met Pro Asp420 425 430Glu Tyr Val Glu Glu Cys Ser Pro Ser His Phe Lys Cys Arg Ser Gly435 440 445Gln Cys Val Leu Ala Ser Arg Arg Cys Asp Gly Gln Ala Asp Cys Asp450 455 460Asp Asp Ser Asp Glu Glu Asn Cys Gly Cys Lys Glu Arg Asp Leu Trp465 470 475 480Glu Cys Pro Ser Asn Lys Gln Cys Leu Lys His Thr Val Ile Cys Asp485 490 495Gly Phe Pro Asp Cys Pro Asp Tyr Met Asp Glu Lys Asn Cys Ser Phe500 505 510
Cys Gln Asp Asp Glu Leu Glu Cys Ala Asn His Ala Cys Val Ser Arg515 520 525Asp Leu Trp Cys Asp Gly Glu Ala Asp Cys Ser Asp Ser Ser Asp Glu530 535 540Trp Asp Cys Val Thr Leu Ser Ile Asn Val Asn Ser Ser Ser Phe Leu545 550 555 560Met Val His Arg Ala Ala Thr Glu His His Val Cys Ala Asp Gly Trp565 570 575Gln Glu Ile Leu Ser Gln Leu Ala Cys Lys Gln Met Gly Leu Gly Glu580 585 590Pro Ser Val Thr Lys Leu Ile Gln Glu Gln Glu Lys Glu Pro Arg Trp595 600 605Leu Thr Leu His Ser Asn Trp Glu Ser Leu Asn Gly Thr Thr Leu His610 615 620Glu Leu Leu Val Asn Gly Gln Ser Cys Glu Ser Arg Ser Lys Ile Ser625 630 635 640Leu Leu Cys Thr Lys Gln Asp Cys Gly Arg Arg Pro Ala Ala Arg Met645 650 655Asn Lys Arg Ile Leu Gly Gly Arg Thr Ser Arg Pro Gly Arg Trp Pro660 665 670Trp Gln Cys Ser Leu Gln Ser Glu Pro Ser Gly His Ile Cys Gly Cys675 680 685Val Leu Ile Ala Lys Lys Trp Val Leu Thr Val Ala His Cys Phe Glu690 695 700Gly Arg Glu Asn Ala Ala Val Trp Lys Val Val Leu Gly Ile Asn Asn705 710 715 720Leu Asp His Pro Ser Val Phe Met Gln Thr Arg Phe Val Lys Thr Ile725 730 735Ile Leu His Pro Arg Tyr Ser Arg Ala Val Val Asp Tyr Asp Ile Ser
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<223>Corin AA 1 to 123，Artificial XhoI site，and Corin AA 449 to 1042<400>16Met Lys Gln Ser Pro Ala Leu Ala Pro Glu Glu Arg Tyr Arg Arg Ala1 5 10 15Gly Ser Pro Lys Pro Val Leu Arg Ala Asp Asp Asn Asn Met Gly Asn20 25 30
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<220>
<223>Reverse Primer Del 72<400>23ggggctcgag aggtgagaag caaattctgc tgacattgc 39<210>24<211>38<212>DNA<213>Artificial<220>
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<223>Forward Primer EntPCR2a<400>28
ggtttaaacg ggcccttagt ttaggag 27<210>29<211>38<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Reverse Primer EntPCR2b<400>29gacgatgacg ataagatcct tggaggtcgg acgagtcg 38<210>30<211>1039<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>Corin AA 1 to 123，Artificial XhoI Site，Corin AA 124 to 791，Enterokinase Site，and Corin AA 802 to 1042<400>30Met Lys Gln Ser Pro Ala Leu Ala Pro Glu Glu Arg Tyr Arg Arg Ala1 5 10 15Gly Ser Pro Lys Pro Val Leu Arg Ala Asp Asp Asn Asn Met Gly Asn20 25 30Gly Cys Ser Gln Lys Leu Ala Thr Ala Asn Leu Leu Arg Phe Leu Leu35 40 45Leu Val Leu Ile Pro Cys Ile Cys Ala Leu Val Leu Leu Leu Val Ile50 55 60Leu Leu Ser Tyr Val Gly Thr Leu Gln Lys Val Tyr Phe Lys Ser Asn65 70 75 80Gly Ser Glu Pro Leu Val Thr Asp Gly Glu Ile Gln Gly Ser Asp Val85 90 95Ile Leu Thr Asn Thr Ile Tyr Asn Gln Ser Thr Val Val Ser Thr Ala100 105 110His Pro Asp Gln His Val Pro Ala Trp Thr Thr Leu Glu Asp Ala Ser115 120 125Leu Pro Gly Asp Gln Ser His Arg Asn Thr Ser Ala Cys Met Asn Ile
