专利名称：水稻冠根控制基因crl3及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及一种利用图位克隆技术克隆的水稻CRL3(crown rootless3)基因，以及转基因互补功能实验鉴定该基因；还涉及利用该基因物调控水稻冠根发生能力从而调节水稻的根系结构提高农作物的产量。
背景技术：
水稻根系由种子根和大量的冠根以及侧根组成，冠根是其最重要的组成部分。冠根为胚后发育的器官，在水稻的茎节位产生。正常发育过程中，在水稻的各个节位都有冠根原基发生，但是一般只有在未伸长的基部节位的冠根原基才能发育并突破表皮形成冠根。水稻冠根的发生发育过程可以划分为12个连续的阶段(Kawata and Harada，1975)，冠根原基起始于几个中柱鞘细胞平周分裂，产生内外两层细胞，外层细胞发育为表皮、内皮层、皮层和根冠，而内层形成维管组织，进一步的平周分裂，外层细胞分化为表皮、内皮和根冠，边缘部分的细胞分化为皮层，并不断分裂增加皮层数目，到这个阶段冠根原基基本形成，包括除维管束的全部组织。在形态结构上，冠根与主根和侧根构造几乎完全相同，包括表皮、皮层、维管柱等结构，具有根冠、分生区、伸长区和成熟区等特征。
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，冠根是其起固着、养分、水分吸收的主要器官，因此也是决定水稻生长与产量的重要因子。通过生物技术调节水稻的冠根数目，进行分子育种研究有着非常良好的应用前景。尽管冠根对水稻生长发育有非常重要的作用，但是对于控制冠根发生发育的相关基因和分子机制仍不清楚。对水稻冠根发生发育遗传机制的研究也是非常有限，目前仅有Inukai和Miwa报道的水稻冠根数目减少的突变体crl1，crl2(crl，crown rootless)。尚无有关控制冠根发生的基因的报道。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种能使水稻具有良好根系结构的蛋白质及其基因，以及由此获得的转基因植物细胞，和利用所述基因对水稻冠根进行改造的方法。
本发明为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的提供一种水稻冠根控制基因CRL3编码的蛋白质，其具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
作为本发明的一种改进上述氨基酸序列还包括在Seq ID No.2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个氨基酸生成的衍生物。
本发明还提供一种编码上述两种蛋白质或其功能类似物的基因，其具有Seq ID No.1所示的核苷酸序列。
作为本发明的一种改进上述核苷酸序列还包括在Seq ID No.1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。
本发明还提供一种包含上述两种核酸的转基因植物细胞。
本发明还提供一种对水稻冠根进行改造的方法，包括用具有Seq ID No.1所示的核苷酸序列的基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。
进一步具体的说本发明的目的是提供一种从水稻突变体crl3中克隆的新基因CRL3，如图6和Seq ID No.1所示的DNA序列，也包括与Seq ID No.1所示的DNA序列至少有70％同源性的基因序列。本发明中的Seq ID No.2和图7所示的蛋白质属于LBD基因家族，其中进行一个或几个替换，插入或缺失所获得的功能类似物。另外，也包括在Seq ID No.1中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能达到本发明的目的。
本发明的另一个目的是提供一种用CRL3基因进行高效的植物转化的方法，具体地说，本发明提供了具有Seq ID No.1和图6所示的序列的基因或基因部分片段的载体，其中，如图5所示的pc5-5和pc-RNAi，该载体可以表达有上述核苷酸序列编码的多肽或其同源类似物。
本发明还提供了一种利用植物表达载体转化植物细胞影响水稻冠根发生能力的方法。
实现本发明的具体技术步骤如下一、水稻冠根缺失突变体crl3的分离和遗传分析通过大量筛选突变体，本发明获得了一个水稻冠根缺失突变体crl3，通过与野生水稻正反交实验，我们获得了一个符合单基因控制的遗传规律的隐性突变体，如图1所示。
