生产能产生或修饰代谢途径的进化微生物的方法

专利名称：生产能产生或修饰代谢途径的进化微生物的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备可以产生或修饰代谢途径的进化微生物的方法，和根据本法所产生的进化微生物及编码其进化蛋白的基因，以及所述的进化微生物，基因或蛋白质在生物转化过程上的应用。
制备修饰其性质的微生物是很常见的方法。其目的在使微生物在具有选择压力的生长培养基中生长，从而选择那些能够抵抗压力的微生物，或者用基因工程技术导入一个或多个异种基因，从而使此微生物产生与所述异种基因表达有关的表现型特征。对于本领域技术人员，此类进化可通过使用突变剂轻易达成。
通过除去培养基中某种成分转化所必需的基因以在选择压力下生长，和利用突变剂生长进化微生物的方法已于FR 2 823 219和WO 03/004656中有所叙述。

发明内容
本发明涉及一种制备能产生或修饰代谢途径的进化微生物的方法，其特征在于其包括以下几个步骤a)修饰原始微生物的细胞使其在某种特定的培养基中生长时抑制代谢物的生成或消耗，从而对微生物的生长造成负面的影响。如细胞未经修饰，微生物则能产生或消耗此代谢物，并能够在相同的特定培养基中正常生长。
b)使前项所得的经修饰的微生物在所述特定的培养基中培养使其发生进化，其中特定的培养基中可能包括进化所需的某种共同底物。
c)筛选能够在此适当地含共同底物的特定的培养基中生长的修饰微生物。
此进化微生物优选至少含有一个编码进化蛋白的进化基因。此进化过程可使受抑制的代谢途径被一个新的代谢途径所取代。
本发明还涉及一个包括在使修饰微生物生长的步骤b)前另加的一个步骤a1)的方法，在所述步骤a1)中，将至少一个编码异种蛋白的异种基因导入，其中此异种基因可预期产生进化而演化出一条新的代谢途径。
本发明还涉及一种包括将编码进化蛋白的基因分离的步骤d)的方法。本发明还涉及一种方法，其为将根据本发明得到的进化基因以某种适合的形式导入某种用于生产的微生物中，进而生产此进化蛋白。
本发明还涉及一种由本发明上述或下列方法所获得的进化微生物。
本发明还涉及一种制备进化蛋白的方法，其特征为使根据本发明的进化微生物在一种合适的培养基中生长从而生产进化蛋白并在有必要时将此蛋白纯化。
本发明还涉及一种由本发明上述或下列方法所获得的编码进化蛋白的进化基因。
本发明还涉及一种由本发明上述或下列方法所获得的进化蛋白。
本发明还涉及由本发明上述或下列方法所产生的进化微生物或进化蛋白质在生物转化过程中的应用。
定义本发明将‘进化微生物’定义为由修饰微生物经筛选而获得的微生物。进化微生物与修饰微生物至少有一点不同。此不同可以为，例如其酶学特性有所改善或能产生一条新的代谢途径。
本发明将‘代谢途径’定义为经一个或多个酶促反应产生了一种分子(产品)而这分子与反应前存在的分子(底物)有所不同。
根据本发明‘修饰’定义为一种改变，特别是指至少一种编码酶的基因和/或此基因的启动子的缺失。根据本发明‘代谢物’定义为由微生物合成和/或转化的分子。
根据本发明‘特定的培养基’定义为一种分子组成已知且适合微生物生长的培养基。特定的培养基实质上不含任何代谢物，其产物通过修饰而被抑制。
根据本发明‘共同底物’定义为一种与底物不同的有机或无机分子，此分子参与反应并将其一个或多个原子供给底物从而产生一个新的产品。共同底物并不具所认知的突变特性。
根据本发明‘筛选’定义为一种用来筛选已进化的微生物的培养方法，其中该微生物的生长已不受修饰所影响。一种优选的用途是连续培养的方法，其用稀释率不断增高的方法进行，从而仅有那些生长率等于或高于所定稀释率的微生物存留在培养基中。
根据本发明‘进化基因’定义为一段由A，T，G或C组成的由终止密码子(TAA，TAG，TGA)所限制的核苷酸序列。在筛选后，至少一个核酸与原序列不同，如此经此进化基因编码所得的蛋白与经原有基因编码所得的蛋白至少有一个氨基酸的差异。
根据本发明‘异种基因’为由起始密码子(ATG或GTG)和终止密码子(TA，TAG，TGA)所包围的一核苷酸序列。这序列又称为编码序列，其来源于与进化和/或生产所用微生物不同的生物体。
根据本发明‘进化蛋白’定义为一氨基酸序列(蛋白序列)，其在筛选后，至少一个氨基酸与与原蛋白序列不同。
根据本发明‘异种蛋白’定义为经异种基因翻译所得的蛋白。
基因与蛋白可由其主要序列确认，还可经序列或序列对比同源性确定同组蛋白。
PFAM(对比性与隐马尔科夫模型蛋白家族数据库；http://www.saneer.ac.uk/Software/Pfam/)存有大量蛋白序列对比性的讯息。每个PFAM能显示多重对比性，展示蛋白质结构域，评估在微生物中的分布，取得进入其他数据库的条件及观察已知的蛋白结构。
COGs(具同源件的蛋白质簇；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)是由与代表30个主要动植物系的43个全长基因组序列来源的蛋白序列比较而得。每个COG至少由3个系确认以便鉴定其固有的保守结构域。
本领域技术人员对鉴定同源系列及其同源性百分比的方法十分熟悉，其中包括可由网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/进入的BLAST程序，其默认参数值均登载在网址上。所得的序列尚可利用CLUSTALW(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)或MULTALIN(http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl)等程序作进一步的探索(对比)。其默认参数值均登录在网站上。
对本领域技术人员而言，利用基因库(GenBank)所提供的基因资料可确定在其他生物体，细菌株，酵母，真菌，哺乳动物，植物等中存在的对等基因。这项常规工作有利地是将从其它微生物中获得的基因进行对比得道共有序列，然后再设计退化探针在另一生物体内克隆相应的基因。这些分子生物学的常规方法对本领域技术人员而言是非常熟悉的，而且这些方法亦在例如萨姆布鲁克等所著的书内有所描述(分子克隆实验指南，1989，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)。
根据本发明在进化株上被缺失或过度表达的基因主要是应用大肠杆菌基因命名定义的。但根据本发明，此种应用更是常规的方法，其包括了在其他微生物中的相应基因。利用基因库所提供的大肠杆菌基因信息，本领域技术人员可认定在其他细菌体内的相应基因。
根据本发明，‘新代谢途径’是指一组一个或多个酶促反应，反应后产生一种化学产物。在筛选进化微生物后其酶活性在同一代谢途径中与未经进化的微生物有所不同。此种不同可为催化反应的类型不同或具有不同的动力学特性(Km，Vmax，Ki，等)。一个新的酶学途径能从一个与最初底物相同或不同的底物中产生一个与最初化学产物不同或相同的化学产物。
根据本发明，‘适当形态’是指一个由起始密码子(ATG或GTG)和终止密码子(TAA，TAG，TGA)所包围的核苷酸序列。这序列称为编码序列或为编码序列的一部分。在所需要的调控子控制下使异种基因在微生物中表达。这些调控子，包括启动调控子或启动子，特别是在微生物中称为强构建启动子的启动子，对本领域技术人员而言是非常熟悉的。构成启动子优选地选自pTAC-O，pLAC-O，pTRC-O或使lac操纵子缺失而构建的强启动子，pTHLA。
根据本发明，‘原始微生物’是指一株从未经过修饰，突变或进化的微生物。
根据本发明，‘生产用微生物’是指经进化微生物导入一个新代谢途径的进化微生物或优化微生物。
根据本发明，‘修饰微生物’是指一株经可控性修饰而非经进化过程而获得的微生物。例如基因的定向突变或缺失，或启动子的定向修饰。
根据本发明，‘适合生产进化蛋白的培养基’是指一个有确定成分的培养基或复合培养基，或部分成分确定培养基。复合培养基来源于植物，微生物或动物性水解产物。其组成可由分析确定。但这类培养基的彻底分析通常很难做到。部分成分确定的培养基是指在特定的的培养基中加入一些复合培养基。
根据本发明，‘生物转化过程’是指一个利用一个或数个酶将分子A转化成分子B的过程。这些酶或许存在或许不存在在一株或数株微生物中。生物转化过程可分成三类生物转换，发酵和生物催化。在生物转换中一种或多种酶由在适当的培养基中生长的微生物所产生，将底物A，如有必要时将一种或多种共同底物转换成底物B。在发酵时，一种或多种酶由在适当的培养基中生长的一种或多种微生物所产生，从而由这些微生物合成底物A。这种适当的培养基中含有共同底物。在生物催化反应中，酶并不存在细胞内而是在一个供应底物A和其他生物转化必备的共同底物的适当的培养基内。
基因分离方法对本领域技术人员而言是非常熟悉的。同时这些方法亦在萨姆布鲁克等著(分子克隆实验指南，1989，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)，奥苏贝尔等著(现代分子生物协议，1987，约翰威利父子出版社，纽约)及马尼阿提斯等著(分子克隆实验指南，1982，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)中均有介绍。这些方法使基因定位，拷贝，提取，然后再将此基因转入一个新的生物体内成为可能。在最后一步前，可在将基因导入生物体前加入一个将基因与一个多核苷酸结合的步骤。
蛋白纯化方法对本领域技术人员而言是非常熟悉的。同时这些方法亦在科立根等著(现代蛋白科学协议，1997，约翰威利父子出版社，纽约)中均有介绍。这些方法能使在断片或非断片蛋白质提取物中提取感兴趣蛋白质成为可能。然后纯化蛋白质，如果此蛋白质为酶，则可通过纯化增强它的活性。这些方法也可使在必要时将蛋白质固定在支承体上(树脂)成为可能。
根据本发明，‘缺失’是指抑制‘缺失’的基因的活性。此种抑制可通过某种适当的手段，将所关注的基因鞭表达产物失活而实现，或通过抑制所关注基因的表达，或通过使至少部分基因缺失从而使基因表达产生障碍(如使表达所需的启动子全部或部分缺失)，或通过使表达产物失去功能(如使所关注基因的编码部分缺失)等来实现。基因缺失优选地包括除去大部分基因。如有必要，可用一段标记基因来取代以便确认，分离与纯化根据本发明的进化株。
根据本发明，‘底物’是能被酶转化的代谢物。如有必要以共同底物存在。
发明的详细描述A.被修饰的微生物根据本发明，被修饰的微生物可为真核或原核生物。
根据本发明，一株微生物是指一组同种的微生物，其包括至少一种此株的微生物。因此所描述的此株微生物的特性与也是此株内任何一种微生物的特性。同理，描述的任何一株微生物的特性也可代表此株内所有微生物的特性。
根据本发明，优化细菌选自细菌，酵母或真菌。具体而言，曲霉菌属(Aspergillus sp.)，杆状菌属(Bacillus sp.)，短杆菌属(Brevibacteriumsp.)，梭状杆菌属(Clostridium sp.)，棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)，埃希氏菌属(Escherichia sp.)，葡糖酸杆菌属(Gluconobacter sp.)，假单胞菌署(Pseudomonas sp.)，红球菌属(Rhodococcus sp.)，酵母菌(Saccharomyces sp.)，链霉菌属(Streptomyces sp.)，黄单胞菌属(Xanthomonas sp.)及假丝酵母(Candida sp.)。
在一优选实施例中，菌属为埃希氏菌属，具体为大肠杆菌。在另一个实施例中，菌属为棒状杆菌属，具体为谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)。
在另一个实施例中，酵母是酵母菌属，具体为塞里维辛酵母菌(S.cerevisiae)。
为了制备修饰微生物，有利地是将与欲修饰的代谢途径有关或无关的其他基因减弱或缺失，以利于微生物的进化。
为制备修饰微生物，还可使与欲修饰的代谢途径有关或无关的异种基因或非异种基因过度表达，以利于微生物的进化。
基因过度表达可通过将启动子原位更换为强启动子或可诱导的启动子而实现。或可将一个或数个复制的质粒拷贝导入细胞中，在所述质粒上，将被过度表达的基因由适当的启动子调控。
所使用的修饰方法当根据选择的被修饰的代谢途径而定。在下列所述的代谢途径中，所使用的方法将逐一描述。
本领域技术人员熟知修饰微生物基因特性所用的方法。
优选地用同源重组法使基因失活。(达森科与华纳(2000)，利用PCR产物将大肠杆菌K-12染色体基因一步失活，美国国家科学院院刊，976640-6645)。现将此方法原理略述于下将在体外获得的一个直链基因片段导入细胞中；此片段由跨越基因的两侧两个区域和至少一个被选中的位于此二区域之间的基因(通常是个耐抗生素基因)构成。此基因片段代表一个失活基因。经历重组并有基因片段融入的细胞通过将其涂抹在一个选择性培养基上进行筛选。经二次重组后的固有基因已被失活基因取代的细胞随即被筛选出来。可用阴性或阳性筛选系统增加二次重组的检测率来改善本方法。
塞里维辛酵母菌(S.cerevisiae)中基因的失活可优选地利用同源重组来实现。(鲍丁等，核酸研究，21，3329-3330，1993；卧旭等，酵母杂志，10，1793-1808，1994；布拉格门等，酵母杂志，14115-32，1998)。
B.生产用微生物生产用微生物选自以上所列的细菌，酵母及真菌。它可是根据本发明的进化过程所获得的进化微生物，或为生产所欲得的代谢物而优化的微生物，在此微生物内至少导入一个根据本发明的进化基因。
C.微生物的培养根据本发明，‘培养’和‘发酵’互相通用，是指在一合适的含有简单碳源的培养基中培养微生物。
根据本发明，简单碳源是指碳的来源，本领域技术人员可其获得正常生长的微生物，特别是细菌。具体而言，其可为可吸收的糖类，如葡萄糖，半乳糖，蔗糖，乳糖，或糖蜜或其他糖的副产品。葡萄糖是一个特别优选的简单碳源。蔗糖是另一个优选的简单碳源。
根据本发明，本领域技术人员能确定微生物的培养条件。具体而言，细菌可在20℃与55℃的间发酵，优选为25℃与40℃。对谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)而言，30℃左右最佳，对大肠杆菌(E.coli)而言，37℃左右最佳。
发酵通常在发酵罐内进行，罐内装有适合细菌生长的已知的特定的无机培养基，此培养基内至少有一种简单碳源，如有必要亦可加入生成代谢物所需的共同底物。
具体而言，大肠杆菌的无机培养基与M9培养基(安德生，1946，美国国家科学院院刊，32120-128)，M63培养基(米勒，1992；细菌基因学速成大肠杆菌及有关细菌实验手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)，或与由西华等人发展出的培养基(1999，生物化学年鉴，27088-96)成分类似或相同。
类似地，用于谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)的无机培养基与BMCG培养基(赖伯等1989，微生物技术应用32205-210)或与由莱德等人发展出的培养基(2001，分子微生物技术杂志，3573-583)成分类似或相同。
D.代谢途径欲进化的代谢途径常选自氨基酸合成途径、核酸合成途径、脂质合成途径、或糖类代谢途径中挑选。
在本发明第一个优选的实施例中，进化的代谢途径是氨基酸的生物合成途径，具体而言选自蛋氨酸(methionine)、半胱氨酸(cysteine)、苏氨酸(threonine)、赖氨酸(lysine)或异亮氨酸(isoleucine)的氨基酸生物合成途径。
在本发明第二个优选的实施例中，修饰的代谢途径是由NADPH再生NADP的代谢途径。半胱氨酸、羟基丙酸盐与木糖醇的生物合成途径将被用到。
D.I.蛋氨酸生物合成途径例如，本发明可应用在蛋氨酸生物合成途径上(图1)用来生产某种微生物株，特别是细菌，如大肠杆菌或棒状杆菌。此种细菌能产生2-氨基-4-(烷巯基)丁酸。具体如通过一个简单的碳源和硫源，例如甲硫醇(CH3SH)，硫化氢(H2S)或其生理上能被接受的盐，生成L-蛋氨酸2-氨基-4-(甲巯基)丁酸。硫源H2S亦可以硫酸盐形式加入培养基内。本发明还涉及此株微生物与其改进的酶及其编码序列。本发明最后涉及利用培养所述微生物株来生产蛋氨酸。DN-蛋氨酸在工业上是由化学合成的。甲硫醇与丙烯醛作用而产生β-硫丙醛，再与氰化氢作用产生α-羟基-γ-硫代丁腈。经氨水处理及水解后得到蛋氨酸。
所有工业生产DL-蛋氨酸均应用相同的原料丙烯醛，甲硫醇，氰化氢，氨水货碳酸氨。外消旋的蛋氨酸的合成可以以批量或连续的程序进行。
工业生产程序包括在化学合成内另加了一个用由米曲霉菌(Aspergillus oryzas)产生的氨酰基转移酶将DL-蛋氨酸转化为纯L-蛋氨酸的生物催化过程。
第6,379,934号美国专利及第1 055 730号欧洲专利描述了用某株棒状菌经扩增accBC基因来生产氨基酸的方法。其中提到了蛋氨酸。但仅例举了生产L-赖氨酸的方法。
但是利用微生物培养合成含硫氨基酸在可行的工业尺度上而言还是十分困难的。其主要是由于生物合成途径及其调控机制的复杂性。
