专利名称：对藻类进行定性与定量分析的方法
技术领域：
本发明涉及检测领域，具体地涉及藻类的定性与定量分析方法。更具体涉及一种采用针对rRNA的S1酶保护分析探针和夹心杂交技术，从而快速鉴定藻的种类和数量的方法。
背景技术：
赤潮是海洋中某些微小的浮游藻类、原生动物或细菌，在一定的条件下暴发性繁殖(增殖)或聚集而引起水体变色的一种有害的生态异常现象。从全球来讲，海洋浮游微藻是引发赤潮的主要生物，在四千多种海洋浮游微藻中有260多种能形成赤潮，其中有70多种能产生毒素。赤潮发生时鱼类和贝类大量死亡，导致重大经济损失和严重的海洋生态灾难；毒素还会富集在贝类和鱼类体内，人类食用后会引发疾病。
如果能够实时监控海水中浮游微藻的种类和数量，获得大量的监测数据，就可能为预报赤潮提供必要的条件，及时对养殖区的鱼、贝类采取措施，避免重大经济损失，保证沿海地区经济和社会稳定发展。
目前鉴定藻的方法主要通过光学显微镜和电子显微镜。训练有素的专家通过光学显微镜轻易就能鉴定大多数微藻，但有些属内的藻很难在种水平上用普通光学显微镜分开。虽然有一些特殊的荧光染料配以荧光显微镜用以区分它们，或者用电子显微镜也可以观察分类学上的细微差别，但这些方法不仅对技术要求高，而且既费时又费力且易发生检测错误。因此本领域长期迫切需要发展出针对赤潮藻等藻类的简单、可靠的鉴定方法。
一般认为微藻的核糖体RNA(rRNA)与藻的进化和分类有密切的关系，GenBank上有关微藻的数据主要集中在这个区域。通过比较相近微藻的rRNA，找出每个种特有的核酸作为寡核苷酸引物和探针，利用分子杂交技术进行定性定量鉴定。目前在用的主要有定量PCR、全细胞杂交和夹心杂交技术。
定量PCR技术是一种高灵敏度高特异性的核酸检测技术，它在微藻鉴定中的应用才刚刚起步。但由于现有的定量PCR技术要求高纯度的DNA或者RNA作为检测样本，而且目前该项技术对仪器和操作人员要求比较高，因此限制了定量PCR在微藻检测中的普及应用。
全细胞杂交的原理是用滤膜和过滤装置收集藻细胞，然后用含有荧光素标记的特异性探针与藻细胞内的rRNA杂交，在荧光显微镜下直接观察，对相应的藻种作出鉴定和定量计数；或者从膜上洗下藻细胞，以寡核苷酸探针结合后，以特定波长在流式细胞计数仪上计数。前者的好处在于计数的同时可以待检藻细胞的形态特征，提高了鉴定的准确性；但该方法仍未克服操作繁琐、费时费力的缺点。研究人员趋向于用流式细胞计数仪，因为该方法可以快速计数，易于自动化，但某些藻自发的荧光可能会影响检测的准确性。此外，该项技术对仪器和操作人员要求也比较高。
PCR-ELISA技术是近年来发展起来的一项核酸快速诊断技术。它首先并通过PCR扩增待检测的目的DNA片段，并在扩增时掺入地高辛或荧光素等标记物；然后与固定在96孔板上特异性寡核苷酸探针杂交，将未杂交的片段洗去后，加入标记了辣根过氧化物酶(HRP)或者碱性磷酸酶(AP)的地高辛或荧光素抗体，最后加入适当的显色底物后，就可以通过96孔板读板机读出数据，从而定性定量分析目的DNA片段。在此基础上的夹心杂交技术是指将扩增好的未标记的PCR产物与96孔板上的DNA杂交，从而被后者抓捕在微孔上，然后再与地高辛或荧光素标记的寡核苷酸探针杂交。由于普通PCR扩增对检测定量的准确性有很大的影响且费时，因此该项技术不太适合应用到海洋样品中的微藻实时监控。
由于rRNA被认为是与藻类的系统进化密切相关的序列，而且真核生物细胞中rRNA含量非常高，可以达到106～107个拷贝，rRNA是夹心杂交的很好的靶点。1996年，Christopher A.Scholin等将提取的RNA或者藻细胞裂解液在一定条件下与结合在96孔板上的寡核苷酸探针杂交后，再用一标记的信号探针与之杂交，最后进行酶标抗体显色反应(见图1)。该技术现在海洋藻类的监测中已经有所应用，但到目前为止，应用该技术能够检测的微藻只限于有限的几种。其主要缺点是(a)因捕获探针的长度仅10-30bp，因此能够有效区别亲缘关系较近的微藻的捕获探针数量极少；(b)在整个检测过程中都需要防止RNA降解，然而洗涤、抗体反应等各步骤极易造成RNA降解，因此操作难度大、检测结果波动性大。
