磁性细胞及其使用方法

专利名称：磁性细胞及其使用方法
技术领域：
本发明涉及在医疗、尤其是再生医疗中有效使用的磁性细胞及其使用方法。
背景技术：
一般而言，在给药后药物分布于全身，因此，对于以抗癌药为首的副作用较强的药物，希望其以高浓度存在于作用部位，而不分布于其它部位。为了使药物集中于局部，已尝试了各种方法，其中之一为使用磁性粒子，通过外部的磁力使药物集中于局部的方法。例如，将磁性体与药物一同包含在脂质体内给药，并通过磁力向局部诱导，从而能够提高药物的局部浓度。(例如参照日本口腔外科学会志1997年2月号p55-61)。
另外，已知有将由磁铁矿等铁磁体和高分子形成的磁珠表面以抗体修饰、利用抗原抗体反应进行细胞分离形成的技术，该技术用于HLA的定型、造血干细胞的选择等(例如参照Biomaterial 2003年2月号p113-119)。

发明内容
但是还没有在可应用于再生医疗等之中的间叶细胞或软骨细胞等细胞中结合了磁性粒子的实例。因此在结合了磁性粒子的细胞给药后能否通过外部的磁力而在局部滞留、或者细胞能否发挥其本来的作用等方面还存在有较多需要解决的未知问题。
本发明人等经过深入研究，结果着眼于细胞表面的性能而完成了本发明。即，本发明的第一种方案为提供一种在细胞表面具有磁性粒子的磁性细胞。通过该细胞的构成，能够利用磁性粒子的磁性将细胞移动至理想的部位。
本发明的磁性细胞的优选方案中，前述表面与前述磁性粒子通过连接体(linker)结合，或者前述表面通过前述磁性粒子具有的特定氨基酸序列粘合。作为前述特定的氨基酸序列，例如可以举出精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸的四个氨基酸构成的肽(RGDS)、或者甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸的五个氨基酸构成的肽(GRGDS)。
本发明的磁性细胞的优选方案中前述表面和前述连接体通过抗原抗体反应进行结合。
本发明的磁性细胞的优选方案中，前述连接体和前述磁性粒子通过化学键结合。
本发明的磁性细胞的优选方案中，前述磁性粒子中至少包含磁性体。
本发明的磁性细胞的优选方案中，前述磁性粒子中还包含药物。
本发明的磁性细胞的优选方案中，前述细胞选自软骨培养细胞、间叶细胞、淋巴细胞及表达整联蛋白的细胞。
本发明的第二种方案为提供一种培养磁性细胞的方法，所述方法包括制备前述磁性细胞的步骤和培养前述磁性细胞的步骤。
另外，本发明的第三种方案为提供一种滞留磁性细胞的方法，所述方法包括下述步骤，即，使前述磁性细胞向病灶部位移动并保留在该部位的步骤，和通过磁场使前述磁性细胞长时间滞留在前述病灶部位的步骤。
本发明的滞留方法的优选方案中，前述滞留步骤通过在体外对病灶部位施加前述磁场或将磁石埋入体内而得以实施。
另外，本发明的第四种方案为提供一种控制磁性细胞活动的方法，所述方法包括以下步骤，即，将前述磁性细胞和含有药物的磁性粒子同时或者分别给予病灶部位的步骤，和从前述磁性粒子中释放前述药物的步骤。
本发明的控制方法的优选方案中，前述药物选自促骨形成药、癌治疗药、或者痴呆症治疗药。
另外，本发明的第五种方案为提供一种治疗方法，所述方法包括以下步骤，即，将前述磁性细胞和含有药物的磁性粒子同时或者分别给予病灶部位的步骤，和从前述磁性粒子中释放出前述药物的步骤。
本发明的治疗方法的优选方案中，前述药物选自促骨形成药、癌治疗药、或者痴呆症治疗药。
通过将本发明的磁性细胞导入生物体内，并利用体外的磁场作用，可以将其长时间保留在病灶部位，因而能够有效发挥该细胞本来具有的功能。另外，通过利用本发明中的磁性细胞，可根据治疗的需要，适用于软骨形成等再生医疗或抗癌药等的药物释放系统。


图1示出本发明的第一种实施方案中磁性细胞的简图。
图2示出本发明的第二种实施方案中磁性细胞的简图。
图3示出作为再生医疗的软骨修复说明图。
图4示出将本发明的磁性细胞注射到关节内1个月后，约72小时不存在外部磁场的情况(A)以及存在外部磁场的情况(B)观测到的显微镜照片(50倍)。
图5示出在大鼠骨髓间叶干细胞中观测到的、本发明磁性细胞的制备例2(A)及3(B)中制备的磁性细胞的显微镜照片(480倍)。
图6示出用软骨诱导培养基对本发明中通过CD44或RGDS肽制成的磁性细胞(大鼠骨髓间叶干细胞)进行21天沉淀培养后，利用RT-PCT法研究II型胶原蛋白、聚集蛋白聚糖(来自软骨)的mRNA(基因)表达的结果。
图7为利用大鼠的神经干细胞说明本发明磁性细胞的形成状态的照片，(A)为400倍的照片，(B)为1600倍的照片。
具体实施例方式
下述实施方案是用于说明本发明的示例，本发明不仅限于所述实施方案。只要不脱离本发明的要点，也可以通过各种方案实施本发明。