蛋氨酸代谢在某层次上是被严密调控的(魏士巴克等，1991，分子微生物学，5，1593-1597)●由三磷酸甘油酸盐合成L-丝氨酸及由天冬氨酸和乙酰辅酶A合成L-高丝氨酸的经碳代谢。
●由培养基中存在的乙酰辅酶A与硫酸盐及L-丝氨酸合成L-半胱氨酸的经硫代谢。
●由L-高丝氨酸，半胱氨酸与乙酰辅酶A或琥珀酰辅酶A合成蛋氨酸。(图1)世界专利申请书WO 93/17112描述了在不同生物体内由L-天冬氨酸生物合成蛋氨酸所涉及的各种酶。此专利申请也描述了在用甲硫醇和硫化氢供应硫时，将一些可指导蛋氨酸合成的异种基因导入微生物的方法。
此发明涉及一些微生物株，具体而言如细菌，特别是能产生通式(I)的2-氨基-4-(烷巯基)丁酸的大肠杆菌与棒状杆菌。
R-S-(CH2)2-CHNH2-COOH(I)其中，R是含有1到18碳原子的直链或支链烷基。其可能含有一个或多个羟基取代物，或在其异芳环内含有一至数个氮原子或硫原子的芳基或异芳基。其可能是苯基，吡啶基(pyrolyl)，吡咯基，吡唑基，三唑基，四唑基，噻唑基，或噻吩基。
通过由通式(II)代表的化合物组成的简单碳源与硫源的代谢R’-SH(II)其中，R′是氢原子或是如上所述的R及其生理上能被接受的盐，其微生物中至少有一个编码具有‘蛋氨酸合成酶’的活性的酶的基因。
根据本发明，具修饰的‘蛋氨酸合成酶’活性的酶能将如通式(III)所描述的底物经生物转化而合成如通式(I)所示的2-氨基-4-(烷巯基)丁酸。
R”-O-(CH2)2-CHNH2-COOH(III)其中，R”是酰基，优选是琥珀酰基或乙酰基。
或直接将底物生物转化成如通式(I)所示的酸。
或将底物生物转化成如通式(IV)所示的高半胱氨酸。
HS-(CH2)2-CHNH2-COOH(IV)高半胱氨酸再经合适的酶转化成如通式(I)所示的酸。
与天然酶相比，这些具有‘蛋氨酸合成酶’活性的酶是经过经修饰而得的，因此它们能将如通式(III)所示的底物优选地生物转化成如通式(I)所示的酸，或转化成如通式(IV)所示的高半胱氨酸，以此取代了其他天然酶催化的反应。这种修饰也称突变，主要导致了修饰过的酶对如通式(II)所示的含硫化合物产生比其天然共同底物更大的亲和力。
根据本发明，简单碳源是本领域技术人员为了使微生物，特别是细菌正常生长而选用的任何可应用的碳源。此定义包括任何可吸收的糖类，如葡萄糖，半乳糖，蔗糖，或糖蜜或这些糖的其他副产品。葡萄糖是一个特别优选的简单碳源。蔗糖是另一个优选的简单碳源。
根据本发明，生理上能接受的盐是不影响微生物代谢或生长的通式(I)的任何盐。它可能是一个碱金属盐，如钠盐。
在本发明的优选实施例中，R是具有1到4碳原子的直链或支链烷基，具体而言如甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基及叔丁基，但优选的是甲基。
所得的如通式(I)所示的2-氨基-4-(烷巯基)丁酸优选地是L-蛋氨酸。用如通式(II)所示的简单碳源和硫源经生物转化产生如通式(I)所示的丁酸有以下数个优点-只须一或二个步骤即可由O-酰基-L-高丝氨酸合成如通式(I)所示的酸或蛋氨酸，同时与高半胱氨酸合成及四氢叶酸循环无关。
-通式(II)所示的含硫化合物，如甲硫醇，通常是有毒性的石油化学品，现可将其用作生物合成生产有用氨基酸的原料，以增加其利用价值。
本发明是基于在甲硫醇存在下直接修饰胱硫醚-γ-合成酶(EC4.2.99.9；GenBank AAN83320，或AAA24167)的‘蛋氨酸合成酶’活性。此在蛋氨酸生物合成途径中的酶是受大肠杆菌(图2)和谷氨酸棒杆菌的metB基因所编码。它对许多底物均有活性。(傅雷文与斯劳特，1967，直接由O-琥珀酰-高丝氨酸酶促合成高丝氨酸或蛋氨酸，生物化学与生物物理，132400-405)。
本发明也是基于在甲硫醇存在下直接修饰O-乙酰基-L-高丝氨酸硫化氢解酶(或O-乙酰基-L-高丝氨酸硫化氢解酶，C4.2.99.9)的‘蛋氨酸合成酶’活性。此在蛋氨酸生物合成途径中的酶是受谷氨酸棒杆菌的metB基因(GenBank AF220150)所编码。它对许多底物均有活性。(斯密斯与汤沐森，1969，在无蛋氨酸的脉孢菌变种及其向蛋氨酸转化途径中S-半胱氨酸甲酯与甲硫醇的应用，生物化学与生物物理，184(1)130-8)。
本发明还涉及制备根据本发明的菌株方法，以及此方法在菌株使用在制备通式(I)的2-氨基-4-(烷巯基)丁酸、优选L-蛋氨酸中的应用。
根据本发明，制备菌株的方法包括从原始菌株得到经修饰的菌株。该菌株内至少一处对编码具有‘蛋氨酸合成酶’活性的酶的基因进行的修饰。该修饰过程包括将原始菌株暴露于通式(II)所示的化合物存在的选择压力中。其目的是将该菌种中编码具‘蛋氨酸合成酶’活性的酶的基因进化为相对原始菌种其编码具‘蛋氨酸合成酶’活性的酶的基因被修饰。
在相同培养条件下(在含有适当量如通式(II)所示的含硫化合物的培养基内)，当菌株(A)比原始菌株(I)能产生更多蛋氨酸时，则其‘蛋氨酸合成酶’的活性有所改进。优选用合成的蛋氨酸的数量来评估改善的程度。在一些情况下，可在一无蛋氨酸存在的基础培养基内用菌株(A)相对于菌株(B)的生长率增加程度来观察改善的程度。
本发明还涉及根据本发明的方法筛选出的‘蛋氨酸合成酶’活性改善的菌株，以及至少一个编码由上述和下述内容定义的具有经修饰的蛋氨酸合成酶’活性的酶的基因。
在本发明的第一个实施例中，具改善‘蛋氨酸合成酶’活性的酶可直接将如通式(III)所示的底物转化成如通式(I)所示的酸。在此例中硫源是如通式(II)所示的化合物，其中R′是如上定义的R基。
具改善的蛋氨酸合成酶活性的酶可选自胱硫醚-γ-合成酶或乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶。
在本发明的第二个实施例中，具改善‘蛋氨酸合成酶’活性的酶可将如通式(III)所示的底物转化成如通式(IV)所示的高半胱氨酸。
HS-(CH2)2-CHNH2-COOH(IV)然后高半胱氨酸再经合适的酶转化成如通式(I)所示的酸。在此情况下，硫源是如通式(II)所示的化合物，其中，R′是氢原子，优选是硫化氢。硫源H2S可直接加入培养基中，或由细菌从简单硫源，如硫酸盐产生。
具改善的‘蛋氨酸合成酶’活性的酶优选地选自胱硫醚-γ-合成酶或乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶。
本领域技术人员知道如何依据它们的进化能力来选择其他的具有修饰的‘蛋氨酸合成酶’活性的酶，以便进行上述的修饰的酶促‘蛋氨酸合成酶反应’。具体例子包括由细菌cysK和cysM基因编码的半胱氨酸合成酶A和B。
对本文中所定义的修饰的胱硫醚-γ-合成酶而言，底物有利的是O-乙酰基-L-高丝氨酸或O-琥珀酰-L-高丝氨酸，优选O-琥珀酰-L-高丝氨酸。
对本文中所定义的修饰的乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶而言，底物有利地是O-乙酰基-L-高丝氨酸或O-琥珀酰-L-高丝氨酸，优选为O-乙酰基-L-高丝氨酸。
对此两种酶而言，所谓修饰就是突变。突变后可使如通式(III)所示的底物优选地与如通式(II)所示的化合物，而不与L-半胱氨酸反应发生转化。
酶突变可通过实现根据本发明所示的在含有通式(II)所示的化合物的培养基中采用选择压力培养制备具有改善‘蛋氨酸合成酶’活性的菌株的方法来获得。
此时，具有胱硫醚-γ-合成酶或乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶编码序列的基因可能是●在原始株(I)基因组内能表达并翻译相应的酶的野生型基因。或●包含胱硫醚-γ-合成酶或乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶的编码序列的异种基因可在调控因子控制下可在被导入的原始株(I)内进行表达与翻译。
●使存在于原始株(I)内的野生型基因直接突变，具体地如通过同源重组突变而得到的基因。
●现将胱硫醚-γ-合成酶或乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶编码序列用常规手段直接突变，然后再将其导入原始株(I)，并在调控因子控制下能在原始株(I)中具有表达和翻译能力的基因。
本领域技术人员对这些调控因子十分熟悉。其包括了启动子调节序列或启动子。具体地如强构建启动子。强构建启动子优选地为pTAC-O(SEQ ID No.1)，pLAC-O(SEQ ID No.2)，pTRC-O(SEQ ID No.3)，或pTHLA(SEQ ID No.4)。所有这些都是由lac操纵子缺失而构成的强启动子。
‘原始’或未修饰‘蛋氨酸合成酶’活性的胱硫醚-γ-合成酶有利地选自PFAM，参考号PF01053或COG参考号CPG0626的胱硫醚-γ-合成酶。
胱硫醚-γ-合成酶优选是从大肠杆菌K12的胱硫醚-γ-合成酶。其代号为SEQ ID No.6。与此序列同源的序列具有胱硫醚-γ-合成酶活性。相对SEQ ID No.6氨基酸序列的同源性至少有80％，优选为90％，更优选为95％。
本领域技术人员对鉴定同源序列及同源性百分比都十分熟悉。特别可利用是BLAST程序。例如BLASTP程序可登录其网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/使用。所有默认参数亦可在此网站上查到。
在本发明的一个较优选的实施例中，原始胱硫醚-γ-合成酶在修饰前在其氨基酸序列C-末端(保守区域1)有以下序列X1-X2-X3-L-G-X4-X5-X6-X7-X8-X9其中X1代表A，G，S，优选为AX2代表E，V，P，T，优选为EX3代表S，T，N，优选为SX4代表G，D，A，H，T，优选为GX5代表V，A，T，H，N，优选为VX6代表E，R，K，F，优选为EX7代表S，T，优选为SX8代表L，I，V，A，优选为LX9代表I，V，A，T，优选为I在根据本发明，具有‘蛋氨酸合成酶’活性的修饰胱硫醚-γ-合成酶，在其C-末端(保守区域1)有以下一段氨基酸序列A-E-S-L-G-G-V-E-S原始胱硫醚-γ-合成酶在修饰前在其N-末端(保守区域2)含有以下一段氨基酸序列X10-X11-Y-X12-R-X13-X14-X15-X16-X17-X18其中X10代表H，Y，F，L，K，优选为AX11代表E，D，K，R，V，I，优选为YX12代表S，A，T，P，G，优选为SX13代表I，S，T，R，E，F，W，D，优选为SX14代表S，G，A，I，E，N，K，P，优选为GX15代表N，H，Q，S，优选为NX16代表P，D，L，优选为PX17代表T，M，N，G，S，优选为T
X18代表R，L，V，S，W，E，优选为R氨基酸X1 to X9对应SEQ ID No.6所示的大肠杆菌K12的胱硫醚-γ-合成酶的324-334残基。
氨基酸X10 to X18对应SEQ ID No.6所示的大肠杆菌K12的胱硫醚-γ-合成酶的44-54残基。
在全文中所用的氨基酸位置是参照大肠杆菌K12的胱硫醚-γ-合成酶的序列。本领域技术人员如何利用序列对比工具在其他胱硫醚-γ-合成酶序列中找到所对应的氨基酸。这些工具包括BLAST程序。可登录其网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/使用。所有默认参数亦可在此网站上查到。序列对比可在蛋白质(SEQ ID No.6)和其编码序列上完成，例如SEQ ID No.5所代表的编码序列。
BlastP的进一步搜索功能可用(PHI-BLAST)主旨来简化搜索。主旨[AGS]-[EVPT]-[STN]-L-G-[GDAHT]-[VATHN]-[ERKF]-[ST]-[LIVA]-[IVAT]可用于保守区域1，主旨x(2)-Y-[SATPG]-R-x(2)-[NHQS]-[PDL]-[TMNGS]-[RLVSWE]可用于保守区域2。其中粗体字母代表在那位置上最常出现的氨基酸，x代表任何氨基酸，而在括号内的数字2表示那里有两个未定的氨基酸。
至于序列对比，则可用CLUSTALW程序(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)或MULTALIN程序(http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cei-bin/multalin.pl)。其默认参数均在网站上可寻。
图7显示对不同胱硫醚-γ-合成酶的序列对比。
它们优选地选自以下的胱硫醚-γ-合成酶(CGS)Q9ZMW7 O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂解酶，幽门螺旋杆菌P46807 O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂解酶，麻风分枝杆菌AAO29646 苛养木杆菌Temeculal株(Xylella fastidiosaTemeculal)
NP_638204 野生黄单胞菌野生株.ATCC 33913NP_358970 肺炎链球菌R6NP_126586 O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂解酶，阿比西火球菌NP_373671 金黄色葡萄球菌金黄色亚种N315NP_418374 大肠杆菌K12NP_601979 谷氨酸棒杆菌ATCC 13032NP_343729 O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂解酶，硫磺矿硫化叶菌NP_786043 O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂解酶，植物乳杆菌WCFS1NP_719586 金属离子还原菌MR-1(Shewanellaoneidensis MR-1)CAD30944 天蓝色链霉菌A3(2)NP_696324 双叉杆菌NCC2705NP_457953 沙门氏伤寒杆菌NP_539021 羊布鲁氏杆菌(Brucella melitensis)EAA30199 O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂解酶，真菌脉胞菌BAC61028 副溶血弧菌如上所述的修饰胱硫醚-γ-合成酶优选地表示至少应当在其C末端有一个突变和(或)在其N末端也至少有一个突变。
根据本发明，所谓突变是指在野生型序列中的某个氨基酸被一个不同的氨基酸所取代。
突变优选地包括用一个非极性氨基酸替换与未修饰的酶的半胱氨酸共同底物作用的酸性氨基酸。此非极性氨基酸可能是甘氨酸，丙胺酸，亮胺酸，异亮胺酸，缬胺酸，苯丙胺酸或蛋氨酸残基。
这些氨基酸可由科罗森等所描述的大肠杆菌胱硫醚-γ-合成酶的晶体结构确认。(EMBOJ，Vol.17，No.23，pp 6827-6838，1998)。
在C-末端的突变最好能发生在‘保守区域1’内的酸性氨基酸上。如在残基X2上则更佳。
根据本发明经修饰后具有‘蛋氨酸合成酶’特性的胱硫醚-γ-合成酶有利地在其C-末端有以下的序列为佳X1-X2-X3-L-G-X4-X5-X6-X7-X8-X9其中X1，X3，X4，X5，X6，X7，X8和X9如前所述。
X2代表G，A，L，I，V，F，或M，优选地为A。
在N-末端的突变最好能发生在如上所述的‘保守区域2’内的氨基酸上。如在残基X11和(或)R和(或)X13上为优选。
根据本发明经修饰后具有‘蛋氨酸合成酶’特性的胱硫醚-γ-合成酶最好在其C-末端有以下的序列A-A-S-L-G-G-V-E-S根据本发明经修饰后具有‘蛋氨酸合成酶’特性的胱硫醚-γ-合成酶在其N-末端有以下的序列为佳X10-X11-Y-X12-X19-X13-X14-X15-X16-X17-X18其中X7，X9，X12，X14，X15，X16，X17和X18如前所述，X11如前所述或是一个非极性氨基酸，X13如前所述或是一个非极性氨基酸，X19如前所述或是一个非极性氨基酸，同时至少一个X11，X13和X19的氨基酸是如上所述的非极性氨基酸。
在本发明的一个优选的实施例中，依此方法修饰而具有‘蛋氨酸合成酶’活性的胱硫醚-γ-合成酶就是一个上述的胱硫醚-γ-合成酶。其利用甲硫醇(如通式(II)所示的化合物，其中R是个甲基)将O-琥珀酰L-高丝氨酸直接转化为L-蛋氨酸。
在本发明的一个优选实施例中，具有‘蛋氨酸合成酶’活性的胱硫醚-γ-合成酶含有如SEQ ID No.8所示的氨基酸序列。编码此修饰酶的DNA序列如SEQ ID No.7所示。
本法明亦涉及如上所述的修饰胱硫醚-γ-合成酶及其编码核苷酸序列。特别是其DNA序列。特别是分离的序列，更特别是其由SEQ ID No.7所代表的序列，含有在宿主生物内在修饰的胱硫醚-γ-合成酶表达及转录所需的调控因子控制下的这些核苷酸序列的克隆和(或)表达载体，及接受这些载体转化的宿主生物。
‘原始’或未修饰的的‘蛋氨酸合成酶’活性酰基高丝氨酸硫化氢解酶最好从对应于PFAM PF01053和COG CPG02873的酰基高丝氨酸硫化氢解酶中挑选。
