专利名称：耐受诱导的靶向抗体产生的利记博彩app
背景技术：
1.发明领域本发明涉及重定向动物免疫应答的方法。尤其是，本发明涉及将动物的免疫应答定向到诸如肿瘤抗原的免疫活性较弱或者罕见的抗原。所述方法将消减免疫与超免疫结合并且引起靶特异性抗体，辅助T细胞(CD4+-T淋巴细胞)以及细胞毒性T细胞(CD8+-T淋巴细胞)的受控或者定向生成。生成的抗体尤其可用于诊断以及治疗学应用。
2.相关技术的描述在超过20年的时间里，mAbs已被用作鉴定来自哺乳动物，鸟以及两栖动物的组织，来自植物，寄生虫，细菌的多种细胞以及病毒存在的抗原以及合成抗原上有力手段。自从K.Landsteiner在上个世纪前半段的首创研究，已经公知抗体可用于通过其特异性识别(与其反应)蛋白的初级，二级和/或三级结构中的微小差异(抗原决定簇)区分两个基本上相同的蛋白。因此，蛋白单个氨基酸的改变，即使是在将单个点突变导入编码特定蛋白的基因后发生，也可通过B淋巴细胞表面上存在的抗体识别，引起免疫细胞的增殖为浆细胞并分泌抗原(抗原决定簇)-特异性抗体。例如，在注射了猪胰岛素的糖尿病患者体内产生抗体，猪胰岛素和人类胰岛素仅仅只有一个氨基酸的差异。
由Khler和Milstein开发的杂交瘤融合方法(1975)Nature 256495-497，可以用于寻找以及鉴定携带这些细致识别特异性的抗体，维持生产浆细胞的永久培养，以及由此工业生产具有所需特异性的mAbs。因而，用于递送诊断用以及近年来的治疗用药物的mAbs的数目及其在治疗学中的应用已经得到了发展。
虽然融合方法已经成为良好受控的常规方法，用诸如完整细胞的抗原复合混合物免疫免疫脾细胞的供体(动物)的方法在大多数情况下仍然是纯粹经验的方法(“标准”免疫方法)。因此不必惊奇，很难预测这种动物的脾中(期望)分泌抗原特异性抗体的浆细胞的存在以及频率。通过利用“标准”免疫常常只能仅仅鉴定一个左右分泌具有期望特异性的mAb的杂交瘤。常常，难以鉴定到分泌mAb的目标杂交瘤。即使发现了似乎具有所期望特异性的mAbs，对许多所产生的mAbs进行的试验已经证实相应的抗原大多数情况下存在于更多细胞中而非目标器官的细胞中并且将其作为了免疫过程中的抗原。显而易见，这些结果显著制约了mAb作为体内器官或者细胞特异性介质的用途。
目前用于生产靶特异性mAbs的方法包括诱导特异性免疫耐受。在此方法中，对免疫显性抗原的免疫应答受到如下因素的制约(a)导入新生儿的耐受度，(b)重复施用低剂量的抗原，(c)在单剂量注射第一组抗原以及诱导初级免疫应答前后或者期间立即施用免疫抑制剂(Many等，Clin.Exptl.Immunol.，1970，687-99；Hanai等，CancerRes.，1986，464438-4443；Middelton等，Fed.Proc.，1984，39926；Golumbiski等，Anal.Biochem.1986，154373；Matthew等，1987，J.Immunol.Meth.，10073-82；Pytowski等，J.Exp.Med.，1988，167421；Williams等，Biotechnique，1992，12842-847；Brooks等，J.CellBiol.，1993，1221351-1359)。然而这些方法仍然受到诸多问题的限制。例如，通常肿瘤特异性抗原(TSAs)以及肿瘤相关抗原(TAAs)通过由未转化的母细胞上已经存在分子的略微修饰(如上所述)衍生而来，因此可能不能被存在的大量其他免疫显性抗原识别。此外，TSAs/TAAs以较低数目存在以至于在宿主细胞中不产生或者仅仅产生短暂的免疫应答。
为了充分利用mAb的潜在区分特异性作为用于诊断或者治疗学目的的靶介质，非常需要操作免疫动物的应答以便实现2个主要目的。首先，B淋巴细胞应答以及抗体产生应该压倒性地针对细胞和/或器官特异性抗原。此外，在融合时，最大可能数目的那些产生所期望抗体的浆细胞应该已经迁移到并且存在于免疫供体动物的脾中。虽然第一个目的应该只是引起响应目标抗原的B淋巴细胞的增殖，第二目的通过在脾中相当多富集大量的所选择(根据抗体特异性)浆细胞，导致这种(期望的)浆细胞和骨髓瘤细胞之间显著高的融合频率。本发明实现了这两种目的并且不仅导致杂交瘤在体外的大量生长而且导致分泌具有精确的期望抗原特异性的mAbs的杂交瘤的可预言的较高频率。
发明概述本发明提供了将动物的免疫应答重定向到免疫性较弱或者罕见的抗原的方法。所述方法包括下列步骤(a)给动物施用第一组抗原并且进行第一以及二次免疫应答；(b)给动物施用抑制迅速增殖免疫细胞生长的免疫抑制剂；(c)给动物施用第二组与第一组抗原类似，或者相关但是不同的抗原；以及(d)加强注射足以提高针对第二组抗原的抗体滴度并且引起分泌针对第二组抗原的抗体的浆细胞增强迁移到动物的脾的第二组抗原。
在本发明的另一方面，提供了产生与免疫性较弱或者含有的抗原特异性反应的单克隆抗体的方法。所述方法包括下列步骤(a)给动物施用第一组抗原并且进行第一以及二次免疫应答；(b)给动物施用抑制迅速增殖免疫细胞生长的免疫抑制剂；(c)给动物施用第二组与第一组抗原类似，或者相关但是不同的抗原；以及(d)加强注射足以提高针对第二组抗原的抗体滴度并且引起分泌针对第二组抗原的抗体的浆细胞增强迁移到动物的脾的第二组抗原；(e)从动物分离脾细胞；以及(f)将分离的脾细胞与在培养基中能够无限复制骨髓瘤细胞或者转化细胞融合，以产生分泌与免疫性较弱或者罕见的抗原特异性反应的单克隆抗体的杂交瘤。优选地，免疫抑制剂为环磷酰胺。在优选实施方案中，第一组抗原包括未转化的细胞，而第二组抗原包括从其衍生的细胞，所述细胞是经致肿瘤性转化的细胞。例如，第一组抗原可以包含BMRPA1(BMPRA.430)细胞并且第二组抗原可以包含BMRPA1.NNK细胞。这里使用的“BMRPA1”细胞以及“BMRPA.430”细胞是同义的。在另一实例中，第一个组抗原可以包含BMRPA1(BMPRA.430)细胞并且并且第二组抗原可以包含TUC3(BMRPA.K-rasvall2)细胞。第二组抗原的实例为肿瘤相关抗原或者肿瘤特异性抗原。癌症相关抗原的实例为胰腺癌相关抗原。
在本发明的另一方面，提供了由如上所述方法产生的单克隆抗体。
能够培养分化状态的BMRPA1细胞的培养基也由本发明提供。该培养基包括约0.02M的谷氨酰胺，约0.01到约0.1M的HEPES-缓冲液，溶于乙酸浓度范围从约0.001到约0.01mg/mL乙酸/L培养基的牛胰岛素)，约1到约8×10-7M ZnS04，约1到约8×10-10M的NiSO46H2O，5×10-7到约5×10-6的CuSO4，约5×10-7到约5×10-6的FeSO4，约5×10-7到约5×10-6M的MnSO4，约5×10-7到约5×10-6M的(NH4)6Mn7O24，约0.3到约0.7mg/L培养基的Na2SeO3，约1×10-10到约8×10-10M的SnCl22H2O以及约5×10-4到约5×10-5M的甲氨酰胆碱，其中所述培养基具有调节到从约6.8到约7.4范围的pH。
优选地，培养基含有约0.02M的谷氨酰胺，约0.02M的HEPES-缓冲液，溶于乙酸的牛胰岛素(0.004mg/mL乙酸/L的培养基)，约5×10-7的ZnSO4，约5×10-10M的NiSO46H2O，约5×10-8M的CuSO4，约5×10-6M的FeSO4，约5×10-9的MnSO4，约5×10-7M的(NH4)6Mn7O24，约0.5mg/L培养基的Na2SeO3，约5×10-10M的SnCl22H2O以及约5×10-5M的甲氨酰胆碱，其中所述培养基具有调节到约7.3的pH。
本发明同样提供了暴露于1μg NNK/ml培养基约16小时的转化的BMRPA1(BMPRA.430)细胞。这种细胞的实例是细胞系BMRPA1.NNK。本发明也提供了来源于注射了BMRPA1.NNK细胞的小鼠肿瘤的细胞系TUNNK。
本发明也提供了基本上纯化形式的癌症相关抗原3D4-Ag，其特征在于通过SDS-PAGE确定的约39.0kD，或通过2D凝胶电泳确定的约41.2 kD的分子量；约5.9到约6.9的等电聚焦pI以及；可在BMRPA1.NNK细胞，BMPRA1.TUC3细胞，BMRPA1.TUNNY细胞，人胰腺癌细胞系CAPAN1以及CAPAN2，A549人肺癌细胞以及B16小鼠黑素瘤细胞中检测到。
本发明也提供与癌症相关抗原3D4-Ag具有结合特异性的抗体。抗原的特征在于通过SDS-PAGE确定的约41.2kD的分子量；约5.9到约6.9的等电聚焦pI以及；可在BMRPA1.NNK细胞，BMPRA1.TUC3细胞，BMRPA1.TUNNY细胞，人胰腺癌细胞系CAPAN1以及CAPAN2，A549人肺癌细胞以及B16小鼠黑素瘤细胞中检测到。抗体可以是多克隆抗体或者单克隆抗体。本发明还提供了单克隆抗体mAb3D4。
在本发明的另一方面，提供了产生与抗原3D4-Ag具有特异性免疫活性的单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞系。
本发明也提供了通过本发明方法产生的杂交瘤，该杂交瘤产生结合于例如，BMRPA1细胞的未转化细胞，以及例如，BMRPA1.NNK细胞的转化细胞的表面上抗原的抗体。
本发明也提供了由受试杂交瘤产生的抗体，诸如单克隆抗体mAb4AB1以及mAb2B5，在所述杂交瘤中这种抗体结合于转化以及未转化的细胞。
本发明也提供了通过本发明方法产生的杂交瘤，该杂交瘤产生结合于例如，BMRPA1.NNK细胞的转化细胞，而非例如，BMRPA1细胞的未转化细胞的抗原的抗体。
本发明也提供了由受试杂交瘤产生的抗体，例如mAb3A2，在所述杂交瘤中这种抗体结合于转化而不是未转化的细胞。
图1A至1D是显示由NNK诱导的BMRPA1细胞形态变化的显微照片。(图1A)未处理的BMRPA1的典型鹅卵石样的上皮细胞单层。(图1B-1F)NNK处理的BMRPA1细胞。暴露于1μg的NNK/ml后在不含FBS的cRPMI中连续细胞传代(p2-9)16h(图1B)p2上皮细胞单层中出现的纺锤细胞；(图1C)p6纺锤细胞束上部以及以内的圆形细胞；(图1D)p7整个TCD以及克隆起点(箭头尖)的病灶(箭头)的出现；(图1E)p9显示的紧密细胞团由多个克隆长成；(图1F)从克隆核心通过吸入细玻璃针(“克隆的”)分离以及再接种的细胞是纺锤形的并且保持形成细胞病灶以及紧密团块的能力。
