酰胺化Exendin－4多肽的重组制备方法

专利名称：酰胺化Exendin－4多肽的重组制备方法
技术领域：
本发明涉及利用基因工程技术制备多肽或蛋白质的方法，尤其涉及利用基因工程技术制备酰胺化Exendin-4多肽的方法，还涉及多肽蛋白的酰胺化技术。
背景技术：
Exendin-4是从大毒蜥Gila monster，Heloderma horridum或Heloderma suspectum的口腔分泌物中分离出来的一种39个氨基酸的多肽，其氨基酸与胰高血糖素类多肽-1(Glucagon like peptide-1)有50％的同源性，并在多种动物模型中表现出与胰高血糖素类多肽-1类似的治疗II型糖尿病的作用。
美国专利5,424,286公开了Exendin-4氨基酸序列及其治疗糖尿病的功能，其中公开的Exendin-4多肽全长为hgegtftsdl skqmeeeavrlfiewlkngg pssgappps.
由于Exendin-4在治疗II型糖尿病(NIDDM)上有许多优越性1.在血糖浓度超过生理浓度时才通过胰高血糖素类多肽-1受体促进胰岛素的分泌，从而调节血糖浓度，当血糖浓度低于生理浓度时，则其降糖作用减弱，其调节血糖的作用具有血糖浓度依赖性；抑制胰高血糖素的分泌。
2.抑制肠道蠕动，降低食物在体内的吸收，从而产生降低患者体重的作用，避免患者长期使用胰岛素和口服糖尿病药物所造成的体重增加或肥胖症以及相关的并发症。
3.促进胰岛前体细胞分化，改善胰岛分泌功能。
鉴于Exendin-4在治疗II型糖尿病(NIDDM)上的优越性，大量制备Exendin-4是将该产品应用到临床的必备条件。利用基因重组技术制备与国外已经用于临床研究的产品具有重要意义。