以从以下所列的乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶中挑选为优选NP_785969 O-乙酰基高丝氨酸(硫醇)-裂解酶，植物乳杆菌WCFS1AAN68137 O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶，恶臭假单胞菌KT2440NP_599886 O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶，谷氨酸棒杆菌ATCC 13032NP_712243 乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶，钩端螺旋体黄胆出血型赖株56601BAC46370 O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶，慢性型大豆根瘤菌USDA110AAO57279 O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶，假单胞杆菌丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000NP_284520 O-琥珀酰高丝氨酸 硫化氢解酶[脑膜炎奈瑟菌Z2491AAA83435 O-琥珀酰高丝氨酸 硫化氢解酶(铜假绿单胞菌)在一个优选实施例中，为了修饰蛋氨酸的生物合成途径必须先用基因工程来修饰细菌。此修饰包括必须减弱至少一个基因和可能须要克隆至少一个异种基因。减弱基因使细菌为了生长而修复一条相当的途径。这个经基因工程修饰过的细菌经过培养与筛选，其生长率可在外源性共同底物的存在或不存在时而加快。
根据本发明构建菌株的方法包括获得原始菌株，将该菌株修饰使其在编码具有“蛋氨酸合成酶”活性的酶(如大肠杆菌MetE)或具有“高半胱氨酸合成酶”活性的酶(如大肠杆菌MetC)的基因上具有至少一处修饰。在构造新的菌株过程中，将所述原始菌株在前述含硫培养基中承受选择压力至少使其中一个基因产生突变(如大肠杆菌MetE)而使进化株恢复蛋氨酸合成酶或高半胱氨酸合成酶活性。这活性的恢复与修饰的倒转无关。
本发明又涉及了一株具有改进“蛋氨酸合成酶”活性的菌种，其中至少有一个涉及传统蛋氨酸生物合成途径的内源基因被失活。
在优选实施例中，该菌株至少有一个失活的内源基因。内源基因可从下列基因中选择metB，metJ，metC，metE，或metH。
在一个优选实施例中，所述修饰菌株是株具有改进“蛋氨酸合成酶”活性的菌种，例如大肠杆菌。先将大肠杆菌野生株的蛋氨酸合成酶活性(受metE基因编码)失活，在将此菌株在一个不含蛋氨酸，S-腺苷甲硫氨酸，高半胱氨酸及胱硫醚，但含甲硫醇(外源性共同底物)或其某种盐化合物的中培养。同时筛选一株进化微生物。其胱硫醚-γ-合成酶在甲硫醇存在下具有很强的蛋氨酸合成酶活性。强到能将失活的活性恢复。在这一个实施例中，有必要指出用来筛选进化微生物的培养基与用来生长原始微生物(未经修饰的微生物)的培养基完全相同。只是增加了一个共同底物(烷基硫醇)。在某特定的实施例中，根据本发明的被进化的微生物是一株大肠杆菌，更优选是大肠杆菌K183株。此株曾在2003年4月2日依布达佩斯公约在CNCM取得注册号码I-3005。(地址为25 rue du Docteur Roux，75724 Paris Cedex 15，France)此株含有表达修饰过的胱硫醚-γ-合成酶的基因，藏有突变E325A的酶及失活的metE基因。
在本发明的某应用特例中，亦可采用有更多缺失基因的菌种，如metC和/或metH和/或metJ缺失，来获取具有改善“蛋氨酸合成酶”性能的菌株。
在第二个相当的优选实施例中，所述原始菌株，特别是大肠杆菌的修饰包括先将胱硫醚-γ-合成酶活性(由大肠杆菌的metC基因编码)失活，再将所述进化菌株在一个不含蛋氨酸，S-腺苷甲硫氨酸，高半胱氨酸及胱硫醚的特定的培养基中培养，然后在内源硫化氢存在情况下选择具有很高的胱硫醚-γ-合成酶的高半胱氨酸合成酶活性的进化微生物。其活性高到能取代失活前的程度。在这一个优选实施例中，有必要指出用来筛选进化微生物的培养基与用来生长原始微生物(未经修饰的微生物)的培养基完全相同。在此例中某一特例下，可将NaSH加入培养基内。在另一个特别应用下，可采用另外在metH和/或metJ中具有至少一处突变的菌株。
在本发明的第三个相当的实施例中，所述原始株，特别大肠杆菌的失活包括将野生型琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶活性(由metB基因编码)和蛋氨酸合成酶活性(受大肠杆菌的metE基因编码)失活。然后将乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶(由谷氨酸棒状杆菌的metY基因编码)转入此菌株内。再将得到的所述修饰菌株在一个不含蛋氨酸，S-腺苷甲硫氨酸，高半胱氨酸及胱硫醚，但含甲基硫醇钠的特定的培养基中培养。其目的在筛选出一株在甲基硫醇钠存在下其乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶(MetY)具有很高的蛋氨酸合成酶活性的进化株。其活性高到能取代失活前的蛋氨酸合成酶活性。在本发明的这一个实施例中，有必要指出用来筛选进化微生物的培养基与用来生长原始微生物(未经修饰的微生物)的培养基完全相同。仅加了一个共同底物(甲基硫醇)。在此例中某一特例中，可采用另外至少在metH和/或metJ和/或metC基因中具有缺失的菌株。
在JP 2000157267-A/3中建议将metJ突变来产生更多的蛋氨酸(参见GenBank E35587)。此基因编码的蛋白质能抑制如metB，E，L，J和R基因(在鼠伤寒沙门氏菌中)。这类失活及修饰步骤能减少所受蛋氨酸负反馈的影响。
基因metC(GenBank M12858)编码胱硫醚-β-裂解酶(EC 4.4.1.8)。基因metE(GenBank AE000458)和基因metH(GenBank J04975)编码蛋氨酸合成酶(EC 2.1.1.13)。蛋氨酸是细胞存活所需的重要的氨基酸。失活一个或多个这些基因则会使蛋氨酸生物合成途径受到抑制。
参考GenBank所中提供的这些基因资料，本领域技术人员可在大肠杆菌外的其他菌种中找到与这些基因相当的基因。这类常规工作可有利地利用保守序列而轻易地完成。保守序列可从为他种微生物而合成的基因决定。通过设计简并探针在其它生物体中克隆相应的基因。本领域技术人员熟知这些常规分子生物化学技术。同时这类技术在如萨姆布鲁克等著(分子克隆实验指南，1989，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)的书内均有描述。
根据本发明的具有一个改进过的‘蛋氨酸合成酶’活性的酶的上述修饰菌株优选地至少有一处下列的基因失活metE和(或)metH，和(或)metC，和(或)metB。
当用以上所述的具有改进性‘蛋氨酸合成酶’活性的酶来将如通式(III)所示的底物直接经由生物转化而变成如通式(I)所示的酸类时，根据本发明的菌株至少在下列基因中有一处失活metE和(或)metH和(或)metB。优选地在metE基因中有一处失活。
当用以上所述的具有改进性‘蛋氨酸合成酶’活性的酶来将如通式(III)所示的底物直接经由生物转化而变成如通式(IV)所示的高半胱氨酸，HS-(CH2)2-CHNH2-COOH(IV)而此产物又能利用一个适当的酶而转化成如通式(I)所示的酸类时，根据本发明的菌株至少在下列基因中的一处失活metC和(或)metB。同时也可能失活metE与(或)内源性metH基因。此时，与metE和(或)metH基因相关的甲基化酶活性可利用导入编码一个具有相同活性的酶基因而恢复。这酶可选自和(或)修饰以增加如通式(I)所示的氨基酸合成产量。
在一实施例中，此菌株另可具有由metA基因所控制的高丝氨酸O-乙酰转移酶活性的修饰，使其具有高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性(EC2.3.1.46)或高丝氨酸O-乙酰转移酶活性(EC 2.3.1.11)。
在某特别实施例中，可将编码高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性的大肠杆菌的metA基因(Genbank AAN83396)替换或修饰。使其获得高丝氨酸O-乙酰转移酶活性。本领域技术人员知道此活性是由谷氨酸棒状杆菌的metA基因(Genbank AF052652)所编码的。用来将大肠杆菌的metA基因替换成谷氨酸棒状杆菌的metA基因的方法，或将大肠杆菌的metA基因修饰而将高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性转换成高丝氨酸O-乙酰转移酶活性的技术亦为本领域技术人员所熟知。
同理亦可替换或修饰用来编码高丝氨酸O-乙酰转移酶活性的谷氨酸棒状杆菌的metA基因，以取得高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性。
所有以上所述的菌株修饰方式均可根据本发明所将菌株暴露于选择压力下达成。或者可采用根据本发明的方法筛选一株略受修饰的菌株。在如通式(II)所示的化合物存在下，特别是在甲硫醇存在下，选出一株具有‘蛋氨酸合成酶’活性的菌株。然后再进行其他所述的修饰以增强规避正常蛋氨酸合成途径的能力。
本领域技术人员深知如何修饰微生物的遗传特性。将某基因的启动子原位替换成一个强表现或诱导启动子可使此基因过度表达。或可将一个复制质粒(单拷贝或多拷贝)转入细胞内。在此细胞内被过度表示的基因受到一个适当启动子控制。
基因失活优选采用同源重组法。其原理可大致描述如下将一个直链片段导入细胞中。此片段在体外获得，由跨越某基因的两侧的两个区域和位于此二区域间的至少一个被选中的基因(通常是个耐抗生素基因)构成。这直链片段代表一个失活基因。经过重组并整合了导入片段的细胞在一选择性培养基上筛选。经过两次重组的细胞被筛选出来。其中的野生型基因被失活基因所取代。这方法可用正负双向选择法加速其检测双重重组的能力。
在一优选实施例中，所用的菌株是大肠杆菌。
在另一实施例中，所用的菌株是一株棒状杆菌，特别是谷氨酸棒状杆菌。
在本发明的一优选实施例中，所用的菌株是于2003年4月2日向CNCM(法国IDA)注册的大肠杆菌K183(注册号码I-3005)。此菌株含有一个能表达修饰的胱硫醚-γ-合成酶的基因，其具前述的E325A突变及失活的metE基因。
根据本发明的微生物包含胱硫醚-γ-合成酶和(或)酰化高丝氨酸硫化氢解酶。优选由筛选与进化来挑选和改善此类微生物。这也是本发明的目的的一。根据本发明的菌株也可经基因工程修饰(也就是说至少一个内源性基因可被失活，突变和(或)过度激活)。这类修饰可在筛选前或筛选后进行。
在如通式(II)所示的化合物存在下，特别是甲硫醇存在下，为了要加快生产蛋氨酸的菌株的筛选及进化，采取了下述的步骤。此方法适用于甲硫醇。但本领域技术人员知道如何将它改用在任何如通式(II)所示的化合物上，特别是硫化氢。
a.将感兴趣的底物的生物合成与微生物生长结合而使底物生产变成微生物生长的必要条件。
一种做法是扰乱编码可将高半胱氨酸转化成蛋氨酸的蛋氨酸合成酶的metE基因。此株则成为蛋氨酸营养缺陷型的株。
为了在一个含有简单碳源和甲硫醇或甲基硫醇钠的基础培养基中生存，微生物优选由O-酰基L-高丝氨酸及甲硫醇或甲基硫醇钠合成L-蛋氨酸的途径。计算机模拟显示在此情况下有可能理论上将蛋氨酸产量加倍(表1)。

表1在固定生物质产量下(连续培养)，用大肠杆菌在(a)葡萄糖中和在(b)葡萄糖与甲硫醇中发酵生产蛋氨酸的最大理论产量(蛋氨酸质量/葡萄糖质量)可是，除L-蛋氨酸外，当欲生产其他2-氨基-4-(烷巯基)丁酸时，培养基须加入蛋氨酸才能使微生物生长。
b.增强主要生物合成途径的抑制调控，特别是酶与基因的复反馈，编码抑制基因的metJ基因可被抑制。同时，由metA基因编码的高丝氨酸转琥珀酰酶受到蛋氨酸和S-腺苷甲硫氨酸向下调控(泰勒等，1966，生物化学杂志，2413641-3642)。当然最好将此酶由一个对负反馈不敏感的酶所取代。(查德等，1970，遗传微生物学杂志.63121-131)。
本发明的另一目的是找寻一个供筛选和确认用的测试方法来寻获一株能利用烷基硫醇或H2S，特别是甲硫醇的代谢作用而产生2-氨基-4-(烷巯基)丁酸，特别是L-蛋氨酸的微生物。
本发明能鉴定某菌株的基因组曾经突变而具有摄取如通式(II)所示的化合物的能力从而产生如通式(I)所示的酸类。这样的修饰诱导了‘蛋氨酸合成酶’活性的增强。从简单碳源和如通式(II)所示的化合物中，可加速这种能生产蛋氨酸的菌株的生长。
本发明的另一目的是筛选一株原始细菌株的方法，其可经基因工程修饰具有编码胱硫醚-γ-合成酶或酰基高丝氨酸硫化氢解酶的基因。此菌种可将的修饰成一株能生产如通式(I)所示的氨基酸的菌种，特别是生产L-蛋氨酸的菌种。同时在如通式(II)的含硫化合物存在下，修饰能诱导‘蛋氨酸合成酶’活性的酶的编码基因，此修饰是通过将此菌株在如通式(II)所示的化合物存在下暴露于选择压力而使菌株向胱硫醚-γ-合成酶编码基因或酰基高丝氨酸硫化氢解酶进化。此进化包括了一个突变，此突变能使此菌株能够优选地直接将如通式(III)所示的底物转化成如通式(I)所示的氨基酸或如通式(IV)所示的高半胱氨酸。
此原始菌株可存在某种缺失和(或)过度激活，特别是将强表现的构成的启动子导入至少一个内源基因内。
本发明另涉及一个修饰菌株。其胱硫醚-γ-合成酶和(或)酰基高丝氨酸硫化氢解酶的编码基因经基因工程修饰而使此酶的‘蛋氨酸合成酶’活性在如通式(II)所示的化合物存在下有所增强，特别是在甲硫醇的存在下。如上所述，此类菌种可能经过至少另一种基因修饰(例如失活，突变或过度表达其内源基因)。
此种菌株能优选地由本发明所示的方法取得。特别是确实能用本发明所示的方法取得。
本发明另涉及一种制备如通式(I)所示的2-氨基-4-(烷巯基)丁酸的方法。其通过将一株具有改进‘蛋氨酸合成酶’活性的微生物在一个含如通式(II)所示含硫化合物的简单碳源培养基中培养。如通式(I)所示的氨基酸以蛋氨酸为优选，更优选为L-蛋氨酸。如通式(II)所示的含硫化合物是甲硫醇或H2S。
根据本发明，‘培养’与‘发酵’乃通用词。是指在一个适合的含简单碳源的培养基中使菌种生长。
本发明所涉及的微生物培养(发酵)条件可由本领域技术人员设定。特别是细菌可在20℃至55℃的间培养，但以在25℃至40℃为优选。对谷氨酸棒状杆菌而言30℃更佳，对大肠杆菌而言37℃为最佳。
发酵在发酵罐内经进行。利用一个适合细菌的矿物质培养基。此培养基至少含有一种简单碳源及如通式(II)所示的含硫化合物。
特别是大肠杆菌用的矿物质培养基成分可与M9培养基(安德生，1946，美国国家科学院院刊，32120-128)或M63培养基(米勒，1992；细菌基因学速成大肠杆菌及有关细菌实验手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)，或由西华等人研发出的培养基(1999，生物化学年鉴，27088-96)成分类似或相同。
同理，谷氨酸棒状杆菌用的矿物质培养基可与BMCG培养基(赖伯等1989，微生物技术应用32205-210)或与由莱德等人研发出的培养基(2001，分子微生物技术杂志，3573-583)的成分类似或相同。
培养基可适量填补任何营养缺陷成分。培养基含适当浓度的简单碳源以供微生物培养及生产所需。另含适当浓度的如通式(II)所示的硫化物使菌株进化及选择的生产方式。
发酵后，利用传统方法将如通式(I)所示的氨基酸收回。如有必要，则进行纯化。
将如通式(I)所示的氨基酸从培养基中回收及纯化的方法对本领域技术人员是非常熟悉的。
本发明另涉及一种制备如通式(I)所示的2-氨基-4-(烷巯基)丁酸的方法。在此方法中将如通式(III)所示的底物R”-O-(CH2)2-CHNH2-COOH(III)其中R”代表一个酰基，以琥珀酰基或乙酰基为优选，与一个具有改进‘蛋氨酸合成酶’活性的酶在一个适当的含如通式(II)所示的含硫反应培养基中产生反应。
此适当的反应培养基为本领域技术人员所周知的普通的酶反应培养基。特别是一个水基培养基，其中酶与底物均溶解或悬浮在培养基中。反应所须的条件亦是本领域技术人员所周知。特别要注意防止任何酶的实质的变性。
在本发明的优选实施例中，这具有改进‘蛋氨酸合成酶’活性的酶存在于一个失活的细菌中，或在细胞提取物中。、在另一个某优选实施例中，这具有改进‘蛋氨酸合成酶’活性的酶是个纯化过的酶。
D.II.半胱氨酶生物合成途径本发明亦涉及由发酵微生物来从事生物转化及生产氨基酸的领域。它涉及一个筛选和直接进化微生物的方法，可用来鉴定经基因工程修饰使其所具有的“修饰的半胱氨酸合成酶”活性的酶，具体如一种修饰的O-酰基-高丝氨酸硫化氢解酶的菌株。这种菌株能产生L-半胱氨酸或与简单碳源代谢而产生其他氨基酸衍生物。本发明亦涉及此类微生物菌株及利用培养这类微生物菌株来生产L-半胱氨酸，或氨基酸衍生物的方法。
半胱氨酸可由不同方法及不同原料生产。向阳化工公司(Sun-Orient Chemical Co.，Ltd)在HCl存在下从水解的毛发中提取L-半胱氨酸。然后由电解法将L-半胱氨酸转化成氢氧化半胱氨酸。