(第一种实施方案)本发明的磁性细胞是基于对存在于细胞表面的粘合成分的利用而得到的。图1为本发明的第一种实施方案中磁性细胞10的简图。该磁性细胞10含有磁性粒子60，所述磁性粒子60通过连接体50与糖蛋白质40结合，所述糖蛋白质40表达在含有核30的细胞20的表面。本发明中利用的糖蛋白质40并不限定于下述物质，但优选CD44或HLA。
作为本发明的磁性粒子60，例如可以举出含有磁性体70的脂质体。所述脂质体中可以进一步含有能够控制细胞功能的药物80，另外，磁性体及药物也可以使用其它类型的包封材料进行包封。
此处，脂质体为具有水性内部的球形脂质双层。形成脂质体时，存在于水性溶液中的分子进入水性内部。脂质体的内容物被保护于外部的微环境之外，并且由于脂质体与细胞膜融合因而该内容物可被有效输送至细胞质内。
本发明中使用的脂质体只要是普通的公知脂质体即可，尤其可以举出能够用于口服给药或者注射的脂质体。可以适用上述脂质体，也可以利用公知的材料重新设计、形成脂质体。具体而言，优选使用含有磷脂、甘油醚磷脂(ether glycerophosphatide)、(神经)鞘磷脂、甘油糖脂、神经鞘糖脂作为脂质体膜的主要构成成分，并含有甾醇类或生育酚类等作为使脂质体膜稳定化的脂质成分的脂质体等。
作为上述磷脂，可以使用天然磷脂、合成磷脂等普通的公知磷脂。优选使用下述磷脂，例如(1)磷脂酰胆碱、(2)磷脂酰乙醇胺、(3)磷脂酰甘油、(4)磷脂酰丝氨酸、(5)磷脂酸、以及(6)磷脂酰肌醇等。
上述(1)的磷脂酰胆碱可以举出，例如蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、源自大豆的磷脂酰胆碱、源自大豆的氢化磷脂酰胆碱等天然磷脂酰胆碱类；含有碳原子数为7～22的饱和或者不饱和羧酸作为构成成分的磷脂酰胆碱等合成磷脂酰胆碱类。作为具体例可以举出二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱等。作为上述脂肪酸残基可以举出辛酰基(octanoyl)、壬酰基(nonanoyl)、癸酰基(decanoyl)、十一烷酰基(undecanoyl)、十二烷酰基(rauroyl)、肉豆蔻酰基(myristovl)、棕榈酰基(palmitoyl)、油基(oleyl)、硬脂基(stearyl)、棕榈油酰基(palmitoleyl)、油基(oleyl)、亚油酰基(linoleyl)、亚麻酰基(linolenyl)、花生四烯酰(arachidonyl)等基团。另外，结合在甘油的1-位、2-位的脂肪酸残基部分可以相同也可以不同。
前述(2)的磷脂酰乙醇胺可以举出例如，源自大豆的磷脂酰乙醇胺、源自大豆的氢化磷脂酰乙醇胺等天然磷脂酰乙醇胺类；含有碳原子数为7～22的饱和或者不饱和羧酸的磷脂酰乙醇胺等合成磷脂酰乙醇胺类。作为具体例可以举出二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺等。作为脂肪酸残基，可以举出与前述(1)同样的基团。
前述(3)的磷脂酰甘油可以举出例如，含有碳原子数为7～22的饱和或者不饱和羧酸的磷脂酰甘油等合成磷脂酰甘油类。作为具体例可以举出二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油等。作为构成脂肪酸残基，可以举出与前述(1)同样的基团。
前述(4)的磷脂酰丝氨酸可以举出例如，源自大豆的磷脂酰丝氨酸、源自大豆的氢化磷脂酰丝氨酸等天然磷脂酰丝氨酸类；含有碳原子数为7～22的饱和或者不饱和羧酸的磷脂酰丝氨酸等合成磷脂酰丝氨酸类。作为具体例可以举出二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、二油酰磷脂酰丝氨酸等。作为构成脂肪酸残基，可以举出与前述(1)同样的基团。
前述(5)的磷脂酸可以举出例如，含有碳原子数为7～22的饱和或者不饱和羧酸的磷脂酸等合成磷脂酸类。作为具体例可以举出二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二油酰磷脂酸等。作为构成脂肪酸残基，可以举出与前述(1)同样的基团。前述(6)的磷脂酰肌醇可以举出例如，源自大豆的磷脂酰肌醇、源自大豆的氢化磷脂酰肌醇等天然类磷脂酰肌醇；也可以使用合成类磷脂酰肌醇。作为构成脂肪酸残基，可以举出与前述(1)同样的基团。