发明内容
本发明的目的是提供酰胺化Exendin-4多肽的制备方法，它包括下述步骤①设计并人工合成编码Exendin-4氨基酸序列的DNA序列；②构建含有Exendin-4多肽编码序列的重组质粒的表达载体；③将重组质粒转入宿主细胞，获得融合表达或非融合表达Exendin-4的基因工程菌；④发酵培养工程菌；⑤表达后处理，获得酰胺化Exendin-4多肽。
在上述制备方法中，步骤①中所述的DNA序列优选含有编码C-末端第40位Gly的密码子。
在上述制备方法中，步骤②中所述的表达载体优选是原核表达载体。
在上述制备方法中，所述的原核表达载体优选是大肠杆菌融合表达载体。
在上述制备方法中，所述的大肠杆菌融合表达载体优选是pThioHis或pGex4T-1。
在上述制备方法中，所述的大肠杆菌表达载体pGex4T-1克隆入编码Exendin-4Gly的DNA序列，形成重组质粒pGSTE4G，将Exendin-4编码基因与GST融合表达。
在上述制备方法中，所述的大肠杆菌优选为BL21。
在上述制备方法中，步骤⑤中所述的表达后处理优选包括下述步骤纯化融合蛋白，用Enterkinase切割融合蛋白，分离纯化Exendin-4Gly，用α-酰胺化酶将Exendin-4Gly转化为酰胺化exendin-4，分离纯化酰胺化exendin-4。
具体实施例方式
本发明下列实施例中所用的分子生物学实验操作除特别说明均参照《分子克隆》和《分子生物学实验指南》。
DNA操作所用的试剂均购自宝生物大连公司，实验条件参照厂商推荐的条件进行。
实施例1 基因工程菌pGSTE4G的构建1.Exendin-4Gly编码基因的获取Exendin-4Gly编码基因是根据大肠杆菌密码偏好原则，由其氨基酸序列反转译为DNA序列。
Exendin-4Gly的氨基酸序列为hgegtftsdl skqmeeeavr lfiewlknggpssgapppsg，根据表达载体后的多克隆位点和限制性蛋白内切酶识别位点，设计如下的编码基因序列5’-gaattcgatg acgatgacaa gcacggtgaa ggtaccttca cctccgacct gtccaaacag 60EcoRIatggaagaag aagctgttcg tctgttcatc gaatggctga aaaacggtgg tccgtcctcc 120ggtgctccgc cgccgtccgg ttaataagtc gac -3’ 153SalI所得序列克隆入pUC18中保存得到pUCE4G，用Promega质粒提取试剂盒提取pUCE4G质粒DNA，用EcoRI/SalI切下120bp的小片段，用琼脂糖凝胶电泳分离小片段，并用凝胶DNA回收试剂盒提取小片段备用。
2.构建质粒pGSTE4G用Promega质粒提取试剂盒提取pGEX 4T-1质粒DNA，，用EcoRI/SalI双酶切，并用CIAP将大片段去磷酸化。将前步准备好的小片段用T4DNA连接酶连接后转化用CaCl2法制备的大肠杆菌BL21感受态细胞。用含100ug/ml Amp的LB平板筛选转化子。将平板中的转化子挑取到含100ug/ml Amp的LB培养液中，37℃振荡培养，用1mM IPTG诱导表达，出现31kd的表达带的为正确的重组子。所得重组子命名为pGSTE4G。
实施例2 分离纯化Exendin-4Gly①接种pGSTE4G到1000ml含100ug/ml Amp的LB培养液中，37℃振荡培养16小时，将培养物接种到20升TB培养基中发酵培养，OD600达到8时加1mM IPTG诱导表达，继续培养4小时后，离心收集菌体。
②所得菌体用50mM Tris.Cl pH8.0，150mM NaCl悬浮，用APV高压匀浆破碎菌体，14000g离心20min收集上清液。
③所得上清液上用50mM Tris.Cl pH8.0，150mM NaCl平衡的GST亲和柱，用50mM Tris.Cl pH8.0，150mM NaCl冲洗杂蛋白，用50mMTris.Cl pH8.0，150mM NaCl，2mM CaCl2，2u/ml Enterkinase在结合有GSTE4G融合蛋白的GST亲和柱中循环2小时，收集穿透液。
④穿透液上用50mM Tris.Cl pH8.0，150mM NaCl平衡的Q-SepharoseFast Flow，用上样缓冲液洗到基线，用50mM Tris.Cl 300mM NaCl洗脱Exendin-4Gly。
实施例3 Exendin-4Gly转化为酰胺化Exendin-4(Exendin-4-NH2)本步骤利用重组α-AE(α-amidating enzyme)将Exendin-4Gly转化为酰胺化Exendin-4(Exendin-4-NH2)。
本步骤按如下方法实施反应体系30mM MES pH6.0，0.0015％(v/v)Triton X-100，11ug/mlcatalase，5mM KI，1.5mM抗坏血酸钠，1％(v/v)乙醇，25000u/mlα-AE，0.2mM ambient O2，1mM Exendin-4Gly(约4mg/ml)。
反应在37℃进行16小时，用2N NaOH调整pH到8.0，加入半胱氨酸到5mM终止反应，并准备纯化酰胺化Exendin-4(Exendin-4-NH2)。
实施例4 纯化酰胺化Exendin-4(Exendin-4-NH2)上述反应混合物上用50mM Tris.Cl pH8.0，150mM NaCl平衡的Q-Sepharose Fast Flow，用上样缓冲液洗到基线，用50mM Tris.Cl 300mMNaCl洗脱Exendin-4-NH2；所收集Exendin-4-NH2上用0.1％TFA平衡的Source 15 RPC反相层析柱，用0％到100％的0.1％TFA乙腈梯度洗脱，收集Exendin-4-NH2，用NaOH调pH到8，上用50mM Tris.Cl pH8.0，150mM NaCl平衡的Q-Sepharose Fast Flow，去掉TFA和乙腈，得到纯品Exendin-4-NH2。
实施例5 重组Exendin-4单次静脉及皮下注射毒性试验1.供试品名称重组Exendin-4(E-4)标示量80μg/ml溶剂甘露醇等保存条件2-8℃保存。
2.研究系统2.1动物种属昆明种小鼠2.2性别和数量60只(雌30只，雄30只)2.3动物年龄3~4周龄2.4试验开始时动物体重雌性18.68±0.62，雄性19.55±0.84。