130 135 140Thr His Ser Gln Cys Gln Met Leu Pro Tyr His Ala Thr Leu Thr Pro145 150 155 160Leu Leu Ser Val Val Arg Asn Met Glu Met Glu Lys Phe Leu Lys Phe165 170 175Phe Thr Tyr Leu His Arg Leu Ser Cys Tyr Gln His Ile Met Leu Phe180 185 190Gly Cys Thr Leu Ala Phe Pro Glu Cys Ile Ile Asp Gly Asp Asp Ser195 200 205His Gly Leu Leu Pro Cys Arg Ser Phe Cys Glu Ala Ala Lys Glu Gly210 215 220Cys Glu Ser Val Leu Gly Met Val Asn Tyr Ser Trp Pro Asp Phe Leu225 230 235 240Arg Cys Ser Gln Phe Arg Asn Gln Thr Glu Ser Ser Asn Val Ser Arg245 250 255Ile Cys Phe Ser Pro Gln Gln Glu Asn Gly Lys Gln Leu Leu Cys Gly260 265 270Arg Gly Glu Asn Phe Leu Cys Ala Ser Gly Ile Cys Ile Pro Gly Lys275 280 285Leu Gln Cys Asn Gly Tyr Asn Asp Cys Asp Asp Trp Ser Asp Glu Ala290 295 300His Cys Asn Cys Ser Glu Asn Leu Phe His Cys His Thr Gly Lys Cys305 310 315 320Leu Asn Tyr Ser Leu Val Cys Asp Gly Tyr Asp Asp Cys Gly Asp Leu325 330 335Ser Asp Glu Gln Asn Cys Asp Cys Asn Pro Thr Thr Glu His Arg Cys340 345 350Gly Asp Gly Arg Cys Ile Ala Met Glu Trp Val Cys Asp Gly Asp His355 360 365
Asp Cys Val Asp Lys Ser Asp Glu Val Asn Cys Ser Cys His Ser Gln370 375 380Gly Leu Val Glu Cys Arg Asn Gly Gln Cys Ile Pro Ser Thr Phe Gln385 390 395 400Cys Asp Gly Asp Glu Asp Cys Lys Asp Gly Ser Asp Glu Glu Asn Cys405 410 415Ser Val Ile Gln Thr Ser Cys Gln Glu Gly Asp Gln Arg Cys Leu Tyr420 425 430Asn Pro Cys Leu Asp Ser Cys Gly Gly Ser Ser Leu Cys Asp Pro Asn435 440 445Asn Ser Leu Asn Asn Cys Ser Gln Cys Glu Pro Ile Thr Leu Glu Leu450 455 460Cys Met Asn Leu Pro Tyr Asn Ser Thr Ser Tyr Pro Asn Tyr Phe Gly465 470 475 480His Arg Thr Gln Lys Glu Ala Ser Ile Ser Trp Glu Ser Ser Leu Phe485 490 495Pro Ala Leu Val Gln Thr Asn Cys Tyr Lys Tyr Leu Met Phe Phe Ser500 505 510Cys Thr Ile Leu Val Pro Lys Cys Asp Val Asn Thr Gly Glu Arg Ile515 520 525Pro Pro Cys Arg Ala Leu Cys Glu His Ser Lys Glu Arg Cys Glu Ser530 535 540Val Leu Gly Ile Val Gly Leu Gln Trp Pro Glu Asp Thr Asp Cys Ser545 550 555 560Gln Phe Pro Glu Glu Asn Ser Asp Asn Gln Thr Cys Leu Met Pro Asp565 570 575Glu Tyr Val Glu Glu Cys Ser Pro Ser His Phe Lys Cys Arg Ser Gly580 585 590Gln Cys Val Leu Ala Ser Arg Arg Cys Asp Gly Gln Ala Asp Cys Asp595 600 605