另外，作为本发明中使用的脂质体膜的构成成分，也可以使用甘油磷脂、(神经)鞘磷脂、甘油糖脂、神经鞘糖脂等。本发明中作为使脂质体膜稳定化的脂质成分，可以使用甾醇类或生育酚类。作为前述甾醇类，只要是普通公知的甾醇类即可，可以举出例如，胆甾醇、谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇等，从购入性方面考虑，优选使用胆甾醇。作为前述生育酚类，只要是普通公知的生育酚类即可，从购入性方面考虑，优选使用市售的α-生育酚。
作为本发明中使用的包封材料，可以使用离子交换树脂、结晶性陶瓷、生物体可适性玻璃、胶乳，也可以与各种表面活性剂一同制成微球进行使用。而且，也可以使用毫微球、及其它脂质、聚合物或者蛋白质材料作为前述包封材料。包封材料的直径优选为数十～数百nm，没有特别的限制。另外，所述药物的包封材料至少含有磁性体，可以包含药物，也可以不包含药物，但是从细胞控制方面考虑，优选包含药物。
另外，本发明的药物包封材料也可设置用于控制药物释放的药物释放控制成分，作为控制药物释放速度的成分，可以举出高分子、温度敏感性分子、超声波及/或磁敏感性物质。具体可以举出特开平5-228358记载的具有浊点的高分子化合物(聚丙烯酸类聚合物)，特开平11-92360记载的超声波敏感性物质(卟啉衍生物、呫吨衍生物)等。
作为本发明中利用的磁性体，只要是具有磁性的物质即可，无任何限制，常磁性、超常磁性、强磁性均可，强磁性中除了亚铁磁性，也包括铁磁性。作为磁性体的具体例，除了磁铁矿(Fe2O3)、磁赤铁矿之外，还可以举出铁、钴、镍等强磁性元素的化合物粒子。所述强磁性化合物中，磁铁矿、磁赤铁矿未表现出对生物体的毒性，并且稳定，因此被优选使用。特别优选磁铁矿。
前述磁性体不仅包括前述强磁性化合物单独存在的情况，也可以包括用纤维素、淀粉、糊精、琼脂、甲基丙烯酸酯或苯乙烯等进行包埋或由磁性细菌生物合成、经磷脂被覆磁铁矿得到的磁性粒子。
下面说明本发明中使前述细胞的表面具有磁性粒子的方法。作为该方法，可以举出细胞表面的反应性官能团和磁性粒子的反应性官能团通过共价键结合的方法、或通过连接体使其结合的方法等。作为本发明中使用的连接体，可以举出两个末端具有羧基或氨基等反应性官能团的化合物(以下，简称为“双官能性间隔体(bifunctional spacer)”)或者抗体。作为细胞磁性细菌和连接体的结合方法，可以举出下述优选例，例如，使粉碎磁性细菌得到的被覆有磷脂膜的磁性粒子通过双官能性间隔体与细胞表面的反应性官能团结合的方法；或者通过抗原抗体反应使细胞表面的HLA或CD44等粘合分子结合在下述结构上的方法等，前述结构为使表面经羧基修饰的磁性粒子和用作连接体的抗体的氨基键合成酰胺键而形成的结构。
本发明的磁性细胞可以为下述任一形式，即，磁性粒子含有在细胞内部，磁性粒子结合在细胞表面，或者磁性粒子通过连接体结合在细胞表面。作为使磁性粒子含有在细胞内部的方法，可以通过对磁性粒子实施例如特开平6-133784记载的利用粒子枪的方法而实现。
本发明的第一种实施方案中，作为前述磁性粒子60中含有的药物80，可以举出以细胞因子(cytokin)等负责细胞信息传递体系的物质为代表的生理活性物质等，但是并不限定于此。作为细胞因子的具体例，可以举出干扰素类(IFN-α、IFN-β、IFN-γ等)、白细胞介素类(IL-1～18等)、淋巴毒素类、肿瘤坏死因子(TNF-α等)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF、CSF-1)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、促红细胞生成素、血栓形成素、造血干细胞因子(SCF)、单核细胞趋化活化因子(MCAF)、转化生长因子(TGF-α、TGF-β)、成纤维细胞生长因子(FGF)、上皮细胞生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、神经细胞生长因子(NGF)等。特别优选干扰素类、白细胞介素类、肿瘤坏死因子、促红细胞生成素、血栓形成素、转化生长因子、成纤维细胞生长因子、上皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、神经细胞生长因子等。
另外，作为前述药物80，也可以举出需要对病灶部位进行预防及/或治疗的疾病的药物等，作为药物的具体例，抗癌药可以举出伊立替康三水盐酸盐(Irinotecan HCl Trihydrate)、自力霉素(mitomycin)、5-氟尿嘧啶、顺氯氨铂(cisplatin)、盐酸吉西他滨(gemcitabine hydrochloride)、阿霉素(doxorubicin)、紫杉醇(taxol)等，但并不局限于此。另外作为阿尔茨海默病(Alzheimer)治疗药可以举出盐酸多奈哌齐(donepezilhydrochloride)等。通过将所述药物80置于构成磁性细胞的脂质体内，可以将本发明的磁性细胞活用为药物释放系统。