2.5动物来源军事医学科学院实验动物中心2.6动物合格证号XCXK(京)2002-0012.7实验设施合格证医动字第01-2049号2.8研究系统选择理由小鼠饲养方便，对药物反应较稳定，是目前国际上比较公认的实验动物之一。
2.9研究系统的标记识别苦味酸标记。
2.10检疫时间及发现2003年7月31日检疫时发现，动物活泼、被毛光滑、大便未见异常。
2.11饲养管理条件养于塑料饲养盒内，雌雄分养，每盒5只，喂以标准饲料，自由摄水，光照12小时明暗交替。室温18~24℃，湿度40-60％。
3.实验设计3.1试验设计的依据3.1.1作用机制及研究背景E-4，是一种39个氨基酸的肽，其结构上有53％与GLP-1(glucagon-like-peptide-1)同源，并为GLP-1受体拮抗剂。GLP-1的生物学活性包括刺激胰岛素的分泌，促进胰岛素的生物合成；抑制胰高血糖素的分泌和胃的排空；减少食物的摄入。GLP-1在体内保持活性时间较短，它可被丝氨酸蛋白酶分解。
E-4具有并且强于GLP-1的药理作用。天然E-4是从Gila毒蜥蜴的唾液液中提取的物质，美国Amylin药厂合成的E-4已完成临床前试验，目前正在进行大规模的III期临床试验。动物试验结果证明E-4在高血糖时可刺激胰岛素的分泌，但在低血糖时无此作用；E-4可调节胃排空，减慢营养物质的吸收；对于肥胖动物，E-4可减少食量，降低体重；尤其是E-4可使血糖水平降至正常水平。另外，E-4治疗糖尿病的作用在于它可刺激胰岛β细胞的复制和再生。
3.1.2临床拟用方案主要适应症治疗2型糖尿病给药途径皮下注射临床拟用剂量5-10μg/人，每日2次。
拟用疗程长期用药。
3.1.3我国药品安全性评价的有关规定。
3.2剂量设计皮下注射以原药液0.2ml/10g体重给予小鼠，则剂量为1600μg/kg。静脉注射以原药液0.2ml/10g体重给予小鼠，则剂量为1600μg/kg。
3.3药物配制用原药液。
3.4给药方法一次给药。
3.5给药途径皮下注射与静脉注射3.5给药容量0.2ml/10g体重3.6给药时间上午8:30~11:304.实验方法取昆明种小鼠60只(雌雄各半)，体重为18-20g，随机分为3组，1组为正常对照组，1组为皮下注射组，1组为静脉注射组。对照组皮下注射给予生理盐水，皮下注射组和静脉注射组按上述设计的给药剂量一次或静脉注射给予小鼠。给药后立即观察动物的表现及死亡情况。
5.观察与记录5.1食量每天称动物食量。
5.2体重给药前、给药后第7天及第14天称动物体重，并与对照比较。
5.3给药后连续观察2小时，以后每天上下午各观察记录一次，仔细记录动物出现的中毒表现，连续观察14天。若动物出现死亡，应及时进行剖检，若有肉眼可见病变应做病理检查。
6.试验结果表示方法受试物最大浓度给予动物后，连续观察14天，若未见动物死亡，则可表示为MTD为该剂量。
结果小鼠皮下及静脉注射E-4后各动物行为表现未见明显异常，观察期间无动物死亡。试验验期间动物体重明显增长，食量正常。
结论在本试验条件下，E-4单次静脉注射给予小鼠的MTD为1600μg/kg。单次皮下注射给予小鼠的MTD为1600μg/kg。
实施例6 Exendin-4降血糖作用的实验研究1材料1.1实验动物Wistar大鼠，雌雄各半，体重200±20g。由东南大学丁家桥校区动物试验中心提供，动物合格证号SYXK(苏)2002-0012。
Db/db小鼠，雌雄各半，体重50-60g。由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，动物合格证号第02-20-9号。
1.2药品与试剂Exendin-4由成都芝田生物工程有限公司提供，批号20030618。葡萄糖测定试剂盒为上海荣盛生物技术有限公司产品。胰岛素测定试剂盒由中科院北京原子能研究所提供。链脲佐菌素为Sigma公司产品。胰岛素注射液为徐州万邦生物化学制药厂产品。胆固醇、甘油三酯、糖化血红蛋白测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。
2、方法2.1正常大鼠试验正常Wistar大鼠，雌雄各半(200±20)克，随机分成5组，每组10只，即正常对照组、阳性对照组(胰岛素0.5iu/kg sc)、Exendin-4高、中、低3个剂量给药组(0.3、1.0、3.0μg/kg)。各给药组皮下注射Exendin-4，正常对照组皮下注射等量磷酸缓冲液。连续给药4周。首次给药后测定0、1、4、8小时空腹血糖，观察药物急性作用；第0、2、4周测定空腹血清葡萄糖、胰岛素浓度；第3周时进行葡萄糖耐量实验；第4周末次给药后1小时取血，测胆固醇、甘油三酯。
2.2链脲佐菌素(STZ)高血糖大鼠试验Wistar大鼠，雄性(200±20)克，除正常对照组外，禁食12小时后ip 50mg/kg STZ(溶于0.1mol/L PH4.5枸橼酸缓冲液中，2％浓度，临用前配制)，72小时后测定血糖，＞13.1mmol/L入选实验。随机分成5组，每组10只，即模型对照组、阳性对照组(胰岛素0.5iu/kg sc)、Exendin-4高、中、低3个剂量给药组(0.3、1.0、3.0μg/kg)。各给药组皮下注射Exendin-4，正常对照组皮下注射等量磷酸缓冲液。连续给药4周。首次给药后测定0、1、4、8小时空腹血糖，观察药物急性作用；第0、2、4周测定空腹血清葡萄糖、胰岛素浓度；第3周时进行葡萄糖耐量实验；第4周末次给药后1小时取血，测糖化血红蛋白、胆固醇、甘油三酯。
2.3自发性糖尿病db/db小鼠试验4周龄db/db小鼠，随机分成5组，每组10只，雌雄各半。即模型对照组、阳性药组(胰岛素1iu/kg sc)、Exendin-4高、中、低3个剂量给药组(0.6、2.0、6.0μg/kg)。另设正常对照组即nondiabeticlittermate。各给药组皮下注射Exendin-4，模型对照组和正常对照组皮下注射等量磷酸缓冲液，连续8周，检测下列指标首次给药时测定0、1、4、8小时的空腹血糖浓度，观察药物的急性作用。实验结束时取血，测定血糖、胰岛素、糖化血红蛋白、胆固醇、甘油三酯。
3、结果3.1 Exendin-4对正常大鼠血糖的急性作用从表1可见，Exendin-4对正常大鼠无急性降血糖作用表1 Exendin-4对正常大鼠血糖(mmol/L)的急性作用(X±S，n＝10)