Asp Asp Ser Asp Glu Glu Asn Cys Gly Cys Lys Glu Arg Asp Leu Trp610 615 620Glu Cys Pro Ser Asn Lys Gln Cys Leu Lys His Thr Val Ile Cys Asp625 630 635 640Gly Phe Pro Asp Cys Pro Asp Tyr Met Asp Glu Lys Asn Cys Ser Phe645 650 655Cys Gln Asp Asp Glu Leu Glu Cys Ala Asn His Ala Cys Val Ser Arg660 665 670Asp Leu Trp Cys Asp Gly Glu Ala Asp Cys Ser Asp Ser Ser Asp Glu675 680 685Trp Asp Cys Val Thr Leu Ser Ile Asn Val Asn Ser Ser Ser Phe Leu690 695 700Met Val His Arg Ala Ala Thr Glu His His Val Cys Ala Asp Gly Trp705 710 715 720Gln Glu Ile Leu Ser Gln Leu Ala Cys Lys Gln Met Gly Leu Gly Glu725 730 735Pro Ser Val Thr Lys Leu Ile Gln Glu Gln Glu Lys Glu Pro Arg Trp740 745 750Leu Thr Leu His Ser Asn Trp Glu Ser Leu Asn Gly Thr Thr Leu His755 760 765Glu Leu Leu Val Asn Gly Gln Ser Cys Glu Ser Arg Ser Lys Ile Ser770 775 780Leu Leu Cys Thr Lys Gln Asp Cys Gly Asp Asp Asp Asp Lys Ile Leu785 790 795 800Gly Gly Arg Thr Ser Arg Pro Gly Arg Trp Pro Trp Gln Cys Ser Leu805 810 815Gln Ser Glu Pro Ser Gly His Ile Cys Gly Cys Val Leu Ile Ala Lys820 825 830Lys Trp Val Leu Thr Val Ala His Cys Phe Glu Gly Arg Glu Asn Ala835 840 845
Ala Val Trp Lys Val Val Leu Gly Ile Asn Asn Leu Asp His Pro Ser850 855 860Val Phe Met Gln Thr Arg Phe Val Lys Thr Ile Ile Leu His Pro Arg865 870 875 880Tyr Ser Arg Ala Val Val Asp Tyr Asp Ile Ser Ile Val Glu Leu Ser885 890 895Glu Asp Ile Ser Glu Thr Gly Tyr Val Arg Pro Val Cys Leu Pro Asn900 905 910Pro Glu Gln Trp Leu Glu Pro Asp Thr Tyr Cys Tyr Ile Thr Gly Trp915 920 925Gly His Met Gly Asn Lys Met Pro Phe Lys Leu Gln Glu Gly Glu Val930 935 940Arg Ile Ile Ser Leu Glu His Cys Gln Ser Tyr Phe Asp Met Lys Thr945 950 955 960Ile Thr Thr Arg Met Ile Cys Ala Gly Tyr Glu Ser Gly Thr Val Asp965 970 975Ser Cys Met Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Lys Pro Gly980 985 990Gly Arg Trp Thr Leu Phe Gly Leu Thr Ser Trp Gly Ser Val Cys Phe995 10001005Ser Lys Val Leu Gly Pro Gly Val Tyr Ser Asn Val Ser Tyr Phe101010151020Val Glu Trp Ile Lys Arg Gln Ile Tyr Ile Gln Thr Phe Leu Leu102510301035Asn<210>31<211>43<212>DNA<213>Artificial
<220>
<223>Forward Primer CorFL-1<400>31ggggctcgag gatgcttctc tcccagggga ccaaagtcac agg43<210>32<211>40<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Reverse Primer CorSo12Apa2<400>32gggggggccc gtttaggaga aaggtctgga tgtaaatctg40<210>33<211>2976<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>SolCorin-EK DNA Sequence<400>33atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60gacgcggccc agccggccag gcgcgcgcgc cgtacgaagc tcgcccttct cgaggatgct120tctctcccag gggaccaaag tcacaggaat acaagtgcct gtatgaacat cacccacagc180cagtgtcaga tgctgcccta ccacgccacg ctgacacctc tcctctcagt tgtcagaaac240atggaaatgg aaaagttcct caagtttttc acatatctcc atcgcctcag ttgctatcaa300catatcatgc