二、图位克隆控制水稻冠根的CRL3基因1)、CRL3基因的初步定位为了分离CRL3基因，本发明采用图位克隆的方法，首先创建了一个F2定位群体，由crl3杂合体(粳稻中花-11号)为母本，选用籼稻Kasalath为父本杂交获得的F2中的隐性个体组成。并利用SSLP分子标记对CRL3位点进行初步定位见图2。定位结果表明，CRL3初步定位在第3染色体短臂介于RM6301和RM6883两个标记之间。
2)、CRL3基因的精细定位通过对RM6301和RM6883两个标记之间的BAC序列分析，发展新的STS标记将CRL3精确定位于BAC OSNJBb0050N02上STS9标记附近20kb范围之内(图3)，通过分析此区段开放阅读框(ORF)推测候选基因。
3)、CRL3基因的鉴定和功能分析通过转基因技术，结果表明本发明获得了使突变体恢复正常功能的转基因水稻(图5)，证明了本发明正确克隆了CRL3基因(图6)，氨基酸序列分析表明CRL3蛋白属于LBD基因家族(图7)。
三、抑制CRL3基因在水稻中的表达通过RNAi和转基因技术抑制CRL3基因在水稻中的表达，获得了冠根数目减少的转基因水稻，冠根数目与CRL3基因的表达量相关，证明CRL3基因表达能够调节冠根的数目。(图8)我国目前存在耕地面积减少，水分及不可再生化肥资源短缺的危机。迫切需要培育高产高效水稻品种，良好的根系结构是决定水稻产量和水分养分吸收效率的基础，基因工程技术的发展使得应用CRL3基因调整水稻根系结构和组成成为可能。本发明的crl3(crown rootless3)突变体，是单基因隐性突变，符合孟德尔方式遗传规律。Crl3突变体由本发明者分离获得。本发明通过图位克隆技术获得控制水稻冠根性状的基因CRL3，并通过转基因功能互补实验鉴定了该基因的功能。因而，本发明能使水稻具有良好的根系结构，从而促进水分养分吸收效率，最终能提高水稻产量。
图1是水稻冠根缺失突变体crl3的表型；图2是CRL3基因在水稻第3染色体上的初步定位图；图3是CRL3基因的精细定位；图4是pc5-5和pc-RNAi载体图谱；图5是功能互补实验T1代转基因水稻的表型。1中花11；2crl3；3T1-1；4T1-2；图6是CRL3基因的DNA序列；图7是CRL3基因编码的氨基酸序列；图8是RNAi(CRL3)转基因水稻的冠根数。
具体实施例方式
实施例11、水稻(Oryza sativa ssp.zhonghual1)突变体crl3(crown rootless 3)，原始野生材料为中花11。
2、水稻材料的培养条件水稻种子用蒸馏水洗净，放于培养皿中，37℃黑暗条件下浸种至露白(1天)，然后转移至湿润滤纸上30℃培养2天；将发芽的种子转移至尼龙纱网上，生长7天(生长条件同上)。将生长7天的幼苗小心的从纱网上取下，移栽到PVC板的海绵球上继续在水稻营养液中培养。
水稻培养条件
光温可控水稻培养室温度控制白天28-30℃，夜晚20-22℃光照时间7:00-19:00光照强度250-300umol.m-2.s-1水稻培养液PH5.0，每天调节一次，培养液每4天更换一次。
水稻培养液母液配方(国际水稻所) 使用时，每4L培养液中加1号-6号贮备液，各5ml。
3、分析和定位群体杂合体(crl3)和原始野生型品种中花11进行正交和反交，F1代自交，在F2代水稻溶液培养14天后，统计野生型和冠根缺失表型个体的数目，并用统计学方法计算分离比例。F2定位群体是由杂合体(crl3)[粳稻]和籼稻品种kasalath杂交获得的，总共鉴定出1880个冠根缺失表型的F2个体，取0.1克左右的嫩叶，用来提取总DNA。
4、通过SSLP和STS标记定位CRL3基因采用水稻微量DNA的快速提取方法从水稻叶片中提取用于基因定位的基因组DNA。取大约0.1g水稻幼嫩叶片，经液氮冷冻，在1.5ml的离心管中将叶片磨成粉末，提取总DNA，获得的DNA溶解于200μl无菌水中。每个SSLP和STS反应用2μl DNA样品。
在CRL3基因的初步定位试验中，对94个F2个体进行SSLP分析。根据公布的粳稻和籼稻创建的分子遗传图谱，选取近似均匀分布于各条染色体上的SSLP引物，根据已知的反应条件进行PCR扩增，然后在6％的丙烯酰胺凝胶电泳分离，检测PCR产物的多态性。
在精细定位CRL3基因时，对由1880F2个体组成的群体进行STS分析。根据分子标记RM6301和RM6883之间的BAC序列和公布的kasalath BAC末端序列，我们设计了3个STS分子标记(STS1，STS7，STS9)，引物序列为STS1U-5’AGTTATGGTGAAATGTGCTTG3’，STS1L-5’AAATCTCTTTAAAAGAACTCG3’；STS7U-5’ACTTCGGAGAGAGTTCATACC3’，STS7L-5’TAACTTGGCGAATCAG3’；STS9U-5’GGGAAGGTATTTATTTGAAGTTT3’，STS9L-5’TTCATAACTAATATGTGTAGCGTG3’。
