专利名称：用于鉴定坛紫菜优良品系的分子标记及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种特征序列扩增(Sequence Characterized Amplified Region，SCAR)标记技术及其在种质纯度鉴定、品系鉴别和分子标记辅助育种中的应用。
背景技术：
坛紫菜(Porphyra haitanensis)属于红藻门(Rhodophyta)红毛菜科(Bangiacea)紫菜属(Porphyra)，是人工紫菜栽培的主要品种之一，具有很高的营养价值和经济价值，其经济效益较好。但是近几年坛紫菜栽培业普遍存在品质下降的问题，因此，利用分子生物学手段结合传统的育种方法，培育出优良坛紫菜新品系就变得非常迫切。目前，坛紫菜优良品系的培育主要采用大田选育、利用物理诱变或化学诱变以及体细胞工程育苗等技术筛选优良种质，再经过海区小规模栽培，分析主要经济性状及其遗传稳定性等手段，过程费时费力，已很难满足坛紫菜养殖生产的需要。新近我们培育出的优良品系表现出比较突出的优良性状藻体生长快，成熟晚，叶状体长度、厚度、主要营养物质(蛋白质、叶绿素、氨基酸等)含量均优于当家品种，因而深受养殖户的欢迎。因此，如果能够利用特异的分子标记技术找到与这一系列优良性状相关的DNA片段或者基因，进而了解与其相关的遗传变异信息，就可以利用这些分子标记，最终从大量养殖对象或野生坛紫菜种质资源库中筛选到含有这些标记的坛紫菜叶状体，再结合其它经济性状指标，就可培育出新的栽培品系，并在生产中推广应用，从而加快坛紫菜优良品系选育的进程，满足生产的需要。
1995年由荷兰Keygene公司的科学家Zabeau和Vos.Peter创建起来的扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)标记技术，相对于其它标记技术，该标记技术多态性强，谱带丰富、清晰可辨，而且实验结果稳定，重复性好。SCAR标记一般由AFLP等分子标记转换而来，其基本原理是根据已获得的标记片段的序列信息，设计一对特异的引物，然后通过PCR的方法来提示多态性。SCAR标记是一种十分稳定的分子标记，在应用上具有迅速、简便、低成本的特点。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种鉴定坛紫菜优良品系的SCAR标记，进而为分子标记辅助育种提供基础资料。
本发明的另一个目的是提供由所述SCAR标记获得的PCR引物序列。
本发明的第三个目的是提供一种使用方便、灵敏度高的包含由SCAR标记获得的PCR引物序列的用于鉴定坛紫菜优良品系的检测试剂盒。
本发明所述的鉴定坛紫菜优良品系的SCAR标记，具有如下核苷酸序列5’-AGTAAAATGGGGAACAGCGACTTCTACAGATGATTGCGAAGGTGTCGTAACAAAACAGCCTGATATGCGTCCAACTTTAGAGAATATTCAATATATTCTTCCCCAGTTCACTGGTCATGTTCAACAAACACCACCAATTTATTCTGCGATAC-3’。
获取SCAR标记的方法如下利用AFLP分子标记技术，首先提取不同紫菜样品的叶状体总DNA，再通过总DNA的酶切、人工接头连接、预扩增以及选择性扩增，最后经聚丙烯凝胶电泳分析获得坛紫菜优良品系特有的AFLP标记的特异性条带；然后对特异性标记片段进行回收，回收产物PCR再扩增并克隆到T载体上，再通过测序分析、利用引物设计软件设计引物，最终将AFLP标记转化成SCAR标记，该标记表现共显性，由此获得与坛紫菜优良品系的优良性状相连锁的SCAR标记。