DL-氢氧化半胱氨酸可由Strecker法生产(在氨水，HCN和巯基醛中合L-半胱氨酸)。
在Bucherer-Berg反应中，将乙缩氯醛，HCN，碳酸铵和硫化钠混合亦可产生L-半胱氨酸。这种L-半胱氨酸是以盐酸盐结晶方式存在于盐酸中。
用酶促反应或用色氨酸合成酶来催化置于β位置的丙氨酸与硫化物的反应来生产半胱氨酸的方法，已在GB2 174 390与EP0 272 365中有所描述。相似地，用微生物发酵来生产半胱氨酸的方法，包括优化微生物分泌合成的半胱氨酸的方法，将cysB基因过度表达来优化H2S产量的方法，及利用对半胱氨酸反馈抑制不敏感的丝胺酸乙酰转移酶的方法，分别在在专利申请EP 0 885 962与WO01/27 307及WO97/15 673中描述。
例如，本发明亦可应用在供应进化微生物的半胱氨酸生物途径(图4)使用。特别是提供能产生如通式(V)所示的2-氨基-4-(烷巯基)丙酸的细菌，例如大肠杆菌与棒状杆菌。
R-S-CH2-CHNH2-COOH(V)其中R是如上定义的通式(I)的半族。
经含如通式(II)所示的硫化物的简单碳源培养基产生的代谢R’-SH(II)
此菌种至少含有一个具有‘进化半胱氨酸合成酶’活性的突变酶的编码基因。
根据本发明，通式(I)表示的‘生理上能接受的盐’是一个不影响代谢或微生物生长的化合物。特别是一个碱金属盐，如钠盐。
在本发明的优选实施例中，R是具有1到4碳原子的直链或支链烷基，具体地选自甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基及叔丁基，优选为甲基。
在如通式(V)所示的2-氨基-4-(烷巯基)丙酸中以L-半胱氨酸为优选。
根据本发明，具有进化的‘半胱氨酸合成酶’活性的酶可以是任何参与如通式(V)所示的氨基酸，特别是L-半胱氨酸，的生物合成的突变酶。其基本活性是能直接将乙酰丝氨酸，优选是O-乙酰-L-丝氨酸，在如通式(II)所示的硫化物中转化产成如通式(V)所示的氨基酸。其在未经突变前，‘半胱氨酸合成酶’活性并非其基本活性。参与半胱氨酸生物转化的天然酶，如cysK与cysM所编码的半胱氨酸合成酶A与B，虽能直接将O-乙酰-L-丝氨酸(乙酰丝氨酸)在硫化氢存在下转化成L-半胱氨酸，但依此定义将被排除在外。
‘原始’未突变酶优选为在H2S存在下催化硫化氢解反应者，优选具有O-酰基-L-高丝氨酸硫化氢解酶活性者。
具有O-酰基-L-高丝氨酸硫化氢解酶活性的‘原始’酶最好从列于PFAM PF01053和COG COG2873的中的O-酰基-L-高丝氨酸硫化氢解酶中挑选。
优选从下列具有酰基高丝氨酸中挑选NP_785969 O-乙酰高丝氨酸(硫醇)-裂解酶，植物乳杆菌WCFS1AAN68137 O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶，恶臭假单胞菌KT2440NP_599886 O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶，谷氨酸棒杆菌ATCC 13032NP_712243 乙酰高丝氨酸硫化氢解酶，钩端螺旋体黄胆出血型赖株56601
BAC46370 O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶，慢性型大豆根瘤菌USDA110AAO57279 O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶，假单胞杆菌丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000NP_284520 O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶，[脑膜炎奈瑟菌Z2491AAA83435 O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶，(铜假绿单胞菌)更优选地，O-酰基-L-高丝氨酸硫化氢解酶选自由棒状杆菌metY基因，特别是谷氨酸棒杆菌metY基因(Genbank AF220150)，编码的O-酰基-L-高丝氨酸硫化氢解酶，选自具有相同的O-酰基-L-高丝氨酸硫化氢解酶活性的同源的酶，至少与被谷氨酸棒杆菌metY基因(Genbank AF220150)编码的O-酰基-L-高丝氨酸硫化氢解酶有80％序列同源性，优选至少85％同源性，更优选至少90％同源性。
本发明是基于以下的事实，在可控情况下修饰酰基高丝氨酸硫化氢解酶对底物的特异性，使其能优先使用乙酰丝氨酸。本发明还是基于在可控情况下能修饰一个底物对一个未经修饰的酶特异性而使其丛具有酰基高丝氨酸硫化氢解酶活性进化到具有半胱氨酸合成酶活性。
在一实施例中，未经修饰的微生物不具有天然O-酰基-L-高丝氨酸硫化氢解酶活性，或不具有编码此酶的metY基因同源的基因。
根据本发明，菌株可用基因工程法通过失活，突变和(或)过度表达来修饰至少一个内源基因。由此而允许其向新的代谢途径进化。特别是根据本发明用基因工程将微生物的cysK和(或)cysM基因抑制。此二基因所编码的蛋白质分别具备半胱氨酸合成酶A及半胱氨酸合成酶B活性。以抑制cysK与cysM基因为优选。
基因cysK(图4)编码半胱氨酸合成酶A(GenBank NP_416909)，基因cysM编码半胱氨酸合成酶B(GenBank NP_416916)。将此二基因失活会造成半胱氨酸生物合途径的关闭。而造成该菌株半胱氨酸的营养缺陷。
在此修饰后的细菌内导入一个酶的编码基因。此酶能在H2S存在下催化如以上所述的硫化氢解反应。不同于其它酶，其主要活性是半胱氨酸合成酶活性(又称为O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶)。特别是一个编码O-酰基-L-高丝氨酸硫化氢解酶的基因，例如棒状杆菌的基因，更特别是谷氨酸棒杆菌的metY基因(Genbank AF220150)。
一个用来编码在H2S存在下能催化硫化氢解反应的酶的基因可用本领域技术人员所周知的直接导入法或复制质粒法转入细菌中。
经修饰后的菌株优选以筛选与进化的方法来筛选与改进。这也是本发明的目的之一。该方法能使酰基高丝氨酸硫化氢解酶活性进化成半胱氨酸合成酶活性，从而恢复生产半胱氨酸的能力。
当经过基因工程修饰与进化后的菌株(E)在含作为简单碳源的葡萄糖的基础培养基内的生长率与一株仅经修饰的菌株(M)在此培养基中的生长率相当时，则可认已完成将酰基高丝氨酸硫化氢解酶活性转化为‘进化的半胱氨酸合成酶’活性的转换。在一特别实施例中，当被修饰的O-酰基-L-高丝氨酸硫化氢解酶蛋白所具有的半胱氨酸合成酶活性比其原有的活性增加10％时，则认为将酰基高丝氨酸硫化氢解酶活性转化为‘进化的半胱氨酸合成酶’活性的转换已告完成。在某些例子中，可看到菌株E的生长率比菌株M的生长率高。最后，在最初不含任何半胱氨酸及相当的培养情况下，当菌株E所生产的半胱氨酸不少于菌株M所生产的半胱氨酸时，则可认为将酰基高丝氨酸硫化氢解酶活性转化为‘进化的半胱氨酸合成酶’活性的转换已告完成。
这类菌种可用基因工程法修饰。将至少一个内源基因失活，突变和(或)过度表达。这修饰过程可在修饰基因进化前或后进行。特别是可根据本发明可经基因工程手段修饰微生物来抑制其半胱氨酸合成酶A，半胱氨酸合成酶B，及胱硫醚-γ-合成酶的活性。以将基因cysK与cysM抑制为优选。基因cysK编码半胱氨酸合成酶A(GenBankNP_416909)，基因cysM编码半胱氨酸合成酶B(GenbankNP_416916)。将此二基因失活可抑制半胱氨酸生物合成途径，进而使此菌株发生半胱氨酸的营养缺陷。如此可筛选将酰基高丝氨酸硫化氢解酶活性修饰成半胱氨酸合成酶活性而恢复半胱氨酸合成的菌种。
如有必要，可缺失用来编码胱硫醚-γ-合成酶活性的基因。
在一实施例中，可将菌株中编码丝氨酸-O酰基转移酶的基因cysE(图4)修饰，使其对半胱氨酸的反馈抑制不敏感。
在另一实施例中，可将菌株中的cysB基因过度表达，进而解除对H2S硫同化途径的调控。
在生产如通式(V)所示的氨基酸时，优选是L-半胱氨酸时，最好能过度表达编码乙酰-CoA合成酶的基因，例如同时过度表达acs基因(EC6.2.1.1，入藏号码AF000480)与如前所定义用来编码‘改进的半胱氨酸合成酶’活性的酶的基因(图4)。
同时可将编码乙酸激酶和(或)磷酸转乙酰酶的基因减弱或缺失。特别是分别用来编码乙酸激酶(EC 2.7.2.1)与磷酸转乙酰酶(EC 2.3.1.8)的ack和pta基因(入藏号码AE000318andAE000319)。这类基因减弱/缺失优选与过度表达编码乙酰-CoA合成酶的基因同时进行。
所有前述的对修饰株所作的改进措施可在开始metY基因进化的前实施。亦可在metY基因进化后实施。但缺失cysK和(或)cysM基因除外。此项工作必须在修饰菌株生长及进化前实施。
本发明又涉及一个制备具有如上所定义的‘进化半胱氨酸合成酶活性’的菌株的方法。此菌株这方法包括在一个适当的简单碳源培养基中生长一株菌种。这株细菌在H2S存在下具有能催化硫化氢解作用的能力。但依定义其本性活性并非‘半胱氨酸合成酶’活性。其目的是在使其酶编码的基因向着能编码‘进化半胱氨酸合成酶活性’的基因进化。
为加速在H2S存在下能催化硫化氢解反应的酶的编码基因的筛选与直接进化，可采取下列措施a.将半胱氨酸的生物合成与微生物生长结合使产生半胱氨酸成为优良生长微生物的必要条件。
为抑制所有天然半胱氨酸合成途径，基因cysK与cysM，加上基因metB与胱硫醚-γ-合成酶的编码(如枯草杆菌的yrhB基因)可能被缺失。如此，这类菌种变成半胱氨酸的营养缺陷株。
为能在一个含简单碳源的基础培养基中生存，此微生物必须优化其O-酰基-L-高丝氨酸硫化氢解酶的半胱氨酸合成酶的活性。从而重新建立一个由乙酰丝氨酸与H2S起始的半胱氨酸合成途径。当metB基因缺失时，必须在培养基中补充蛋氨酸。
b.抑制调控机制，特别是酶与基因水平上的反馈抑制，以增强主要生物合成途径。
可过度表达编码同化硫途径的激活蛋白的基因cysB gene来优化H2S的产量(WO01/27307)。另外由cysE基因编码的丝氨酸乙酰转化酶的被证明受半胱氨酸反馈所抑制。因此最好将此酶替换成一个对反馈抑制不敏感的酶(WO97/15673；WO 02/061106)，或可将其过度表达(WO 02/29029)。
本发明亦涉及一个生产半胱氨酸的方法。此法将一株如上文中所定义的具有‘进化半胱氨酸合成酶’活性的微生物在一个如上所定义的合适的含简单碳源的培养基内培养。
发酵条件属于本领域技术人员的范畴。发酵是在发酵罐内进行。包括一种适合所要培养的细菌的无机培养基。此培养基含一个碳源。
培养基可弥补因缺失cysK和(或)cysM基因而引起的营养缺陷。培养基含一种简单碳源。其浓度由生长方式与生产方式而定。并含有如通式(II)所示的硫化物。其浓由菌株即进化程度与生产方式调节。
发酵后，以传统方法收回半胱氨酸。如有必要可将其纯化。
本领域技术人员对在培养基中的半胱氨酸的回收及纯化的方法非常熟悉。
本发明又涉及一种生产如通式(V)所示的氨基酸的方法。其特点是将乙酰丝氨酸与前文所定义的具有‘进化半胱氨酸合成酶’活性的酶在一个合适的并含有如通式(II)所示的硫化物的反应培养基中反应。
这一个合适的反应培养基是个本领域技术人员所周知的普通酶培养基。特别是一个水基培养基，其中底物与酶均溶解或悬浮在内。此反应条件亦为本领域技术人员所周知。特别要注意避免让酶发生变性。
在一优选实施例中，这具有‘进化半胱氨酸合成酶’活性的酶存在于失活的细菌中，或在细胞提取物的内。
D.III.NADPH-依赖性途径的进化.
在另一优选实施例中，一个具NADPH依赖性的途径可被进化。为达到此目的，必须修饰原始菌株使NADPH生产率大于将NADPH氧化成NADP+(或可写为NADA)的速率。在某种选定的特定的培养基中，此种菌株不会生长。
本发明涉及修饰菌种使NADPH能在其进化的代谢途径中被消耗。根据本发明的这类菌种可用在消耗NADPH的生物转化程序中。
本发明更涉及在合适的培养基中通过与生长有关的生物转化生产化工产品的方法。同时这类菌种具有生产以上所述的化工产品的基因特性。
生物转化过程的研发使我们能低价生产化工产品品。同时亦可将工业或农业副产品善加利用。
利用体内生物转化生产感性趣的化工产品可依以下两种方式进行-第一，发酵，发酵可由一个简单碳源生产化工产品(例如依WO0102547所描述可在葡萄糖中利用谷氨酸棒状杆菌生产赖氨酸)。
-第二，利用微生物将一个非简单碳源底物生物转化而生产化合物。此底物仅仅用来产生所需的生物质量的感兴趣的化工产品(例如WO0012745所描述的R-哌啶衍生物生产法与WO0068397描述的塔格糖生产法)。
一个生物转化程序的改善牵涉许多因素，例如温度，氧饱和度，培养基的成分，回收方式等等。也可以将微生物修饰使化工产品的产量或分泌量增加。
对发酵而言，或许可将生物合成途径优化。例如将基因调控机制修饰，或利用基因修饰而改善酶的特性，或优化共同底物的再生。
对生物转化而言，或许可经改善酶动力学特性来减低副产品的生成及优化生物转化步骤中共同底物的再生。
在所有生物转化程涉及的共同底物中，NADPH是非常重要的。特别在生产氨基酸(如精氨酸，脯胺酸，异亮氨酸，蛋氨酸，或赖氨酸)，维生素(例如泛酸盐，维生素K1，或维生素E)，芳香族化合物(例如WO9401564)，)，或其他高增值的化工产品。
本发明涉及产生消耗NADPA的酶进化和代谢途径的修饰微生物。
为了创造此类微生物，本发明人选择采用了能使其NADPH生产率增加和NADPH氧化成NADP+速率减低的修饰。这类经修饰后的微生物可用来产生消耗NADPH的进化酶或代谢途径。这类细菌则可被恰如其分地用在生物转化过程中以生产来源于NADPH-依赖性的合成途径的化工商品。
用大肠杆菌优化NADPH的过程叙述如下。同样原理也适用于对其他在厌氧状况下培养的微生物。
根据本发明修饰后菌株缺失udhA和/或qor基因。在一优选实施例中，udhA与qor基因同时缺失。
在某一特别的实施例中，根据本发明修饰后菌株还缺失了pgi或pfkA和/或pfkB基因。
以上列出的基因对本领域技术人员是非常熟悉的。同时在科学文献中亦有描述。特别是在大肠杆菌中的基因大肠杆菌基因及参考文献udhAX66026可溶性吡啶转氢酶；qorL02312醌氧化还原酶；pgiX15196磷酸葡萄糖异构酶(EC 5.3.1.9)；pfkAX02519磷酸果糖激酶-1；pfkBK02500磷酸果糖激酶-2。
本发明另一个目的是一株用本文所述方法修饰过而能产生NADPH的进化微生物。此株具有一个或多个编码具NADPH-依赖性酶的基因。这些酶参与和生产感兴趣的化工产品的生物转化过程。同时这类酶与一个或数个筛选标记基因会引起进化。
根据本发明，对修饰株而言，这类基因可能是天然的。或可经一个适当的载体而转入优化的菌株内。可将此类基因直接整合到微生物的基因组中，或利用一个复制载体。此载体具有一或多个参与和生产所述化工产品的生物转化过程的酶的编码基因，或所述的筛选标记基因。
这些基因包含了一个编码参与和生产感兴趣的化工产品的生物转化过程的酶的核酸序列，和/或一个筛选标记的核酸序列。此编码序列被连接到一个被选来参与生物转化的原核细胞和/或原核细胞的高效率启动子序列。此载体(或质粒)可在大肠杆菌与另一株微生物间穿梭。
本发明另涉及如本文所述的一种生产修饰微生物的方法。其中可将udhA和/或qor基因缺失。如令有必要，可再将pgi或pfkA和/或pfkB基因缺失。
在一优选实施例中，制备菌株的方法还包括利用至少一个合适的载体转化到修饰过的菌株中。此载体具有一或数个编码一个或数个参与和生产感兴趣的化工产品的生物转化过程同时能消耗NADPH的酶的基因，和一或数个筛选标记基因。这个载体能使这些具备基因具备复制能力，或能将这些基因整合到修饰菌株的染色体内。根据本发明，通过载体的转化可在修饰过的菌株内，也可在修饰前进行。
能生产NADPH的菌株可经分子生物学法修饰取得。
本发明的另一方面涉及利用这类修饰株将具NADPH-依赖性的酶进化来改善其动力学特性，或扩展或缩小其底物特异性。其最终目的是产生一个新的代谢途径和/或改善生物转化的产出率。本发明另涉及在消耗NADPH的生物转化反应中使用这类修饰株或进化株。而使生物转化率高于使用未修饰株和/或未进化株的产出率。
本发明又涉及利用一个消耗NADPH的过程来生产感兴趣的化工产品的方法，其特征是此方法具有以下几个步骤a)根据本发明的方法在一适当的培养基中培养进化株。此培养基有助于此菌株的生长，并具有除了NADPH以外的发酵或生物转化反应所需要的底物。
b)由培养基抽取感兴趣的化工产品，如有必要并将产品纯化。
优选的化工产品选自半胱氨酸，蛋氨酸，3-羟基丙酸，氢化可的松，木糖醇和甘油。
为进行生物转化反应，此方法包括在合适的培养基中添加被转化的底物。
在步骤b)中所述的培养基至少包括一种可摄取的碳水化合物。此碳水化合物可从下列可直接摄取的糖类中挑选如葡萄糖，半乳糖，蔗糖，乳糖，糖蜜或这些糖的副产品。在一优选实施例中，简单碳源是葡萄糖。在另一优选实施例中，简单碳源是蔗糖。此培养基中可含一或数种有利于生产感兴趣的化工产品的底物(例如氨基酸，维生素，矿物盐等)。
本发明可由下列案例阐明。但其适用范畴不受这些案例所约束。
E.