前述药物80也可以形成盐。所述盐的优选例可以举出与无机酸形成的盐、与有机酸形成的盐、与无机碱形成的盐、与有机碱形成的盐、与酸性或者碱性氨基酸形成的盐等，其中优选药理学允许的盐。作为与无机酸形成的盐的优选例，可以举出例如与盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等形成的盐。作为与有机酸形成的盐的优选例，可以举出例如与醋酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、酒石酸、枸橼酸、乳酸、硬脂酸、苯甲酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸等形成的盐。作为与无机碱形成的盐的优选例可以举出，例如钠盐、钾盐等碱金属盐；钙盐、镁盐等碱土类金属盐；铝盐、铵盐等。与有机碱形成的盐的优选例可以举出，例如与二乙胺、二乙醇胺、葡甲胺(meglumine)、N，N’-二苄基乙二胺等形成的盐。
前述药物80在作为相关疾病的预防或者治疗药给予患者时，给药途径、给药量、给药次数因患者的症状、疾病的种类·程度、年龄、心·肝·肾功能等而异，无法进行限定。例如，用于治疗人类癌症时，成人口服给药量为0.01mg～1000mg/日、优选为0.1mg～1000mg/日、更优选为0.1mg～100mg/日，成人静脉给药量为0.01mg～500mg/日、优选为0.1mg～500mg/日、更优选为0.1mg～100mg/日，可根据症状，一日分成1次至5次进行给药。
也可以制成含有前述药物80的药物组合物导入磁性细胞，前述组合物可以使用赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、稳定剂、矫味矫臭剂、稀释剂等添加剂，以公知的方法进行制备。赋形剂的具体例可以举出乳糖、白糖、葡萄糖、玉米淀粉、马铃薯淀粉、α-淀粉、糊精等淀粉衍生物；结晶纤维素等纤维素衍生物；阿拉伯胶、糊精、支链淀粉等有机类赋形剂；及轻质硅酸酐、合成硅酸铝、硅酸钙、硅酸铝酸镁等硅酸盐衍生物；磷酸氢钙等磷酸盐；碳酸钙等碳酸盐；硫酸钙等硫酸盐等无机类赋形剂等。润滑剂的具体例可以举出硬脂酸、硬脂酸钙、硬脂酸镁等硬脂酸金属盐；滑石粉；胶态二氧化硅；硅酸铝镁、鲸蜡等蜡类；硼酸；己二酸；硫酸钠等硫酸盐；乙二醇；富马酸；苯甲酸钠；DL亮氨酸；脂肪酸钠盐；月桂基硫酸钠、月桂基硫酸镁等月桂基硫酸盐；硅酸酐、硅酸水合物等硅酸类；以及上述淀粉衍生物。作为粘合剂的具体例，可以举出羟基丙基纤维素、羟丙甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙(烯)二醇(macrogol)、及与前述赋形剂相同的化合物。作为崩解剂的具体例，可以举出低取代羟基丙基纤维素、羧基甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、内交联羧甲基纤维素钠等纤维素衍生物；羧甲基淀粉、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯基吡咯烷酮等经过化学修饰的淀粉、纤维素类等。作为稳定剂的具体例可以举出对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯等对羟基苯甲酸酯类；氯丁醇、苄醇、苯乙醇等醇类；苯扎氯铵；苯酚、甲(苯)酚等酚类；乙基汞硫代水杨酸钠(thimerosal)；脱氢醋酸；及山梨酸等。作为矫味矫臭剂的具体例可以举出通常用于制剂中的甜味剂、酸味剂、香料等。
作为本发明中使用的细胞，优选淋巴细胞、间叶干细胞、软骨培养细胞等，但并不局限于此。
(第二种实施方案)图2为本发明的第二种实施方案中磁性细胞的简图。本发明的第二种实施方案中利用了存在于细胞表面的整联蛋白110和对于该整联蛋白有粘合活性的肽120。作为前述肽可以举出RGDS(由精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸四种氨基酸构成的肽，分子量433.42)，但不限定于此。
本发明的第二种实施方案通过使用以RGDS的氨基酸序列修饰磁珠表面而得到的活化磁珠130，提供了表面具有磁性粒子的磁性细胞200。
所述磁性细胞的制备方法如下。第一，利用试剂将表面预先经羧基修饰的磁珠活化。该活化步骤中只要使用可活化羧基的试剂即可，没有特别的限制，但优选使用碳二亚胺类。第二，使存在于磁珠表面的活化羧基和肽的氨基反应，形成酰胺键，从而能够在磁珠的表面导入肽。