综上所述，目前缺乏对微藻进行快速、简便、可靠的鉴定方法，因此本领域迫切需要开发新的能够对微藻的种类和/或数量进行快速、简便、可靠的鉴定方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种对微藻种类和/或数量进行快速、简便、可靠的鉴定方法。
在本发明的第一方面，提供了一种检测样品中藻类的方法，该方法包括以下步骤(a)将待检测样品和S1酶保护分析探针的混合并杂交，形成混合溶液；(b)在适合条件下，用S1酶(浓度通常为0.05-10U/μl，较佳地为0.1-5U/μl，更佳地为0.5-2.5U/μl)处理步骤(a)的混合溶液，从而切割单链核酸以及降解双链核酸中的单链部分；(c)对步骤(b)的溶液进行变性处理，从而释放出S1酶保护分析探针；(d)用固定于固相载体上的抓捕探针，将被保护的S1酶保护分析探针特异地抓捕在固相载体上；(e)用带有可检测信号的专一信号探针与S1酶保护分析探针杂交；或者用连接探针与S1酶保护分析探针杂交，然后用带有可检测信号的通用信号探针再与连接探针杂交；(f)检测可检测信号，从而确定样品中藻类的种类和/或数量。
在另一优选例中，所述的S1酶保护分析探针的长度为40-100个核苷酸，并且特异性结合于一种或多种藻类的rRNA特定区域(例如种特异性或属特异性S1酶保护分析探针)。
在另一优选例中，所述的抓捕探针的长度为12～50个核苷酸，并特异性结合于S1酶保护分析探针的一端。
在另一优选例中，所述的连接探针的长度为40～100个核苷酸，并且在一端约有15～35个核苷酸的S1酶保护分析探针结合区，与S1酶保护分析探针的不结合抓捕探针的一端互补，并且在另一端具有15-50个核苷酸的信号探针结合区，与信号探针互补。
在另一优选例中，所述的专一信号探针的长度为15～50个核苷酸，与S1酶保护分析探针的不结合于抓捕探针的一端互补，并且所述的在5’端或3’端带有选自下组的标记物地高辛、荧光素、生物素、辣根过氧化物酶、或其它组合。
在另一优选例中，所述的通用信号探针的长度为15～50个核苷酸，与连接探针的不结合于S1酶保护分析探针的一端互补，并且所述的在5’端或3’端带有选自下组的标记物地高辛、荧光素、生物素、辣根过氧化物酶、或其它组合。
在另一优选例中，所述的方法用于定性或定量检测角毛藻，并且S1酶保护分析探针、抓捕探针序列、连接探针序列和信号探针序列分别具有SEQ ID NO1、2、3、4所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的方法用于定性或定量检测塔玛亚历山大藻，并且S1酶保护分析探针、抓捕探针序列、连接探针序列和信号探针序列分别具有SEQ ID NO5、6、7、4所示的核苷酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种检测样品中藻类的试剂盒，它包括以下组件(a)S1酶保护分析探针，所述的S1酶保护分析探针的长度为40-100个核苷酸，并且特异性结合于藻类的rRNA特定区域；(b)抓捕探针，所述的抓捕探针的长度为12～50个核苷酸，并特异性结合于S1酶保护分析探针的一端；(c)连接探针，所述的连接探针的长度为40～100个核苷酸，并且在一端约有15～35个核苷酸的S1酶保护分析探针结合区，与S1酶保护分析探针的不结合抓捕探针的一端互补，并且在另一端具有15-50个核苷酸的信号探针结合区，与信号探针互补，附加条件是当信号探针为(d1)所述的专一信号探针则无连接探针；(d)信号探针，所述的连接探针选自下组(d1)所述的专一信号探针的长度为15～50个核苷酸，与S1酶保护分析探针的不结合于抓捕探针的一端互补，并且所述的在5’端或3’端带有选自下组的标记物地高辛、荧光素、生物素、辣根过氧化物酶、或其它组合；(d2)所述的通用信号探针的长度为15～50个核苷酸，与连接探针的不结合于S1酶保护分析探针的一端互补，并且所述的在5’端或3’端带有选自下组的标记物地高辛、荧光素、生物素、辣根过氧化物酶、或其它组合。