图1在细菌内由高丝氨酸合成蛋氨酸图2根据本发明利用大肠杆菌合成蛋氨酸的图解；同理，此方法可移转到其他微生物上，包括谷氨酸棒状杆菌。利用metB*或metY**的模式必须使用开始时至少是Δ(metE)的菌种。利用metB**或metY*的模式必须使用开始时至少是Δ(metC)的菌种。
图注MetA高丝氨酸琥珀酰转移酶；可被一个不受蛋氨酸反馈抑制的异构体所取代，或被一个不受蛋氨酸反馈抑制的高丝氨酸乙酰转移酶异构体所取代。MetB胱硫醚-γ-合成酶MetB*胱硫醚-γ-合成酶进化成‘蛋氨酸合成酶’MetB**胱硫醚-γ-合成酶进化成高半胱氨酸合成酶MetY*O-乙酰-高丝氨酸(谷氨酸棒状杆菌)进化成高半胱氨酸合成酶MetY**O-乙酰-高丝氨酸(谷氨酸棒状杆菌)进化成‘蛋氨酸合成酶’中间的途径代表大肠杆菌的天然蛋氨酸合成途径。其他途径对应于本发明所示的方法。
图3表示根据本发明，用来筛选菌株的连续发酵机制。例如我们采用了DASGIP公司的“Fedbatch-Pro”技术。由一个计算机控制的模块系统同时进行微生物发酵和补充培养基的pH与pO2的监控。
图4在细菌内由丝氨酸合成半胱氨酸图5由O-乙酰-L-丝氨酸合成半胱氨酸的策略。用红色箭头为根据本发明所得到的metY进化基因(metY*)所编码的具丝氨酸合成酶活性的酶所采用的途径。
图6用异核相关谱法(HAQC)比较蛋氨酸中第五个5碳原子的13C-核磁共振谱，(a)野生型的水解物(上图)与Kla-F优化株(下图)。可观察到Kla-F株的第五个碳原子未被碳13所标定。如此可确认该碳原子来自甲基硫醇钠。
图7利用MULTIALIN法取得的胱硫醚-γ-合成酶未经修饰的序列对比。(http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html)图8利用MULTIALIN法取得的酰基高丝氨酸硫化氢解酶未经修饰的序列对比。
图9大肠杆菌原始株Δ(metE)在批式培养中的直接筛选中生长率进化情况。横轴传代次数；箭头族群K144；μ推导值从OD 2-3推导所得，μ计算值从大于4倍DO中获得。
图10在首次种植后(培养1)及在第十次再植后(再植次数10)的大肠杆菌Δ(metE)株生长动力学图。
图11利用引子DmetJBF与MetJR对大肠杆菌ΔmetE∷Cm株进行PCR。引子DmetJBF的5’端可与位于metL基因3’端的序列杂化。
图-12利用PCR扩增片段进行同源重组后所得的菌株(见图11)；可进行两个不同的同源重组，每个重组的可能性相同。在第一个情况下，大肠杆菌ΔmetE∷Cm株参与反应。在第二个情况下，可将位于metL的前的metBLF操纵元的启动子更换，产生大肠杆菌[ΔmetJ，ΔmetJ∷Cm]株。
图13大肠杆菌[Δ(metBJ，metC)pTrc-metY]株在含有作为简单碳源的葡萄糖的特定的培养基(MML8)中的生长率随时间进化的情况F.实施例F.I.蛋氨酸生物合成途径本发明第一个应用(实施例F.I.1.)是在生产蛋氨酸的生物合成途径的代谢工程上。它包括以下几个步骤a)将metE基因从大肠杆菌原始株中缺失；所得的修饰株是蛋氨酸缺陷株。原始株可在一不含蛋氨酸，S-腺苷甲硫氨酸，高丝氨酸或胱硫醚的基础培养基(MM)中存活。但此修饰株则失去此能力。
b)在同一基础培养基(MM)内加入甲基硫醇钠(共同底物)后，培养修饰株使其的内源酶活性进化成蛋氨酸合成酶活性来弥补所缺失的酶活性(MetE)。
c)在甲基硫醇钠存在下，筛选具有新的蛋氨酸合成酶活性的进化株，并将此株定性。
d)将编码具有进化酶活性的蛋白的基因分离。在此案例中，是具有改进蛋氨酸合成酶活性的胱硫醚-γ-合成酶。
本发明第二个应用(实施例F.I.2.)是在生产蛋氨酸的生物合成途径的代谢工程上。它包括以下几个步骤a)将metC基因从大肠杆菌原始株中缺失；所得的修饰株是蛋氨酸缺陷株。原始株可在一不含蛋氨酸，S-腺苷甲硫氨酸，高丝氨酸或胱硫醚的基础培养基(MM)中存活。但此修饰株则失去此能力。
b)在不存在任何共同底物的同一基础培养基(MM)内培养修饰株，使其内源酶活性进化成高丝氨酸合成酶活性来弥补所缺失的酶活性(MetC)。
本发明第三个应用(实施例F.I.3.)是在生产蛋氨酸的生物合成途径的进化上。它包括以下几个步骤a)将metC，metB，和metJ基因从大肠杆菌原始株中缺失；所得的修饰株是蛋氨酸缺陷株。原始株可在一不含蛋氨酸，S-腺苷甲硫氨酸，高丝氨酸或胱硫醚的基础培养基(MM)中存活。但此修饰株则失去此能力。
a1)导入一个从谷氨酸棒状杆菌分离出的异种基因，metY基因。此基因可将乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性进化成蛋氨酸合成酶活性。
b)在同一基础培养基(MM)内加入甲基硫醇钠(共同底物)后，培养大肠杆菌修饰株[metYΔ(metB，metC，metJ)]使其的内源酶活性进化成蛋氨酸合成酶活性来弥补所缺失的酶活性(MetB与MetC)。
c)在甲基硫醇钠存在下，筛选具有新的蛋氨酸合成酶活性的进化株。
案例F.I.1在甲基硫醇钠存在下制备一株具有蛋氨酸合成酶活件的进化株
a)构建大肠杆菌修饰株Δ(metE)metE基因的失活可经导入一个氯霉素抗性基因框架及缺失大部分有关基因而达成。此法曾在下列文献中报告达森科与华纳(2000)，利用PCR将大肠杆菌K-12一步染色体基因失活，美国国家科学院院刊，976640-6645。
此策略的执行用到两个寡核苷酸-含100个碱基的DmetER(SEQ ID NO 1)tacccccgacgcaagttctgcgccgcctgcaccatgttcgccagtgccgcgcgggtttctggccagccgcgcgttttcagCATATGAATATCCTCCTTAG其-一个区域(小写)与metE基因(4010643至4012904序列，为网址http://genolist.pasteur.fr/Colibri/所登录的参考序列)的序列(4012903至4012824)同源；-另一区域(大写)是用来扩增质粒pKD3中的氯霉素抗性基因框架。(达森科与华纳(2000)，利用PCR将大肠杆菌K-12一步染色体基因失活，美国国家科学院院刊，976640-6645)。
-含100个碱基的DmetEF(SEQ ID NO 2)tgacaatattgaatcacaccctcggtttccctcgcgttggcctgcgtcgcgagctgaaaaaagcgcaagaaagttattggTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG其-一个区域(小写)与metE基因的序列(4010644至4010723)同源；-另一区域(大写)是用来扩增质粒pKD3中的氯霉素抗性基因框架。
寡核苷酸DmetER与DmetEF是用来扩增质粒pKD3中的氯霉素抗性基因框架。所得的PCR产物用电穿孔法转入MG1655(pKD46)株。在此株内表达的红色重组酶使同源重组顺利进行。然后将氯霉素抗性转化子筛选。同时用寡核苷酸metE和metEF加入利用PCR分析证实此抗性框架的导入。
MetER(SEQ ID NO 3)ggtttaagcagtatggtgggaagaagtcgc(与4012978至4012949的序列同源)。
MetEF(SEQ ID NO 4)cccggggatgaataaacttgccgccttccc(与4010567至4010596的序列同源)。
然后可将此氯霉素抗性基因框架剔除。将具有可作用在氯霉素抗性基因框架的FRT位置上的FLP重组酶质粒pCP20用电穿孔技术导入到重组株中。经过在42℃一连串的培养，氯霉素抗性基因框架的丢失可用加入同样的寡核苷酸后用PCR分析证实。
b)在利用甲基硫醇钠做共同底物的情况下培养与进化Δ(metE)修饰株为优化利用大肠杆菌从甲硫醇生产蛋氨酸的能力，可在培养瓶中进行控制性的筛选。
如上所述，将metE基因失活而产生的蛋氨酸缺陷的大肠杆菌，除非能从甲硫醇中产生蛋氨酸，否则不能生长。
利用此法筛选一株在甲硫醇存在下其胱硫醚-γ-合成酶(EC 4.2.99.9)已具备‘但蛋氨酸合成酶’活性的大肠杆菌修饰株。
这种控制下所作的筛选是在一个密封的玻璃瓶中进行。瓶中有50毫升无机培养基。培养基中有33mM葡萄糖及25mg/l氯霉素。(西华等，1999，生物化学年鉴，27088-96。)将某确定OD600nm值的大肠杆菌K12ΔmetE株种植于此培养基。须种植足够的菌以使其中存在若干偶发的metB基因突变，使其能摄取甲硫醇。这些菌种是通过在基础培养基中加入蛋氨酸培养蛋氨酸缺陷株而获得的。
在三个瓶中加入100μl的400mg/l甲硫醇溶液。第四个瓶中不加任何甲硫醇。在37℃摇动培养6天。然后测量OD600nm。其结果报告在表2。

表2.在有甲基硫醇钠时(培养瓶1-3)或在无甲基硫醇钠时(对照培养瓶)的大肠杆菌培养基的光密度(OD)这些结果显示在培养瓶2与3中生长的菌种可利用甲硫醇来产生供其生长所用的蛋氨酸(光密度增大)。
所观察到的改进“蛋氨酸合成酶”活性是因在培养瓶2与3的大肠杆菌K12ΔmetE株的胱硫醚-γ-合成酶编码基因已被修饰。
在培养瓶2中的大肠杆菌可被用来进一步改善在甲硫醇存在下的“蛋氨酸合成酶”活性。可采用的方法包括筛选与经多次发酵而寻求改进，或重复上以上所述的培养瓶试验。
c)筛选与经多次发酵而寻求改进为优化大肠杆菌基于甲硫醇的蛋氨酸生产过程而进行筛选。
此方法可用来筛选在甲硫醇存在下其胱硫醚-γ-合成酶(EC 4.2.99.9)已发展成改进的“蛋氨酸合成酶”活性的大肠杆菌的株。或者，可使用如同在实施例2中获得的菌株。
这种直接筛选可在一个连续多阶系统中进行(Figure 3)。
在第一个发酵罐中以近于最大生长率的速度培养细菌。所生长的细菌被不断地由第一个发酵罐中移到第二个发酵罐内。第二个发酵罐的特色是具选择性筛选的低稀释度(甲硫醇)。
在第二个发酵罐内细菌所承受的选择压力是由其甲硫醇浓度所决定。接二连三的筛选程序使我们能将甲硫醇浓度慢慢增加以逐渐加强筛选压力。
在每个浓度下，在第二个发酵罐中的筛选株不断地进化。结果将所有的甲硫醇都代谢完毕(发酵罐中无残余甲硫醇)。
在此情况下，将第二个发酵罐当生长发酵罐，把第一个发酵罐当筛选罐再重新筛选。在此时加入比上次用的更浓的甲硫醇。
经过不同的筛选循环来获取一株能迅速发酵甲硫醇的菌株。并将此菌株分析以确定其胱硫醚-γ-合成酶编码基因的突变。
d)在甲基硫醇钠存在下筛选进化株将培养瓶2中的大肠杆菌Δ(metE)菌相连续种植，可得菌相Kla-F。
所获的新菌相Kla-F在下述的一个基础培养基的中培养。(西福等，1999，生物化学年鉴，27088-96)此培养基含2.5g.l-1被碳-13均匀标识的葡萄糖和未被碳-13标识的甲基硫醇钠(200ppm)。此菌相在无甲基硫醇钠存在时是蛋氨酸缺陷株。
在培养完成后，细胞经回收及洗涤，最后在107℃ 6N HCl中水解24小时。产品用二维核磁共振(NMR)法分析(异核相关谱HSQC)。分析结果可分辨蛋氨酸的5-碳是从由培养液中葡萄糖而产生的L-半胱氨酸而来(传统途径)，或是经本发明所创造的新代谢途径从甲基硫醇钠而来。
在甲基硫醇钠不存在的状况下，大肠杆菌野生株K12(能从葡萄糖产生蛋氨酸)被用来做相同的实验。
图6显示两个从两次取样而得到的一维核磁共振谱。然后将此两谱重叠以增加清晰度。这些一维谱是从二维核磁共振的异核相关谱(质子与碳13原子的相关性)中抽取的。此二维核磁共振谱是在一个细菌的酸性水解物中测得。
此样本是个完全水解物。根据核磁共振的灵敏度及使用的采样时间，所测到的是氨基酸，糖类，碱类与甘油。每个酸的碳原子(与一质子偶合)都有个核磁共振的信号。
在这两株中，蛋氨酸的5-碳(在甲基端)均产生了一个14.7ppm的化学位移。
但可见到在上面那个谱中5-碳信号比较强。表示着这个5-碳是由碳-13标识的。所以这个5-碳是从培养基中经过标识的葡萄糖底物中取得的。
相反的，下面的谱中5-碳信号非常弱(Kla-F株)。这结果显示这个5-碳基本上未被标识。但是在此分子中的其他碳原子均被很强的标识(结果未示)。这未经标识的5-碳不是来自葡萄糖，而是来自甲硫醇。
所以可以归结到下列的结论Kla-F株所产的蛋氨酸是由琥珀酰-L-高丝氨酸和甲基硫醇钠得到的。
Kla-F菌相在培养瓶中接连种植了14次。所得的是菌相K144(如图9所示)。然后将此菌种涂抹在基础培养培养板上。板上唯一的碳源是葡萄糖。将接种过的培养皿在有氧情况下放置在一个有氧的瓶子内。另将一个装有甲基硫醇钠水溶液的试管也放入瓶中。将瓶子放置在37℃培养箱内。因甲硫醇的沸点仅在5℃，甲硫醇在在瓶内空气中富集。4天后，克隆开始在培养皿中出现。这些是能在甲硫醇存在下产生蛋氨酸的细菌。包括克隆K176在内，共有10个菌落被分离。克隆K176是在液体培养基中生长的。将其制备成甘油标准液，编号为K183。
测定克隆K183及大肠杆菌原始株K12Δ(metE)的metJ与metB(SEQ ID No.5)基因的序列。经进化后的metB基因，被改称为metB*基因(SEQ ID No.7)，其序列显示第325个氨基酸为一个丙氨酸(SEQ IDNo.8)，而不是一个谷氨酸(SEQ ID No.6)。metJ基因未见任何突变。本菌株已于2003年4月2日向CNCM注册取得注册号码I-3005。
●克隆K183的性能分析克隆K183是在基础培养基中在培养瓶内培养成的。此培养基中仅有的碳源是葡萄糖与甲基硫醇钠。同时在相同情况下平行培养大肠杆菌野生株K12.。其每单位生物质量的葡萄糖消耗量是另一株大肠杆菌野生株(MBM01)的两倍。这种过度消耗或许是由于产生醋酸盐所致。

表3.比较大肠杆菌野生株与进化克隆K183的生物质量生产率生物质量生产率以生物质量/葡萄糖质量表示醋酸盐生产率以醋酸盐质量/葡萄糖质量表示将此二培养物中的胞内与胞外代谢物分析后发现在细胞内丙氨酸，丙酮酸盐，丁酮酸盐，与2-酮异己酸盐浓度上升，但色胺酸，正缬氨酸，正亮氨酸，亮氨酸与蛋氨酸的浓度降低。
在细胞外，谷氨酸，异亮氨酸，苏氨酸，缬氨酸与2-酮异己酸盐有所堆积，但丙酮酸盐，正亮氨酸及色胺酸有所减少。
●在甲硫醇存在下描述MBM01与K183株的‘蛋氨酸合成酶’特异活性为阐明K183株相对野生株(MBM01)具有较高的蛋氨酸合成酶活性，在细胞萃取液内进行酶反应。细胞萃取液是在不含无甲硫醇从大肠杆菌K183株与MBM01株的丰富培养基(BH1，经由DIFCO销售，含葡萄糖2.5g/L)中取得。蛋白萃取物用PD10脱盐后存放在冰上。
反应条件与样本处理-将甲基硫醇钠溶液稀释10倍(100μl 3M水溶液加900μlMilliQ水)后存放在冰上。
-将反应混合物20μL 500mM pH 6.5磷酸盐缓冲液，10μL2.5mM磷酸吡哆醛，16μL 25mM O-琥珀酰高丝氨酸，10μL0.3M甲基硫醇钠，和24μL MilliQ水制备后存放在冰上。
-将试管放置在37℃(在无菌工作台使用恒温混匀器)，并加入蛋白萃取物(20μl)开始反应。
-要终止反应时(0至30分钟)，将试管放置在冰上，并加入在-20℃的丙酮400μl。
-将试管留置在-20℃ 30分钟。
-无菌工作台内将试管打开，放置10分钟让甲硫醇与丙酮蒸发散去(在冰上)。
-将混合物在10,000g下离心5分钟。把上清(～100μl)倒进一个Eppendorf管内。将其稀释至1ml。
测量由琥珀酰高丝氨酸所释放的琥珀酸盐以决定蛋氨酸合成酶活性将10μl上述样本在Dionex DX-500离子色谱仪上分析。此色谱具有一个2mmAG-11预柱，一个2mmAS-11主柱，一个ASRS超级离子抑制器，与一个10μl样本注入回路。采用下列的梯度0-7分钟0.5mM KOH；7分钟注入；7-9.5分钟0.5mM KOH；9.5-13分钟0.5-5mM KOH；13-25分钟5-38.3mM KOH。
测量在甲硫醇存在下蛋氨酸合成量以决定蛋氨酸合成酶活性采用气相色谱/质谱联用系统(GC-MS)来分析蛋氨酸。但在注入样本前必须将样本硅基化。为此，每个样本内均加入一个内标准(丝氨酸13C)以使硅基化质量得到保证。所有样本冻干过夜。
衍生物依以下所述的方法制备用一个1ml自动加样器加入400μl羟胺溶液(将0.250g+/-0.002g溶解在10ml吡啶中)，并确保试管被紧紧地盖住。用旋涡混合器将此混合物搅拌两次，每次10秒钟。然后将此混合物离心集中在试管底部(最多在5000g离心1分钟)。然后将试管放置在30℃让反应进行1_小时。将试管打开用一个1ml自动加样器加入1000μlBSTFA溶液。再加入100μl吡啶(用一个200μl自动加样器)。将试管盖紧后，用旋涡混合器将混合物搅拌10秒钟。制备TBDMS衍生物时，将此混合物在60℃培养60分钟。制备BSTFA衍生物时，将混合物在70℃培养30分钟。如有必要，可用一个一次性0.22μm PTFE膜过滤器将样本过滤，或将样本在5000g下离心5分钟。样本然后被转移到一个1.5ml玻璃瓶内。封妥后注入色谱仪中。
在一个具有一个非极性色谱柱(HP-5MS，Bios Analytique)的Agilent Technologies GC6890/MSD5973气相色谱/质谱仪上进行分析。携带气体是氦气。流量是1ml.min-1。以非分流方式，流量为50ml.min-1时间为0.85min注入1μl样本。其温度分布如下起始温度90℃保持2分钟，以10℃.min-1梯度加温至320℃。在此温度保持6分钟。用质谱仪测量。以电子冲击离子化样本。在m/z＝40至550amu范围内用扫描式法进行分析。溶剂通过时间为3.10分钟。
在此条件下，在甲硫醇内培养的样本的‘蛋氨酸合成酶’活性可用离子色谱法定量分析琥珀酸盐再用GC-MS分析蛋氨酸来检测。
分析结果如表四所示。

表4在甲硫醇存在下菌株MBM01及K183萃取物的蛋氨酸合成酶活性如此证明了在甲硫醇存在下这株进化株的蛋氨酸合成酶活性比原始株强。同时证明了这突变胱硫醚-γ-合成酶(E325A)具有修饰过的蛋氨酸合成酶活性。
e)进化基因的分离与具进化蛋氨酸合成酶活性的METB*酶的动力学特性为测量在METB与METB*中与蛋氨酸合成酶与胱硫醚-γ-合成酶活性有关的动力学参数，采用下述的策略将metB和metB*基因克隆到过度表达载体pTopo(Invitrogene)中-将metB或metB*基因用寡核苷酸metJ/metLR与抗热性聚合酶Pwo扩增。
-将PCR产物与质粒pTOPO 4-PCR平端连接。将所构成的质粒pTopo.metB或pTopo.metB*转换至DH5α并筛选Apr克隆。
-萃取质粒pTopo.metB或pTopo.metB*后用酶切法证实其结构。
-结构证实后，将质粒pTopo.metB转化至MG1655(ΔmetBJ，ΔmetE)株中。再用上述的酶切法证实所构建的质粒。再用PCR及寡核苷酸metJR/metLR证实metJ基因在MG1655(ΔmetBJ，ΔmetE)株中缺失。并用寡核苷酸metER/metEF证实metE基因在MINS33株中缺失。
在丰富培养基培养后，萃取蛋白质。蛋氨酸合成酶活性与胱硫醚-γ-合成酶活性分别用甲基硫醇钠及半胱氨酸为共同底物而决定的。
蛋氨酸合成酶活性的动力学特性如表5所示。胱硫醚-γ-合成酶活性的动力学特性如表6所示。

表5.METB与METB*蛋氨酸合成酶活性的明显动力学特性.