与正常对照组比较 *P＜0.05 **P＜0.01
3.2 Exendin-4连续给药1个月对正常大鼠空腹血糖、胰岛素的影响从表2可见，与正常组比较，Exendin-4连续给药1个月对正常大鼠空腹血糖、胰岛素无明显影响。
表2 Exendin-4连续给药1个月对正常大鼠空腹血糖、胰岛素的影响(X±S，n＝10)

与正常对照组比较 *P＜0.05 **P＜0.013.3 Exendin-4对正常大鼠糖耐量的影响从表3可见，Exendin-4可明显减少腹腔注射葡萄糖后血糖的升高，提高正常大鼠的糖耐量。
表3 Exendin-4对正常大鼠糖耐量的影响(X±S，n＝10)

与正常对照组比较 *P＜0.05 **P＜0.013.4 Exendin-4对正常大鼠血酯的影响从表4可见，Exendin-4对正常大鼠胆固醇、甘油三酯无明显影响。
表4 Exendin-4对正常大鼠胆固醇、甘油三酯的影响(X±S，n＝10)

3.5 Exendin-4对STZ大鼠空腹血糖的急性作用从表5可见，Exendin-4可剂量依赖性地降低STZ大鼠空腹血糖，皮下注射后4小时血糖降到最低点，8小时时部分恢复。
表5 Exendin-4对STZ大鼠空腹血糖的急性作用(X±S，n＝10)

与正常对照组比较 ***P＜0.001与模型组比较 #P＜0.05 ##P＜0.013.6 Exendin-4连续给药1个月对STZ大鼠空腹血糖、胰岛素的影响表6结果表明，与模型组比较，Exendin-4连续给药1个月时，第2周开始空腹血糖浓度明显降低，而血清胰岛素水平升高。
表6 Exendin-4连续给药1个月对STZ大鼠空腹血糖、胰岛素的影响(X±S，n＝10)