在另一优选例中，所述的试剂盒用于定性或定量检测角毛藻，并且S1酶保护分析探针、抓捕探针序列、连接探针序列和信号探针序列分别具有SEQ ID NO1、2、3、4所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的试剂盒用于定性或定量检测塔玛亚历山大藻，并且S1酶保护分析探针、抓捕探针序列、连接探针序列和信号探针序列分别具有SEQ ID NO5、6、7、4所示的核苷酸序列。
图1是现有技术中Christopher A.Scholin等发展的夹心杂交技术的示意图。
图2是本发明方法的示意图。
图3显示了用针对角毛藻的探针探测各种不同的藻的检测结果，证明了本发明方法的可行性和探针的特异性。
图4显示了对不同细胞数的角毛藻的检测曲线。
图5显示了用针对塔玛亚历山大藻的探针探测各种不同的藻的检测结果，证明了本发明方法的可行性和探针的特异性。
图6显示了对不同细胞数的塔玛亚历山大藻的检测曲线。
具体实施例方式
本发明人经过多年广泛而深入的研究，开发了一种全新的针对rRNA的定性定量分析方法，从而实现对生物种类(如藻类)的快速定性和定量。
如本文所用，术语“S1酶保护分析探针”指与目标RNA互补而且用于的S1酶保护分析方法的寡核苷酸。本领域技术人员可以用本领域的常规方法，通过测定生物的rRNA序列，进行多序列比较，寻找出待检测生物的特征序列，作为该种生物或该类生物的rRNA特异区域，然后根据该rRNA特异区域序列(特征序列)设计S1酶保护分析探针。通常该探针长约40-100个核苷酸，较佳地为45-75个核苷酸，更佳地为50～70个核苷酸。应理解，寻找生物特异性区域的方法以及根据特异区域设计探针的技术都是本领域已知的，有市售的设备和软件可供技术人员使用。已有的实验表明，不同藻rRNA之间若存在2-3个以上核苷酸的连续错配或者缺失也可以作为特异探针设计的靶序列。
如本文所用，术语“抓捕探针”指与S1酶保护分析探针的一端(通常为3′端)结合，从而将经过S1酶酶切处理和变性处理后保留在溶液中的S1酶保护分析探针捕获下来的探针。抓捕探针的长度为12-50个核苷酸或更长，较佳地为15～35个核苷酸。通常，在检测之前，将抓捕探针固定于固相载体，从而形成预制的用于夹心杂交的检测载体。用于固定的方式没有特别限制，可以用本领域常用的固定方法，例如通过高盐吸附、化学合成或者亲和素与生物素作用结合固定在酶标板或者玻璃片、尼龙膜以及纤维素膜上。
如本文所用，术语“连接探针”指这样的探针，它与S1酶保护分析探针的另一端(通常为5′端)互补，从而能够在抓捕探针捕获S1酶保护分析探针后，结合于S1酶保护分析探针的另一端。通常，连接探针长约40-100个核苷酸，较佳地为45～70个核苷酸，并且在5′端或3′端约有15～35个核苷酸的S1酶保护分析探针结合区，与S1酶保护分析探针的一端(不同于与抓捕探针互补结合的一端)互补；并且在另一端具有15-50个核苷酸的信号探针结合区，与信号探针互补。在一优选例中，用于检测不同微藻的连接探针具有相同的信号探针结合区，从而可以使用通用的信号探针，以便进一步降低成本。