突变A325E的作用是在甲硫醇中将此酶的Km减低45倍，但Vmax只被减低一半。

表6.METB与METB*胱硫醚-γ-合成酶活性的明显动力学特性。
突变A325E的作用是将半胱氨酸的胱硫醚-γ-合成酶活性减低13倍，同时降低其Km值。
实施例F.I.2.由胱硫醚-γ-合成酶中进化出高半胱氨酸合成酶活性
●MG1655(ΔmetC∷Cm)与MG1655(ΔmetC)株的构建为失活基因metC，采用了达森科与华纳(2000)所述的同源重组策略。此策略允许导入一个氯霉素抗性基因框架及缺失大部分有关基因。为达到此目的，采用了两个寡核苷酸为失活基因metC-含100个碱基的DmetCR(SEQ ID NO 13)ccggcgtccagatcggcaatcagatcgtcgacatcttccagaccaatatgcaggcgaatcaaggtcccgctaaaatcgatCATATGAATATCCTCCTTAG其中有-一个区域(小写)与metC基因(如网址http://genolist.pasteur.fr/Colibri/所登录的参考序列的3150251至3151438序列)的序列(3151419至3151359)同源。
-另一区域(大写)是用来扩增氯霉素抗性框架(参考序列刊载在达森科K.A.与华纳，B.L.，2000，PNAS，976640-6645)。
-内含100个碱基的DmetCF(SEQ ID NO 14)cggacaaaaagcttgatactcaactggtgaatgcaggacgcagcaaaaaatacactctcggcgcggtaaatagcgtgattTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG其中有-一个区域(小写)与metC基因的序列(3150255至3150334)同源。
-另一个区域(大写)是用来扩增氯霉素抗性框架。
寡核苷酸DmetCR与DmetCF是用来从质粒pKD3扩增氯霉素抗性框架的。用电穿孔法将所得的PCR产物转化至MG1655(pKD46)株中。在此株中表达的红重组酶使同源重组得以进行。具有氯霉素抗性的菌株经筛选后，利用PCR及寡核苷酸metCR与metC证实菌株已导入此氯霉素抗性转化子。所得的菌株被称为MG1655(ΔmetC∷Cm)株。
MetCR(SEQ ID NO 11)cgtccgggacgccttgatcccggacgcaac(与3151522至3151493的序列同源)。
MetCF(SEQ ID NO 12)gcgtttacgcagtaaaaaagtcaccagcacgc(与3150118至3150149的序列同源)。
可将此氯霉素抗性框架剔除。将质粒pCP20用电穿孔法转入重组株中。此质粒具有作用在此氯霉素抗性框架FRT位点的FLP重组酶。经连续在42℃培养后，用PCR及同样的寡核苷酸证实氯霉素抗性框架遗失。这株菌被命名为MG1655(ΔmetC)株。
菌株Δ(metC)的构建如实施例F.I.2.所述。在一优选实施例中，在培养瓶中培养大肠杆菌Δ(metC)株(见实施例F.I.1)。瓶中的基础培养基仅含葡萄糖为其唯一的碳源。此培养基不含甲硫醇或H2S。经过每次种植后，重新测量生长率。在基础培养基中，Δ(metC)A株的生长率大有增进。表示其胱硫醚-γ-合成酶的高半胱氨酸合成酶活性在内源性H2S的影响下大有进步(见图10)。

实施例F.I.3.由乙酰高丝氨酸硫化氢解酶进化而得的蛋氨酸合成酶活性MG1655(ΔmetB-ΔmetJ)株的创建为缺失基因metB及metJ，并保留操纵子metBL的启动子，将一个氯霉素抗性框架导入。同时将大部分有关的基因缺失并保留metBL启动子。为达到此目的，采用了一下两种寡核苷酸。
对基因metBJ-内含30个碱基的MetJR(SEQ ID NO 9)ggtacagaaaccagcaggctgaggatcagc与在基因metJ(4125975至4125581的序列，参考序列登录在http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)下游的序列(4125431至4125460)同源。
-内含100个碱基的DmetJBF(SEQ ID NO 10)tatgcagctgacgacctttcgcccctgcctgcgcaatcacactcatttttaccccttgtttgcagcccggaagccattttcaggcaccagagtaaacatt其中有
-一个部分(大写)与位于基因metJ与metB(4126252至4127412的序列)的间内含操纵子metBLF启动区域的序列(4126217至4126197)同源。
-另一部分(小写)则与对应于metL基因(4127415至4129847的序列)开始处与metB基因结尾处的序列(4127460至4127380)同源。
这两个寡核苷酸是用来扩增与MG1655Δ(metJ∷Cm)株染色体DNA有关的区域；见图11。
所得的PCR产物经电穿孔转化至MG1655(pKD46)株中。在此株中表达的红重组酶使同源重组顺利进行。具氯霉素抗性的菌株经筛选后，用寡核苷酸MetJR与MetLR通过PCR法证实经同源重组后metB基因已自氯霉素抗性转化子中缺失。
所要得到的菌株是MG1655(ΔmetB-ΔmetJ∷Cm)株。在此株中，基因metJ与metB被剔除了。同时操纵子metBLF的启动子也被换位到metL的前(见图12)。
如此，这个氯霉素抗性框架可被剔除。质粒pCP20可用电穿孔法转入重组株中。此质粒所含的FLP重组酶作用在氯霉素抗性框架的FRT位点上。经过在42℃一连串的培养后，可用寡核苷酸MetLR与MetJR通过PCR法证实确实以剔除了氯霉素抗性框架。
菌株MG1655Δ(metC∷Cm，metJB)与MG1655Δ(metC，metJB)的构建为缺失菌株MG1655(ΔmetB-ΔmetJ)的metC基因(对应于登录在http://genolist.pasteur.fr/Colibri/参考序列3150251至3151438的序列)，采用了噬菌体P1转导法。此方法涉及两个步骤。第一步是制备菌株MG1655Δ(metC∷Cm)的噬菌体裂解物。第二步是将其转导至菌株MG 1655Δ(metB-ΔmetJ)中。
菌株Δ(metC∷Cm)的构建已在实施例F.I.2.中有所叙述。
噬菌体P1裂液的制备过程-用100μl经过夜培养的菌株MG1655(ΔmetC∷Cm)在10mlLB+Cm 30μg/ml+葡萄糖0.2％+CaCl25mM种植。
-在37℃及振荡下孵育30分钟。
-加入100μl由野生株MG1655所得的噬菌体裂解液(大约1.109噬菌体/ml)。
-在37℃振荡3小时直到所有细胞菌已裂解为止。
-加入200μl氯仿并用旋涡混合器混合。
-在4500g下离心10分钟以除去所有细胞碎片。
-将上清移入一无菌的试管中，并添加200μl氯仿。
-将裂解液储存在4℃。
转导过程-将5ml在LB培养基内过夜培养的MG1655(ΔmetB-ΔmetJ)菌株在1500g下离心10分钟。
-将细胞沉积物悬浮在2.5ml的10mM MgSO4及5mMCaCl2溶液内。
--对照试管100μl细胞100μl菌株MG1655(ΔmetC∷Cm)的噬菌体P1-试验试管100μl细胞+菌株MG1655(ΔmetC∷Cm)的噬菌体P1-在30℃无振荡情况下孵育30分钟。
-在每个试管中添加100μl 1M柠檬酸钠，并用旋涡混合器将混合物混匀。
-添加1ml LB培养基。
-在37℃与振荡下培养1小时。
-在7000rp离心3分钟。将收集物涂抹在LB+Cm 30μg/ml培养皿上。
-在37℃过夜培养。
菌株的验证筛选此氯霉素抗性转化子。含(metC∷Cm)区域的导入可用寡核苷酸MetCR与MetCF通过PCR法证实。同时可用寡核苷酸MetJR与MetLR证实此株含有基因metB与metJ。这菌株被命名为MG1655Δ(metC∷Cm，metJB)。
MetCR(SEQ ID NO 11)cgtccgggacgccttgatcccggacgcaac(与3151522至3151493的序列同源)。
MetCF(SEQ ID NO 12)gcgtttacgcagtaaaaaagtcaccagcacgc(与3150118至3150149间的序列同源)。
如前所述，可将此氯霉素抗性框架剔除。将质粒pCP20用电穿孔法转入重组位点中。此质粒具有作用在此氯霉素抗性框架FRT位点的FLP重组酶。经连续在42℃培养后，用同样的寡核苷酸通过PCR法(MetCR和MetCF，与MetJR和Met LR)证实氯霉素抗性框架遗失。这株菌被命名为MG1655Δ(metC，metJB)。
质粒pTrc99A-metY的转入及菌株的进化在一优选实施例中，构建了一能表达谷氨酸棒状杆菌metY基因的质粒。此基因是从谷氨酸棒状杆菌的染色体DNA经PCR扩增而得。然后再将此基因导入质体pTrc99A中。metY基因和其野生型启动子可经PCR扩增。在一优选实施例中，metY基因可在某种启动子控制下被克隆并在大肠杆菌内表达。所用的载体为pTrC99A(Pharmacia)。也可用从pUC，pBluescript，pCR-Script，pTopo，等载体中挑选出的载体。
将前面所得的大肠杆菌Δ(metC，metJB)株用谷氨酸棒状杆菌质粒pTrc-metY经电穿孔转化。
用所得的菌株接种于一个锥状瓶中(OD600nm～0.4-0.5)。瓶中含有大约其10％左右的基础培养基。在此培养基中葡萄糖是唯一的碳源。最初因MetY酶的琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶活性较低，此菌相在基础培养基(MML8)内的生长率因受蛋氨酸合成量的限制而偏低(μ～0.06h-1)。当OD600nm达到2时将菌株种植。总共筛选了22个培养循环。在此进化-筛选过程中生长率发生了显而易见的进步(见图13)。基于以前的经验，这样的改善可归于metY基因的进化。其将O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶活性改变为O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶活性，从而允许由细菌所生的O-琥珀酰高丝氨酸和H2S生产高半胱氨酸。为优化metY基因的进化过程，可用相似方法利用其他大肠杆菌突变株进行，例如突变株Δ(metC，metB)。
实施例F.I.4.用补充培养基培养法生产及纯化蛋氨酸预培养预培养是在一个装有50ml基础培养基的500ml培养瓶中过夜进行的。此培养基为一修正的M9培养基，内含葡萄糖2.5g/l。细胞经离心回收并存放在5ml修正的M9基础培养基中。
在发酵罐内培养在一个可用容积为300ml的Fedbatch-pro DASGIP型发酵罐中以补充培养基培养法进行培养。
发酵罐内装有145ml修正的M9基础培养基。并利用5ml预培养液接种。接种OD600nm在0.5到1.2的间。
培养温度控制在30到37℃的间。其pH用一种CH3SNa溶液连续调解控制在6.5到8之间。如有必要，可加入适量的2N氢氧化钠来完成pH调节。在批式操作时，保持振荡率在200到400rpm之间。在半连续灌流培养过程快结束时，将振荡率增快到1000rpm。用一个气体流量控制器保持溶解氧浓度在30％至40％饱和度之间。当OD600nm达到2.5至3时，开始半连续灌流培养。最初将补充培养基以0.3到0.5ml/h的速率加入。并逐渐将此速率加快至2.5到3.5ml/h之间。在此后24h到32h之间，培养基补充率保持固定。补充培养基与修正的M9培养基基本相同。仅增加了300至500g/l的葡萄糖。同时在此培养基中另添加一些CH3SNa溶液(1至5M)来促使细菌生长并用来调节pH。当细胞浓度达到20到50g/l时，立刻将补充培养基换成仅含少量磷的修正的形M9基础培养基。不用甲硫醇溶液，而将CH3SH气体直接注射进发酵罐中。气体流量依与补充培养基的流量对碳底物的摩尔比而定，大约在1到3之间。当细胞浓度达到50到80g/l之间，将发酵反应停止。此时将发酵液用NaOH溶液将其pH调整到7.5至9之间。同时将此发酵液加热到60至80℃之间。将此发酵液在超过滤装置上过滤。将此发酵液温度保持在60至80℃之间。再用炭将发酵液脱色前(使用一个脱色柱或批式操作)，先将其浓缩。脱完色的发酵液再经一次过滤出去其中的粒子。然后与浓HCl作用使其pH降到2.28以下(蛋氨酸的pK1值)。析出的蛋氨酸盐酸盐结晶经过滤回收。蒸发后除去HCl取得纯L-蛋氨酸。
生物材料的注册菌株K183已于2003年4月2日依布达佩斯公约条款向法国国家微生物收集中心(CNCM，地址25 rue du Docteur-Roux，75724 ParisCedex 15，France)注册，取得注册号码I-3005。
F.II.半胱氨酸生物合成途径的进化本发明应用在半胱氨酸生物途径的代谢工程技术的例子(实施例F.II.1.)包括以下数个步骤a)将大肠杆菌原始株的cysK与cysM缺失而使修饰株变成有半胱氨酸营养缺陷株。原始株可在无蛋氨酸，S-腺苷甲硫氨酸，高半胱氨酸，胱硫醚，或半胱氨的基础培养基(MM)中生长。但此修饰株则失去了这种能力。
a1)导入一个从谷氨酸棒状杆菌分离的异种基因，基因metY。此基因从乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性向半胱氨酸合成酶活性进化。
b)在基础培养基(MM)内，在无共同底物存在的情况下，培养大肠杆菌修饰株[metY(cysK，cysM)]使基因MetY进化而产生半胱氨酸合成酶活性来弥补由于缺失基因CysK与CysM而散散丧失的酶活性。
c)筛选在内源H2S存在下具有半胱氨酸合成酶的进化株。同时检验所创造的新合成途径。
实施例F.II.1将乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性进化成半胱氨酸合成酶活性a)大肠杆菌Δ(cysK，cysM)株的构建利用导入抗生素抗性框架基因(氯霉素与卡那霉素)与缺失大部分有关的基因分别将cysK与cysM失活。这方法在达森科K.A.；华纳，B.L.(2000)，利用PCR将大肠杆菌K-12一步染色体基因失活，美国国家科学院院刊，976640-6645，中有所描述。构建一种基因需要合成一对寡核苷酸对cysK而言DcysKR内含100个碱基(SEQ ID NO 15)TgttgcaattctttctcagtgaagagatcggcaaacaatgcggtgcttaaataacgctcacccgatgatggtagaataacCATATGAATATCCTCCTTAG其中有
-一个区域(小写)与基因cysK(其参考序列登录在http://genolist.pasteur.fr/Colibri/上)的一个序列(2531396至2531317)同源。
-一个区域(大写)用来扩增氯霉素抗性框架。(参考序列报告在达森科K.A.；华纳，B.L.，2000，美国国家科学院院刊，976640-6645中)。
-DcysKF内含100个碱基(SEQ ID NO 16)agtaagatttttgaagataactcgctgactatcggtcacacgccgctggttcgcctgaatcgcatcggtaacggacgcatTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG其中有-一个区域(小写)与基因cysK的一个序列(2530432至2530511)同源。
-一个区域(大写)用来扩增氯霉素抗性框架。
Pour cysMDcysMR内含100个碱基(SEQ ID NO 17)cccgccccctggctaaaatgctcttccccaaacaccccggtagaaaggtagcgatcgccacgatcgcagatgatcgccacCATATGAATATCCTCCTTAG其中有-一个区域(小写)与基因cysM(其参考序列登录在http://genolist.pasteur.fr/Colibri/上)的一个序列(2536699至2536778)同源。
-一个区域(大写)用来扩增卡那霉素抗性框架。
DcysMF内含100个碱基(SEQ ID NO 18)AgtacattagaacaaacaataggcaatacgcctctggtgaagttgcagcgaatggggccggataacggcagtgaagtgtgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG其中有-一个区域(小写)与基因cysM的一个序列(2537600至2537521)同源。
-一个区域(大写)用来扩增氯霉素抗性框架。
寡核苷酸DcysKR和DcysKF，与DcysMR和DcysMF是分别用来从质粒pKD3与pKD4中扩增氯霉素与卡那霉素抗性框架所用的。用电穿孔法将所得的PCR产物转化至MG1655(pKD46)株中。在此株中表达的红重组酶使同源重组得以顺利进行。将每种抗生素抗性转化子分别筛选。利用PCR及寡核苷酸cysKR与cysKF和cysMR与cysMF分别证实菌株已导入此二抗生素抗性转化子。
cyKR(SEQ ID NO 19)tttttaacagacgcgacgcacgaagagcgc(与2531698至2531669的序列同源)。
cysKF(SEQ ID NO 20)ggcgcgacggcgatgtgggtcgattgctat与2530188至2530217的序列同源)。
cysMR(SEQ ID NO 21)ggggtgacggtcaggactcaccaatacttc(与2536430至2536459的序列同源)。
cysMF(SEQ ID NO 22)gcgcgcatcgctggccgctgggctacacac(与2538071至2538042的序列同源)。
如前所述，可将此氯霉素抗性框架及卡那霉素抗性框架剔除。将质粒pCP20用电穿孔法转入重组位点中。此质粒具有作用在此氯霉素抗性框架或卡那霉素抗性框架FRT位点的FLP重组酶。经连续在42℃培养后，用PCR及同样的寡核苷酸证实抗生素抗性框架已失落。
a1)将基因metY转入先前菌株中将基因metY导入PCR4TOPO载体(Zero Blunt TOPO PCR cloningkit，Invitrogen)构建质粒pTopometY。为达到此目的，将由谷氨酸棒状杆菌ATCC13032株的染色体DNA所分离的metY基因用聚合酶Pwo及以下所列的寡核苷酸进行PCR扩增MetYR(SEQ ID NO 23)ttagagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaataaaaactcttaaggacctccaaatgccTRC型启动子(pTRC-O)是用粗体罗马字体表示。metY基因的是用粗体罗马加底线字体表示。而metY基因的起始密码子是用粗斜体表示。
MetYF(SEQ ID NO 24)gctctgtctagtctagtttgcattctcacg在转录终止子下游的序列。
质粒pTopometY是将PCR产物直接导入载体Topo中所构建。载体Topo携带了大肠杆菌的复制起点及一具青氨苄霉素抗性基因与一卡那霉素抗性基因。
然后将质粒pTopometY转化到大肠杆菌DH5α株中。质粒pTopometY中的metY基因序列与通用寡核苷酸M13正向引物和M13负向引物可用来检验所构建成的质粒。
用点穿孔法将此质粒转化大肠杆菌Δ(cysK，cysM)株。
