专利名称：一种苹果酒的混合酵母发酵方法
技术领域：
一种苹果酒的混合酵母发酵方法，涉及苹果酒的酿造技术领域。
背景技术：
优良苹果酒酵母应该有较高的发酵效率，不产生明显的异味，形成必要的挥发性香气物质。酵母的较高发酵效率主要包括较高的发酵速率和完全的发酵能力(完全利用苹果汁中的可发酵性糖)。
目前应用于苹果酒工业发酵的酵母主要是酵母属酵母(Saccharomyces)。关于目前使用的酵母的酿造特性，人们认为，这些单株酵母属酵母以及混和酵母属酵母虽然有较高的发酵效率，但形成的挥发性香气物质含量较少，缺少酯香(Lackingin estery cider character)。
与现代果酒发酵相比，虽然传统发酵的果酒风味存在不确定性，发酵周期长，但传统发酵的果酒有浓郁的果香(酯香)。人们认为，传统发酵的果酒和现代工艺发酵的果酒香气上的差异可能主要是由于发酵果酒的酵母不同。现代的果酒发酵趋向于纯种酵母属酵母发酵。传统发酵过程的果酒不添加酵母，也不添加二氧化硫，酵母在发酵过程中是一个顺序生长的过程，当乙醇浓度上升至2-4％前，涉及到的是非酵母属酵母(non-saccharomyces spp.)，当乙醇浓度上升至2-4％后，占优势的酵母是酵母属酵母(Saccharomyces cerevisiae(uvarum))。据报道，传统果酒有浓郁的果香可能主要是由于非酵母属酵母的作用。对果酒香气风味有积极影响的非酵母属酵母有柠檬形克氏酵母(Kloeckera apiculata)，法尔皮有孢汉生酵母(Hanseniaspora valbyensis)，美极梅氏酵母(Metschnikowia pulcherrima)，但是这些非酵母属酵母的发酵效率普遍较低(Quere and Drilleau，1996；Lea，1995；Plata et al，2003；Zohre and Erten，2002)。因此，人们试图通过非酵母属酵母和酵母属酵母混合发酵增加果酒中的酯香，同时保证用于果酒发酵的酵母有较高的发酵效率(Plataet al，2003；Zohre and Erten，2002)，但有关混合酵母对苹果酒挥发性物质及发酵效率的影响未见详细的成功报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种苹果酒的混合酵母发酵方法。若要调节苹果酒的果香、总酯含量、醇酯比，改变酵母属酵母和非酵母属酵母均能达到目的，但由酵母属酵母改变为非酵母属酵母更有效。乙酸-2-苯乙酯是引起我国主要苹果品种果香产生区别的重要物质。醇酯比是影响苹果酒果香(酯香)的最重要因素，其次是总酯浓度，其中，醇酯比与果香强度成负相关，总酯浓度与果香强度成正相关；在实验用酵母中法尔皮有孢汉生酵母醇酯比最低，总酯、乙酸-2-苯乙酯产生量最高，酵母属酵母(Saccharomyces cerevisiae)CCTCC M201022的发酵效率最高。本发明试图通过优化接种量、苹果汁营养条件等发酵参数，使法尔皮有孢汉生酵母和酵母属酵母CCTCC M201022的混合酵母发酵既能降低苹果酒的醇酯比、增加苹果酒中的总酯、乙酸-2-苯乙酯产生量，从而增强苹果酒的果香，又使苹果酒发酵有较高的发酵效率。
本发明的技术方案酵母菌株酵母属酵母(Saccharomyces cerecisiae)CCTCC M201022由本实验室筛选得到中国专利01127081.0。
法尔皮有孢汉生酵母(Hanseniaspora valbyensis)采用AS 2.1488(见《中国菌种目录》1992，170页)，ATCC 10631(《真菌目录》2000年台湾版22页)等。
发酵方法苹果酒的发酵本发明中用于苹果酒发酵的苹果汁为浓缩苹果汁稀释至22.0°Brix的苹果汁。