利用这3个STS分子标记对1880F2个体进行连锁分析。
5、基因预测和比较分析根据精细定位的结果，CRL3基因位于BAC克隆OSNJBb0050N02上STS9标记附近20kb范围之内。根据BAC克隆OSNJBb0050N02序列，设计20对引物，采用PCR方法分别从crl3和野生型中花11的基因组中扩增出这20kb(共20个DNA片段)，进行测序分析。发现第18对引物扩增的产物突变体crl3比野生型中花11缺少20bp。将这结果重复验证两次，发现突变体crl3基因组都缺少这20bp。根据BAC克隆OSNJBb0050N02序列的基因注释信息(NCBI)，发现20bp缺失位于一个具有LOB结构域的LBD基因。
实施例2植物转化将BAC克隆OSNJBb0050N02用HindIII不完全酶切，电泳分离后，割取5-10kb的DNA片段连接到pCAMBIA2301中，测序分析发现一个5.4kb的片段包括CRL3完整的ORF区，3.7kb的上游序列连接到pCAMBIA2301，所以获得了用于转化的质粒pC5-5(图4)。这个质粒通过电击的方法转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系EHA105中转化水稻。将F3个体[F2中的突变个体单株收获F3个体，F3个体早期(3周内)仍然缺少冠根]的成熟种子脱壳、消毒，经过诱导培养基培养3周后，挑选生长旺盛愈伤用作转化的受体。用含有双元质粒载体的EHA105菌株侵染水稻愈伤，在黑暗、25℃条件下培养3天后，在含有150mg/L G418的选择培养基上筛选抗性愈伤和转基因植株。将G418抗性植株，转到溶液培养2周后，转到水田栽培收获T1代(图5)。
以上所述仅为本发明的若干个具体实施方式
，应当指出，对于本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表SEQ ID NO1atgacgggat ttggatcgcc gtgcggcgcg tgcaagtttc tgcggcgcaa gtgcgtgcgc60gggtgcgtgt tcgcgccata cttctgccac gagcaagggg cggcgcactt cgccgccatc120cacaaggtgt tcggcgccag caacgtgtcc aagctgctcg cccacctgcc gctcgccgac180cgccccgagg ccgccgtcac tatctcctac gaggcgcagg cccgcctccg cgaccccatc240tatggctgcg tcgcccacat cttcgccctc cagcagcagg tgatgacgct gcaggcgcag300ctggcgtcgc tcaaggcggc ggcggcgcaa gggatacacc accaggacgt cggcgccacc360accaagggcg gctacatgag cgccgccgcc accgccgccg acgaccaatt agggtacggc420ggctacaacc agtggtgcgg cagcaatggg ggcggcgcgc cggcggcgtc gcagccgggc480gcgtatagca gcaatggcgg cgccggccac ggccacgact ccatcaccgc gctgctggcg540gccgggtcgg actacatgca gcactcgctg taccacgcgt tcgagcactc ggagggcgcc600ggcgccgtgg acgacgggca cgcggccgcc gcggccttcg aggcggcggc ggagtcgtcg660tcgtgcggca tggcggcgtc gttcgccgcc gacgagagcg tgtggaggtc gtcgtcgtcg720ggataccaag attgcgagga tctccagagc gtcgcctacg cttaccttaa ccgctcgtaa780SEQ ID NO2Met Thr Gly Phe Gly Ser Pro Cys Gly Ala Cys Lys Phe Leu Arg Arg15 10 15Lys Cys Val Arg Gly Cys Val Phe Ala Pro Tyr Phe Cys His Glu Gln20 25 30Gly Ala Ala His Phe Ala Ala Ile His Lys Val Phe Gly Ala Ser Asn35 40 45