图2A显示BMRPA1(BMRPA.430)，BMRPA1.NNK以及BMRPA1.K-rasVall2(TUC3)细胞的培养皿。通过苏木精以及曙红(H&E)染色可肉眼观察到病灶。图2B到2D为显示通过H&E染色形成的病灶的显微照片。BMRPA1.NNK细胞形成嗜碱性病灶(图2C)，类似于转化的BMRPA1.K-rasVall2(TUC3)细胞(图2D)培养物中观察到的结果。在相同条件下生长以及染色的BMRPA1细胞中不存在病灶(图2B)。
图3图示BMRPA1.NNK和BMRPA1细胞在10％FBS中的细胞生长。细胞(5×104)铺板在60mm TCD中，并允许在补充10％FBS的cRPMI中生长。以指示的时间间隔通过胰蛋白酶-EDTA释放一式三份平皿中的细胞并且进行计数。在图3中实心三角形表示BMRPA1.p48细胞；实心倒三角表示未克隆的BMRPA1.NNK.p11细胞；且空心菱形表示克隆的BMRPA1.NNK.p23。每一实验进行两次且所示的结果为两个试验的结果。对于每一时间点，给出一式三份细胞计数的平均数+SD。
图4A至4D为显示细胞生长的FACS分析的结果。将BrdU添加于BMRPA1.p54(图4B)，未克隆的BMRPA1.NNK.p13(图4C)，以及克隆的BMRPA1.NNK.p23细胞(图4D)。细胞处理相同但是不用BrdU的被用作阴性对照(图4A)。细胞(5×104)铺板在60mm TCD中，并允许在补充10％FBS的cRPMI中生长。三天后，将BrdU添加到新鲜培养基中并且通过FACS分析测定结合的BrdU。每一实验进行两次且所示结果为两次实验的结果。图4E为包括来自4A-4D的FACS分析数据的柱状图。每一测试细胞系结合的BrdU+/-SD的百分比包含在结果部分。
图5图示血清丧失对NNK-转化和未转化的BMRPA1细胞的影响。将BMRPA1.NNK和BMRPA1细胞以1.5×104/孔接种在24-孔TCP中，并培养在含有1，5和10％FBS的cRPMI中。以指定的时间间隔，通过结晶紫试验评价一式三份孔中的相对细胞生长(Serrano等，1997等)。NNK-转化的和未转化的BMRPA1细胞在第1天的OD600nm实际上是相同的。当与BMRPA1细胞生长相比时，BMRPA1.NNK细胞在仅仅1％FBS中的生长优点是显而易见的。每一实验进行两次且结果为两次实验的结果。每一时间点表示一式三份的孔在相对于第1天OD600nm读数的指定时间点的OD600nm值平均数的比率。
图6A和6B是显示(A)BMRPA1.NNK.P23细胞和(B)BMRPA1.K-ras皮下注射接种的Nu/Nu小鼠肿瘤切片的H&E的显微照片。
图7A图示通过Cell-EIA测定的环磷酰胺有效消除针对未转化细胞表达的抗原的抗体应答。与仅仅用BMRPA1细胞免疫4次的小鼠[三角形；4I(430)]相比较，在分别用BMRPA1细胞(在这里也称为BMRP.430细胞)然后用环磷酰胺[圆，3次免疫(3I)BMPRA430细胞(430)+Cy]，以及再注入相同细胞[正方形，3I(430)+Cy+I(430)]免疫的小鼠中观察到对BMRPA1抗原的强烈免疫抑制。利用连续稀释的免疫血清以及BMRPA1(BMRP.430)细胞上的Cell-EIA一式两份测定相对的抗体滴度。
图7B为显示大鼠胰腺的免疫组织化学的两个显微照片，证实了环磷酰胺的免疫抑制。用BMRPA1细胞直接免疫4次后获得的血浆原位对大鼠的胰腺细胞进行了强烈染色(左)。由免疫三次，然后Cy，以及用BMRPA1细胞再次免疫的小鼠获得血清没有染色，这证实了环磷酰胺-诱导的针对BMRPA1细胞的免疫反应的抑制效果。
图7C图示了用BMRPA1.NNK细胞(在这里也称为BMRPA.430.NNK细胞)超免疫增加了抗体产生。在杂交瘤融合之前用BMRPA1.NNK细胞另外免疫5次(5I)，进一步增加了环磷酰胺环磷酰胺抑制后用BMRPA1 NNK细胞的3I标准免疫获得的Ab滴度。分别进行3I(430)+Cy+3I(BMRPA1.NNK(正方形)和3I(430)+Cy+8I(BMRPA1.NNI)(圆)后，用血清以及免疫前对照血清(三角形)在BMRPA1 NNK细胞上进行Cell-EIA。一式两份的孔的光密度(OD 490nm)读数为平均值±SD，以测定用另外5次注射BMRPA1.NNK细胞快速超免疫(环磷酰胺处理后总计八次注射)后的抗体滴度。
图gA-8J为显示识别位于两个独立转化的细胞系的细胞表面上的抗原的杂交瘤上清液3C4的显微照片。通过EDTA释放细胞，且在冰上将完整的、活细胞与3C4上清液和FITC-GαM IgG顺序地反应。冲洗细胞并固定在载玻片上且在可见光(图8A，8C，8E，8G，和8I)以及UV光(图8B，8D，8F，8H和8J)下照相。用3C4在转化的BMRPA1.NNK(图8D)和BMRPA1.Krasvall2(图8F)细胞上观察到线性的环状染色图谱，并且在BMRPA1细胞(图8H)中没有任何的染色，这表明3C4识别细胞-表面转化相关的抗原。图8B显示在用BMRPA1.NNK细胞(阳性对照)超免疫小鼠的预融合血清中观察到BMRPA1.NNK细胞的强烈染色。图8J显示没有观察到用未反应消耗的杂交瘤上层清液和FITC-GαM IgG处理的转化BMRPAlKrasvall2TUC3的染色(特异性对照)。
图9A至9F为显示3D4识别在未转化的大鼠胰腺细胞中不存在的BMRPA1.NNK细胞中的胞内抗原的显微照片。利用mAb 3D4或免疫血清进行免疫细胞化学染色，然后用HRP GαM-IgG和HRP反应底物二氨基联苯胺(DAB)检测，在固定的Triton X-100(1％)渗透性的细胞系(图9C-9F)和大鼠胰腺的冷冻切片(图9A和9B)上进行。用mAb 3D4处理图9A，9C和9E的样品；用获自BMRAP1.NNK细胞直接免疫的小鼠的血清处理图9B，9D和9F的样品。在可渗透的BMRPA1.NNK细胞(图9E)中观察到染色，而在渗透性的未转化的BMRPA1细胞(图9C)中以及渗透性的标准大鼠胰腺组织细胞(图9A)中没有观察到染色。正如所预料的，用BMRPA1.NNK细胞直接免疫的小鼠的血清与标准胰腺组织(B)，BMRPA1(D)和BMRPA1.NNK细胞(图10F)显示出广泛的交叉反应性。
图10为显示将3D4抗原鉴定为转化的BMRPA1细胞中约39kD抗原的Western印迹。将来自通过10％SDS-PAGE凝胶分离的相应细胞裂解物(30μg)的相等的蛋白量转到硝化纤维上，然后与mAb3D4和HRP-Ga M IgG一起连续温育。然后通过增强的ECL和暴露于X-omat膜肉眼观察Ag-Ab复合物的位置泳道1，BMRPA1细胞；泳道2，BMRPA1 NNK细胞；泳道3，BMRPA1.K-rasvall12细胞。在泳道4，在BMRPA1.NNK细胞裂解物(特异性对照)的免疫印迹过程中用mAb3D4代替耗尽的P3U-1骨髓瘤培养基。
图11为显示鉴定在CAPAN-1存在但在标准的胰腺管和腺泡人胰腺细胞中不存在的3D4-Ag的Western印迹。如图10所述进行Western印迹分析，除了通过12％SDS-PAGE凝胶分离20μg来自相应细胞裂解物的蛋白。
泳道1，BMRPA1.K-rasvall12细胞(阴性对照1，无mAb3D4)；泳道2，BMRPA1.K-rasvall2细胞；泳道3，ARIP细胞；泳道4，人胰腺腺泡组织；泳道5，人胰腺管组织；泳道6，CAPAN-1细胞；泳道7，MIA PaCa-2细胞。
图12为显示鉴定在来源于人肺癌和小鼠黑素瘤细胞系中的3D4-Ag表达的Western印迹。如图11所述进行Western印迹分析，除了泳道1，人肺癌A549细胞；泳道2，人结肠癌CaCO-2细胞；泳道3，人宫颈癌HeLa细胞；泳道4，人胚肾293细胞；泳道5，人白血细胞(WBC)；泳道6，小鼠成纤维细胞L929细胞；泳道7，小鼠黑素瘤B16细胞；泳道8，暴露于消耗的P3U-1骨髓瘤培养基的人肺癌A549细胞(特异性对照)。
图13A，B和C显示了通过来自总细胞裂解物的100μg多肽的2D多肽分离2D等电聚焦/Duracryl凝胶电泳分离，然后BMRPA1(图13A)和BMRPA1 NNK(图13B)的银染色鉴定大鼠3D4-Ag。将来自未染色凝胶与银染色凝胶的分离多肽转到硝化纤维膜上。膜的Western印迹分析(图13D)表明大鼠3D4-Ag具有三种电荷同种型(6.24+/-0.25，6.3+/-0.20，6.5+/-0.25的pIs)，并在BMRPA1.NNK细胞中确定具有41.2kD的分子量。用Amido黑或RevPro对硝化纤维膜染色显示了3D4-Ag相对于主要蛋白的位置，所述主要蛋白的表达谱可在银-染色凝胶中鉴定。在3个单独的实验中的相同位置发现了大鼠3D4-抗原(图13C，箭头尖)。
发明详述本发明涉及将动物的免疫应答重定向到免疫性较弱或者罕见的抗原。根据本发明，提供了产生大量的靶-特异性mAbs的方法，所述mAbs抗(i)几乎任何抗原表位，据此可以区分例如来自单个点突变的两个同源蛋白抗原，或抗(ii)弱免疫原性或在复合抗原的混合物中较少存在的任何抗原。产生的抗体可用于诊断和治疗动物尤其是人的各种病症。此外，本发明提供了靶-特异性辅助T细胞(CD4+-T淋巴细胞)和细胞毒性T细胞(CD8+-T淋巴细胞)。
根据本发明，在用第一组抗原完全免疫宿主后，即第一和第二免疫应答完成后施用免疫抑制。此导致(i)不仅抑制/消除早期(初级)应答的B细胞克隆(如在其它利用免疫抑制剂的方法中)，而且抑制/消除那些对最初的复合抗原混合物中较少存在的免疫原或仅仅在二次免疫应答过程中，即第二和/或第三次加强免疫后，较低频率存在的免疫原产生应答的B细胞克隆；(ii)消除经受类别转换并且已经产生记忆细胞的应答/增殖B细胞克隆，所述记忆细胞在与新抗原(第二次&第三次加强)接触后可能产生针对任何存在于复合抗原混合物中的免疫原的高度亲合抗体；(iii)消除针对来自复合抗原混合物的加工抗原的AP(树状细胞＞＞巨噬细胞)的呈递应答的增殖辅助CD4+TH淋巴细胞。因此，在混合物中的某些抗原被相关的B细胞最初识别后去除这些TH淋巴细胞将除去类别转换需要的增殖B细胞的辅助细胞，以产生较高亲合力和持久的抗体，以及产生特异性记忆B淋巴细胞。此外，(iv)生成针对最初复合抗原混合物的持久(＞4个月)免疫抑制。