tgtttggctg taccctcgcc ttccctgagt gcatcattga tggcgatgac360agtcatggac tcctgccctg taggtccttc tgtgaggctg caaaagaagg ctgtgaatca420gtcctgggga tggtgaatta ctcctggccg gatttcctca gatgctccca gtttagaaac480caaactgaaa gcagcaatgt cagcagaatt tgcttctcac ctcagcagga aaacggaaag540caattgctct gtggaagggg tgagaacttt ctgtgtgcca gtggaatctg catccccggg600aaactgcaat gtaatggcta caacgactgt gacgactgga gtgacgaggc tcattgcaac660tgcagcgaga atctgtttca ctgtcacaca ggcaagtgcc ttaattacag ccttgtgtgt720gatggatatg atgactgtgg ggatttgagt gatgagcaaa actgtgattg caatcccaca780acagagcatc gctgcgggga cgggcgctgc atcgccatgg agtgggtgtg tgatggtgac840cacgactgtg tggataagtc tgacgaggtc aactgctcct gtcacagcca gggtctggtg900gaatgcagaa atggacaatg tatccccagc acgtttcaat gtgatggtga cgaggactgc960
aaggatggga gtgatgagga gaactgcagc gtcattcaga cttcatgtca agaaggagac1020caaagatgcc tctacaatcc ctgccttgat tcatgtggtg gtagctctct ctgtgacccg1080aacaacagtc tgaataactg tagtcaatgt gaaccaatta cattggaact ctgcatgaat1140ttgccctaca acagtacaag ttatccaaat tattttggcc acaggactca aaaggaagca1200tccatcagct gggagtcttc tcttttccct gcacttgttc aaaccaactg ttataaatac1260ctcatgttct tttcttgcac cattttggta ccaaaatgtg atgtgaatac aggcgagcgt1320atccctcctt gcagggcatt gtgtgaacac tctaaagaac gctgtgagtc tgttcttggg1380attgtgggcc tacagtggcc tgaagacaca gattgcagtc aatttccaga ggaaaattca1440gacaatcaaa cctgcctgat gcctgatgaa tatgtggaag aatgctcacc tagtcatttc1500aagtgccgct caggacagtg tgttctggct tccagaagat gtgatggcca ggccgactgt1560gacgatgaca gtgatgagga aaactgtggt tgtaaagaga gagatctttg ggaatgtcca1620tccaataaac aatgtttgaa gcacacagtg atctgcgatg ggttcccaga ctgccctgat1680tacatggacg agaaaaactg ctcattttgc caagatgatg agctggaatg tgcaaaccat1740gcgtgtgtgt cacgtgacct gtggtgtgat ggtgaagccg actgctcaga cagttcagat1800gaatgggact gtgtgaccct ctctataaat gtgaactcct cttcctttct gatggttcac1860agagctgcca cagaacacca cgtgtgtgca gatggctggc aggagatatt gagtcagctg1920gcctgcaagc agatgggttt aggagaacca tctgtgacca aattgataca ggaacaggag1980aaagagccgc ggtggctgac attacactcc aactgggaga gcctcaatgg gaccacttta2040catgaacttc tagtaaatgg gcagtcttgt gagagcagaa gtaaaatttc tcttctgtgt2100actaaacaag actgtgggcg ccgccctgct gccgacgatg acgataagat ccttggaggt2160cggacgagtc gccctggaag gtggccatgg cagtgttctc tgcagagtga acccagtgga2220catatctgtg gctgtgtcct cattgccaag aagtgggttc tgacagttgc ccactgcttc2280gaggggagag agaatgctgc agtttggaaa gtggtgcttg gcatcaacaa tctagaccat2340ccatcagtgt tcatgcagac acgctttgtg aagaccatca tcctgcatcc ccgctacagt2400cgagcagtgg tggactatga catcagcatc gttgagctga gtgaagacat cagtgagact2460ggctacgtcc ggcctgtctg cttgcccaac ccggagcagt ggctagagcc tgacacgtac2520tgctatatca caggctgggg ccacatgggc aataaaatgc catttaagct gcaagaggga2580gaggtccgca ttatttctct ggaacattgt cagtcctact ttgacatgaa gaccatcacc2640actcggatga tatgtgctgg ctatgagtct ggcacagttg attcatgcat gggtgacagc2700