本发明所述的由SCAR标记获得的PCR引物具有如下序列Marker15’-AGT AAA ATG GGG AAC AGC-3’Marker25’-ATC GCA GAA TAA ATT GGT G-3’本发明所述的用于鉴定坛紫菜优良品系的检测试剂盒，它包含以下组分组分I10×反应缓冲溶液250μL组分II Taq DNA聚合酶 50μL组分III 无菌双蒸水(ddH2O) 3.0mL组分I含有50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-Cl(pH9.0)，0.1％ Triton X-100，1.5mmol/LMg2+，50pmol/L正链引物Marker1，50pmol/L负链引物Marker2和200μmol/L dNTPs。
组分IITaq DNA聚合酶的浓度为2.5U/μL。
正链引物Marker1的序列为5’-AGT AAA ATG GGG AAC AGC-3’。
负链引物Marker2的序列为5’-ATC GCA GAA TAA ATT GGT G-3’本发明利用AFLP标记技术，对坛紫菜优良品系及其他一些品系进行分析，找到优良品系特异的AFLP标记，并成功地将其转换成SCAR标记，获得的SCAR标记可广泛用于品系纯度鉴定、品系鉴别和分子标记辅助育种。通过所获得的特异引物PCR扩增可对个体进行鉴定，从而从大量养殖对象或野生坛紫菜种质资源库中筛选出优良的品系，缩短了育苗周期，提高了选育的准确性。并可为种质鉴定奠定基础，也为坛紫菜遗传多样性、基因定位和快速构建遗传图谱以及分子标记辅助育种等研究提供了参考数据。用于鉴定坛紫菜优良品系的检测试剂盒使用方便，重复性好，可靠性高，检测费用低，省时省力。
图1为利用检测试剂盒对不同品系及野生坛紫菜进行鉴定的凝胶电泳图。
具体实施例方式
实施例1.鉴定坛紫菜优良品系的AFLP标记的获得一.材料实验用的16个紫菜样品(阴干-20℃保存)名称及来源见表1。
表1. 16个紫菜样品名称及来源
二.方法利用AFLP分子标记技术对不同品系及野生坛紫菜进行筛选。AFLP分析参照Invortron公司的AFLP Analysis System I和AFLP Starter Primer Kit说明书进行，并稍有改动。
1.坛紫菜叶状体总DNA提取(1)将复苏后的坛紫菜叶状体剪切成小块，加入适量的海螺酶(1g叶状体加10mL 3％酶液并加入适量玻璃珠)，于黑暗条件下振荡(100r/min，26℃)酶解，0.5h后，每间隔15min镜检一次，至坛紫菜小块大部分酶解成单细胞为止；(2)酶解结束后，加1倍体积的海水(比重1.030)与酶解液混合以终止酶解反应，用200目的筛绢过滤。滤液3500g离心5min后弃上清液；(3)加入海水(比重1.030)将细胞沉淀摇匀，再次离心；
(4)重复(3)三次；(5)用双蒸水快速冲洗沉淀，4000g离心收集离心管底的细胞用于DNA提取；(6)沉淀的细胞中加入2mL叶状体DNA提取液(0.6％ Sarcosyl，10mmol/L EDTA，O.2％ PVP，5％ β-巯基乙醇)，用枪头混匀，避免产生气泡。加入RNase A，使RNase A终浓度达到50μg/mL，混匀。37℃水浴1～1.5h，中间适当搅拌混匀几次，避免产生气泡；(7)加入蛋白酶K，使蛋白酶K终浓度达到100μg/mL，混匀，37℃水浴2h，中间适当搅拌混匀几次，避免产生气泡，取出离心管，加10％体积的2mol/L Tris-Cl(pH8.0)，混匀，冷却到4℃；(8)加入Tris饱和的苯酚抽提10min，4℃12000g离心10min，取上清；(9)上清加入酚-氯仿(1∶1)抽提10min，4℃12000g离心10min，取上清；(10)重复(9)一次；(11)上清加入氯仿-异戊醇抽提10min，4℃12000g离心10min，取上清；(12)上清加1/10体积的3mol/L NaAc(pH5.4)，再加入2倍体积的-20℃无水乙醇沉淀1h，4℃ 12000g离心10min，去上清，用70％乙醇洗涤沉淀2遍，4℃12000g离心10min，沉淀放置在37℃干燥，溶解于适量TE缓冲液中，-20℃保存。