因此，本发明的方法不同于现有方法，因为在用第一抗原免疫以及耐受后，本发明还采用用天然以及变性形式的第二组期望抗原进行的快速的顺序免疫以及超免疫。这引起(i)在延续抑制动物针对存在于第一复合抗原混合物中的抗原的应答期间，针对第二组抗原的抗体滴度的显著增长；(ii)分泌特异于第二组抗原的高亲合性抗体的浆细胞向宿主动物脾的增强迁移。因此，可以预料宿主动物脾中浆细胞的比例对比其它的特异性的增加有利于针对第二组抗原的特异性。因此，在杂交瘤融合期间在脾细胞内产生特异于第二组抗原的更高亲合性抗体的浆细胞的数目将增加而且将与骨髓瘤细胞融合。这提高了鉴定分泌特异于存在于第二组抗原中的独特抗原决定簇的抗体的杂交瘤的机率。此外，还(iii)产生针对第二组抗原中天然以及变性形式分子的单克隆抗体(mAb)。
除了产生由后二次免疫应答的免疫抑制剂重复处理诱导的抗第一组抗原的持久耐受，随后用相关而且不同的第二组抗原快速超免疫选择性免疫缺陷的宿主动物，引起虽然受到制约但是强烈的，即针对任何新抗原以及抗原决定簇的目标免疫应答以及抗体产生。在超免疫动物体内第二组抗原的持续高水平存在将迫使应答B细胞大量增殖，穿过类别转换，并且选择产生与第二组抗原内的天然和/或变性形式的独特抗原决定簇反应的更高亲合性抗体的浆细胞。选择随后用于杂交瘤融合的宿主动物脾细胞内浆细胞高频率的存在显著提高了分泌期望的特异性mAbs的杂交瘤的频率。合起来，因此本发明的方法构成了优越于在生产mAbs选择抗原复合混合物内抗原决定簇中使用标准免疫过程的主要优点。
因此本发明提供了产生目标特异性单克隆抗体的方法，包括下列步骤。首先，用第一组抗原免疫动物，并且充分加强免疫用于完全免疫以便完成第一以及二次免疫应答。然后，对免疫的动物施用抑制快速增殖免疫细胞生长的免疫抑制剂，所述迅速增殖免疫细胞包括B淋巴细胞以及T淋巴细胞(细胞毒/抑制性细胞，辅助细胞)的克隆。然后用第二组抗原免疫免疫抑制的动物(天然以及变性形式)，所述第二组抗原相关于但是不同于第一组抗原，并且其后进行充分地加强免疫。超免疫方案后，在短期内动物接受第二组抗原的另外的加强免疫。脾细胞分离自动物并且与能够在培养中无限复制的骨髓瘤细胞或转化细胞者产生杂交瘤。产生的杂交瘤可以进行培养并且产生筛选用于产生所期望单克隆抗体的克隆。产生抗体的克隆可以在体内或者体外生长以便产生较大量的所期望抗体。
本发明方法中使用的免疫抑制剂应为抑制快速增殖免疫细胞，包括B淋巴细胞和T淋巴细胞的克隆生长的那些抑制剂。尤其有用的化合物包括烷化剂，抗代谢物，以及天然产物。此类化合物的实例包括但不限于，环孢素A，mycophenolate，mofetil，咪唑硫嘌呤，他克莫司，来氟米特，霉酚酸，苯丙氨酸氮芥，苯丁酸氮芥，氨甲喋呤，fluomracil，长春新碱，白消安，以及环磷酰胺。优选地，环磷酰胺被用作本发明方法中的免疫抑制剂。
本发明方法中使用的抗原可以包含任何有效激发脊椎动物生物体免疫应答的物质。因此，例如抗原可能是诸如细菌或者病毒的传染剂。用于本发明的抗原还可以包含分离的蛋白，肽或者其片段。这种蛋白，肽或者其片段可以分离自传染剂或者其它的活体来源，可以是化学合成或者重组产生。此外，诸如半抗原的小分子可以起用于本发明方法中所使用抗原的作用。优选地，抗原是传染剂或者肿瘤性转化细胞的表面蛋白。更优选地，抗原是肿瘤相关抗原(TAA)或者肿瘤特异性抗原(TSA)。在大量肿瘤中已经鉴定到了TAAs，包括黑色素瘤，乳腺癌，前列腺癌，食道癌，淋巴瘤以及许多其它的肿瘤。参见Shawler等人的，(1997)Advances in Pharmacology 40309-337，Academic Press。
因此，用于本发明方法的抗原可以事实上包括任何抗原决定簇(表位)(i)由此可以区分例如源于单个点突变的两个同源蛋白抗原，或者(ii)具有微弱免疫原性或者以低频率存在于复合抗原混合物内的任何抗原。如果两个蛋白由于添加删除或者取代的任一组合产生了氨基酸序列的变异，但却具有相同的功能性质，或者是来源于共享相同功能性质的蛋白的片段，那么这两个蛋白抗原是同源的。为了产生特异于抗原决定簇(表位)的单克隆抗体，采用两组相关但是不同的抗原，所述单克隆抗体可用于区分两个同源蛋白抗原或者特异于弱免疫原性或者低频存在于复合抗原内的抗原。
这两个相关但是不同的抗原组可以通过若干方式获得。例如，可以自第一组织来源分离细胞以及可以用作第一组抗原，而来自相同生物体的第二组织来源的细胞可以用作第二组抗原。可以作为第一和第二组抗原来源的细胞的实例包括来自不同胰腺组织诸如管细胞，中心腺泡细胞，腺泡细胞以及胰岛细胞的细胞。在另一实例中，不同的脑组织层可用作源自于前体细胞的多种类型的脑细胞。在另一实例中，甲状腺细胞以及甲状旁腺细胞可以用作第一和第二组抗原。肾上腺组织也由用作第一和第二组抗原的不同细胞型构成。在另一实例中，可以利用分离自受试者未患病卵巢的细胞作为初级抗原，以及分离自同一受试者患病卵巢的细胞作为二级抗原分离卵巢癌特异性抗原。
本发明的方法尤其适用于产生针对TSAs以及TAAs的mAb，如上所述，TSAs以及TAAs常常衍生自未转化母细胞上已存在分子的略微修饰。因此，这种TSAs以及TAAs在无数已存在的其它免疫显性抗原中不能被识别。TSAs/TAAs还可以以较少的数目存在，以至于这种宿主中仅仅产生短暂的免疫应答或者无免疫应答产生。因此例如，对于TSAs以及TAAs，未转化的母细胞系以及转化的肿瘤性转化细胞系可用作第一以及第二组相似或者相关，然而不同的抗原。致瘤性转化已知由K-ras原癌基因突变以及p16肿瘤抑制基因启动子的甲基化发生，引起P16蛋白表达的损失(Belinsky等1998)。因此，细胞可以用诸如包括K-ras致癌突变的质粒或者包括可以灭活p16肿瘤抑制基因的核苷酸序列的质粒载体进行转化。此外将细胞暴露于包括4-(甲基-亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1丁酮(NNK)的亚硝胺已经显示可以导致形成DNA以及蛋白加合物加合物，DNA链断裂以及基因突变的形成(Curphey等，1987等，1987；Van Benthem等，1994；Staretz等，1995；Hecht，1996)。烟碱-衍生的NNK及其代谢物4-(甲基-亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇(NNAL)，可用于在实验动物体内产生胰腺肿瘤(Hofflnan，D.等人1994，J.Tox.，以及Env.Health 411-52)并且尤其适用于诱导胰腺细胞的致瘤性转化。胰腺细胞暴露NNK的时间可以从约6小时到约60小时的任一时间段。优选的暴露时间为从约12小时到约24小时。约16小时的暴露时间尤其优选。
目前有一系列已知可以将标准细胞转化为肿瘤性细胞的致癌物质。根据本发明，细胞可以暴露于各种化合物以便产生肿瘤转化细胞。这种化合物的实例包括但是不局限于诸如NNK的亚硝胺及其他类别的化合物，诸如烷化剂，芳烷化剂，芳基烷化剂，芳基胺化剂以及多环芳烃。这些化合物及其在生成肿瘤转化细胞中的应用描述在多种公开物中，例如Yuspa，S.H.，Shields，P.G.，“Etiology of cancerchemicalfactors”在Cancer，Principles and Practice of Oncolog，Devita Jr.V.T.，Hellman，S.，Rosenberg，S.A.(编辑)，Lippincott Williams and Wilkens，Philadelphia，6th编辑，pp.179-193，此处其内容全部引入作为参考。上述致癌物质不是概括性的而仅仅是示范性的。很多不同的致癌物质可被用来产生用于生成用于本发明方法应用的TAAs或者TSAs的肿瘤转化细胞。
直接取自动物来源的肿瘤组织或者细胞常常包含正常和癌细胞以及结缔组织以及蛋白酶的混合物。因此，转化的细胞系优选用作本发明方法的抗原或者抗原来源。未转化的母细胞系可以用作第一组抗原而从其衍生的已经进行了致瘤性转化的细胞系可以用作第二组相关(相似)然而不同的抗原。
根据本发明的方法，如上所述的免疫消减超免疫方案(“ISHIP”)已经被用于产生靶向抗体。下面将更具体描述也称作“耐受诱导的靶向抗体产生”的一般方法。
在方案开始时(第0天)，对动物采血用于获得免疫前血清。优选小鼠的动物用第一组称为复合抗原谱“A”的抗原免疫。优选地，第一个组抗原由腹膜内(ip)或者皮下注射(sc)进行给药。此外，优选地，将活性以及固定细胞的混合物用作第一组抗原，即复合抗原谱“A”。例如，下文描述的BMPRA.430细胞可用作复合抗原谱“A”。可以用于固定细胞的这种化合物的复合物以及制剂是本领域公知的并且包括，例如甲醛，glutaldehyde以及低聚甲醛。优选低聚甲醛在本发明的方法中固定细胞。
然后用活以及固定的复合抗原谱“A”的混合物加强免疫动物两次。在12-15天，通过例如腹膜内注射50％的第0天注射使用的细胞数或者蛋白浓度的活性/固定的复合抗原谱“A”进行第一次加强注射。在18-21天，进行第二次加强注射并且包括由与第0天相同浓度的活性/固定的复合抗原谱“A”构成。优选地，第二次加强注射是通过皮下给药进行的。
然后对动物称重确定基线重量，随后将其用于确定免疫抑制剂(在以下详细描述)的效果。第二次加强注射后大约4-24小时，可以对动物采血以便获得免疫血清，并且可以试验血清中抗抗原谱“A”的抗体。在随后的5天时间(23-26)，可以每天对动物称重然后施用免疫抑制剂，诸如60mg/kg BW稀释在无菌的生理盐溶液中的环磷酰胺。优选地，通过腹膜内(ip)注射施用环磷酰胺。典型的处理程序如下。第二次加强注射后24小时，对动物称重并以60mg/kg BW腹膜内施用环磷酰胺。第二次加强注射后48小时，对动物再次称重并以60mg/kg BW腹膜内施用环磷酰鞍。第二次加强注射后72小时，对动物称重并以60mg/kgBW施用环磷酰胺。第二次加强注射后96小时，对动物称重并以60mg/kg BW施用环磷酰胺。最后，第二次加强注射后120小时，对动物再次称重并以60mg/kg BW施用环磷酰胺。优选地通过i.p施用环磷酰胺。