与正常对照组比较 **P＜0.01与模型组比较 ##P＜0.013.7 Exendin-4对STZ大鼠糖耐量的影响表7结果可见，与正常组比较，模型组大鼠腹腔注射葡萄糖后，其0.5、1小时的血糖升高值明显增加。而连续给予Exendin-4后可明显抑制血糖的升高。
表7 Exendin-4对STZ大鼠各时间点血糖变化值(mmol/L)的影响(X±S，n＝10)

与正常对照组比较 **P＜0.01与模型组比较##P＜0.01
3.8 Exendin-4对STZ大鼠血脂及糖化血红蛋白的影响表8结果表明Exendin-4连续给药1个月，各剂量可以非常显著地降低糖化血红蛋白的浓度，高剂量也能降低血清胆固醇水平。而对甘油三酯无明显作用。
表8 Exendin-4对STZ大鼠血脂及糖化血红蛋白的影响(X±S，n＝10)

与正常对照组比较 **P＜0.01与模型组比较 #P＜0.05 ##P＜0.013.9 Exendin-4对db/db小鼠血糖的急性影响从表9可见，Exendin-4可剂量依赖性地降低db/db小鼠空腹血糖，皮下注射后4小时血糖降到最低点，幅度达30％，8小时时部分恢复。
表9 Exendin-4对db/db小鼠血糖的急性影响(X±S，n＝10)

与模型组比较 *P＜0.05 **P＜0.01
3.10 Exendin-4连续给药2个月对db/db小鼠血糖、胰岛素的影响表10结果表明Exendin-4连续给药2个月可以明显降低db/db小鼠血清血糖、胰岛素水平。
表10 Exendin-4多次给药对db/db小鼠血糖和胰岛素的影响(X±S，n＝10)

与正常对照组比较 **P＜0.01与模型组比较 #P＜0.05 ##P＜0.013.11 Exendin-4对db/db小鼠糖化血红蛋白、血脂的影响表11结果表明Exendin-4连续给药2个月可以明显降低db/db小鼠胆固醇、甘油三酯及糖化血红蛋白的水平。
表11 Exendin-4对db/db小鼠糖化血红蛋白、血脂的影响(X±S，n＝10)