2.总DNA的酶切PCR管(0.2mL)中加入2.5μL5×酶切反应缓冲液，125ng(≤18μL)样品DNA，1μL EcoRI，1μL Mse I，ddH2O补齐到12.5μL。12000g离心10s，充分混匀，置于37℃温育2h，再将酶切反应混合物置于70℃水浴15min，灭活内切酶。
3.人工接头连接酶切后的DNA中，加入12μL接头溶液，0.5μL T4 DNA连接酶，12000g离心10s，充分混匀，20℃连接2h(或过夜)，置于70℃水浴15min，灭活酶。
4.预扩增25.5μL反应体系中加入2.5μL连接反应产物，20μL预扩增引物混合溶液，2.5μL 10×PCR反应buffer(含Mg2+)，0.5μLTaq酶(5U/μL)。预扩增反应条件94℃，30s；56℃，1min；72℃，1min，20个循环。预扩增产物用TE缓冲液稀释50倍，作为选择性扩增的模板。
5.选择性扩增20μL反应体系中加入0.18μL EcoR I引物(27.8ng/μL)，4.5μL Mse I引物(6.7ng/μL)，2μL 10×PCR反应buffer(含Mg2+)，0.1μL Taq酶(5U/μL)，5μL模板DNA，8.14μL ddH2O。EcoR I引物和Mse I引物3’端分别为3个选择性碱基。扩增条件为94℃，30s；65℃，30s；72℃，1min，1个循环；94℃，30s；65℃，30s；72℃，1min(每个循环复性温度降0.7℃)，进行12个循环；94℃，30s；56℃，30s；72℃，1min；23个循环。选择性扩增产物置于94℃水浴2min，迅速取出置于冰浴中使DNA解链变性。取10μL样品进行变性聚丙烯酰胺电泳检测，银染显色，凝胶成像分析。
三.结果根据AFLP初步分析的结果，从25对引物中筛选出11对有效引物，用这11对引物对优良品系和部分紫菜的总DNA进行特异性AFLP标记分析，结果显示获得了优良品系的特异性条带ACA-CAC(340)、ACA-CAC(203)、AAC-CAC(177)共3个，分子量大小分别为340bp、203bp和177bp。
实施例2.优良品系特异的SCAR标记的获得一、材料紫菜样品同实施例1，大肠杆菌DH5α，pMD18-T Vector二、方法1.特异AFLP片段的回收根据获得的AFLP聚丙烯凝胶电泳图谱，寻找优良品系特异的AFLP标记条带，用锋利的刀片切下含有该条带的凝胶。回收的凝胶块溶于400μL高盐溶液(20％ ethanol，1mol/L LiCL和10mmol/L Tris-HCL，Ph7.5)中，室温放置24h，65℃温育2h，无水乙醇沉淀DNA并溶于20μL TE中。
2.特异AFLP片段的PCR再扩增取5μL回收的DNA为模板，用与选择性扩增时相同的引物按下列程序94℃ 30S；56℃ 30S；72℃ 60S扩增35个循环。
3.PCR扩增产物的回收PCR扩增出的特异片段经1.2％琼脂糖凝胶电泳后，用上海生物工程公司生产的UNIQ-5柱离心式DNA胶回收试剂盒回收，操作依试剂盒说明进行。
4.连接反应按TaKaRa pMD 18-T Vector说明书进行操作；5.感受态大肠杆菌的制备(1)大肠杆菌DH5α单菌落接种于5mL的LB培养液中，37℃震荡培养3～4h(OD260为0.2～0.4)，停止培养；(2)冰浴30min，无菌操作倒入5mL管中，12000g离心1min收集沉淀；(3)加入0.1mol/LCaCl2(预冷)1mL，混匀后转入1.5mL管，再12000g离心1min，去上清；(4)沉淀加入200μL 0.1mol/LCaCl2(预冷)，混匀，4℃过夜或冻存于-70℃。