观察到环磷酰胺处理的动物重量减轻2-10％是药物效果的一般指标，因为用这种药物进行处理具有减少动物食物以及液体摄取的效果。最后注射环磷酰胺后，可以每日称重动物约10-12天的时间段。在这个时间段的最后，动物将恢复它们的预处理时的重量。当合适时，当然可以使用除了环磷酰胺的免疫抑制剂药物显示效果。例如，可以获得血样并确定血小板以及白细胞(WBC)的水平，该水平在免疫抑制剂药物处理后将会降低。
然后从免疫的动物(33-36天)收集血液，并确定建立的免疫血清中抗抗原谱A(例如BMRPA.430细胞)以及抗第二组密切相关但是不同的抗原的抗体滴度。就是这组抗原，针对其动物被定向进行免疫应答，即修饰的抗原谱“A+”或者“A+na”。优选地，第二组抗原包括转化的细胞，诸如，例如称为BMRPA.430.NNK或者BMRPA1.NNK的转化的细胞系(以下描述的)。用免疫前血清以及第二次加强后，即第一次注射环磷酰胺之前5小时采集的血清试验血样。预期的结果描述在表1中表1
然后在第37天通过腹膜内或者皮下注射抗原谱“A+”或者“A+na”细胞(例如活性(50％)以及低聚甲醛-固定的(50％)细胞，这里为BMRPA.430.NNK细胞的混合物)。
在第49-52天，通过腹膜内注射50％的第37天注射使用的细胞数施加抗原谱“A+”或者“A+na”(即，活性/固定的细胞混合物)的第一次加强注射。在55-58天，腹膜内注射75％的第37天注射的细胞数施加抗原谱“A+”或者“A+na”(即，活性/固定的细胞混合物)的第二次加强注射。
然后收集用于试验的血清并且进行以下的超免疫方案。在第60-63天，在第37天使用的剂量水平施用抗原谱“A+”或者“A+na”的加强注射。在62-65天，施用第4次加强注射作为60-63天的重复注射。优选地，通过s.c.注射给药。在64-67天，利用1.5×的37天注射的抗原谱“A+”或者“A+na”的量进行第5次加强注射。在66-69天，施加第6次加强注射作为第64-67天的重复注射。优选通过i.p.注射进行最后两次加强注射。
在68-71天，施加第7次加强注射作为第64-67天的重复注射。在70-73天(融合天-2天)，进行作为64-67天重复注射的第8次加强注射。
在71-74天，从免疫的动物获得血清并分别试验抗抗原谱“A+”以及“A+na”以及“A”以及动物没有暴露的抗原，即不相关的抗原或者细胞(Ir-Ag)的抗体的存在。
预期结果概括在下表2表2
在72-75天，从一个或者多个通过71-74天试验测定的血清抗体滴度限定的小鼠分离脾细胞用于融合，并且收集血清用于其它测定抗抗原谱“A+”以及“A+na”以及“A”以及“Ir-Ag”的抗体的存在。
如上所述，从免疫动物获得的脾细胞与骨髓瘤细胞或者能够在培养中无限复制的转化细胞融合产生杂交瘤。产生杂交瘤的方法是本领域公知的并且包括例如Khler和Milstein(1975)以及Pytowski(1988)描述的那些方法，其内容全部引入作为参考。克隆单独的杂交瘤细胞并且检验这些克隆产生抗体“A+”或者“A+na”的能力。例如，可以筛选杂交瘤悬浮液的抗原特异性抗体反应性。一旦鉴定到产生与抗原“A+”或者“A+na”反应的抗体的杂交瘤细胞系，可以将细胞冷冻并且保藏以保证长期供应。当需要更多抗体时，可以随后融化这种细胞系，保证长期供应。
受试抗体在诊断以及治疗学中具有不同的应用价值。对于诊断应用，根据本发明产生的抗体可以用作免疫限定与抗原的交叉反应性的工具。例如，根据本发明产生的抗体可以与相同的抗原上的不同抗原决定簇(表位)反应并且可用作诊断工具或者对照。此外，特异于某种类型的肿瘤细胞的受试抗体可用于显示在这种肿瘤细胞中发生的变化并且可用于监控病人的治疗。例如，肿瘤细胞死亡时，抗原脱落入血液和血清中，并且受试抗体可用于确定肿瘤中发生的这种改变。此外，根据本发明产生的与特异性抗原，例如肿瘤特异性抗原反应的抗体可单独给药或者与细胞毒类药物结合给药用于治疗。
下列实施例更进一步说明本发明。
实施例1胰腺细胞系BMRPA.430通过致瘤性转化发育为细胞系BMRPA.430.NNK(BMRPA1.NNK)材料1640 RPMI培养基，青霉素-链霉素母液(10,000U/10,000mg/mL)(P/S)，N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)缓冲液，0.2％胰蛋白酶与2mM乙二胺四乙酸(胰蛋白酶-EDTA)，和台盼蓝全部获自GIBCO(纽约)。胎牛血清(FBS)获自Atlanta Biologicals(Atlanta，GA)。不含Ca2+和Mg2+的Dulbecco′s磷酸盐缓冲液(PBS)，以及所有用于完全培养基的痕量元素购自Sigma化学公司(ST.Louis，MO)。组织培养瓶(TCFs)获自Falcon-Becton Dickinson(MountainView，C.A.)，组织培养皿(TCDs)获自Corning(Corning，NY)，24-孔组织培养平皿(TCP)和96-孔TCP获自Costar(Cambridge，MA)。滤膜(0.22，0.45μm)获自Nalgene(Rochester，NY)。
复合RPMI(cRPMI)细胞培养基的制备.用RPMI.谷氨酰胺(0.02M)，HEPES-缓冲液(0.02M)，溶于乙酸的牛胰岛素(0.02mg/mL乙酸/L培养基)，氢化可的松(0.1μg/mL)，痕量元素包括ZnSO4(5×10-7M)，NiSO46H2O(5×10-10M)，CuSO4(10-8M)，FeSO4(10-6M)，MnSO4(10-9M)，(NH4)6Mn7O24(10-7M)，Na2SeO3(0.5mg/L培养基)，SnCl22H2O(5×10-10M)和甲氨酰胆碱(10-5M)制备cRPMI，并且pH调节为7.3。培养基被无菌过滤。
细胞和培养物BMRPA.430(BMRPA1)是由正常自然无限增殖的细胞系(Bao等，1994)。TUC3(BMRPA1.K-rasvall2)是通过用含有激活的在密码子12处具有致癌突变(Gly-＞Val)的人IL-ras的质粒转染转化的BMRPA1细胞(Dr.M.Perucho，California Institute forBiological Research，La Jolla)。所有的细胞系通常在37℃培养在cRPMI中(10％FBS)，于95％空气-5％CO2的温箱Forma Scientific)中。通过胰蛋白酶-EDTA进行细胞传代。细胞冷冻保藏在用50％消耗培养基和50％含有新鲜cRPMI与10％FBS和10％DMSO的冷冻培养基制成的混合物中。通过台盼蓝排除评价细胞活力。
NNK暴露所有的含有致癌因子培养基的制品存在单独的实验室中在利用指定保护措施的NCI-设计和保证的化学通风橱中进行制备。制备NNK(American Health Foundation，N.Y)作为10mg NNK的PBS溶液的母液并添加至无FBS的cRPMI中使得终浓度为100，50，10，5和1μg/ml。在36代(p36)的BMRPA1细胞以105/60mm TCDs接种并允许培养6天时间。在这时除去培养基，并且用预加温的(37℃)无FBS的cRPMI在它们用含有不同浓度NNK的无FBS的cRPMI(4ml/TCD)处理之前冲洗细胞2次。6组含有BMRPA1细胞的TCDs培养在无FBS不含NNK的cRPMI中并用作对照。八个用于六组不同培养条件的每一组的TCDs放回到37℃和95％空气-5％CO2的温箱中。16h后，从所有TCDs取出含NNK的培养基并且用PBS冲洗细胞3x然后添加新鲜的cRPMI-10％FBS(4ml/TCD)，并且继续培养。没有NNK的对照培养进行平行处理。通过每两天用新鲜cRPMI-10％FBS取代1/2的消耗培养基培养细胞。在完全铺满生长时由所有TCDs收集细胞，集中每一组中的细胞，并且以2×104在新鲜TCDs中进行传代。
克隆分离为了促进从转化细胞的单独克隆中挑洗细胞，含有克隆的细胞培养物以105个细胞/100mm TCDs重新接种，并且培养7天。将无菌巴斯德移液管的狭窄末端用火焰烤，快速地拉长并且在其最细的地方打断来产生足够细的玻璃针仅仅挑取细胞-富集克隆的核心。仅仅NNK处理的细胞含有细胞-富集的，球状的克隆。挑选8个显著克隆的中心核心，并且将包括～80-200个紧密聚集细胞的每一核心置于每一24-孔平皿的独立的孔中。4个克隆的细胞因此成活转移并且被扩大。
细胞生长试验为测定10％FBS时的细胞生长，细胞以5×104细胞/601mm接种在含有4ml cRPMI-10％FBS的TCD中。每3天，移取一式三份TCDs中的各试验用细胞系，细胞用胰蛋白酶-EDTA降解，并在台盼蓝存在下进行计数。为评价含有降低的FBS浓度的cRPMI对细胞生长的影响，相同数量的(1.5×104细胞/ml/孔)的NNK-处理的和未处理的BMRPA1细胞接种在24孔TCDs的一式三份孔中。允许细胞过夜粘附在cRPMI 10％中，用PBS冲洗，并且用含有所示％FBS的cRPMI进行重新温育。通过改变的结晶紫相对增殖试验评价细胞生长(Serrano，1997)。简要地，用PBS冲洗细胞，固定在10％福尔马林缓冲液中然后用蒸馏水漂洗。然后细胞用0.1％结晶紫在室温下(RT)染色30分钟，用dH2O冲洗，并且干燥。用1ml的10％乙酸提取细胞-结合的染料，等分试样用dH2O稀释为1∶2，并转入96-孔微量滴定板用于OD600nm测定。根据24小时OD600nm读数值的计算细胞生长。