c)培养编码乙酰-高丝氨酸硫化氢解酶活性的metY基因使其向半胱氨酸合成酶活性进化先前所提的含metY基因的菌株可在园瓶内或锥状瓶中作控制性的筛选。使用此法可筛选到一株大肠杆菌，其乙酰-高丝氨酸硫化氢解酶活性已进化成‘半胱氨酸合成酶’活性。此控制性筛选是在锥状瓶内进行的。瓶内装有50ml的无机培养基(西华等，1999，生物化学年鉴，27088-96)。培养基内另含33mM葡萄糖，与最终浓度为25mg/l的氯霉素及25mg/l的卡那霉素。
以大肠杆菌K12[Δ(cysK，cysM)pTopometY]株在一定的OD600nm值下接种此培养基。采用了一个足够大的菌相来种植以确保某些细菌的metY基因已存在一些相关的突变使其已能摄取O-乙酰丝氨酸。这菌相是由在一个含半胱氨酸的基础培养基中培养一株有半胱氨酸营养缺陷的菌株得来的。用大肠杆菌K12(ΔcysK，cysM)株种植一个对照培养。
在37℃振荡下培养6天。随后测量OD600nm值。对照培养几乎显示OD值不变。其他培养的OD值则有明显的变化。所以在这些锥状瓶中可能已显现了‘进化的半胱氨酸合成酶活性。’这种突变最可能发生在metY基因上。因为这是这些菌株与对照株唯一不同的处。
可重复使用前述的瓶内培养法将在阳性培养物中的菌相的半胱氨酸合成酶活性继续改进。
c)克隆的筛选将进化后的菌相涂抹在一个凝胶化的基础培养基上。其中唯一的碳源是葡萄糖。在有氧条件下，将接种皿放置在37℃。36小时后，克隆在皿上出现。这些克隆对应于能在葡萄糖为唯一碳源的情况下产生半胱氨酸的菌种。分离了三株克隆。
●合成途径的控制将大肠杆菌进化株K12[Δ(cysK，cysM)pTopometY]在一个基础培养基(西华等，1999，生物化学年鉴，27088-96)中培养。此培养中含2.5g.l-1用碳13均匀标识的葡萄糖。培养后，将细胞收回，洗涤。再将细胞在107℃利用6N HCl水解24小时。采用2D NMR(HSQC)分析产物来决定葡萄糖中碳13的去出。由此可证实半胱氨酸是由丝氨酸和乙酰-丝氨酸合成的。此现象表示由metY基因所编码的酶已进化而具有半胱氨酸合成酶活性。
F.III.具NADPH依赖性酶的进化本发明可将具NADPH依赖性的生物转化途径经代谢工程法更改。在某一实施例中(实施例F.III.1.)，包括以下数个步骤a1)将基因udhA与pgi从大肠杆菌原始株中缺失；a2)将基因pfkA，pfkB与udhA在大肠杆菌原始株中失活；优化所得的修饰株还原NADP的能力。原始株可在基础培养基(MM)中生长，但修饰株在此培养基中生长的能力大大地减弱了。
b)转入一个含有为蜡状芽孢杆菌苄基还原酶编码的yueD基因的质粒。
c)在基础培养基(MM)中培养前述的修饰柱。并在培养基中加入对硝基苯甲醛(共同底物)使其在这代谢不良的底物上能进化出苄基还原酶活性。
d)定性分析进化株YueD。
实施例F.III.1大肠杆菌菌株Δ(udhA，pgi)与A(pfkA，pfkB，udhA)的构建和蜡状芽孢杆菌苄基还原酶动力学特性的修饰a1)大肠杆菌修饰株Δ(udhA，pgi)的构建导入一个卡那霉素抗性框架及缺失大部分有关基因可将基因udhA失活。此方法已在达森科与华纳(2000)，利用PCR将大肠杆菌K-12一步染色体基因失活，美国国家科学院院刊，976640-6645中有所描述。
为此合成了两个寡核苷酸-DudhAR内含100个碱基(SEQ ID NO 25)cccagaatctcttttgtttcccgatggaacaaaattttcagcgtgcccacgttcatgccgacgatttgtgcgcgtgccagTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG其中有
-一个区域(小写)与udhA基因(其参考基因为序列4158303至4156969，已登录在http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)的一个序列(4157144至4157223)同源。
-一个区域(大写)用来扩增一个卡那霉素抗性框架(其参考序列已报告在达森科与华纳(2000)，美国国家科学院院刊，976640-6645中)。
DudhAF内含100个碱基(SEQ ID NO 26)ggtgcgcgcgtcgcagttatcgagcgttatcaaaatgttggcggcggttgcacccactggggcaccatcccgtcgaaagcCATATGAATATCCTCCTTAG其中有-一个区域(小写)与udhA基因)的一个序列(4158285至4158206)同源。
-一个区域(大写)用来扩增一个卡那霉素抗性框架)。
寡核苷酸DudhAR与DudhAF是用来从质粒pKD4中扩增这个卡那霉素抗性框架用的。所得的PCR产物经由电穿孔法转入菌株MG1655(pKD46)中。在此株内表达的红重组酶让同源重组得以顺利进行。此卡那霉素抗性转化子被筛选。并用寡核苷酸UdhAR与UdhAF证实此抗性框架确实已被导入。
UdhAR(SEQ ID NO 27)gcgggatcactttactgccagcgctggctg(与4156772至4156801的序列同源)。
UdhAF(SEQ ID NO 28)ggccgctcaggatatagccagataaatgac(与4158475至4158446的序列同源)。
导入一个氯霉素抗性框架及缺失大部分有关基因可将基因pgi失活。此方法已在达森科与华纳(2000)，利用PCR将大肠杆菌K-12一步染色体基因失活，美国国家科学院院刊，976640-6645中有所描述。
为此合成了两个寡核苷酸-DpgiR内含100个碱基(SEQ ID NO 29)gcgccacgctttatagcggttaatcagaccattggtcgagctatcgtggctgctgatttctttatcatctttcagctctgCATATGAATATCCTCCTTAG其中有
-一个区域(小写)与pgi基因(其参考基因为序列4232980至4232901，已登录在http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)的一个序列(4231337至4232986)同源。
-一个区域(大写)用来扩增一个氯霉素抗性框架(其参考序列已报告在达森科与华纳(2000)，美国国家科学院院刊，976640-6645中)。
-DpgiF内含100个碱基(SEQ ID NO 30)ccaacgcagaccgctgcctggcaggcactacagaaacacttcgatgaaatgaaagacgttacgatcgccgatctttttgcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG其中有-一个区域(小写)与pgi基因的一个序列(4231352至4231432)同源。
-一个区域(大写)用来扩增一个氯霉素抗性框架。寡核苷酸DpgiR与DpgiF是用来从质粒pKD3中扩增这个卡那霉素抗性框架用的。所得的PCR产物经由电穿孔法转入菌株MG1655udhA(pKD46)中。在此株内表达的红重组酶让同源重组得以顺利进行。此氯霉素抗性转化子被筛选。并用寡核苷酸PgiR与PgiF证实此抗性框架确实已被导入。
PgiR(SEQ ID NO 31)cggtatgatttccgttaaattacagacaag(与4233220至4233191的序列同源)。
PgiF(SEQ ID NO 32)gcggggcggttgtcaacgatggggtcatgc(与4231138至4231167的序列同源)。
可将此氯霉素抗性框架及卡那霉素抗性框架剔除。将质粒pCP20用电穿孔法转入重组株中。此质粒具有作用在此氯霉素抗性框架与卡那霉素抗性框架FRT位点的FLP重组酶。经连续在42℃培养后，用PCR及同样的寡核苷酸证实其抗生素抗性框架已失落。
a2)大肠杆菌修饰株Δ(pfkA，pfkB，udhA)的构建导入一个卡那霉素抗性框架及缺失大部分有关基因可将基因pfkA失活。此方法已在达森科与华纳(2000)，利用PCR将大肠杆菌K-12一步染色体基因失活，美国国家科学院院刊，976640-6645中有所描述。
为此合成了两个寡核苷酸-DpfkAR内含100个碱基(SEQ ID NO 33)ttcgcgcagtccagccagtcacctttgaacggacgcttcatgttttcgatagcgtcgatgatgtcgtggtgaaccagctgCATATGAATATCCTCCTTAG其中有-一个区域(小写)与pfkA基因(其参考基因为序列4105132至4106094，已登录在http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)的一个序列(4106081至4106002)同源。
-一个区域(大写)用来扩增一个氯霉素抗性框架(其参考序列已报告在达森科与华纳(2000)，美国国家科学院院刊，976640-6645中)。
-DpfkAF内含100个碱基(SEQ ID NO 34)ggtgtgttgacaagcggcggtgatgcgccaggcatgaacgccgcaattcgcggggttgttcgttctgcgctgacagaa ggTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG其中有-一个区域(小写)与pfkA基因的一个序列(4105147至4105227)同源。
-一个区域(大写)用来扩增一个卡那霉素抗性框架。
寡核苷酸DpfkAR与DpfkAF是用来从质粒pKD3中扩增这个氯霉素抗性框架用的。所得的PCR产物经由电穿孔法转入菌株MG1655(pKD46)中。在此株内表达的红重组酶让同源重组得以顺利进行。此氯霉素抗性转化子被筛选。并用寡核苷酸PfkAR与PfkAF和PCR分析法证实此抗性框架确实已被导入。
PfkAR(SEQ ID NO 35)ccctacgccccacttgttcatcgcccg(与4106434至4106408的序列同源)。
PfkAF(SEQ ID NO 36)cgcacgcggcagtcagggccgacccgc(与4104751至4104777的序列同源)。
基因udhA的失活已在实施例F.III.1a1)中有所描述。可用同法进行。
可将此二抗生素抗性框架剔除。将质粒pCP20用电穿孔法转入重组中。此质粒具有作用在此氯霉素抗性框架或卡那霉素抗性框架FRT位点的FLP重组酶。经连续在42℃培养后，用PCR及同样的寡核苷酸证实抗生素抗性框架已失落。
导入一个氯霉素抗性框架及缺失大部分有关基因可将基因pfkB失活。此方法已在达森科与华纳(2000)，利用PCR将大肠杆菌K-12一步染色体基因失活，美国国家科学院院刊，976640-6645中有所描述。
为此合成了两个寡核苷酸-DpfkBR内含100个碱基(SEQ ID NO 37)gcgggaaaggtaagcgtaaattttttgcgtatcgtcatgggagcacagacgtgttccctgattgagtgtggctgcactccCATATGAATATCCTCCTTAG其中有-一个区域(小写)与pfkB基因(其参考基因为序列1804394至1805323，已登录在http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)的一个序列(1805320至1805241)同源。
-一个区域(大写)用来扩增一个氯霉素抗性框架(其参考序列已报告在达森科与华纳(2000)，美国国家科学院院刊，976640-6645中)。
-DpfkBF内含100个碱基(SEQ ID NO 38)gcgccctctctcgatagcgcaacaattaccccgcaaatttatcccgaaggaaaactgcgctgtaccgcaccggtgttcgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG其中有-一个区域(小写)与pfkB基因的一个序列(1804421至1804499)同源。
-一个区域(大写)用来扩增一个氯霉素抗性框架。寡核苷酸DpfkBR与DpfkBF是用来从质粒pKD3中扩增这个氯霉素抗性框架用的。所得的PCR产物经由电穿孔法转入菌株MG1655A(pfkA，udhA)(pKD46)中。在此株内表达的红重组酶让同源重组得以顺利进行。此氯霉素抗性转化子被筛选。并用寡核苷酸PfkBR与PfkBF证实此抗性框架确实已被导入。
PfkBR(SEQ ID NO 39)gccggttgcactttgggtaagccccg(与1805657至1805632的序列同源)。
PfkBF(SEQ ID NO 40)tggcaggatcatccatgacagtaaaaacgg(与1803996至1804025的序列同源)。
如前所述，可将此氯霉素抗性框架框架剔除。将质粒pCP20用电穿孔法转入重组株中。此质粒具有作用在此氯霉素抗性框架的FRT位点的FLP重组酶。经连续在42°C培养后，用PCR及同样的寡核苷酸证实氯霉素抗性框架已失落。所得的菌株被命名为MG1655Δ(pfkA，pfkB，udhA)株。
b)将蜡状芽孢杆菌苄基还原酶编码基因yueD导入菌株A(pgi，udhA)或Δ(pfkA，pfkB，udhA)中将基因yueD导入载体pTrc99A(Amersham-Pharmacia)中。用寡核苷酸YueDR与YueDF来扩增由蜡状芽孢杆菌染色体所分离的基因。
YueDR(SEQ ID NO 41)CGTGAATTC(此处为国际公布时丢失处，申请人已要求国际局更正)将1-苯基-1，2-丙二酮(共同底物)加入基础培养基中。发现在同一培养基中修饰株可以略逊于原始株(未经修饰)的速率生长。此刻决定在一化学恒定器，(OD 5)，种植在一个含有对硝基苯甲醛(共同底物)与修饰株的基础培养基。在此种情况下，修饰株以与其在无共同底物存在的基础培养基中相似的生长率生长。将化学恒定器维持1到5星期，但逐渐增加其稀释率。稀释率可分步或连续增大。常规性地制备在化学恒定器中菌相的甘油标准保存液。
d)进化酶YueD的定性分析当菌相不能再适应所施加的稀释率时，筛选工作既告完成。从所得的最后进化菌相中分离单一菌落。(如有必要可用上一个甘油标准存储液。)审查此进化的苄基还原酶的动力学特性。将其与原始苄基还原酶动力学特性在1-苯基-1，2-丙二酮与对硝基苯甲醛中比较。在对硝基苯甲醛中，此进化的苄基还原酶的kcat值大有改善。但在1-苯基-1，2-丙二酮中，其kcat值大被压低了许多。进化克隆的序列中发现许多点突变。这可解释为何这些酶有不同的底物特异度。
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<210>7<211>1161<212>DNA<213>大肠杆菌<400>7atgacgcgta aacaggccac catcgcagtg cgtagcgggt taaatgacga cgaacagtat 60ggttgcgttg tcccaccgat ccatctttcc agcacctata actttaccgg atttaatgaa120ccgcgcgcgc atgattactc gcgtcgcggc aacccaacgc gcgatgtggt tcagcgtgcg180ctggcagaac tggaaggtgg tgctggtgca gtacttacta ataccggcat gtccgcgatt240cacctggtaa cgaccgtctt tttgaaacct ggcgatctgc tggttgcgcc gcacgactgc300tacggcggta gctatcgcct gttcgacagt ctggcgaaac gcggttgcta tcgcgtgttg360tttgttgatc aaggcgatga acaggcatta cgggcagcgc tggcagaaaa acccaaactg420gtactggtag aaagcccaag taatccattg ttacgcgtcg tggatattgc gaaaatctgc480catctggcaa gggaagtcgg ggcggtgagc gtggtggata acaccttctt aagcccggca540ttacaaaatc cgctggcatt aggtgccgat ctggtgttgc attcatgcac gaaatatctg600aacggtcact cagacgtagt ggccggcgtg gtgattgcta aagacccgga cgttgtcact660gaactggcct ggtgggcaaa caatattggc gtgacgggcg gcgcgtttga cagctatctg720ctgctacgtg ggttgcgaac gctggtgccg cgtatggagc tggcgcagcg caacgcgcag780gcgattgtga aatacctgca aacccagccg ttggtgaaaa aactgtatca cccgtcgttg840ccggaaaatc aggggcatga aattgccgcg cgccagcaaa aaggctttgg cgcaatgttg900agttttgaac tggatggcga tgagcagacg ctgcgtcgtt tcctgggcgg gctgtcgttg960tttacgctgg cggcatcatt agggggagtg gaaagtttaa tctctcacgc cgcaaccatg 1020acacatgcag gcatggcacc agaagcgcgt gctgccgccg ggatctccga gacgctgctg 1080
cgtatctcca ccggtattga agatggcgaa gatttaattg ccgacctgga aaatggcttc1140cgggctgcaa acaaggggta a 1161<210>8<211>5<212>PRT<213>大肠杆菌<400>8Met Glu Thr Thr His1 5<210>9<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MetJR<400>9ggtacagaaa ccagcaggct gaggatcagc 30<210>10<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DmetJBF<400>10tatgcagctg acgacctttc gcccctgcct gcgcaatcac actcattttt accccttgtt 60tgcagcccgg aagccatttt caggcaccag agtaaacatt 100<210>11<211>30
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MetCR<400>11cgtccgggac gccttgatcc cggacgcaac 30<210>12<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MetCF<400>12gcgtttacgc agtaaaaaag tcaccagcac gc32<210>13<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DmetCR<400>13ccggcgtcca gatcggcaat cagatcgtcg acatcttcca gaccaatatg caggcgaatc 60aaggtcccgc taaaatcgat catatgaata tcctccttag 100<210>14<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DmetCF