A.顺序混菌苹果酒发酵在1000mL三角瓶中装入800mL稀释后的浓缩苹果汁，稀释后的浓缩苹果汁的外观糖为22°Brix。法尔皮有孢汉生酵母种子和酵母属酵母种子已在30℃培养48小时。先接种法尔皮有孢汉生酵母，再在发酵若干天后接种酵母属酵母菌种CCTCC M201022，在15℃下进行发酵。以后每3天取样测定发酵液中的外观糖、计数法尔皮有孢汉生酵母和酵母属酵母数量，取样前充分摇匀发酵液。当发酵液中外观糖达到恒定值时，3000rpm离心10min分离发酵液以除去酵母，测定发酵液中总糖浓度、醇类酯类物质生成量。
B.发酵效率研究的苹果酒发酵所有发酵均在15℃条件下进行。
C.正交试验确定最佳接种量、(NH4)2SO4和VB1浓度，提高混菌酵母发酵的发酵效率在11个50mL三角瓶中加入25mL稀释后的浓缩苹果汁，该稀释后的浓缩苹果汁外观糖为22°Brix，取其中10个三角瓶接种法尔皮有孢汉生酵母，其中9个三角瓶接种量为1×102、1×104、1×106cfu/mL，每个接种量接种3个三角瓶；另外1个三角瓶接种量为4×106cfu/mL；最后1个三角瓶接种酵母属酵母，接种量为2×106cfu/mL，作为酵母属酵母发酵的对照样品。发酵第3天，取9个按1×102、1×104、1×106cfu/mL接种量接种过法尔皮有孢汉生酵母的三角瓶接种酵母属酵母，并加入(NH4)2SO4和VB1，酵母属酵母接种量、(NH4)2SO4和VB1加入浓度分别为1×102、1×104、1×106cfu/mL、250、500、750mg/L、0.16、0.4、0.8mg/L。发酵过程中，每3天取样测一次外观糖，至每两次外观糖含量之差小于1.0后，每1天取样测定外观糖，至24小时发酵液的外观糖达到恒定值时，离心发酵液，测定总糖浓度。
混合酵母接种时间对发酵效果的影响非酵母属酵母法尔皮有孢汉生酵母发酵后的3天为降糖延滞期，发酵后的3-18天为快速降糖期，发酵21天后，外观糖没有明显的降低，进入降糖平衡期。所以本发明选择法尔皮有孢汉生酵母的发酵延滞期(发酵第3天)、快速发酵中期(发酵第9天)，快速发酵后期(发酵第15天)为酵母属酵母的加入时间进行顺序混合酵母发酵特性研究。
在法尔皮有孢汉生酵母发酵期的第3、9、15天加入酵母属酵母，混菌发酵液中醇酯比分别为2.97、2.32、1.05，分别是纯种酵母属酵母发酵液的20.96％、16.34％、7.41％；总酯浓度分别为68.12mg/L、80.03mg/L、85.60mg/L，分别是纯种酵母属酵母发酵液的总酯浓度(23.78mg/L)的2.86、3.37、3.60倍。因此，在不同时间接种酵母属酵母的混菌发酵，可以调节苹果酒中香气物质的醇酯比、酯类物质浓度，酵母属酵母加入时间滞后，能够降低苹果酒中香气物质的醇酯比、增加苹果酒中的酯类物浓度，从而增加苹果酒的酯香。本发明选择在发酵第三天加入酵母属酵母CCTCC M201022。
混合酵母接种量对发酵效果的影响在酵母属酵母接种量相同的条件下，在1×102-1×106cfu/mL范围内增加法尔皮有孢汉生酵母的接种量有利于缩短发酵时间，接种量最低(1×102cfu/mL)和最高(1×106cfu/mL)均会降低发酵液中的残余总糖浓度，但接种量为1×104cfu/mL时，发酵液中残余总糖浓度上升，该现象说明，法尔皮有孢汉生酵母对酵母属酵母的抑制作用与发酵液中法尔皮有孢汉生酵母的初始浓度有关，但是，抑制程度不随发酵液中法尔皮有孢汉生酵母数量的增加而增加，有效的混菌发酵应排除使发酵液中残糖含量最高的法尔皮有孢汉生酵母接种量(1×104cfu/mL)。本发明选择法尔皮有孢汉生酵母接种量为1×102cfu/mL或1×106cfu/mL。
在法尔皮有孢汉生酵母接种量相同的条件下，增加酵母属酵母的接种量不能缩短发酵时间，但可以降低发酵液中残余总糖含量。所以本发明选择酵母属酵母接种量为1×106cfu/mL～2×106cfu/mL。
苹果汁所加营养物质(NH4)2SO4和VB1对酵母发酵效率的影响加入(NH4)2SO4和VB1的苹果酒发酵，外观糖达到恒定值的时间相同，并等于相应的对照发酵样品，所以，加入(NH4)2SO4和VB1不能提高两株酵母的发酵速率。