5-溴脱氧尿核苷(BrdU)的掺入将细胞(5×104)铺板在60mmTCD中，并在cRPMI-10％FBS中培养。三天后，在3h内添加具有BrdU(lOuM)的新鲜培养基，冲洗细胞，用Trypsin-EDTA释放，以及按照生产商(Becton Dickinson)的建议通过FACS分析用FITC共轭的抗-BrdU抗体(Becton Dickinson)测定掺入的BrdU。简要地，在PBS-1％BSA中冲洗两次106的胰蛋白酶-EDTA释放的细胞，在70％乙醇中固定30分钟，并在37℃再悬浮在RNA酶A(0.1mg/mL)中30分钟。冲洗细胞后，用2N HCl/Triton X-100变性它们的DNA 30分钟，并用pH 8.5的0.1M Na2B4O7.10H2O中和。然后在具有0.5％吐温20的PBS-1％BSA中冲洗细胞，并再悬浮在具有20uL FITC-抗BrdU抗体的50uL的0.5％吐温的PBS-BSA溶液中。37℃45分钟后，冲洗细胞，再悬浮在含有碘化丙啶(0.005mg/mL)和RNA酶A(0.1mg/mL)的1mL柠檬酸钠缓冲液中。通过利用来自Becton Dickinson公司的装备有488nm发射波长的氩离子激光器的FACScan分析器进行荧光激活的细胞分选或流式细胞计数法(FACS)分析来测定掺入的BrdU以及PI染色。
独立样本t-检验用于显示未转化和转化的掺入BrdU的细胞百分比的统计上的显著(p＜0.05)差异。如先前所述(Barlogie等，1983；Alanen等，1990)由DNA柱状图计算DNA指数，为转化细胞中G0/G1峰值的PI染色测定值除以未转化细胞中G0/G1峰值的PI染色测定值的比率。
贴壁独立生长将4ml 0.5％琼脂-培养基混合物的等分试样(琼脂在64mL的H2O中高压灭菌，在水浴中冷却至50℃，以及添加至15mL5X cRPMT，19mL FBS和1mL P/S中)被倾注到25cm2的TCFs中并在4℃硬化过夜。在细胞铺板之前，将瓶置于37℃的CO2-空气温箱中5h来促进pH和温度的平衡。通过胰蛋白酶-EDTA收集细胞，将0.1mL的细胞悬液(在cRPM中40000/mL细胞)被小心地分散在每一瓶的琼脂表面并且将培养物放回至具有95％的O2-5％CO2的37℃温箱中。24h后，倒置琼脂-涂敷的TCFs来进行过量培养基的排水。在克隆生长9d和14d后利用Zeiss倒置显微镜显微检验培养物。
Nu/Nu小鼠中的致肿瘤性Nu/Nu小鼠(7周龄)获自Harlan实验室(Indianapolis，IN)。通过胰蛋白酶-EDTA释放用于注射的细胞，在cRPMI中冲洗，并且以108细胞/mL再悬浮在PBS中。每一测试小鼠皮下注射(s.c.)0.1ml的此种细胞悬液。在第一个4周期间每日检查动物的肿瘤发育，其后一周一次。由肿瘤核心切下小块的肿瘤(1-2mm3)并且在4℃置于4％低聚甲醛中过夜。然后在PBS中冲洗组织，并且置于30％蔗糖中另一个24小时。利用Jung低温恒温器(Leica)制备在Lipshaw包埋基质(Pittsburgh，PA)中的冷冻肿瘤组织的切片，置于凝胶涂敷的玻片上，-20℃储存。根据标准方法进行H&E染色。
由切除的Nu/Nu小鼠肿瘤建立TUNNY细胞系。
按照具有几个程序改变的类似于Amsterdam，A.和Jamieson，J.D.，1974，J.Cell Biol.631037-1056描述方法，由已被皮下移植到Nu/Nu小鼠中的BMRPA1.NNK细胞长成的肿瘤分离细胞。通过CO2窒息处死肿瘤-耐受的Nu/Nu小鼠，置于冰-冷却的床上，打开肿瘤上的皮肤并且通过外科手术和消毒快速地切除肿瘤，并置于在冰上的L-15培养基(GIBCO，Grand Island，NY)中用于即时的处理。当仍然在冰冷的L-15培养基中时，将组织切碎成小块，然后进行两个循环的酶催化降解和机械破碎。L-15培养基中降解混合物由胶原酶(1.5mg/ml)(136U/mg；Worthington Biochem.Corp.)，大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)(0.2mg/ml)(Sigma Chem.Comp.)，以及牛血清蛋白(BSA；结晶的)(2mg/ml)(Sigma)构成。第一降解循环(25分钟，37℃)后，细胞和组织片段在250xg下颗粒化，并用冰冷的无Ca++和Mg++含有SBTI(0.2mg/ml)、BSA(2mg/ml)、EDTA(0.002M)和HEPES(0.02M)的磷酸盐缓冲盐水(PD)中冲洗一次(Boehringer Mannheim Biochem.，Indianapolis)(S-Buffer)。细胞被再次颗粒化，再悬浮在降解混合物中，并进行第二降解循环(50分钟，37℃)。虽然在降解混合物中，残留的细胞块仍然通过利用移液管和具有减少了尺寸的针头的注射器重复吸取细胞悬液来破碎细胞。细胞悬液然后连续地剪流通过无菌的200μ-网筛和20μ-网筛的尼龙Nytex栅格(TetkoInc.，Elmsford，NY)，在S-缓冲液中冲洗并再悬浮在2-3ml的L-15培养基中，在4℃，50xg离心5分钟。收集细胞颗粒，PBS冲洗，并再悬浮在cRPMI中。处理碎片样品通过台盼蓝(Fisher Sci)排除(Michl J.等，1976，J.Exp.Med.144(6)，1484-93)进行活细胞计数以及用于细胞化学分析。以6-孔TCD中105细胞/35mm孔接种细胞以及培养在cRPMI中。
显微照相细胞培养物的所有观测和照相在装备了相位光学装置和Leitz相机的Leitz倒置显微镜上进行。观察结果记录在TMX ASA100黑白胶片上。
实施例2结果NNK对BMRPA1形态的影响重复暴露于NNK及其它亚硝胺，已经观察到诱导各种啮齿动物以及人体外胰腺癌实验模型中的细胞毒和肿瘤形态二者的改变(Jones，1981，Parsa，1985，Curphey，1987，Baskaran等1994)。为确定这种改变是否是由单独暴露于NNK以及相对小的NNK浓度诱导，将BMRPA1细胞暴露于含有100，50，10，5和1μgNNK/mL的无血清培养基16个小时。如在上述用胰腺细胞进行的研究中观察到的，较高浓度的NNK导致细胞毒素改变，包括较差的吸附，退化，细胞死亡，以及细胞生长缓慢，而此类改变在暴露于5，和1μgNNK/mL的细胞中较少观察到。用100，50，10μg NNK/ml处理的退化改变在一周内表现出致瘤性转化诸如纺锤形态和病灶过度拥挤的形态改变。用1μg/ml NNK处理的BMRPA1细胞也显示出致瘤性转化的表型改变，但是以较慢的速率，经过几周的时间进行的。如使用其它的诱变剂(Srivastava和Old，1988)，在较低剂量观察到的改变更可能反映在接近于人类环境的剂量损害NNK-诱导的特异性、优选的分子位点。此外，在1μg/mL时的这些改变渐进速度可以传代研究NNK-诱导转化过程中的早期和晚期事件。因此，将BMRPA1细胞暴露于1μg NNK/mL无FBS培养基16小时获得了如下呈现的结果。
连续培养传代35次的BMRPA1细胞形成了单层典型鹅卵石状未转化的接触抑制上皮细胞(图.1A)。暴露于1μgNNK/ml两周后，BMRPA1细胞显示出微小的形态变化在较少分散区域中的细胞开始失去它们的多边形形状，以及包括具有较少细胞质和较黑细胞核的纺锤形细胞的细胞岛开始形成(图1B，p2)。传代6(p6)次开始，在稠密聚集的纺锤细胞链的顶部及其内部可观察到圆形细胞数目的增加(P6-8)，此表明接触抑制的丧失(图.1C)。
通过p7密集细胞(病灶)的岛状区域变得突出(图1D，箭头尖)，且细胞的球状聚集开始在这些病灶的顶部形成作为克隆(p7-11)。暴露于NNK后约3个月，在p8-9首先看到可清楚区别的克隆。最初的克隆较小(图1D，箭头)且仅仅很少，但是它们存在于NNK-处理的BMRPA1细胞在其中进行传代的所有6个TCFs中。因为紧凑的团(图1E)的粘合性显著下降，克隆继续水平和垂直生长，例如密集的细胞可通过胰酶消化以及反复吸取很容易地分离，显示这种培养物可能包括致瘤性转化的细胞。通过胰酶消化这种克隆进行快速破裂与未转化的BMRP430(BMRPA1)细胞直接对比。在暴露于没有NNK的无FBS cRPMI 16h后连续培养的对照BMRPA1细胞没有显示任何的改变并且与BMRPA1细胞的最初单层不能进行区别。
为促进克隆-形成细胞的表型和分子特征的研究，用细玻璃针分离几个克隆的核心，且分别培养80-200细胞的各个分离物，作为称作“克隆的BMRPA1.NNK”的细胞系。分离的细胞显示为纺锤形到三角形并且通常为具有含有一或多个显著核的不同大小的多核。当重新接种在新瓶中时，这些细胞保持形成病灶和克隆的能力(图.1F)。有趣地是，在NNK-转化的BMRPA1中看到的NNK-诱导的表型改变类似于但少于通过人致癌K-rasvall2进行的BMRPA1转化过程中观察到的那些改变。在H&E染色后可容易地肉眼(图2A)和显微(图2C)观察到的NNK-诱导的嗜碱形病灶也类似于通过用致癌的K-rasvall2转染转化的BMRPA1细胞形成的那些改变(图2A和2D)。相反，在未处理的BMRPA1细胞的生长过程中不形成病灶和克隆(图2A和B)。通过NNK在BMRPA1细胞中诱导的形态变化同样类似于体外培养的其它转化细胞中已经充分鉴定的特性在低细胞密度时纺锤形和三角形的细胞形状，高细胞密度时的圆形-带环的外观，并且通过病灶中以及相邻细胞顶部的生长显示出接触抑制的丧失(Chung，1986)。
NNK-诱导的过度增殖通过比较在补充有10％FBS的复合培养基(cRPMI)中NNK-处理以及未处理细胞培养物的细胞生长评价NNK对BMRPA1细胞增殖的长期、稳定的影响。BMRPA1，未克隆的NNK-处理的BMRPA1细胞，以及“克隆的”BMRPA.1NNK细胞，即，如本实施例所述产生的分离细胞，以相同的密度接种在TCDs中。在预先确定的天数，通过胰蛋白酶-EDTA释放TCDs中的细胞，收集，以及在台盼蓝存在下进行计数。如图3所示，未处理的BMRPA1细胞在46代(p46)大约第9天达到稳定状态，显示接触抑制生长。相反，在NNK处理后平行生长11代的NNK-处理细胞11代在第一个9天期间显示出更快的生长(图3)，且以后生长减慢可能是因为不受NNK影响的未转化BMRPA1细胞的继续存在。分离自NNK-诱导的克隆核心分离的克隆BMRPA.1NNK细胞(图IF)在培养的12天期间以比未处理的BMRPA1细胞以更快的速率继续生长从而导致非常密集的过度拥挤。