6.连接产物的转化(1)取感受态细胞悬液100μL，加入连接产物(含量小于50ng)，轻轻摇匀，冰浴30min；(2)42℃水浴中热击90s(不要摇动管)，迅速置于冰浴3～5min；(3)然后向管中加入1mL LB培养液，摇床上50r/min震荡培养2～3h；(4)取200μL菌液涂布到含80μg/mL的Amp抗生素的筛选板上，待吸收后，倒置，37℃培养过夜。碱裂解法提取质粒，用PCR和酶切的方法鉴定，将阳性克隆的新鲜菌液加等体积的60％甘油保存，送至上海生物工程公司测序。
三.结果获得了多个优良品系特异的AFLP标记条带，对其中的标记条带ACA-CAC(203)进行了PCR再扩增，扩增产物回收连接到T载体的测序结果为AFLP标记条带ACA-CAC(203)的序列为5’-GATTGACTGCGTACCAATTCACAGTAAAATGGGGAACAGCGACTTCTACAGATGATTGCGAAGGTGTCGTAACAAAACAGCCTGATATGCGTCCAACTTTAGAGAATATTCAATATATTCTTCCCCAGTTCACTGGTCATGTTCAACAAACACCACCAATTTATTCTGCGATACGTGTTACTCAGGACTCATCAATCGTCGAC-3’。
取该序列中间的152个碱基作为优良品系特异的SCAR标记，其序列为5’-AGTAAAATGGGGAACAGCGACTTCTACAGATGATTGCGAAGGTGTCGTAACAAAACAGCCTGATATGCGTCCAACTTTAGAGAATATTCAATATATTCTTCCCCAGTTCACTGGTCATGTTCAACAAACACCACCAATTTATTCTGCGATAC-3’。
实施例3.由SCAR标记获得的PCR引物序列一.方法以ACA-CAC(203)的SCAR标记序列为引物设计模板，通过Primer 5.0引物设计软件设计引物。
二.引物设计原则1.两引物中的GC含量应尽量相似；2.引物内部避免具有明显的二级结构；3.两引物之间避免有互补序列，以免形成“引物二聚体”；4.引物与靶序列片段的配对须精确、严格，特别是在3’末端；5.特异引物应具有一定的退火温度(不低于50℃)和一定的长度(不小于18个bp)。
三.结果根据SCAR标记序列设计了特异引物，其序列为Marker15’-AGT AAA ATG GGG AAC AGC-3’Marker25’-ATC GCA GAA TAA ATT GGT G-3’。
该引物的优点扩增条带清晰，且扩增稳定，重复性好，扩增片段的大小为152bp。
实施例4.鉴定坛紫菜优良品系的PCR检测试剂盒一.材料紫菜样品为实施例1中的坛紫菜7个(LSD、NH、JJS、BBD、DXY、GL1、CCS0401)，条斑紫菜2个(LYG和RD)；Marker 1/Marker 2特异引物组合。
二.检测试剂盒的组分坛紫菜优良品系特异SCAR标记检测试剂盒，它包括以下含量的各组分组分I10×反应缓冲溶液 250μL组分II Taq DNA聚合酶 50μL组分III 无菌双蒸水(ddH2O) 3.0mL其中组分I含有50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-Cl(pH9.0)，0.1％ Triton X-100，1.5mmol/L Mg2+，50pmol/L正链引物Marker1，50pmol/L负链引物Marker2和200μmol/LdNTPs。组分II的浓度为2.5U/μL。
三.使用方法在25μL PCR反应体系中加入组分I 2.5μL，组分II 0.5μL，模板DNA 20ng(参照实施例1中的DNA提取方法提取)，组分III补至25μL。以下述PCR反应程序进行反应95℃，3min，预变性1个循环。95℃，1min；55℃，40s；72℃，90s；35个循环。72℃，延伸5min。扩增产物取5μL进行12％ PAGE凝胶电泳检测，银染显色，凝胶成像分析。