对于本发明的磁珠上的肽被覆量而言，相对于3mg磁珠，作为配体的肽或者抗体能够被覆至10ng～20μg，优选为15ng～15μg，进一步优选为20ng～10μg。因此相对于每单位重量的磁珠，即，相对于每1mg的磁珠，可被覆3ng～6.6μg。当肽在磁珠上的被覆量过多时，使最终的磁性细胞之间相互粘合，由此使其难以向作为靶部位的病灶部位移动。如果被覆量过少，则可能无法发挥磁性细胞本身的性能。
然后，使导入了肽的磁珠和所希望的细胞表面的粘合分子发生反应，从而可以制备出本发明的磁性细胞。发生上述反应时虽然也受到所导入肽的比例的影响，但相对于数量为2×105的前述所希望的细胞而言，导入了肽的磁珠的量优选为0.1μl～20μl，更优选为0.2μl～18μl，进一步优选为0.5μl～15μl。如果导入了肽的磁珠量为0.1μl以下，则不能发挥磁性细胞自身的功能；如果导入了肽的磁珠量为20μl以上，则磁性细胞之间相互粘合，难以向作为靶部位的病灶部位移动。
作为导入了肽的磁珠与存在于细胞表面的粘合分子的反应溶液，可以举出BSA(牛血清白蛋白)的磷酸缓冲食盐水(以下称为“BSA/PBS”)，更优选使用在BSA/PBS中添加EDTA(乙二胺四乙酸)而得到的溶液、0.5％BSA 4.4μM EDTA in PBS(-)(EDTA浓度为4.4μM～2mM)，但不限于上述溶液。
另外，在本发明的第二种实施方案中，可以同样利用前述第一种实施方案中的磁性体和药物，这是本领域技术人员容易理解的。
下面说明本发明的磁性细胞的使用方法。通过将上述制备的磁性细胞在各种细胞中进行培养，可以将其用于后述的治疗之中。需要说明的是，可以适当选择培养中使用的培养液及培养温度。培养液因所用细胞不同而不同，例如，对于软骨培养细胞而言，适用DMEM(DulbeccosModified Eagle Medium)为基础的培养液。
可以通过使本发明的磁性细胞在所希望的病灶部位长期滞留，根据所述细胞的种类而用于治疗。例如，使用骨髓间叶干细胞时，可以在病灶部位形成软骨样组织。因此，在所希望的病灶部位长期滞留较为重要。
本发明中的用语“使磁性细胞在病灶部位长期滞留”是指滞留足够长的时间以使磁性细胞发挥其具有的功能，该时间优选为1～90日的期间，更优选1～80日的期间，进一步优选1～50日的期间。作为本发明磁性细胞的给药部位，只要是体内存在病灶的部位、或者实施治疗的部位即可，例如，可以举出例如脑、骨、肝脏、心脏、关节等。作为疾病的具体例，可以举出中风、恶性肿瘤、脊髓损伤、软骨缺损、肌肉缺损、韧带损伤等。
作为使本发明的磁性细胞存留于体内的给药方法，可以通过外科手术进行给药，也可以通过注射进行给药。此处所谓外科给药是指例如在骨中开孔进行给药；注射给药是指通过注射对患部直接给药或者经静脉注射对全身给药。
为了磁化磁性粒子，本发明中所使用的用语“磁场”优选为60高斯(以下记为“G”)或60高斯以上，为了防止磁性粒子在体内扩散而使其在局部滞留，更优选为70G或70G以上。可以从体外施加磁场，也可以通过在体内埋置磁石而施加磁场。此时从磁力、稳定性、强度方面考虑，磁石优选为钕磁石。
图3示出适用本发明磁性细胞的治疗的模式简图。如图3所示，本发明的磁性细胞经关节内注射而导入生物体内。由于在磁性细胞应该移动、存留的位置配置永磁铁，因此可以使本发明的磁性细胞在前述永磁铁的磁力作用下向理想的位置移动。图3中磁性细胞可被移至关节软骨的缺损部位并存留于该部位。本发明的磁性细胞所使用的细胞只要是骨髓间叶干细胞，就可以在上述部位形成软骨样组织而修复前述缺损部位。
图3中说明了作为再生医疗而受到关注的软骨修复，如果治疗部位为癌细胞，则可以通过使构成磁性细胞的磁性粒子中含有抗癌药而使药物集中于局部。
给予至生物体内的本发明的磁性细胞通过酶等的作用或温度等释放出药物。
本发明中“控制磁性细胞的活动”是指利用细胞因子等药物控制分化、生长等细胞活动。
磁性细胞和药物包封材料可以同时给予也可以分别给予，例如可以举出以下方式，即将磁性细胞及药物包封材料分别制成注射剂，装入一个包装盒中制成药物试剂盒等。
用下述实施例进一步详细地说明本发明，但本发明的范围并不局限于此。本领域技术人员能够基于本发明的记载实施各种变更、修改，上述变更、修改也包括在本发明之中。
实施例(磁性细胞的制备之一)1.磁珠的活化从作为磁珠的Ferri Sphere 100C原液(50mg/ml)(日本Paint)中取出相当于3mg(60μl)的量，加入0.01N NaOH，用搅拌器在室温下搅拌10分钟后进行洗涤。重复进行一次上述洗涤操作后加入去离子水，用搅拌器在室温下搅拌5分钟后洗涤。将上述洗涤操作重复3次。为了使磁珠活化，在除去剩余的水分之后，先将25mM 2-[N-吗啉代]乙磺酸(以下称为“MES”)(SIGMA社制)、pH5.0下制备的50mg/ml的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(以下称为“EDC”)(SIGMA社制)和N-羟基琥珀酰亚胺(以下称为“NHS”)(SIGMA社制)各50μl与磁珠在试管中充分混合，然后在室温下缓慢翻转搅拌30分钟。将反应后的试管在钕磁石上放置2分钟，除去上清液。最后用25mM MES、pH5.0下洗涤2次，使最终溶液的体积为40μl。