由于细胞增长曲线能够显示NNK-处理以及未处理的BMRPA1细胞之间仅仅在有助于显著地观察细胞生长的接触抑制生长和细胞死亡的高细胞密度时的显著生长差异，NNK-处理细胞在低细胞密度时增殖的增加的固有能力通过测定这些细胞掺合BrdU的能力进一步的进行评价。测定BrdU在RNA酶处理细胞中的掺入通常用于评价增殖细胞S期过程中的DNA合成(Alberts B.，Johnson，Lewis，J.，Raff，M.，Roberts，K.，Walter，P.，2002，Molecular Biology of theCell，Garland Science，Taylor and Francis，4th ed.，NY)。通过FACS分析BrdU在未转化的BMRPA1.p58，转化未克隆的BMRPA.NNK.p11，和转化克隆的BMRPA.NNK.p23细胞中的掺入获得的结果进一步提供了NNK处理导致BMRPA1中持续过度增殖改变的证据(图4A-4E)。这些观测提供了NNK能够通过诱导接触抑制和过度增殖的病灶损失转化BMRPA1细胞的实验证据。
血清消耗对未转化的和NNK-转化的BMRPA1细胞的作用常常提到的转化细胞的一个特征是它们在低浓度生长因子和血清，不能充分提供初级和未转化细胞生长的条件下选择性生长的优点(Chung，1986；Friess等，1996；Katz和McConnick 1997)。为确定未转化和NNK转化细胞的血清依赖性，细胞被转入到补充以1％，5％和10％FBS的cRPMI培养基中，以相同的细胞数接种在24-孔TCPs的孔中，并培养12天。结晶紫试验用于评价相应的细胞生长(Serrano，1997)。此试验提供了优于Trypsin-EDTA释放细胞的计数的明显优点，因为它消除了由于在低血清浓度时细胞强粘着于TCDs发生的细胞损失(不完全释放以及细胞死亡)。
如图5所示，转化的BMRPA.1NNK细胞在所有实验的FBS浓度中具有优于未处理细胞的选择性生长优点。甚至在含有1％FBS的cRPMI培养基中，NNK转化细胞的生长好于培养在具有10％FBS的cRPMI中的未处理BMRPA1细胞。对BMRPA1.NNK细胞在严重血清-缺乏条件下持续细胞生长能力的观察提供了对BMRPA1细胞通过暴露于NNK进行转化的进一步支持。
不依赖于贴壁的细胞生长许多细胞的恶性转化已显示新获得了在琼脂上，在不依赖于贴壁条件下生长的能力(Chung，1986)。通过将细胞以低密度分散在软琼脂上检测克隆的BMRPA1.NNK和未处理的BMRPA1细胞在琼脂上生长的能力(参见实施例1)。这些细胞在14天期间形成克隆的能力显示于表3中。
表3对照BMRPA1和NNK-处理的BMRPA1细胞在琼脂上不依赖于贴壁的克隆形成
*利用目测计数栅格计算一系列30个连续1mm2区域的克隆数。显示为5个TCFs+/-SEM的克隆平均数。
证实了以前的观察(Bao等，1994)，BMRPA1细胞不能在琼脂上生长和死亡。相反，BMRPA1.NNK细胞显示出强烈的生长和形成克隆的能力。事实上，约1/4的BMRPA1.NNK细胞接种形成的克隆大于50个细胞。在琼脂上的生长表现出致瘤性转化。
Nu/Nu小鼠中的致瘤性在琼脂上生长的细胞通常在Nu/Nu小鼠中具有生长为肿瘤的能力(Shin等，1975；Colbum等，1978)。细胞在Nu/Nu小鼠中生长为肿瘤的能力被认为是恶性转化的强烈表现(Chung，1986)。因此，107个克隆的、活BMRPA1.NNK细胞皮下注射(s.c.)在Nu/Nu小鼠的后部侧面区域。另一组小鼠在类似条件下s.c.注射未转化的BMRPA1细胞。第三组Nu/Nu小鼠用BMRPA1 K-rasvall2细胞注射用于阳性对照，因为这些细胞先前已显示在Nu/Nu小鼠中形成肿瘤。
表4BMRPAI.NNK细胞在Nu/Nu小鼠中的致瘤性。
BMRPA1细胞不能在注射的5Nu/Nu小鼠中形成肿瘤，而BMRPA1.K-rasvall2迅速生长为小瘤(＜0.5cm)，在接种4周后变成肿瘤(＞1cm)。显然不同的是用克隆的BMRPA1.NNK细胞注射的Nu/Nu小鼠中肿瘤形成的过程。在用克隆的BMRPA1.NNK细胞注射后的一周之内，在所有六只小鼠的注射部位形成2-3mm的小瘤。在两个月内，3个动物中的小瘤消失。然而，直到4个月的潜伏期之后，在剩余3个动物中的小瘤在接下来的12-16周内发展为超过1cm直径的肿瘤。其中的一个携带大肿瘤团的小鼠进一步发展为腹水，此表明转移性肿瘤细胞的存在。通过BRMPA.NNK和BMRPA1.K-ras细胞形成的肿瘤的组织病理学形态显示于图6A和6B中。
通过机械破坏和胶原酶降解组合方法由一个在BMRPA1.NNK注射的Nu/Nu小鼠中的生长的肿瘤建立被命名为TUNNK的细胞系。TUNNK具有类似于注射到Nu/Nu小鼠中的克隆BMRPA1.NNK细胞的转化形态特征。迄今为止，两者之间的唯一显著不同的表型特性为TUNNY体外浮动作为细胞聚集体的倾向，表明细胞粘着特性中的重大变化发生在体内选择性生长过程中。为检验NNK-转化的细胞在Nu/Nu小鼠中的选择性生长是否导致最初的NNK-诱导的过度增殖的进一步增加，同样在相同于图4所示的条件下测定TUNNK细胞的BrdU掺入。TUNNK的增殖稍微小于最初经皮下导入到Nu/Nu小鼠中的克隆的BMRPA1.NNK(图4)。然而，所观察到的NNK-转化细胞在Nu/Nu小鼠中形成肿瘤的能力表明单独暴露于1μg NNK/ml16h影响BMRPA1细胞恶性转化中的重要、限速步骤。
实施例3利用耐受-诱导的抗体产生来鉴定肿瘤相关抗原材料和方法材料含有5.5mM葡萄糖的DMEM(DMEM-G+)，青霉素-链霉素，HEPES缓冲液，具有2mMEDTA的0.2％胰蛋白酶，牛血清蛋白(BSA)，山羊血清，和台盼蓝的RPMI1640获自GIBCO(纽约)。胎牛血清(FBS)来自Atlanta Biologicals(亚特兰大，GA)。次黄嘌呤(H)，氨基蝶呤(A)，和用于选择性HAT和HT培养基的胸苷(T)和PEG1500购自Boehringer Mans-heim(Gennany)。二氨基联苯胺(DAB)获自BioGenex(Dublin，CA)。PBS和辣根过氧化酶标记的山羊抗-小鼠IgG[F(ab’)2HRP-GαM IgG]获自Cappel实验室(Cocluanville，Pa)。抑肽酶，胃酶抑制剂，PMSF，脱氧胆酸钠，碘乙酰胺，低聚甲醛，Triton X-100，Trizma碱，OPD，HRP-GαM IgG，以及所有用于完全培养基的痕量元素购自Sigma(ST.Louis，MO)。过硫酸铵，十二烷基硫酸钠(SDS)，二硫苏糖醇(DTT)，尿素，CHAPS，低分子量标记物，和预先染色的(Kaleidoscope)标记获自BIORAD(Richmond，CA)。增强的化学发光(ECL)试剂盒获自Amersham(Arlington Heights，IL)。巯基乙醇(2-ME)和膜获自Eastman Kodak(Rochester，N.Y)。组织培养瓶(TCF)获自Falcon(Mountain View，CA)，组织，培养皿(TCDs)获自Corning(Corning，NY)，24-孔TC平皿(TCPs)和96-孔TCPs来自Costar(Cambridge，MA)。组织培养箱/玻片(每个8室)来自Miles(Naperville，IL)。
细胞和培养物所有的大鼠胰腺细胞系培养在含有10％FBS的cRPMI中。其它的细胞系获自美国组织培养物保藏中心(ATCC)，除了大鼠毛细血管内皮细胞(E49)来自Dr.M.DelPiano(Max PlanckInstitute，Dortmund，Gennany)。白血球来自健康的志愿者供体，以及人胰腺组织(解开的移植组织)由Organ Transplantation Division at DownstateMedical Center的Sommers医生提供。通过台盼蓝排除评价细胞的活力。
免疫消减超免疫流程(ISHIP)活的(106)以及低聚甲醛固定和冲洗的(106)细胞的混合物用于每一腹膜内免疫(ip)。使用六只雌性Balb/c小鼠(年龄约12周)(Harlan-Sprague Dawley Labs，St.Louis)两个小鼠在标准免疫过程中用BMRPA1细胞注射4X。其它的四个小鼠类似地用BMRPA1细胞注射3X，且在最后一次加强注射后5小时在接下来5天用60μg环磷酰胺/天/g体重进行ip注射。这些免疫抑制小鼠中的两个在最后一次环磷酰胺注射后用BMRPA1细胞再次注射。其它的两个免疫抑制小鼠每周三次或更多次用转化的BMRPA1.NNK细胞注射，且一周以后在融合前10天用转化的BMRPA1.NNK细胞进行5次额外注射超免疫小鼠(ISHIP小鼠)。所示免疫次数后的一周之内，由所有的小鼠获得血清。
杂交瘤和mAb纯化如以前的描述通过P3U1骨髓瘤细胞与来自大多数免疫抑制ISHIP小鼠的脾细胞融合获得杂交瘤(Kohler和Milstein，1975；Pytowski等，1988)。杂交瘤细胞培养在288个孔的24-孔TCPs中。杂交瘤最初在HAT DMEM-G+(20％FBS)培养基中培养10天，然后在含HT培养基中培养8d，然后在DMEM-G+(20％FBS)中培养。通过细胞-酶免疫测定(细胞-EIA)在融合后3周开始测试3X杂交瘤上清液，分析在选择特异性含mAb上清液的选择之前存在的特异性活性，用于进一步通过免疫荧光显微技术和免疫组织化学的分析。通过50％饱和硫酸铵沉淀杂交瘤上层清液纯化制得MAb3D4，且然后将沉淀溶于PBS并进行抗PBS透析。MAb 3D4被鉴定为小鼠IgG1抗体以及如以前描述的通过Sepharose-Blue色谱法由透析材料分离(Pytowski等，1988)。通过Bradford试验测定IgG部分含有约10.5mg的蛋白/mL(BioRad)。
细胞-酶免疫测定(细胞-EIA)BMRPA1和BMRPA1.NNK细胞以3×104/孔接种在具有0.1mL cRPMI-10％FBS的TCPs(96孔)中。细胞贴壁生长24小时，空气干燥，并且在室温下真空贮藏。然后用PBS-1％BSA再水合细胞，然后添加杂交瘤上清液或小鼠血清的两倍系列稀释液到每一孔中，在室温下(RT)持续45分钟。用PBS-BSA冲洗后，将HRP-GαM IgG(PBS-1％BSA中1∶100)在室温下添加到每一孔中持续45分钟。然后洗去未结合的抗体，并且在室温下添加OPD底物。在OD490nm用微孔板读数器(Bio-Rad 3550)评价底物颜色的展开。对于杂交瘤上清液而言，大于0.20(用反应血清获得的阴性对照OD值的5X)的OD490nm值被认为是阳性的。