<400>14cggacaaaaa gcttgatact caactggtga atgcaggacg cagcaaaaaa tacactctcg 60gcgcggtaaa tagcgtgatt tgtaggctgg agctgcttcg 100<210>15<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DcysKR<400>15tgttgcaatt ctttctcagt gaagagatcg gcaaacaatg cggtgcttaa ataacgctca 60cccgatgatg gtagaataac catatgaata tcctccttag 100<210>16<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DcysKF<400>16agtaagattt ttgaagataa ctcgctgact atcggtcaca cgccgctggt tcgcctgaat 60cgcatcggta acggacgcat tgtaggctgg agctgcttcg 100<210>17<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DcysMR<400>17cccgccccct ggctaaaatg ctcttcccca aacaccccgg tagaaaggta gcgatcgcca 60
cgatcgcaga tgatcgccac catatgaata tcctccttag 100<210>18<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DcysMF<400>18agtacattag aacaaacaat aggcaatacg cctctggtga agttgcagcg aatggggccg 60gataacggca gtgaagtgtg tgtaggctgg agctgcttcg 100<210>19<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>cysKR<400>19tttttaacag acgcgacgca cgaagagcgc 30<210>20<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>cysKR<400>20ggcgcgacgg cgatgtgggt cgattgctat 30<210>21<211>30
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>cysMR<400>21ggggtgacgg tcaggactca ccaatacttc 30<210>22<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>cysMF<400>22gcgcgcatcg ctggccgctg ggctacacac 30<210>23<211>74<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MetYR<400>23ttagagctgt tgacaattaa tcatccggct cgtataatgt gtggaataaa aactcttaag 60gacctccaaa tgcc74<210>24<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MetYF
<400>24gctctgtcta gtctagtttg cattctcacg 30<210>25<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DudhAR<400>25cccagaatct cttttgtttc ccgatggaac aaaattttca gcgtgcccac gttcatgccg 60acgatttgtg cgcgtgccag tgtaggctgg agctgcttcg 100<210>26<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DudhAF<400>26ggtgcgcgcg tcgcagttat cgagcgttat caaaatgttg gcggcggttg cacccactgg 60ggcaccatcc cgtcgaaagc catatgaata tcctccttag 100<210>27<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>UdhAR<400>27gcgggatcac tttactgcca gcgctggctg 30
<210>28<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>UdhAF<400>28ggccgctcag gatatagcca gataaatgac 30<210>29<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DpgiR<400>29gcgccacgct ttatagcggt taatcagacc attggtcgag ctatcgtggc tgctgatttc 60tttatcatct ttcagctctg catatgaata tcctccttag 100<210>30<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DpgiF<400>30ccaacgcaga ccgctgcctg gcaggcacta cagaaacact tcgatgaaat gaaagacgtt 60acgatcgccg atctttttgc tgtaggctgg agctgcttcg 100<210>31<211>30<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>PgiR<400>31cggtatgatt tccgttaaat tacagacaag 30<210>32<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PgiF<400>32gcggggcggt tgtcaacgat ggggtcatgc 30<210>33<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DpfkAR<400>33ttcgcgcagt ccagccagtc acctttgaac ggacgcttca tgttttcgat agcgtcgatg 60atgtcgtggt gaaccagctg catatgaata tcctccttag 100<210>34<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DpfkAF<400>34ggtgtgttga caagcggcgg tgatgcgcca ggcatgaacg ccgcaattcg cggggttgtt 60
cgttctgcgc tgacagaagg tgtaggctgg agctgcttcg 100<210>35<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PfkAR<400>35ccctacgccc cacttgttca tcgcccg 27<210>36<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PfkAF<400>36cgcacgcggc agtcagggcc gacccgc 27<210>37<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DpfkBR<400>37gcgggaaagg taagcgtaaa ttttttgcgt atcgtcatgg gagcacagac gtgttccctg 60attgagtgtg gctgcactcc catatgaata tcctccttag 100<210>38<211>99
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DpfkBF<400>38gcgccctctc tcgatagcgc aacaattacc ccgcaaattt atcccgaagg aaaactgcgc 60tgtaccgcac cggtgttcgt gtaggctgga gctgcttcg 99<210>39<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PfkBR<400>39gccggttgca ctttgggtaa gccccg 26<210>40<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PfkBF<400>40tggcaggatc atccatgaca gtaaaaacgg 30<210>41<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>YveDR
<400>41cgtgaattct tattcatcaa ttctaataa29<210>42<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>YueDF<400>42acgttcatga gatacgttat cataacagga ac3权利要求
1.一种可用来修饰代谢途径的进化微生物的制备方法，其特征为此方法包括以下数个步骤a)利用细胞的基因修饰从一个原始微生物制备一个修饰微生物，使此被修饰的微生物在一个特定的培养基生长时抑制某种代谢物的产生或消耗，因而使其生长能力受损；b)在前述的特定的培养基中培养此修饰微生物使其进化，此特定的培养基含可促成进化的共同底物；a)筛选能在此特定的培养基(必要时含有共同底物)中生长的修饰微生物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征为所述的代谢途径选自氨基酸的生物合成途径，核酸的合成途径，脂质的合成途径或糖类的代谢途径。
3.如权利要求2所述的方法，其特征为修饰的代谢途径是氨基酸的生物合成途径。
4.如权利要求3所述的方法，其特征为修饰的代谢途径是选自以下的氨基酸的生物合成途径蛋氨酸，半胱氨酸，苏氨酸，赖氨酸，或异亮氨酸。
5.如权利要求2所述的方法，其特征为修饰的代谢途径能消耗NADPH。
6.如权利要求1至4任何一项所述的方法，其特征为或许因为限制了由NADPH氧化成NADP的反应，在a)步骤中所作的修饰对将NADP还原成NADPH有利。
7.如权利要求1所述的方法，其特征为进化微生物至少有一个编码进化蛋白的进化基因，此进化使用一个新的代谢途径来取代被抑制的代谢途径。
8.如权利要求1或2任何一项所述的方法，其特征为其包括一个附加的步骤a1)，在此步骤中导入至少一个编码异种蛋白的异种基因，此异种基因能促成新的代谢途径的进化，并为在步骤b)培养修饰微生物做好制备工作。
9.如权利要求7或8任何一项所述的方法，其特征为包括分离编码进化蛋白的进化基因的步骤d)。
10.如权利要求9所述的方法，其特征为将进化的基因以某种合适的形态导入生产用微生物中用以生产进化蛋白。
11.根据权利要求1至10的任何一项所述的方法得到的进化微生物。
12.如权利要求11所述的进化微生物，其特征为此微生物为具有一种修饰的“蛋氨酸合成酶”活性的大肠杆菌K183株，并已在2003年4月2日向CNCM注册，取得注册号码I-3005。
13.一种制备进化蛋白的方法，其中如权利要求11所述的进化微生物在适合生产进化蛋白的培养基中培养。
14.如权利要求13所述的方法，其特征为所生产的进化蛋白被纯化。
15.根据权利要求9所述的方法获得的编码进化蛋白的进化基因。
16.根据权利要求13或14任何一项所述的方法获得的进化蛋白。
17.如权利要求16的进化蛋白，其特征为此酶具有修饰的“蛋氨酸合成酶”活性，其选自具有修饰的“蛋氨酸合成酶”活性的胱硫醚-γ-合成酶或酰基高丝氨酸硫化氢解酶中挑选。
18.如权利要求17的进化蛋白，其特征为具有未修饰的“蛋氨酸合成酶”活性的胱硫醚-γ-合成酶在进化前选自PFAM PF01053或COGCPG0626中的胱硫醚-γ-合成酶。
19.如权利要求18的进化蛋白，其中具有未修饰的“蛋氨酸合成酶”活性的胱硫醚-γ-合成酶在进化前在其C端(保守区域1)具有以下的氨基酸序列X1-X2-X3-L-G-X4-X5-X6-X7-X8-X9其中X1代表A，G，S，优选为AX2代表E，V，P，T，优选为EX3代表S，T，N，优选为SX4代表G，D，A，H，T，优选为GX5代表V，A，T，H，N，优选为VX6代表E，R，K，F，优选为EX7代表S，T，优选为SX8代表L，I，V，A，优选为LX9代表I，V，A，T，优选为I其对应大肠杆菌K12株的胱硫醚-γ-合成酶序列(SEQ ID NO 6)的氨基酸残基324-334，。
20.如权利要求18或19的进化蛋白，其特征为具有未修饰的“蛋氨酸合成酶”活性的胱硫醚-γ-合成酶在进化前在其N端(保守区域2)具有以下的氨基酸序列X10-X11-Y-X12-R-X13-X14-X15-X16-X17-X18其中X10代表A，H，Y，F，L，K，优选为AX11代表Y，E，D，K，R，V，I，优选为YX12代表S，A，T，P，G，优选为SX13代表I，S，T，R，E，F，W，D，优选为SX14代表S，G，A，I，E，N，K，P，优选为GX15代表N，H，Q，S，优选为NX16代表P，D，L，以为优选PX17代表T，M，N，G，S，优选为TX18代表R，L，V，S，W，E，优选为R其对应大肠杆菌K12株的胱硫醚-γ-合成酶序列(SEQ ID NO 6)的氨基酸残基44-54。
21.如权利要求18至20的任何一项的进化蛋白，其特征为其包括至少一个在C端的突变，和/或至少一个在N端的突变。
22.如权利要求21的进化蛋白，其特征为突变是将在未修饰的酶中与共同底物半胱氨酸反应的酸性氨基酸被一个选自如下的非极性氨基酸残基所取代甘胺酸，丙胺酸，亮胺酸，异亮胺酸，缬胺酸，苯丙胺酸或蛋氨酸。
23.如权利要求22的进化蛋白，其特征为胱硫醚-γ-合成酶C端的突变被导入如权利要求14所定义的“保守区域1”的酸性氨基酸，特别是到X2残基上。
24.如权利要求23的进化蛋白，其特征为其C端具有如下所述的氨基酸序列X1-X2-X3-L-G-X4-X5-X6-X7-X8-X9其中X1，X3，X4，X5，X6，X7，X8与X9与上文中定义相同X2代表G，A，L，I，V，F，M，优选为A其对应大肠杆菌K12株的胱硫醚-γ-合成酶(SEQ ID NO 8)的氨基酸残基324-334。
25.如权利要求24的进化蛋白，其特征为其C端具有如下所述的氨基酸序列A-A-S-L-G-G-V-E-S其对应大肠杆菌K12株的胱硫醚-γ-合成酶(SEQ ID NO 8)的氨基酸残基324-332。
26.如权利要求25的进化蛋白，其特征为具有修饰过的《蛋氨酸合成酶》活性的胱硫醚-γ-合成酶含有如SEQ ID NO 8所示的氨基酸序列。
27.如权利要求18至26的任何一项的进化蛋白，其特征为胱硫醚-γ-合成酶N端的突变发生在被导入到如上定义的“保守区域2”的酸性氨基酸，特别是到X11和/或R和/或X13残基上。
28.如权利要求27的进化蛋白，其特征为具有修饰过的《蛋氨酸合成酶》活性的胱硫醚-γ-合成酶的N端有下列的氨基酸序列X10-X11-Y-X12-X19-X13-X14-X15-X16-X17-X18其中X7，X9，X12，X14，X15，X16，X17与X18如上文定义，X11如权利要求15所定义，或代表一个非极性氨基酸，X13如权利要求15所定义，或代表一个非极性氨基酸，X19是R或代表一个非极性氨基酸，X11，X13与X19中，至少一个代表非极性氨基酸，其中非极性氨基酸可从甘胺酸，丙胺酸，亮胺酸，异亮胺酸，缬胺酸，苯丙胺酸或蛋氨酸残基中挑选。
29.如权利要求16的进化蛋白，其特征为未突变的原始酶进化前在H2S存在下能催化硫化氢解反应。
30.如权利要求29的进化蛋白，其特征为未突变的原始酶在进化前具有O-酰基-L-高丝氨酸硫化氢解酶活性。
31.如权利要求30的进化蛋白，其特征为具有O-酰基-L-高丝氨酸硫化氢解酶活性的原始酶的是从PFAM PF01053或COG COG2873对应的O-酰基-L-高丝氨酸硫化氢解酶中选出的。
32.如权利要求31的进化蛋白，其特征为原始酶是从以下所列的酰基高丝氨酸硫化氢解酶中挑选出的NP_785969O-乙酰基高丝氨酸(硫醇)-裂解酶，植物乳杆菌WCFS1AAN68137 O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶，恶臭假单胞菌KT2440NP 599886 O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶，谷氨酸棒杆菌ATCC 13032NP_712243乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶，钩端螺旋体黄胆出血型赖株56601BAC46370 O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶，慢性型大豆根瘤菌USDA110AAO57279 O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶，假单胞杆菌丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000NP_284520 O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶[脑膜炎奈瑟菌Z2491AAA83435 O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶(铜假绿单胞菌)
33.如权利要求31的进化蛋白，其特征为原始酶在进化前是由谷氨酸棒状杆菌的metY基因所编码的O-酰基-L-高丝氨酸硫化氢解酶。
34.如权利要求33的进化蛋白，其特征为O-酰基-L-高丝氨酸硫化氢解酶是被谷氨酸棒状杆菌metY基因(Genbank AF220150)所编码的。
35.权利要求11所述的进化微生物或权利要求15所述的进化蛋白在生物转化方法中的应用。
36.如权利要求35所述的生物转化方法，其中生物转化依赖NADPH依赖性的酶。
37.如权利要求36所述的方法，其中具NADPH依赖性的酶因进化而具有底物特异性。
全文摘要
本发明涉及制备能修饰代谢途径的进化微生物的一个新的方法，其特征为其包括以下步骤a)通过对原始微生物细胞的基因修饰生产修饰的微生物，如在可影响微生物生长的特定培养基中培养微生物时抑制代谢物的生成和吸收，b)培养从前述特定的培养基中得到的微生物以诱导所述细胞发生进化，有时有必要向特定培养基中加入共同底物以促进所述的进化，c)选择可在特定培养基中进化的修饰微生物，此特定培养基可任选地含有共同底物。本发明还涉及如上所述得到的进化微生物、通过所述方法得到的编码进化蛋白质的进化基因以及所述的进化微生物、基因或蛋白质在生物转化方法中的应用。
文档编号C12P13/06GK1751120SQ200480004474
公开日2006年3月22日 申请日期2004年2月17日 优先权日2003年2月18日
发明者M·沙托, B·冈萨雷斯, I·梅尼亚尔－萨勒, P·N·P·苏凯勒, O·赞克 申请人:代谢开发公司