2.活化后的抗体的固定用60μl的25mM MES溶解大鼠的CD44抗体(20μg)(CHEMICON社制)，加入上述活化磁珠，在室温下缓慢翻转搅拌3小时，将抗体固定在活化磁珠上。将反应后的试管在钕磁石上放置2分钟，除去上清液。为了除去未与磁珠反应的抗体，添加处于磷酸缓冲液中的0.05M乙醇胺，并在室温下缓慢翻转搅拌1小时。将固定后的磁珠用0.5％BSA(SIGMA社制)的磷酸缓冲液在4℃下洗涤5分钟。将上述洗涤操作反复进行4次后，悬浮在1ml的0.5％BSA磷酸缓冲液中，在4℃下保存。
3.将固定化磁珠结合在细胞上将培养的大鼠骨髓间叶干细胞从皿(dish)中剥离并移至试管中，在4℃下保存10分钟。添加60μl配制成细胞悬浮液(1×106cells)的上述磁珠后，在4℃下缓慢地翻转搅拌1小时使其发生抗原抗体反应。将反应后的试管在钕磁石上放置2分钟后除去上清液。用0.5％BSA的磷酸缓冲液使其重悬。将该洗涤操作进行4次。然后使其悬浮在磷酸缓冲液等之中用于试验。
(具有磁性脂质体的磁性细胞的制备例1)1.N-[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰基]磷脂酰乙醇胺(以下称为“PDP-PE”)的合成在3ml无水乙醇中溶解25mg N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯和50μmol三乙醇胺，进一步溶解50μmol磷脂酰乙醇胺，并进行搅拌。5小时后减压除去甲醇，并将残留物溶解于氯仿中。用氯仿洗涤150℃下活化了一夜的硅胶柱(10ml)。洗柱后使反应物流过柱子，进一步用20ml氯仿洗涤。分别流过氯仿∶甲醇的比例为40∶1、30∶1、25∶1、20∶1及15∶1的混合溶液各20ml，最后流过10∶1的混合溶液60ml。将15∶1及10∶1的洗出液合并，进行减压浓缩。
2.脂质体的制备将10μmol蛋黄磷脂酰胆碱(Egg phosphatidylcholin)、10μmol胆甾醇及1μmol PDP-PE溶解于3ml的乙醚中，将乙醚减压气化。加入1ml含有磁性体铁(Fe2O3)5mg及包封药物(TGF-β、bFGF)的0.9％生理盐水、以及硼酸/枸橼酸缓冲液(pH6.0)，用涡流混合器(Vortex mixer)进行震荡，使烧杯内附着的薄层被膜完全剥离。在水浴超声波仪(Bathsonicator)(同上)中进行50分钟超声处理。用0.45T的永磁铁(同上)将制成的磁性体脂质体及未包封的磁性体从溶液中分离出来。在1000×g(ppm)下离心分离15分钟，将作为上清液的磁性体脂质体和作为沉淀的未被封入的磁性体分离。
3.脂质体与抗体的结合在60μl的25mM MES中溶解人的CD44抗体(20μg)，加入制成的脂质体，在室温下缓慢地翻转搅拌3小时将抗体固定在脂质体上。反应后在钕磁石上放置2分钟，除去上清液。为了除去未反应的抗体，加入0.05M乙醇胺的磷酸缓冲液，在室温下缓慢地翻转搅拌1小时。在4℃下用0.5％BSA的磷酸缓冲液洗涤5分钟。将该洗涤操作反复进行4次，使其在1ml 0.5％BSA的磷酸缓冲液中悬浮稳定，在4℃下保存。
4.将固定了抗体的脂质体结合在细胞上将培养的人骨髓间叶干细胞从皿(dish)中剥离并移至试管中，在4℃下保存10分钟。添加配制成细胞悬浮液(1×106cells)的脂质体后，在4℃下缓慢地翻转搅拌1小时使其发生抗原抗体反应。将反应后的试管在钕磁石上放置2分钟，除去上清液。用0.5％BSA磷酸缓冲液重悬。将该洗涤操作进行4次。然后使其悬浮在磷酸缓冲液等之中直接用于试验。
试验例1(体外试验)将结合了以前述方法制备的磁性粒子的骨髓间叶干细胞4×106cells放入培养皿中。本实施例中，在培养皿的下部中央设置了4300G的圆形(直径5mm)钕磁石；然而在比较例中未设置磁石。在培养皿中加入TGF-β和地塞米松。培养21天后，用甲苯胺蓝染色进行评价。实施例中，以磁石对应的位置为中心，局部形成了软骨样组织。然而在比较例中未在局部形成软骨样组织。