完整细胞上的间接免疫荧光试验(IFA)通过与0.02M EDTA的PBS溶液用温育释放细胞，用PBS-1％BSA冲洗，以及在冰冷温度下存活用于分析。细胞与具有杂交瘤上清液或血清的悬浮液中培养1h，在PBS-1％BSA中冲洗(3X)，以及暴露于以1∶40稀释在PBS-1％BSA中的FITC-GαM IgG。45分钟后，洗去未结合的抗体，并通过表荧光显微镜法检测细胞。
渗透的细胞和组织切片的免疫过氧化物酶染色。
细胞和组织的制备转化以及未转化的BMRPA1细胞以1×104细胞/0.3mL cRPMI/箱接种在组织培养箱中。两天后，在4℃，4％低聚甲醛的PBS溶液中固定细胞过夜。然后用PBS-1％BSA冲洗细胞两次及其用于免疫组织化学染色。免疫组织化学染色的胰腺组织来自用4％低聚甲醛的0.1M磷酸缓冲液，pH7.2灌注的成年大鼠。由固定大鼠切除固定的胰腺并在4％缓冲的低聚甲醛中于4℃过夜保藏。
然后冲洗胰腺并置于30％蔗糖中过夜。用Jung低温恒温器(Leica)制备冷冻组织切片(10μl)，置于凝胶-涂层载玻片上，-20C储存。然后在4％缓冲的低聚甲醛中后固定细胞系或组织切片1分钟，在Tris缓冲液(TrisB)(0.1M，pH 7.6)中冲洗，并在室温下置于Triton X-100(0.25％TrisB)15分钟。然后如以前的描述进行免疫组织化学分析(Guz等，1995)。
3D4-Ag的Western印迹分析用于测试3D4-Ag是否存在的细胞系铺满生长在25cm2TCDs中，用冰冷PBS冲洗，并培养在具有含50mMTris-HCl、1％ NP40，0.5％脱氧胆酸钠、0.1％ SDS、5mM EDTA、1μg/mL、2μg/mL胃蛋白酶抑制剂、1mM PMSF以及5mM碘乙酰胺的0.5mLRIPA裂解缓冲液(pH8)的冰上。30分钟后，将剩余的细胞碎片刮入裂解溶液中，并以11,500xg离心细胞裂解物15分钟来除去不溶的碎片。胰腺组织的细胞裂解物按类似方式处理用于Western印迹分析，区别在于2片～2mm3的每一组织类型用Dounze匀浆器在1mL RIPA裂解缓冲液中在冰温下进行匀浆。通过Bradford试验(BioRad)测定每一裂解物的蛋白浓度。细胞提取物与等体积的样品缓冲液(125mM Tris-HCl，2％(v/v)2-巯基乙醇，2％SDS，0.1％溴酚蓝，20％v/v甘油，pH6.8)混合。如以前的描述(Laemmli，1970通过SDS-PAGE由每一样品(20μg/孔)分离蛋白，并电转移在硝化纤维膜上。膜与在TBS-T中的5％(w/v)乳粉一起温育1h后，添加mAb 3D4(1∶200)和HRP-GαM IgG并利用ECL试剂盒按照制造商(Amersham)的建议进行化学发光放大。通过曝光X-OMAT膜(Kodak)测定每一测试样品中化学发光的目的蛋白的存在。
2D等电点聚焦/SDS-Duraclyl凝胶电泳的多肽分离。
以105细胞/25cm2TCF铺板未转化的和NNK-转化的细胞，每三天加料一次，并培养直到未转化的细胞铺满。瓶中的细胞然后在用于Bradford′s蛋白测定的RIPA缓冲液或者在裂解缓冲溶液中裂解，所述裂解缓冲溶液由0.1g DTT，0.4g CHAPS，5.4g尿素，500μL的Bio-lyte两性电解质，6mL ddH2O，5mM EDTA，1μg/mL蛋白酶抑制剂，2μg/mL抑肽酶，1mM PMSF以及5mM碘乙酰胺组成。在11,500xg离心细胞裂解物15分钟来除去不溶的碎片。然后使用预制的第一和第二向凝胶和来自Genomic Solutions(MA)的设备。将蛋白(100μg)上样在第一向(pI3-10)中，其在300V电泳3小时，然后在1000v电泳17h。用于每一实验的第二向利用预制的10％SDS-Duracryl凝胶(Genomic Solutions，MA)以20mA/凝胶进行电泳。将分离的多肽以1.25mA/cm2(484mA)在半干的条件下快速地转移到硝化纤维膜，1h，或根据制造商的说明(GenomicSolutions，MA)进行银染色。硝化纤维膜然后用于通过Western印迹分析进行的3D4-Ag检测，然后用Rev Pro(Genomic Solutions，MA)或Amido黑(Sigma)染色。如以前描述(O’Farrell，1975)测定来自第一向凝胶的0.5cm切片的pH梯度。利用100 ASA黑白(Kodalc)胶片对2D分离多肽的银染色照相。
显微照相术染色的细胞培养物或组织样品的所有观察和照相用装备有照相机和相位光学装置的Leitz倒置照相显微镜进行，利用125ASA黑白，400 ASA Ektachrome(Kodak)或1600 ASA PROVIA(Fuji)胶片。
实施例4结果免疫消减超免疫流程(ISHIP)发展的产生抗体的免疫消减方法能利用充分限定剂量的环磷酰胺能够优选杀死已被刺激来增殖主要针对复合Ags共用的免疫显性表位应答的B-细胞的能力优点，所述抗体能够识别两个紧密相关的复合抗原之间的差别(Aisenberg，1967；Aisenberg and Davis，1968；Williams等，1992；Matthew andSandrock，1987；Pytowski等，1988)。过去，用大剂量绵羊红细胞形式的免疫后施用环磷酰胺产生非常有效的抗原-特异性免疫耐受，而如果在较低剂量的Ag后施用药物，则特异性免疫耐受性就不是有效的(Aisenberg 1967；Aisenberg和Davis，1968；Playfair，1969)。为提高环磷酰胺在消除免疫针对未转化的BMRPA1细胞(“耐受原”)上呈递的抗原应答的免疫细胞增殖的克隆的有效性，设计了一种免疫流程，其中用BMRPA1细胞3次免疫后施用环磷酰胺(图7)。通过用来自免疫和环磷酰胺-处理小鼠的血清的细胞-EIA开始评价环磷酰胺对干燥BMRPA1细胞免疫抑制的程度。由用BMRPA1细胞i.p免疫4次的小鼠收集的血清含有对于这些细胞而言相当大的抗体滴度(图7A)。相反，当注射三次BMRPA1细胞然后5小时后以及接下来5天通过i.p注射环磷酰胺时，在所有检验的4只小鼠中观察到强烈的免疫抑制。显然，环磷酰胺处理后用BMRPA1细胞加强注射没有引起耐受原抗体滴度的恢复(图7A)。这些结果通过对大鼠胰腺组织的免疫组织化学得以证实(图7B)。用BMRPA1细胞免疫的小鼠的血清观察到与大鼠胰腺组织的强烈交叉反应活性(图7B，左边)，而来自BMRPA1免疫和随后环磷酰胺-处理小鼠的血清几乎没有显示大鼠胰腺组织的染色(图7B，右边)。
在这些研究中使用的环磷酰胺剂量已经显示在小鼠体内优先杀死抗原-特异性增殖B细胞和T细胞，但是它同样对脾细胞具有额外的、非特异性的细胞毒作用(Aisenberg，1967；Aisenberg and Davis，1968；Turk等，1972；Lagrange等，1974；Marinova-Mutafchieva等，1990；Pantel等，1990)。这种以前描述的非特异性的免疫抑制据报道存在于免疫消减流程中在环磷酰胺处理后3到7周时(Aisenberg 1967，1968)，其是当转化的BMRPA1.NNK细胞(新的抗原)将被导入到耐受未转化BMRPA1细胞(耐受原)的动物体内的时间。这种部分非特异性免疫抑制的状态可减少对存在于用于可能降低目的抗体产生的融合的动物脾中转化抗原的特异性B-细胞的数目。此外，甚至在经典免疫中当具有所有完整免疫系统的动物用癌细胞注射时，观察到转化相关的抗原具有低的免疫原性(Old，1981；Shen等，1994)。为了使这些潜在的问题最小化以及增加通过肿瘤抗原刺激增殖的B-细胞的数目，通过环磷酰胺对BMRPA1细胞次级免疫应答的免疫抑制后用BMRPA1.NNK细胞i.p.免疫，10和16天后两次加强注射，以及在杂交瘤融合之前用转化细胞另外加强注射5次进行快速超免疫。对来自用于杂交瘤融合的小鼠超免疫之前和之后收集的血清进行细胞-EIA，表明用BMRPA1.NNK细胞注射5次进行的快速超免疫引起针对BMRPA1.NNK细胞的抗体滴度的增加(图7C)。
NNK-转化的和未转化的BMRPA1细胞之间抗原性差别的测定通过细胞-EIA测定由288个孔收集的杂交瘤上层清液只与干燥NNK-转化和未转化的BMRPA1细胞反应的IgG抗体的存在。在融合后18到21天评价确定了288孔中的265(92％)含有一或多个生长的杂交瘤细胞。通过细胞-EIA，来自73个孔(或23.5％)的上清液含有与转化的BMRPA1.NNK细胞反应的抗体。与此相反，仅仅47(或16.3％)个上清液与BMRPA1细胞反应，表明BMRPA.NNK细胞表达并不由未转化的BMRPA1细胞表达的抗原。此外，所有的47个与BMRPA1细胞反应的杂交瘤上清液显示出与转化的BMRPA1.NNK细胞的交叉反应性。
选择的杂交瘤上清液与完整的未转化和转化的BMRPA1细胞的免疫反应性如在干燥、破碎的细胞上进行细胞-EIA测试的，上清液中的抗体可接触和结合胞内和原生质膜抗原。为了获得识别抗原的细胞位点的相关初始信息，最初选择5个杂交瘤上清液通过IFA在完整细胞上进行进一步的实验，因为通过细胞-EIA这些上清液一致地显示出仅仅与BMRPA1.NNK细胞(上清液3A2；3C4；3D4)或者与BMRPA1.NNK和BMRPA1细胞二者(上清液4AB1；2B5)具有所希望的强烈活性。如表5中所概括的，上清液3C4，4AB1和2B5染色的完整细胞的细胞表面与细胞-EIA的结果相符合。显著地，3C4染色的BMRPA1.NNK(图8D)和BMRPA1.K-rasvall2细胞(图8F)是环状的，但是没有染色未转化的BMRPA1细胞的细胞表面(图8H)，这表明3C4-抗原仅仅存在于转化细胞的表面膜上。
表5通过免疫荧光显示的所选择的上清液与完整细胞的免疫反应性。
*通过比较每一样品与平行制备的用来自超免疫小鼠的血清(阳性对照，IFA＝3+)染色的细胞以及未反应消耗的杂交瘤上清液[阴性对照，IFA＝(-)]的荧光强度，测定间接免疫荧光染色的强度。