ggtgggcctc ttgtttgtga gaagcctgga ggacggtgga cattatttgg attaacttca2760tggggctccg tctgcttttc caaagtcctg gggcctggcg tttatagtaa tgtgtcatat2820ttcgtcgaat ggattaaaag acagatttac atccagacct ttctcctaaa caagggcgag2880cttggtaccg agctcggatc cgaaggtaag cctatcccta accctctcct cggtctcgat2940tctacgcgta ccggtcatca tcaccatcac cattga 2976<210>34<211>991<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>IgK Secretion Signal Sequence，Artificial XhoI Site，Corin AA 124to 796，Enterokinase Site，Corin AA 802 to 1042，and C-TerminalV5 and 6xHis Tags<400>34Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr20 25 30Lys Leu Ala Leu Leu Glu Asp Ala Ser Leu Pro Gly Asp Gln Ser His35 40 45Arg Asn Thr Ser Ala Cys Met Asn Ile Thr His Ser Gln Cys Gln Met50 55 60Leu Pro Tyr His Ala Thr Leu Thr Pro Leu Leu Ser Val Val Arg Asn65 70 75 80Met Glu Met Glu Lys Phe Leu Lys Phe Phe Thr Tyr Leu His Arg Leu85 90 95Ser Cys Tyr Gln His Ile Met Leu Phe Gly Cys Thr Leu Ala Phe Pro100 105 110Glu Cys Ile Ile Asp Gly Asp Asp Ser His Gly Leu Leu Pro Cys Arg115 120 125Ser Phe Cys Glu Ala Ala Lys Glu Gly Cys Glu Ser Val Leu Gly Met130 135 140
Val Asn Tyr Ser Trp Pro Asp Phe Leu Arg Cys Ser Gln Phe Arg Asn145 150 155 160Gln Thr Glu Ser Ser Asn Val Ser Arg Ile Cys Phe Ser Pro Gln Gln165 170 175Glu Asn Gly Lys Gln Leu Leu Cys Gly Arg Gly Glu Asn Phe Leu Cys180 185 190Ala Ser Gly Ile Cys Ile Pro Gly Lys Leu Gln Cys Asn Gly Tyr Asn195 200 205Asp Cys Asp Asp Trp Ser Asp Glu Ala His Cys Asn Cys Ser Glu Asn210 215 220Leu Phe His Cys His Thr Gly Lys Cys Leu Asn Tyr Ser Leu Val Cys225 230 235 240Asp Gly Tyr Asp Asp Cys Gly Asp Leu Ser Asp Glu Gln Asn Cys Asp245 250 255Cys Asn Pro Thr Thr Glu His Arg Cys Gly Asp Gly Arg Cys Ile Ala260 265 270Met Glu Trp Val Cys Asp Gly Asp His Asp Cys Val Asp Lys Ser Asp275 280 285Glu Val Asn Cys Ser Cys His Ser Gln Gly Leu Val Glu Cys Arg Asn290 295 300Gly Gln Cys Ile Pro Ser Thr Phe Gln Cys Asp Gly Asp Glu Asp Cys305 310 315 320Lys Asp Gly Ser Asp Glu Glu Asn Cys Ser Val Ile Gln Thr Ser Cys325 330 335Gln Glu Gly Asp Gln Arg Cys Leu Tyr Asn Pro Cys Leu Asp Ser Cys340 345 350Gly Gly Ser Ser Leu Cys Asp Pro Asn Asn Ser Leu Asn Asn Cys Ser355 360 365Gln Cys Glu Pro Ile Thr Leu Glu Leu Cys Met Asn Leu Pro Tyr Asn370 375 380