在法尔皮有孢汉生酵母和酵母属酵母中，加入(NH4)2SO4的最低总糖残余浓度分别是22.08g/L、3.62g/L，加入VB1的最低总糖残余浓度分别是22.85g/L、3.79g/L，即在两株酵母中，加入(NH4)2SO4的最低残余总糖浓度均低于加入VB1的最低残余总糖浓度，说明(NH4)2SO4和VB1两种因素中，(NH4)2SO4更有利于酵母降低发酵液中的残余总糖含量。
加入VB1、(NH4)2SO4的混菌发酵苹果酒中残余总糖浓度为3.17-3.49g/L均在4.0g/L以下，与纯种酵母属酵母的残余总糖浓度(3.82g/L)接近。明显低于纯种法尔皮有孢汉生酵母的残余总糖浓度25.45g/L。
CCTCC M201022的接种量增加为2×106cfu/mL时，与法尔皮有孢汉生酵母混菌发酵过程中，未加入VB1、(NH4)2SO4的样品和加入VB1、(NH4)2SO4样品外观糖达到恒定值的时间均为21天，因此，在该接种量条件下，VB1、(NH4)2SO4对外观糖达到恒定值的时间无明显影响。但该条件下，能降低发酵液中残余总糖含量，从25.45g/L降至24.00g/L。
未加入(NH4)2SO4和VB1的样品混菌发酵的发酵时间和残糖浓度分别为38天和3.92g/L，发酵时间长于21天，残糖含量高于最高值3.49g/L，说明在混菌接种量为1×102和2×106cfu/mL的混菌发酵条件下，同时加入(NH4)2SO4和VB1既能缩短发酵时间，又能降低发酵液中的残余总糖浓度。
影响混合酵母发酵效率的最佳接种量、(NH4)2SO4和VB1浓度的确定接种量、苹果汁营养条件均对酵母发酵效率有显著影响，所以有必要对这些因素进行正交试验，以确定影响混合酵母发酵效率的最佳接种量、(NH4)2SO4和VB1浓度。
因素重要性次序为酵母属酵母接种量、法尔皮有孢汉生酵母接种量、(NH4)2SO4浓度、VB1浓度。最佳配比为A1B3C2D3。
最终确定的最佳接种量、(NH4)2SO4和VB1浓度为法尔皮有孢汉生酵母1×102cfu/mL，酵母属酵母2×106cfu/mL，(NH4)2SO4500mg/L，VB10.8mg/L。
本发明的有益效果对混合酵母发酵苹果酒和纯种酵母发酵苹果酒的果香感官评定表明，混合酵母发酵苹果酒比纯种酵母属酵母有浓郁的果香。
A.醇酯比。混菌发酵、法尔皮有孢汉生酵母纯种发酵和酵母属酵母纯种发酵苹果酒的醇酯比分别为3.06、0.82、11.90，从该结果可以看出，混菌发酵的醇酯比为酵母属酵母的25.72％，因此，可以有效地降低醇酯比。
B.酯类物质a.乙酸酯三种发酵液中检测出的主要乙酸酯为乙酸乙酯、乙酸-2-苯乙酯和乙酸异戊酯，混菌发酵、法尔皮有孢汉生酵母纯种发酵和酵母属酵母纯种发酵苹果酒中乙酸酯总和分别为56.05mg/L、107.03mg/L、19.01mg/L，占相应苹果酒中总酯含量的90.26％、96.89％和68.93％，因此，一方面可以认为，与酵母属酵母纯种发酵相比，法尔皮有孢汉生酵母纯种发酵有利于发酵液中乙酸酯的生成，另一方面说明，与酵母属酵母纯种发酵相比，混菌发酵部分包含了法尔皮有孢汉生酵母产生高浓度乙酸酯的优良酿造特性，有利于提高苹果酒中乙酸酯浓度。
b.乙酯三种发酵液中检测出的主要乙酯为丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、琥珀酸二乙酯和9-癸烯酸乙酯，混菌发酵、法尔皮有孢汉生酵母纯种发酵和酵母属酵母纯种发酵苹果酒中乙酯总和分别为6.05mg/L、3.44mg/L和8.57mg/L。占相应苹果酒中总酯含量的9.74％、3.11％和31.07％，因此，一方面可以认为，与法尔皮有孢汉生酵母纯种发酵相比，酵母属酵母纯种发酵有利于发酵液中乙酸酯的生成，另一方面说明，与法尔皮有孢汉生酵母纯种发酵相比，混菌发酵部分包含了酵母属酵母产生高浓度乙酯的优良酿造特性，有利于提高苹果酒中乙酯浓度，比法尔皮有孢汉生酵母纯种发酵的苹果酒香气更复杂。