图4示出将本发明的磁性细胞注射到关节内1个月后，约72小时不存在外部磁场(A)及存在外部磁场(B)的情况下观测到的显微镜照片(50倍)。由图4(A)可知，用黑点表示的磁性细胞在细胞中任意位置均能被观测到，然而，由图4(B)可知，用黑点表示的磁性细胞集中存在于图4(B)的左上方。需要说明的是，图4(A)及(B)实际是用苏木精-伊红(hematoxylin-eosine)进行了染色，在图4中表示为灰色。
从以上结果可知，本发明的磁性细胞可以通过磁石的作用向局部移动。并且，受到外部磁场作用的细胞中可以观测到利用玻璃软骨进行的修复。
试验例2(家兔的膝间部骨缺损修复)
在家兔的膝关节部，按照Bioindustry 2002.Vol.19.No.6 p47-53记载的方法制作2处宽5mm的骨缺损。在该缺损部位注射3.0μg实施例中得到的磁性细胞。然后将具有700G磁场的磁石置留在缺损部位对应的表面，置留9周。在比较例中不施加外部磁场地给予磁性细胞。结果发现，实施例中软骨细胞局部存在于骨缺损部位并通过形成新生骨的交联而修复骨缺损，然而未施加外部磁场的比较例中未发现骨缺损的修复。
(磁性细胞的制备例2)1.使用EDC和NHS进行的磁珠活化从Ferri Sphere 100C原液(50mg/ml)(日本Paint社)中取出相当于3mg(60μl)的量，加入0.01N NaOH，用搅拌器在室温下搅拌10分钟后洗涤。重复进行一次上述洗涤操作后加入去离子水，用搅拌器在室温下搅拌5分钟后洗涤。将上述洗涤操作重复3次。为了使磁珠活化，在除去了剩余的水分之后，先将25mM MES、pH5.0下制备成的50mg/ml EDC、和NHS各50μl与磁珠充分混合，并在室温下缓慢翻转搅拌30分钟。将反应后的试管在钕磁石上放置2分钟后除去上清液。最后用25mM MES、在pH5.0下洗涤2次(使最终溶液的体积为40μl)。
2.活化后的抗体的固定用60μ1的25mM MES、在pH5.0下溶解大鼠的CD44抗体(CHEMICON社制)、或者RGDS peptides(peptide研究所)(20μg)，加入活化磁珠(40μ1的25mM MES pH5.0下悬浮)，在室温下缓慢翻转搅拌3小时，将抗体固定在活化磁珠上。将反应后的试管在钕磁石上放置2分钟，除去上清液。为了除去未与磁珠反应的抗体，添加处于PBS(-)pH8.0中的0.05M乙醇胺，并在室温下缓慢地翻转搅拌1小时。将固定后的磁珠用处于PBS(-)中的0.5％BSA在4℃下洗涤5分钟。将上述洗涤操作反复进行4次后，悬浮在1ml处于PBS(-)中的0.5％BSA中，在4℃下保存。
3.将固定了抗体的磁珠结合在细胞上将培养的大鼠骨髓间叶干细胞从皿中剥离并移至试管中。添加15μl配制成500μl细胞悬浮液(2×105cells)的磁珠后，在4℃下间断进行翻转搅拌，共计1小时，使其发生抗原抗体反应。此时的反应缓冲液为处于PBS(-)中的0.5％BSA。将反应后的试管在钕磁石上放置2分钟后除去上清液。用处于PBS(-)中的0.5％BSA将其重悬。将该洗涤操作进行3～4次。然后使其悬浮在PBS(-)等之中用于试验。
(磁性细胞的制备例3)1.利用EDC和NHS进行的磁珠活化从Ferri Sphere 100C原液(50mg/ml)(日本Paint社)中取出相当于3mg(60μl)的量，加入0.01N NaOH，用搅拌器在室温下搅拌10分钟后洗涤。重复进行一次上述洗涤操作后加入去离子水，用搅拌器在室温下搅拌5分钟后洗涤。将上述洗涤操作重复3次。为了使磁珠活化，在除去了剩余的水分之后，先将25mM MES、pH5.0下制备成的50mg/ml EDC、和NHS各50μl与磁珠充分混合，并在室温下缓慢翻转搅拌30分钟。将反应后的试管在钕磁石上放置2分钟后除去上清液。最后用25mM MES、pH5.0下洗涤2次(使最终溶液的体积为40μl)。
2.活化后的抗体的固定用60μl的25mM MES pH5.0溶解大鼠CD44抗体(CHEMICON社制)或者RGDS peptides(peptide研究所)(10ng)，加入活化磁珠(40μl的25mM MES pH5.0下悬浮)，在室温下缓慢翻转搅拌3小时，将抗体固定在活化磁珠上。将反应后的试管在钕磁石上放置2分钟后除去上清液。为了除去未与磁珠反应的抗体，添加处于PBS(-)pH8.0中的0.05M乙醇胺，并在室温下缓慢地翻转搅拌1小时。将固定的磁珠用处于PBS(-)中的0.5％BSA在4℃下洗涤5分钟。将上述洗涤操作反复进行4次后，悬浮在1ml处于PBS(-)中的0.5％BSA中，在4℃下保存。