Ser Thr Ser Tyr Pro Asn Tyr Phe Gly His Arg Thr Gln Lys Glu Ala385 390 395 400Ser Ile Ser Trp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Ala Leu Val Gln Thr Asn405 410 415Cys Tyr Lys Tyr Leu Met Phe Phe Ser Cys Thr Ile Leu Val Pro Lys420 425 430Cys Asp Val Asn Thr Gly Glu Arg Ile Pro Pro Cys Arg Ala Leu Cys435 440 445Glu His Ser Lys Glu Arg Cys Glu Ser Val Leu Gly Ile Val Gly Leu450 455 460Gln Trp Pro Glu Asp Thr Asp Cys Ser Gln Phe Pro Glu Glu Asn Ser465 470 475 480Asp Asn Gln Thr Cys Leu Met Pro Asp Glu Tyr Val Glu Glu Cys Ser485 490 495Pro Ser His Phe Lys Cys Arg Ser Gly Gln Cys Val Leu Ala Ser Arg500 505 510Arg Cys Asp Gly Gln Ala Asp Cys Asp Asp Asp Ser Asp Glu Glu Asn515 520 525Cys Gly Cys Lys Glu Arg Asp Leu Trp Glu Cys Pro Ser Asn Lys Gln530 535 540Cys Leu Lys His Thr Val Ile Cys Asp Gly Phe Pro Asp Cys Pro Asp545 550 555 560Tyr Met Asp Glu Lys Asn Cys Ser Phe Cys Gln Asp Asp Glu Leu Glu565 570 575Cys Ala Asn His Ala Cys Val Ser Arg Asp Leu Trp Cys Asp Gly Glu580 585 590Ala Asp Cys Ser Asp Ser Ser Asp Glu Trp Asp Cys Val Thr Leu Ser595 600 605Ile Asn Val Asn Ser Ser Ser Phe Leu Met Val His Arg Ala Ala Thr610 615 620
Glu His His Val Cys Ala Asp Gly Trp Gln Glu Ile Leu Ser Gln Leu625 630 635 640Ala Cys Lys Gln Met Gly Leu Gly Glu Pro Ser Val Thr Lys Leu Ile645 650 655Gln Glu Gln Glu Lys Glu Pro Arg Trp Leu Thr Leu His Ser Asn Trp660 665 670Glu Ser Leu Asn Gly Thr Thr Leu His Glu Leu Leu Val Asn Gly Gln675 680 685Ser Cys Glu Ser Arg Ser Lys Ile Ser Leu Leu Cys Thr Lys Gln Asp690 695 700Cys Gly Arg Arg Pro Ala Ala Asp Asp Asp Asp Lys Ile Leu Gly Gly705 710 715 720Arg Thr Ser Arg Pro Gly Arg Trp Pro Trp Gln Cys Ser Leu Gln Ser725 730 735Glu Pro Ser Gly His Ile Cys Gly Cys Val Leu Ile Ala Lys Lys Trp740 745 750Val Leu Thr Val Ala His Cys Phe Glu Gly Arg Glu Asn Ala Ala Val755 760 765Trp Lys Val Val Leu Gly Ile Asn Asn Leu Asp His Pro Ser Val Phe770 775 780Met Gln Thr Arg Phe Val Lys Thr Ile Ile Leu His Pro Arg Tyr Ser785 790 795 800Arg Ala Val Val Asp Tyr Asp Ile Ser Ile Val Glu Leu Ser Glu Asp805 810 815Ile Ser Glu Thr Gly Tyr Val Arg Pro Val Cys Leu Pro Asn Pro Glu820 825 830Gln Trp Leu Glu Pro Asp Thr Tyr Cys Tyr Ile Thr Gly Trp Gly His835 840 845Met Gly Asn Lys Met Pro Phe Lys Leu Gln Glu Gly Glu Val Arg Ile
850 855 860Ile Ser Leu Glu His Cys Gln Ser Tyr Phe Asp Met Lys Thr Ile Thr865 870 875 880Thr Arg Met Ile Cys Ala Gly Tyr Glu Ser Gly Thr Val Asp Ser Cys885 890 895Met Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Lys Pro Gly Gly Arg900 905 910Trp Thr Leu Phe Gly Leu Thr Ser Trp Gly Ser Val Cys Phe Ser Lys915 920 925Val Leu Gly Pro Gly Val Tyr Ser Asn Val Ser Tyr Phe Val Glu Trp930 935 940Ile Lys Arg Gln Ile Tyr Ile Gln Thr Phe Leu Leu Asn Lys Gly Glu945 950 955 960Leu Gly Thr Glu Leu Gly Ser Glu Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu965 970 975Leu Gly Leu Asp Ser Thr Arg Thr Gly His His His His His His980 985 990<210>35<211>46<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Forward Primer SolCat1<400>35ctgctgccga cgatgacgat aagatccttg gaggtcggac gagtcg 46<210>36<211>45<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Forward Primer SolCat2<400>36aaacaagact gtgggcgccg ccctgctgcc gacgatgacg ataag 45