如本文所用，术语“信号探针”指结合于连接探针，从而产生可检测信号的探针。信号探针与连接探针的一端(不同于与S1酶保护分析探针互补结合的一端)互补。通常，信号探针长约15-50个核苷酸，更佳地20～40个核苷酸，并且在5′端或3′端带有标记物。常用的标记物包括(但并不限于)地高辛、荧光素、生物素或者辣根过氧化物酶等。在一优选例中，用于检测不同微藻的信号探针是相同的。
一种特别形式的信号探针是将连接探针的功能和信号探针的功能合二为一所形成的探针。即在连接探针不与S1酶保护分析探针的另一端标记荧光素、生物素等标记物所形成的专一信号探针。这样特别探针既作为一般连接探针起作用，又起到信号探针的作用。然而，缺点是在针对每一组检测探针都需要合成一个带有标记的专一信号探针，合成的成本较高，而通用信号探针可以广泛通用，不必为每一个新设计的微藻S1酶保护分析探针合成一个专一的高成本的信号探针。
如上所述，本领域技术人员可用常规方法和设备，根据S1酶保护分析探针而设计和合成相应的抓捕探针、连接探针和信号探针。
简而言之，本发明方法是针对待检生物的rRNA特定区域合成以S1酶保护分析探针为核心的一套探针，联合S1酶保护分析和夹心杂交技术实现对rRNA的定性定量分析。
本发明方法的原理如图2所示。它包括下列步骤
(a)待检测样品和S1酶保护分析探针的混合在该步骤中，可以将经裂解处理已释放出rRNA的待检测的微藻样品与S1酶保护分析探针混合。也可以将待检测的微藻样品与S1酶保护分析探针直接混合，然后再进行裂解处理，从而释放rRNA。一旦释放出的rRNA包含对应于S1酶保护分析探针的靶序列，经过杂交，则会与S1酶保护分析探针形成双链。
(b)S1酶处理S1酶是一种已知的、分子量约为32,000道尔顿的含Zn2+的糖蛋白，是一种单链特异性的核酸内切酶，能将DNA或RNA降解成为酸可溶性5’-P核苷酸，最终90％以上被降解为5’-P单核苷酸。也可以降解双链核酸中的单链部分，中等量的S1酶可在切口或小缺口处切割双链DNA。如果S1酶的用量过大，则双链核酸可以被完全消化；S1酶的最适pH在4.5附近，作用时必需有辅因子Zn2+，该酶的抑制剂是一定浓度的EDTA和磷酸化合物。其属于依赖Zn2+的糖蛋白质，对热极其稳定，在底物存在下65～70摄氏度仍能表现活性。
在本发明方法中，当S1酶保护分析探针与待检测生物的rRNA杂交后，用适当浓度(通常为0.05-10U/μl，较佳地为0.1-5U/μl，更佳地为0.5-2.5U/μl，最佳地为1U/μl)的S1酶消化过量游离的探针；当该探针与其他非目标rRNA反应时，由于杂交体存在切口或小缺口，S1酶亦能将该探针切断；最终保留下与完全匹配的S1酶保护分析探针和目标生物的rRNA形成的DNA/RNA双链，而且该双链的量代表了样本中相应的rRNA的量。
(c)DNA-RNA杂合体的变性在该步骤将DNA/RNA双链杂合体变性为DNA单链(即S1酶保护分析探针)和RNA单链。合适的变性方法没有特别限制，可以用本领域常用的各种变性方法，例如热变性等。例如，加入中和溶液后加热，使S1酶保护分析探针和目标生物的rRNA形成的杂合体变性，从而释放出保留下来的S1酶保护分析探针。由于RNA不稳定，解链形成的RNA单链易被内源或源的RNA酶降解。
(d)捕获S1酶保护分析探针将保留有S1酶保护分析探针的溶液与预先固定于固相载体上的抓捕探针杂交，将S1酶保护分析探针特异地抓捕在固相载体上，并洗涤除去非特异的结合。
(e)结合带可检测信号的探针一种方法包括步骤(e1)用连接探针与被捕获的S1酶保护分析探针杂交，并洗涤除去非特异的结合；和(e2)用带有标记物的信号探针再与连接探针杂交，并洗涤除去非特异的结合。
另一种方法是使用专一信号探针与被捕获的S1酶保护分析探针杂交，并洗涤除去非特异的结合，此时可省略步骤(e1)。