与正常对照组比较 **P＜0.01与模型组比较 #P＜0.05 ##P＜0.01
实施例7 重组Exendin-4一般药理学试验研究报告1.材料与方法1.1名称重组Exendin-4。
1.1.1标示量80ug/ml1.1.2性状及理化性质本品为白色冻干粉，易溶于水1.1.3保存条件2-8℃保存。
1.2研究系统1.2.1动物种属昆明种小鼠。
1.2.2数量及性别小鼠120只，雌雄各半。
1.2.3动物体重小鼠体重18-22g。
1.2.4动物来源小鼠购于中国军事医学科学院实验动物中心。
1.2.5研究系统选择的理由小鼠遗传背景清楚，对药物的反应比较稳定，个体差异较小，饲养方便，体形较小，便于试验操作，节省供试药物。
1.2.7研究系统的标记识别小鼠采用苦味酸标记。
1.2.8检疫时间2003年12月16日至2004年3月25日1.2.9检疫结果各动物健康活泼，背毛光滑。饮食及活动均未见异常表现。
1.2.10饲养管理条件小鼠每笼5只，喂以标准饲料，自由摄水，室温20-25℃，湿度40-70％，光照12小时明暗交替。
1.3实验仪器及试剂1.3.1 GJ-8502型计算机自动控制小鼠自主活动实验仪，中国医学科学院药物研究所生产。
1.3.2 0.3％戊巴比妥钠溶液1.3.3金属网等1.4剂量设计及依据1.4.1试验设计的依据
1.4.1.1作用机制及研究背景Exendin-4(E-4)是一种39个氨基酸的肽，其结构上有53％与GLP-1同源，并为GLP-1受体拮抗剂。GLP-1的生物学活性包括刺激胰岛素的分泌，促进胰岛素的生物合成；抑制胰高血糖素的分泌和胃的排空；减少食物的摄入。GLP-1在体内保持活性时间较短，它可被丝氨酸蛋白酶分解。
E-4具有并且强于GLP-1的药理作用。天然E-4是从Gila毒蜥蜴的唾液液中提取的物质，美国Amylin药厂合成的E-4已完成临床前试验，目前正在进行大规模的III期临床试验。动物试验结果证明E-4在高血糖时可刺激胰岛素的分泌，但在低血糖时无此作用；E-4可调节胃排空，减慢营养物质的吸收；对于肥胖动物，E-4可减少食量，降低体重；尤其是E-4可使血糖水平降至正常水平。另外，E-4治疗糖尿病的作用在于它可刺激胰岛β细胞的复制和再生。
1.4.1.2药效学试验在培养的在体、离体胰岛中，在高葡萄糖浓度条件下，E-4可刺激胰岛素的分泌。
E-4的降血糖作用和刺激胰岛素分泌作用在很多动物模型中进行了研究，包括ob/ob、db/db小鼠、糖尿病肥胖Zucker大鼠和糖尿病恒河猴等。
研究结果显示，小鼠试验降糖达到35％时，GLP-1多数剂量在药后1h消除，而E-4持续时间超过4h。db/db小鼠给药剂量为0.001、0.01、0.1、1、10 100μg/100μL/只，ED50为0.059±0.15μg/kg；ob/ob小鼠给药剂量为0.001、0.01、0.1、1、10 100μg/100μL/只，ED50为0.136μg/kg。恒河猴试验E-4可降低糖尿病恒河猴血糖浓度，并有剂量依赖关系，给药剂量为0.1、1、10、100μg/kg，降糖37％的ED50为0.25±0.09μg。
1.4.1.3药代动力学参数II型糖尿病患者，48小时内接受3到4次E-4，剂量达到0.1～0.4μg/kg，结果血浆药物至少在15小时可检测到。另一项研究显示，2型糖尿病患者23小时连续皮下接受4个剂量0.2、0.4、0.6、0.8μg/kg的E-4，稳态血药浓度至少保持4小时。
1.4.1.4安全性评价试验未见E-4临床前安全性评价试验的报道，E-4临床试验中，给药剂量为0.1μg/kg，没有明显的安全性问题，仅有轻度的头痛、恶心、呕吐和轻微的低血糖症状。
1.4.1.5临床拟用方案主要适应症II型糖尿病给药途径皮下注射临床拟用剂量5-10μg/人，每日2次1.4.1.6相关法规我国药品监督局颁布的《药品注册管理办法》(试行)中附件三生物制品注册分类及申报资料项目要求，以及新药药理(毒理)临床前研究指导原则。
1.4.2试验剂量小鼠试验Exendin-4剂量为1.0、3.0、10.0μg/kg，该剂量大于小鼠的药效学等效剂量(小鼠等效剂量折算为1.30-2.60μg/kg)1.5实验方法小鼠120只(体重18～22g，雌雄各半)，按性别、体重随机分为对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组4组，给药方法皮下注射，容量0.2ml/10g。
观察内容a.一般行为观察40只小鼠，雌雄各半，按上述分组给药，直接观察给药后动物一般行为表现、姿势、步态，流涎、肌颤及瞳孔变化。
b.对正常小鼠自主活动的影响40只小鼠，雌雄各半，按上述分组给药，每轮每组1只动物给药，间隔12分钟给下一轮，于给药后1h分别测试10min内各组小鼠自主活动数，每轮测定4只，共测10轮，比较组间结果。
c.对戊巴比妥钠催眠阈下剂量作用的影响40只小鼠，雌雄各半，按上述分组给药，给药后1h分别腹腔注射戊巴比妥钠(30mg/kg)，观察30min内睡眠情况，如有动物出现翻正反射消失，需记录出现动物数及出现睡眠的潜伏期。
d.攀网能力对正常小鼠攀网能力的影响。将金属网呈45°置于实验台上，40只小鼠，雌雄各半，按上述分组用药后将实验小鼠每次两只放于网上任其攀爬，观察10分钟内各组落下的小鼠只数。
2.试验结果2.1对小鼠一般行为的影响皮下注射给予Exendin-4 1.0、3.0、10.0μg/kg后，各组小鼠均未见明显异常变化，未见异常姿势、步态，无流涎、肌颤、抽搐、肌肉瘫痪等现象发生，瞳孔无改变。
2.2对小鼠自主活动的影响皮下注射给予Exendin-4 1.0、3.0、10.0μg/kg后，各组动物自主活动无异常改变，与生理盐水对照组比较，无统计学差异，详见表12。
表12 Exendin-4对小鼠自主活动的影响(x±SD，n＝10)