<210>37<211>326<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>IgK Secretion Signal Sequence，Corin AA 787 to 796，EnterokinaseSite，Corin AA 802 to 1042，and C-Terminal V5 and 6xHis Tags<400>37Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr20 25 30Lys Leu Ala Leu Lys Gln Asp Cys Gly Arg Arg Pro Ala Ala Asp Asp35 40 45Asp Asp Lys Ile Leu Gly Gly Arg Thr Ser Arg Pro Gly Arg Trp Pro50 55 60Trp Gln Cys Ser Leu Gln Ser Glu Pro Ser Gly His Ile Cys Gly Cys65 70 75 80Val Leu Ile Ala Lys Lys Trp Val Leu Thr Val Ala His Cys Phe Glu85 90 95Gly Arg Glu Asn Ala Ala Val Trp Lys Val Val Leu Gly Ile Asn Asn100 105 110Leu Asp His Pro Ser Val Phe Met Gln Thr Arg Phe Val Lys Thr Ile115 120 125Ile Leu His Pro Arg Tyr Ser Arg Ala Val Val Asp Tyr Asp Ile Ser130 135 140Ile Val Glu Leu Ser Glu Asp Ile Ser Glu Thr Gly Tyr Val Arg Pro145 150 155 160Val Cys Leu Pro Asn Pro Glu Gln Trp Leu Glu Pro Asp Thr Tyr Cys165 170 175Tyr Ile Thr Gly Trp Gly His Met Gly Asn Lys Met Pro Phe Lys Leu180 185 190
Gln Glu Gly Glu Val Arg Ile Ile Ser Leu Glu His Cys Gln Ser Tyr195 200 205Phe Asp Met Lys Thr Ile Thr Thr Arg Met Ile Cys Ala Gly Tyr Glu210 215 220Ser Gly Thr Val Asp Ser Cys Met Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val225 230 235 240Cys Glu Lys Pro Gly Gly Arg Trp Thr Leu Phe Gly Leu Thr Ser Trp245 250 255Gly Ser Val Cys Phe Ser Lys Val Leu Gly Pro Gly Val Tyr Ser Asn260 265 270Val Ser Tyr Phe Val Glu Trp Ile Lys Arg Gln Ile Tyr Ile Gln Thr275 280 285Phe Leu Leu Asn Lys Gly Glu Leu Gly Thr Glu Leu Gly Ser Glu Gly290 295 300Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Arg Thr Gly305 310 315 320His His His His His His325<210>38<211>9<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>Substitute Activation Sequence 1<400>38Leu Lys Thr Pro Arg Val Val Gly Gly1 5<210>39<211>9<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>Substitute Activation Sequence 2<400>39
Leu Lys Gln Ala Arg Val Val Gly Gly1 5<210>40<211>9<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>Substitute Activation Sequence 3<400>40Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly1 5<210>41<211>6<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>Substitute Activation Sequence 4<400>41Asp Asp Asp Asp Lys Ile1 权利要求
1.分离的经修饰的corin分子或其片段或衍生物，其包含取代活化序列。
2.权利要求1的分离的分子，其中所述经修饰的corin分子包含细胞外结构域，或其片段或衍生物。
3.权利要求2的分离的分子，其中所述细胞外结构域包括丝氨酸蛋白酶催化结构域和选自由CRD1、LDLR1-5、CRD2、LDLR6-8和SRCR组成的一组中的至少一个额外的结构域，或其片段或衍生物。