3.将固定了抗体的磁珠结合在细胞上将培养的大鼠骨髓间叶干细胞从皿中剥离并移至试管中，添加1μl配制成500μl细胞悬浮液(2×105cells)的磁珠后，在使用CD44抗体的情况下，在冰箱中(4～10℃)间断进行翻转搅拌，共计1小时，使其发生抗原抗体反应。在使用RGDS peptides的情况下，在37℃下用1小时间断进行翻转搅拌，使其与细胞发生反应。此时的反应缓冲液为处于PBS(-)中的0.5％BSA 4.4μM EDTA。将反应后的试管在钕磁石上放置2分钟，除去上清液。用处于PBS(-)中的0.5％BSA将其重悬，将该洗涤操作进行3～4次，然后使其悬浮在PBS(-)等之中用于试验。
图5示出在大鼠骨髓间叶干细胞中观测在前述制备例2(A)、3(B)中制备的磁性细胞(通过整联蛋白和RGDS肽连接的磁性细胞)的显微镜照片(480倍)。由图5可知，本发明磁性细胞的行为受到下述因素的影响，即，具有磁性体的RGDS肽在磁珠上的导入量，即，前述肽在磁珠上的被覆量，和制备磁性细胞时细胞上的磁珠量。当前述导入量或磁珠量较高时，最终在生物体内的细胞中磁性细胞之间具有凝集的倾向。
图6示出用软骨诱导培养基对本发明通过CD44或者RGDS肽制成的磁性细胞(大鼠骨髓间叶干细胞)进行沉淀(pellet)培养21天后，利用RT-PCT法，研究II型胶原蛋白、聚集蛋白聚糖(来自软骨)的mRNA(基因)表达的结果。在添加了TGF-β和地塞米松进行分化诱导的组(D+组)中能够确认到两个基因的表达，在未添加TGF-β和地塞米松进行培养的组(D-组)中不能确认两个基因的表达。从图6的结果可以推测，通过RT-PCR复合体的软骨形成作用，以CD44抗原或RGDS肽作为连接体的磁性细胞(骨髓间叶干细胞)可以分化诱导成软骨细胞。
图7为说明利用大鼠神经干细胞形成本发明的磁性细胞的状态的照片。从图7的结果可以确认，通过移液管(pipetting)将凝集的大鼠神经干细胞离散开，然后使前述经RGDS肽修饰后的磁珠作用于该细胞，能够通过神经干细胞的整联蛋白形成利用大鼠神经干细胞的磁性细胞。
产业实用性根据本发明的磁性细胞，通过将其导入生物体内并利用从体外施加的磁场作用，能够使其长期存留于病灶部位，因此能够有效发挥该细胞本来具有的功能。另外，根据治疗的需要，本发明的磁性细胞可以适用于软骨形成等再生医疗、抗癌药等的药物释放系统之中。
权利要求
1.一种磁性细胞，是在细胞表面具有磁性粒子的磁性细胞。
2.如权利要求1所述的磁性细胞，其特征为，所述表面与所述磁性粒子通过连接体结合，或者所述表面通过所述磁性粒子具有的特定氨基酸序列接合。
3.如权利要求2所述的磁性细胞，其特征为，所述表面与所述连接体通过抗原抗体反应结合。
4.如权利要求2或3所述的磁性细胞，其特征为，所述连接体与所述磁性粒子通过化学键结合。
5.如权利要求1～4中任一项所述的磁性细胞，其特征为，所述磁性粒子中至少包含磁性体。
6.如权利要求5所述的磁性细胞，其特征为，所述磁性粒子中还包含药物。
7.如权利要求1～6中任一项所述的磁性细胞，其特征为，所述细胞选自软骨培养细胞、间叶细胞、淋巴细胞及表达整联蛋白的细胞。
8.一种培养磁性细胞的方法，其特征为，所述方法包括制备权利要求1～7中任一项所述的磁性细胞的步骤和培养所述磁性细胞的步骤。
9.一种滞留磁性细胞的方法，其特征为，所述方法包括下述步骤，即，使权利要求1～7中任一项所述的磁性细胞向病灶部位移动并存留在该部位的步骤，和通过磁场使所述磁性细胞长期滞留在所述病灶部位的步骤。
10.如权利要求9所述的滞留方法，其特征为，所述滞留步骤是通过从体外对病灶部位施加磁场或将磁石埋入体内而而进行的。
11.一种控制磁性细胞活动的方法，所述方法包括以下步骤，即，将权利要求1～7中任一项所述的磁性细胞和含有药物的磁性粒子同时或者分别给予病灶部位的步骤，和从所述磁性粒子中释放所述药物的步骤。
12.如权利要求11所述的方法，其特征为，所述药物选自促骨形成药、癌治疗药、或者痴呆症治疗药。
13.一种治疗方法，所述方法包括以下步骤，即，将权利要求1～7中任一项所述的磁性细胞和含有药物的磁性粒子同时或者分别给予病灶部位的步骤，和从所述磁性粒子中释放所述药物的步骤。
14.如权利要求13所述的治疗方法，其特征为，所述药物选自促骨形成药、癌治疗药、或者痴呆症治疗药。
全文摘要
由于目前还没有在可应用于再生医疗等之中的在间叶细胞或软骨细胞等细胞中结合了磁性粒子的实例，因此本发明研究了将结合了磁性粒子的细胞给药后能否通过外部的磁力而在局部滞留、或者细胞能否发挥其本来的作用。本发明提供了一种使间叶细胞或软骨细胞的表面与磁性粒子结合而得到的磁性细胞，将该细胞给予体内并施加外部磁场，由此能够将该细胞长期留存于病灶部位。也可以使本发明的磁性细胞中进一步包含药物而构建药物释放系统。
文档编号C12N5/00GK1742080SQ20048000294
公开日2006年3月1日 申请日期2004年6月25日 优先权日2003年6月30日
发明者越智光夫 申请人:卫材株式会社, 越智光夫