与对照组比较，p＞0.052.3对戊巴比妥钠催眠阈下剂量作用的影响皮下注射给予Exendin-4 1.0、3.0、10.0μg/kg，给药后30min分别腹腔注射戊巴比妥钠(30mg/kg)，观察30min内睡眠情况，以动物出现翻正反射消失持续1分钟以上为准，各组出现睡眠的动物数及出现睡眠的潜伏期未见明显差别，详见表13。
表13 Exendin-4对戊巴比妥钠催眠阈下剂量作用的影响(x±s，n＝10)

与对照组比较，p＞0.052.4对小鼠攀网能力的影响皮下注射给予Exendin-4 1.0、3.0、10.0μg/kg后，各组动物攀网能力与生理盐水对照组比较，无统计学差异，详见表14。
表14 Exendin-4对小鼠攀网能力的影响(n＝10)

3.结论在本试验条件下，Exendin-4 1.0、3.0及10.0μg/kg皮下给药，小鼠一般行为表现、姿势、步态等未见异常，给药动物的自主活动数、对戊巴比妥钠催眠阈下剂量的反应、攀网能力等与对照组比较无显著差异。提示本品对精神、神经均无明显影响。
序列表<110>成都芝田生物工程有限公司<120>酰胺化Exendin-4多肽的重组制备方法<130>MP040485-2<150>200410038842.2<151>2004-04-30<160>1<210>1<211>153<212>DNA<213>Escherichia coli<400>1gaattcgatg acgatgacaa gcacggtgaa ggtaccttca cctccgacct gtccaaacag 60atggaagaag aagctgttcg tctgttcatc gaatggctga aaaacggtgg tccgtcctcc 120ggtgctccgc cgccgtccgg ttaataagtc gac 15权利要求
1.酰胺化Exendin-4多肽的重组制备方法，它包括下述步骤①设计并人工合成编码Exendin-4氨基酸序列的DNA序列；②构建含有Exendin-4多肽编码序列的重组质粒的表达载体；③将重组质粒转入宿主细胞，获得融合表达或非融合表达Exendin-4的基因工程菌；④发酵培养工程菌；⑤表达后处理，获得酰胺化Exendin-4多肽。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤①中所述的DNA序列含有编码C-末端第40位Gly的密码子。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤②中所述的表达载体是原核表达载体。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的原核表达载体是大肠杆菌融合表达载体。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的大肠杆菌融合表达载体是pThioHis或pGex4T-1。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的大肠杆菌表达载体pGex4T-1克隆入编码Exendin-4Gly的DNA序列，形成重组质粒pGSTE4G，将Exendin-4编码基因与GST融合表达。
7.如权利要求4-6所述的制备方法，其特征在于，所述的大肠杆菌为BL21。
8.如权利要求1-6所述的制备方法，其特征在于，步骤⑤中所述的表达后处理包括下述步骤纯化融合蛋白，用Enterkinase切割融合蛋白，分离纯化Exendin-4Gly，用α-酰胺化酶将Exendin-4Gly转化为酰胺化exendin-4，分离纯化酰胺化exendin-4。
全文摘要
本发明公开了酰胺化Exendin－4多肽的重组制备方法，通过人工合成编码Exendin－4氨基酸序列的DNA序列，并克隆入表达载体中构建重组质粒，将其转入宿主细胞，获得融合表达Exendin－4的基因工程菌，发酵培养工程菌，经过表达后的处理工艺，获得酰胺化Exendin－4多肽。本制备方法与化学合成方法相比，具有降低生产成本，满足大规模生产的特点。
文档编号C12N15/16GK1693459SQ200410062650
公开日2005年11月9日 申请日期2004年7月8日 优先权日2004年4月30日
发明者赵波 申请人:成都芝田生物工程有限公司