四.规格该检测试剂盒可检测100个样品。
优点该检测试剂盒使用方便，扩增方法简单，重复性好，可靠性高。检测费用低，省时省力。
五.结果如图1所示，泳道1～7分别为坛紫菜样品LSD、NH、JJS、BBD、DXY、GL1和优良品系CCS0401的扩增结果，8、9泳道为两种条斑紫菜样品RD和LYG的扩增结果，M为pUC MixMarker，条带大小从上到下依次为1116、883、692、501、489、404、331、242、190、147、111和67bp。从图中可以看到，只有CCS0401能扩增出1条大小约为150bp的条带。
权利要求
1.用于鉴定坛紫菜优良品系的分子标记，其特征在于所述的特征序列扩增(SCAR)标记具有如下核苷酸序列5’-AGTAAAATGGGGAACAGCGACTTCTACAGATGATTGCGAAGGTGTCGTAACAAAACAGCCTGATATGCGTCCAACTTTAGAGAATATTCAATATATTCTTCCCCAGTTCACTGGTCATGTTCAACAAACACCACCAATTTATTCTGCGATAC-3’获取SCAR标记的方法如下利用AFLP分子标记技术，首先提取不同紫菜样品的叶状体总DNA，再通过总DNA的酶切、人工接头连接、预扩增以及选择性扩增，最后经聚丙烯凝胶电泳分析获得坛紫菜优良品系特有的AFLP标记的特异性条带；然后对特异性标记片段进行回收、回收产物PCR再扩增并克隆到T载体上，再通过测序分析、利用引物设计软件设计引物，最终将AFLP标记转化成SCAR标记，该标记表现共显性，由此获得与坛紫菜优良品系的优良性状相连锁的SCAR标记。
2.由权利要求1所述的SCAR标记获得的PCR引物，其特征在于所述的PCR引物具有如下序列Marker15’-AGT AAA ATG GGG AAC AGC-3’Marker25’-ATC GCA GAA TAA ATT GGT G-3’。
3.用于鉴定坛紫菜优良品系的检测试剂盒，其特征在于检测试剂盒包含以下组分组分I 10×反应缓冲溶液 250μL组分II Taq DNA聚合酶50μL组分III无菌双蒸水(ddH2O)3.0mL其中组分I含有50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-Cl(pH9.0)，0.1％Triton X-100，1.5mmol/L Mg2+，50pmol/L正链引物Marker1，50pmol/L负链引物Marker2和200μmol/L dNTPs；组分II Taq DNA聚合酶的浓度为2.5U/μL；所述正链引物Marker1的序列为5’-AGT AAA ATG GGG AAC AGC-3’；所述负链引物Marker2的序列为5’-ATC GCA GAA TAA ATT GGT G-3’。
全文摘要
用于鉴定坛紫菜优良品系的分子标记及其应用，涉及一种SCAR标记技术及其应用。利用AFLP标记技术，对坛紫菜优良品系等进行分析，找到优良品系特异的AFLP标记，并将其转换成SCAR标记，用SCAR标记设计特异引物Marker1和Marker2，并将特异引物做成用于鉴定坛紫菜优良品系的检测试剂盒，通过特异引物PCR扩增对个体进行鉴定，从养殖对象或野生坛紫菜种质资源库中筛选出优良品系，缩短育苗周期，提高选育准确性。广泛用于品系纯度与品系鉴别和分子标记辅助育种。为种质鉴定奠定基础，为坛紫菜遗传多样性、基因定位和快速构建遗传图谱及分子标记辅助育种等研究提供参考数据。检测试剂盒使用方便，重复性好，可靠性高，检测费用低，省时省力。
文档编号C12Q1/68GK1661097SQ20041008238
公开日2005年8月31日 申请日期2004年12月31日 优先权日2004年12月31日
发明者左正宏, 陈奕欣, 李博文, 王重刚, 陈骁, 赵扬, 陈昌生 申请人:厦门大学, 集美大学