4.权利要求3的分离的分子，其中所述细胞外结构域包括丝氨酸蛋白酶催化结构域和LDLR1-5、CRD2、LDLR6-8以及SRCR结构域，或其片段或衍生物。
5.权利要求2的分离的分子，其中所述取代活化序列取代野生型人corin活化序列RILGG。
6.权利要求2的分离的分子，其中所述取代活化序列是DDDDKILGG。
7.权利要求2的分离的分子，其中所述取代活化序列选自由LKTPRVVGG(SEQ ID NO38)、LKQARVVGG(SEQ ID NO39)、DDDDKIVGG(SEQ ID NO40)和DDDDKI(SEQ ID NO41)组成的一组。
8.权利要求2的分离的分子，其中所述取代活化序列由蛋白酶识别和切割。
9.权利要求2的分离的分子，其中所述取代活化序列由丝氨酸蛋白酶识别和切割。
10.权利要求2的分离的分子，其中所述取代活化序列由II型跨膜蛋白酶识别和切割。
11.权利要求2的分离的分子，其中所述取代活化序列是DDDDKILGG，其由肠激酶识别和切割。
12.权利要求2的分离的分子，其中所述取代活化序列由凝血酶、凝血因子Xa、弗林蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、凝血酶、纤溶酶、激肽释放酶、针依瓦菊素、人呼吸道胰蛋白酶样蛋白酶(HAT)、肥大细胞类胰蛋白酶、MBL关联的丝氨酸蛋白酶(MASP-1和MASP-2)、hepsin、MT-SP1/matryptase、TMPRSS2或Stubble-stubbloid识别和切割。
13.权利要求2的分离的分子，其进一步包含信号肽序列。
14.权利要求13的分离的分子，其中所述信号肽序列是细菌、真菌、昆虫、植物或动物来源的。
15.权利要求13的分离的分子，其中所述信号肽是Igκ信号序列。
16.权利要求2的分离的分子，其进一步包含表位标记。
17.权利要求16的分离的分子，其中所述表位标记是氨基酸标记。
18.权利要求16的分离的分子，其中所述表位标记是组氨酸(6×His)或半胱氨酸。
19.权利要求16的分离的分子，其中所述表位标记是V5或flag。
20.权利要求2的分离的分子，其来源于原核或真核生物来源。
21.权利要求20的分离的分子，其中所述真核生物是哺乳动物。
22.权利要求21的分离的分子，其中所述哺乳动物是牛、猪、鼠、马、犬、猫、鸟、鱼、绵羊、昆虫、猿、或人类动物。
23.一种活化的经修饰的corin分子，其包括由蛋白酶切割的取代活化序列。
24.权利要求2的分离的分子，其中所述取代活化序列已经被切割从而产生经修饰的活化的corin分子。
25.一种编码权利要求2或24的经修饰的corin分子的分离的核酸分子。
26.一种互补的核酸分子，其包括一种与权利要求25的核酸分子互补的核苷酸序列。
27.权利要求25的核酸分子，其是DNA或RNA。
28.权利要求25的核酸分子，其是肽核酸分子(PNA)。
29.权利要求25的核酸分子，其是硫代磷酸酯衍生分子。
30.权利要求25的核酸分子，其被选自于由放射性标记、酶、发色团和荧光剂组成的一组的化合物标记以便直接或间接产生可检测的信号。
31.含有权利要求25的核酸分子的载体。
32.权利要求31的载体，其中所述载体是质粒、粘粒、BAC、YAC、PAC或噬菌粒。
33.一种宿主载体系统，其含有处于合适的宿主细胞中的权利要求31的载体。
34.权利要求33的宿主载体系统，其中所述合适的宿主细胞是原核或真核细胞。
35.权利要求34的宿主载体系统，其中所述原核细胞是细菌细胞。
36.权利要求34的宿主载体系统，其中所述真核细胞是酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
37.包含权利要求2的分离的分子的药物组合物，所述组合物含有药物学可接受的赋形剂和治疗有效量的所述经修饰的corin分子。
38.权利要求37的药物组合物，其中所述的药物赋形剂选自于如下一组磷酸缓冲盐水溶液、水、乳剂、油/水乳剂、湿润剂、无菌溶液、赋形剂、淀粉、奶、糖、粘土、明胶、硬脂酸、硬脂酸的盐、硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石粉、植物脂肪或油类、树胶和乙二醇。
39.权利要求38的药物组合物，其被配制成脂质体、聚合组合物或聚合物微球。
40.权利要求38的药物组合物，其被配制成片剂、包衣片剂或胶囊剂。
41.一种试剂盒，其包含权利要求2的分离的分子。
42.包含权利要求25的核酸分子的试剂盒。
43.用于预防充血性心力衰竭的方法，其包括以治疗有效量的权利要求2的分子给药，其中所述的经修饰的corin分子降低血压。
44.权利要求43的方法，其中所述方法用于预防高血压、心脏肥大、心肌病、心脏纤维化、局部缺血性心脏病、瓣膜性心脏病、心肌炎和先兆子痫中的充血性心力衰竭。
45.用于预防和治疗患者充血性心力衰竭的方法，其包括对所述患者以治疗有效量的权利要求2的分子给药。
46.一种基因治疗组合物，其包括与治疗有效量的基因治疗载体组合的编码由SEQ ID NO34所示的氨基酸序列构成的经修饰的corin分子的SEQ ID NO33所示的核酸序列。
47.经修饰的corin分子，其包括corin的细胞外区域或其片段或衍生物，以及取代活化序列DDDDKILGG，其中所述细胞外结构域包括LDLR1-5、CRD2、LDLR6-8、SRCR和丝氨酸蛋白酶催化结构域，或其片段或衍生物。
48.权利要求47的分子，其中所述经修饰的corin分子包含SEQID NO34所示的氨基酸序列。
49.编码权利要求48的分子的分离的核酸分子，其包含SEQ IDNO33所示的核酸序列。
全文摘要
本发明涉及新的经修饰的corin分子或其片段或衍生物，其含有取代活化序列。所述经修饰的corin分子在所述取代活化序列处被切割，从而产生活化的corin分子或其片段或衍生物，它们呈现出天然存在的野生型corin分子的功能活性。所述经修饰的corin分子能够被用于治疗多种疾病或紊乱，包括充血性心力衰竭和急性心肌梗塞。
文档编号C12N15/57GK1836037SQ200480023009
公开日2006年9月20日 申请日期2004年6月9日 优先权日2003年6月11日
发明者吴庆宇 申请人:舍林股份公司