识别EDTA-释放的完整细胞表面上的抗原的另一杂交瘤上清液(2B5和4AB1)，与转化的和未转化的细胞的原生质膜抗原以斑点模式进行反应(表5)。有趣地是，杂交瘤上清液3D4和3A2没有染色完整的、EDTA-释放的活的未转化或转化的BMRPA1细胞。考虑到3D4和3A2通过细胞-EIA与BMRPA1.NNK干燥细胞的强烈、稳定的反应性，通过间接免疫荧光与EDTA-释放的完整细胞的类似反应性的缺失表明3D4和3A2抗原可能在转化BMRPA1细胞中具有胞内位点。
用3D4渗透性转化的BMRPA1.NNK细胞的免疫细胞化学染色为了证实3D4-抗原在BMRPA1.NNK细胞中的可能胞内位置，在固定的Triton-X-100渗透性细胞上进行免疫细胞化学染色。如图9所示，超免疫、阳性对照血清染色整个细胞体以及大多数细胞组分包括扩散的、渗透性NNK细胞的展开原生质膜(图9F)。有趣地是，用mAb 3D4染色主要地保持在细胞质中且特别是在渗透性BMRPA1.NNK(图9E)和BMRPA1.K-rasvall2细胞的核周区域，在活跃分裂的细胞中具有特别强烈的染色。相反，mAb 3D4不与渗透性但是未转化的BMRPA1细胞反应(图9C)，其在载玻片上的单层上皮细胞外观可在用增加了抗这些细胞的免疫小鼠血清染色后被很好地看到(图9D)。最重要地，mAb 3D4不与标准大鼠胰腺组织中的不同细胞类型反应，包括导管、腺泡和胰岛细胞(图9A)，表明3D4-抗原是转化相关的抗原。
3D4-抗原是41.2kD的啮齿动物和人癌症相关的抗原。用mAb3D4的Western印迹染色在K-Ras和NNK-转化的BMRPA1细胞中显示出～41.21kD的单条带，然而在未转化的BMRPA1细胞中没有该条带(图10)。很明显，强烈的3D4-抗原表达同样在人胰腺癌细胞CAPAN1(图11，条带6)和CAPAN2(没有显示)中观察到，作为分子量类似于在BMRPA1.K-rasvall2细胞(图11，条带2)中观察到的条带。在来源于未转化的人腺泡(图11，条带4)和胰管细胞(图11，条带5)的细胞裂解物中没有发现3D4-抗原。此外，没有在ARIP中观察到3D4-抗原表达(图5，条带3)，ARIP为来源于外分泌大鼠胰腺肿瘤的初级培养物的细胞系。重要的是注意到来源于大鼠胰腺肿瘤的ARIP细胞，显示出正常的细胞特性并生长为具有鹅卵石外观的单层并且在裸鼠中不产生肿瘤。
同样通过Western印迹分析测定3D4-抗原在来自人肺癌(A549)，转化的初级胚肾癌(293)，宫颈上皮(HeLa)，结肠腺癌(CaCo-2)，正常人白血球(WBC)，小鼠成纤维细胞(L929)以及小鼠黑素瘤细胞(B16)细胞中的表达(图12)。仅仅在A549人肺癌和B16小鼠黑素瘤细胞中观察到强烈的3D4-抗原表达(图12，条带1，7)。
在余下的癌细胞系，L929小鼠成纤维细胞(图12)和E49大鼠脑毛细血管内皮细胞(未显示)中没有3D4表达。在正常人白血球(图12，条带5)和初级人脐带内皮细胞HUVEC(未显示)中没有检测到3D4抗原。这些结果表明3D4-Ag是癌症相关的抗原，其表位和分子量在小鼠，大鼠和人的一些选择的癌细胞中是保守的。
通过2D多肽分离，随后进行银染和Western印迹来鉴定3D4-抗原。双向(2D)凝胶电泳可以根据分子量和等电点由总细胞裂解物分离数以千计的多肽(O′Farrell，1975)。通过分离更大量的待分离蛋白，使结果更可再现，以及改进检测方法和2D图谱分析，技术的进步继续提高了2D分离技术的能力(Bauw等，1989；Kovarova等，1994)。为了更好地鉴定3D4-抗原，根据在第一向中3-10pH梯度上的pI分离100μg的总细胞裂解物蛋白，然后根据分子量在第二向通过Duracyl凝胶电泳分离。含有来自NNK-转化和未转化BMRPA1细胞的2D分离多肽的凝胶银染色显示了可再现的2D分离和多肽图谱(图13A和13B)。来自NNK-转化和未转化细胞的2D分离多肽的银染色显示大多数多肽在未转化的和NNK-转化细胞中以类似的水平表达。然而，BMRPA1和BMRPA1.NNK细胞之间的定量和定性的多肽表达差异是显而易见的。
将分离多肽由未染色的凝胶转移到硝化纤维膜，然后用mAb 3D4进行Western印迹分析鉴定的3D4-抗原作为为大鼠(pI约6.24+/-0.25，6.30+/-0.20和6.48+/-0.25)，以及人(pI约6.6，6.7以及6.9)胰腺癌细胞系中具有三个电荷变体的多肽。相同的膜用Rev-Pro和Amido黑进行的多肽染色显示出与用更敏感的银染色来自并行电泳凝胶相同的多肽谱，有助于确定3D4-抗原相对于总细胞裂解物中其它蛋白的定位(图13D，13C)。容易识别的主要蛋白例如肌动蛋白(43 kD)的位置，以及所用的分子量标准(2D和1D)有助于确定人和大鼠细胞中～41.2kD的分子量的3D4-抗原。
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权利要求
1.将动物的免疫应答重定向到免疫性较弱或者罕见的抗原的方法，所述方法包括下列步骤(a)给动物施用第一组抗原并且进行第一以及二次免疫应答；(b)给动物施用抑制迅速增殖免疫细胞生长的免疫抑制剂；(c)给动物施用第二组与第一组抗原类似，或者相关但是不同的抗原；以及(d)加强注射足以提高针对第二组抗原的抗体滴度并且引起分泌针对第二组抗原的抗体的浆细胞增强迁移到动物的脾的第二组抗原。
2.产生与免疫性较弱或者罕见的抗原特异性反应的单克隆抗体的方法，所述方法包括下列步骤(a)给动物施用第一组抗原并且进行第一以及二次免疫应答；(b)给动物施用抑制迅速增殖免疫细胞生长的免疫抑制剂；(c)给动物施用第二组与第一组抗原类似，或者相关但是不同的抗原；以及(d)加强注射足以提高针对第二组抗原的抗体滴度并且引起分泌针对第二组抗原的抗体的浆细胞增强迁移到动物的脾的第二组抗原；(e)从动物分离脾细胞；以及(f)将分离的脾细胞与在培养基中能够无限复制骨髓瘤细胞或者转化细胞融合，以产生分泌与免疫性较弱或者罕见的抗原特异性反应的单克隆抗体的杂交瘤。
3.根据权利要求1或2的方法，其中免疫抑制剂为环磷酰胺。
4.权利要求1或者2的方法，其中第一组抗原包括未转化的细胞，并且第二组抗原包括从经致瘤性转化衍生的细胞。
5.权利要求1或者2的方法，其中第二组抗原包括天然以及变性形式的抗原。
6.权利要求4的方法，其中第一组抗原包括BMRPA1(BMPRA.430)细胞并且第二组抗原包括BMRPA1.NNK细胞。
7.权利要求4的方法，其中第一组抗原包括BMRPA1(BMPRA.430)细胞并且第二组抗原包括TUC3(BMRPA1.K-rasva112)细胞。
8.权利要求4的方法，其中第二组抗原包括肿瘤相关抗原或者肿瘤特异性抗原。
9.权利要求8的方法，其中癌症相关抗原为胰腺癌相关抗原。
10.根据权利要求8的方法，其中肿瘤相关抗原为胰腺肿瘤相关抗原。
11.能够培养分化状态的BMRPA1细胞的培养基，该培养基包括约0.02 M的谷氨酰胺，约0.01到约0.1M的HEPES-缓冲液，溶于乙酸浓度范围从约0.001到约0.01mg/mL乙酸/L培养基的牛胰岛素)，约1到约8×10-7M ZnSO4，约1到约8×10-10M的NiSO46H2O，5×10-7到约5×10-6的CuSO4，约5×10-7到约5×10-6的FeSO4，约5×10-7到约5×10-6M的MnSO4，约5×10-7到约5×10-6M的(NH4)6Mn7O24，约0.3到约0.7mg/L培养基的Na2SeO3，约1×10-10到约8×10-10M的SnCl22H2O以及约5×10-4到约5×10-5M的甲氨酰胆碱，其中所述培养基具有调节到从约6.8到约7.4范围的pH。
12.由权利要求2的方法产生的单克隆抗体。
13.转化的BMRPA1(BMPRA.430)细胞，暴露于1μg NNK/ml培养基约12到约24小时。
14.细胞系BMRPA1.NNK，衍生自权利要求13的细胞。
15.细胞系TUNNY，衍生自注射了BMRPA1.NNK细胞的小鼠的肿瘤。
16.基本上为纯化形式的癌症结合抗原3D4-Ag，其特征在于通过SDS-PAGE确定的约41.2kD的分子量；约5.9到约6.9的等电聚焦pI以及；可在BMRPA1.NNK细胞，BMPRA1.TUC3细胞，BMRPA1.TUNNY细胞，人胰腺癌细胞系CAPAN1，CAPAN2，A549人肺癌细胞以及B16小鼠黑素瘤细胞中检测到。
17.与癌症相关抗原3D4-Ag具有特异性结合特异性的抗体，其中所述抗原的特征在于通过SDS-PAGE确定的约41.2kD的分子量；约5.9到约6.9的等电聚焦pI以及；可在BMRPA1.NNK细胞，BMPRA1.TUC3细胞，BMRPA1.TUNNY细胞，人胰腺癌细胞系CAPAN1，CAPAN2，A549人肺癌细胞以及B16小鼠黑素瘤细胞中检测到。
18.权利要求17的抗体，为单克隆抗体。
19.鼠杂交瘤细胞系，产生与权利要求16的3D4-Ag具有特异性免疫活性的单克隆抗体。
20.单克隆抗体mAb3D4，由权利要求19的杂交瘤分泌。
21.由权利要求6的方法产生的杂交瘤，其中杂交瘤产生结合于BMRPA1以及BMRPA1.NNK细胞表面上抗原的抗体。
22.由权利要求21的杂交瘤产生的抗体，其中所述抗体为mAb4AB1或mAb2B5。
23.由权利要求6的方法产生的杂交瘤，其中杂交瘤产生结合于BMRPA1.NNK细胞而非未转化的BMRPA1细胞的抗原的抗体。
24.由权利要求23的杂交瘤产生的抗体，其中抗体为mAb3A2。
全文摘要
本发明提供了将动物的免疫应答定向到诸如肿瘤抗原的免疫活性较弱或者罕见的抗原的方法。所述方法将消减免疫与超免疫结合并且引起靶特异性抗体，辅助T细胞(CD4+－T淋巴细胞)以及细胞毒性T细胞(CD8+－T淋巴细胞)的控制或者定向生成。本发明还提供了未转化以及转化的细胞系，以及分化状态的未转化细胞系生长所需的生长培养基。本发明还提供了与不同的致瘤细胞反应的单克隆抗体以及产生这种抗体的杂交瘤。
文档编号C12P21/08GK1984999SQ200480003042
公开日2007年6月20日 申请日期2004年1月29日 优先权日2003年1月29日
发明者约瑟夫·米希尔, 斯特凡·M·布拉度 申请人:纽约州立大学研究基金会