Val Ser Lys Leu Leu Ala His Leu Pro Leu Ala Asp Arg Pro Glu Ala50 55 60Ala Val Thr Ile Ser Tyr Glu Ala Gln Ala Arg Leu Arg Asp Pro Ile65 70 75 80Tyr Gly Cys Val Ala His Ile Phe Ala Leu Gln Gln Gln Val Met Thr85 90 95Leu Gln Ala Gln Leu Ala Ser Leu Lys Ala Ala Ala Ala Gln Gly Ile100 105 110His His Gln Asp Val Gly Ala Thr Thr Lys Gly Gly Tyr Met Ser Ala115 120 125Ala Ala Thr Ala Ala Asp Asp Gln Leu Gly Tyr Gly Gly Tyr Asn Gln130 135 140Trp Cys Gly Ser Asn Gly Gly Gly Ala Pro Ala Ala Ser Gln Pro Gly145 150 155 160Ala Tyr Ser Ser Asn Gly Gly Ala Gly His Gly His Asp Ser Ile Thr165 170 175Ala Leu Leu Ala Ala Gly Ser Asp Tyr Met Gln His Ser Leu Tyr His180 185 190Ala Phe Glu His Ser Glu Gly Ala Gly Ala Val Asp Asp Gly His Ala195 200 205Ala Ala Ala Ala Phe Glu Ala Ala Ala Glu Ser Ser Ser Cys Gly Met210 215 220
Ala Ala Ser Phe Ala Ala Asp Glu Ser Val Trp Arg Ser Ser Ser Ser225 230 235 240Gly Tyr Gln Asp Cys Glu Asp Leu Gln Ser Val Ala Tyr Ala Tyr Leu245 250 255Asn Arg Ser
权利要求
1.一种水稻冠根控制基因CRL3编码的蛋白质，其特征在于具有SEQID NO2所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的稻冠根控制基因CRL3编码的蛋白质，其特征在于所述氨基酸序列还包括在Seq ID No.2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个氨基酸生成的衍生物。
3.一种编码权利要求1或2所述蛋白质或其功能类似物的基因，其特征在于所述基因具有Seq ID No.1所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的编码权利要求1或2所述蛋白质或其功能类似物的基因，其特征在于所述核苷酸序列还包括在Seq ID No.1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。
5.一种包含权利要求3或4所述核酸的转基因植物细胞。
6.一种对水稻冠根进行改造的方法，其特征在于包括用权利要求3所述的基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。
全文摘要
本发明公开了一种水稻冠根控制基因CRL3编码、具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的蛋白质，和具有Seq ID No.1所示的核苷酸序列的基因；还公开了一种转基因植物细胞，和用基因转化水稻细胞、再将转化后的水稻细胞培育成植株的水稻冠根改造方法。本发明能利用该基因物调控水稻冠根发生能力，从而调节水稻的根系结构，提高农作物的产量。
文档编号C12N15/29GK1587415SQ20041005357
公开日2005年3月2日 申请日期2004年8月6日 优先权日2004年8月6日
发明者吴平, 刘洪家, 余晓波, 何晓薇, 吴运荣, 王首锋, 金维正 申请人:浙江大学