C.顺序混合酵母发酵和纯种酵母发酵的发酵效率比较顺序混菌发酵与酵母属酵母纯种发酵的发酵时间相同，均为31天；法尔皮有孢汉生酵母发酵结束时间为40天。
法尔皮有孢汉生酵母发酵40天时，残糖含量为30.21g/L，不能降糖至4.0g/L以下，而顺序混菌发酵与酵母属酵母发酵31天时残余总糖分别为3.88g/L、3.47g/L，均低于4.0g/L。
因此，优化发酵条件后的混菌发酵具备与酵母属酵母相似的高发酵效率的优良发酵性能。
生物材料样品保藏酵母属酵母，保藏日期2001年6月24日，保藏单位名称及简称中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为NOM201022。
具体实施例方式
实施例1接种量、苹果汁营养条件均对酵母发酵效率有显著影响，所以有必要对这些因素进行正交试验，以确定影响混合酵母发酵效率的最佳接种量、(NH4)2SO4和VB1浓度。
采用的正交实验的因素和水平如表1所示。法尔皮有孢汉生酵母采用AS2.1488，酵母属酵母采用CCTCC M201022。
表1 L9(34)正交实验的因素和水平
试验安排及结果如表2所示。
表2 L9(34)正交试验安排及结果
因素重要性次序为酵母属酵母接种量、法尔皮有孢汉生酵母接种量、(NH4)2SO4浓度、VB1浓度。最佳配比为A1B3C2D3。
最终确定的最佳接种量、(NH4)2SO4和VB1浓度为法尔皮有孢汉生酵母1×102cfu/mL，酵母属酵母2×106cfu/mL，(NH4)2SO4500mg/L，VB10.8mg/L。
实施例2按照最佳工艺条件，接种量法尔皮有孢汉生酵母ATCC 10631 1×102cfu/mL，酵母属酵母CCTCC M201022 2×106cfu/mL，营养物质添加量(NH4)2SO4500mg/L，VB10.8mg/L进行苹果酒混合酵母发酵，混合发酵温度为15℃，混合发酵时间为31天后，所得苹果酒产品总糖为3.88g/L，醇酯比为3.06，总酯浓度为62.10mg/L，是纯种酵母属酵母发酵的2.6倍。
权利要求
1.一种苹果酒的混合酵母发酵方法，其特征是以浓缩苹果汁稀释至22°Brix的苹果汁进行发酵，在发酵第一天接种法尔皮有孢汉生酵母(Hanseniasporavalbyensis)，接种量为1×102cfu/mL或1×106cfu/mL，再在发酵第三天接种酵母属酵母CCTCC M201022，接种量为1×106cfu/mL～2×106cfu/mL，在发酵苹果汁中添加营养物质(NH4)2SO4和VB1，添加量为(NH4)2SO4250～750mg/L，VB10.16～0.8mg/L，混合发酵温度为15℃，混合发酵时间为31天。
2.根据权利要求1所述的混合酵母发酵方法，其中的接种法尔皮有孢汉生酵母(Hanseniaspora valbyensis)，接种量为1×102cfu/mL，接种酵母属酵母CCTCCM201022，接种量为2×106cfu/mL。
3.根据权利要求1所述的混合酵母发酵方法，其中的接种用的法尔皮有孢汉生酵母种子和酵母属酵母CCTCC M201022种子均已在30℃培养48小时，培养基为浓缩苹果汁稀释至10°Brix的苹果汁。
4.根据权利要求1所述的混合酵母发酵方法，其中的法尔皮有孢汉生酵母采用AS 2.1488或ATCC 10631。p
全文摘要
一种苹果酒的混合酵母发酵方法，涉及苹果酒的酿造技术领域。本发明提出一种非酵母属酵母法尔皮有孢汉生酵母(Hanseniaspora valbyensis)和酵母属酵母CCTCC M201022的混合酵母发酵方法来制备苹果酒，并确定了酵母接种量、接种时间和营养物质(NH
文档编号C12G3/02GK1635080SQ200410064830
公开日2005年7月6日 申请日期2004年9月29日 优先权日2004年9月29日
发明者徐岩, 王栋, 赵光鳌 申请人:江南大学