(f)信号检测可用本领域常规方法对可检测信号进行信号检测。例如信号探针上可以标记上荧光信号，这样通过激发荧光来读取数据；也可以在信号探针上标记上地高辛、荧光素或者生物素等，然后通过辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗体或者亲和素与之反应；最后加入发光底物或者显色底物(TMB或者NPP等)，通过探测发光强弱或者吸光度来判读信号。
本发明的主要优点在于1)探针适用性好夹心杂交特异识别的关键是抓捕探针的特异性，一般情况抓捕探针约长20～30核苷酸，该探针要具有特异性，必须与其他非目标生物的rRNA分子要有较大的差异，尽管不同生物的rRNA在进化上会有差异，但在找到并成功验证亲缘关系较近的生物之间的特异性探针并不是一件容易的事，这可能也是夹心杂交技术发展到现在只有找到很少量抓捕探针的原因之一。本发明中涉及的S1酶保护分析探针，尽管长度在60个核苷酸左右，但并不要求探针全长都要有特异性，而只要求探针的中间区域有几个核苷酸的差异即可，这大大方便了特异探针的寻找和实现，从而使本发明可以广泛适用于几乎所有的微藻。
2)稳定性高夹心杂交技术成功执行的关键之一在于保证RNA分子在整个过程不被降解，特别要保证抓捕探针与信号探针之间的那段目标RNA分子(可能在几十到几百个核苷酸之间)在整个实验过程的完好无损。但由于实验过程涉及抗原抗体反应和多次洗涤步骤，这为RNA酶对RNA分子降解提供了较多机会，因此要保证目标RNA分子不被降解有非常大的难度。即使最终能够实现定性分析，定量分析的可信度也大大打了折扣。而本发明中直接与rRNA分子相关的过程只有S1酶保护分析探针与rRNA分子杂交这一步，只要杂交裂解液加入适当的RNA酶抑制剂就能保证杂交时rRNA分子不被降解或很少被降解，实验操作的其他步骤都是针对稳定的DNA分子进行的，相对比较容易执行。因此本发明的稳定性远远高于夹心杂交技术。
(3)可以实现快速自动化的分析大量样品由于不需要抽提RNA或DNA，也不需要进行PCR反应，因此操作相对简单，可以实现自动化；本发明可在5小时左右获得结果，实现了快速检测大量样品，能够满足大规模即时监测的要求。
(4)结果准确性高。由于S1酶的特性，能将非特异结合的S1酶保护分析探针降解，因此本发明方法用于定性检测微藻时候特异性非常高，而且用于定量检测微藻时线性非常好，检测结果的准确性高。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1对应用针对rRNA的S1酶保护分析和夹心杂交技术实现对角毛藻的定性定量分析在本实施例中，将S1酶保护分析技术和夹心杂交技术联合用来实现对海洋赤潮生物角毛藻(Chaetoceros sp.)的定性和定量分析，步骤如下1.1角毛藻rRNA特异区域的寻找和S1酶保护分析探针的设计与合成通过测定角毛藻核糖体小亚基18S rRNA序列并与其它藻类的rRNA序列进行多序列比较，找到其在小亚基rRNA的550～700区域与其它藻类不同，确定该区域序列为特征序列；根据特征序列设计和合成S1酶保护分析探针CHV_S1，序列为5’-TTA ATGCCAGGACGAACCACTCAAGGATGGCGCGACAACATCGAGTACCCACCAAAGGTC(SEQ IDN01)。
根据S1酶保护分析探针设计和合成夹心杂交所需的其他探针抓捕探针CHV_CAPT5’-Biotin-GACCTTTGGTGGGTACTCGATGTTG(SEQ ID NO2)，长25个核苷酸，与S1酶保护分析探针的3’端互补，在5’端有生物素(Biotin)标记；连接探针CHV_LINK5’-CTTGAGTGGTTCGTCCTGGCATTAATAACAACTCACCTG CCGAATGAACTAGCCCTG(SEQ IDO3)，在5’端的25个核苷酸与S1酶保护分析探针的5’端互补。
通用信号探针Universal_SIGNAL_PROBE5’-Fluorescein-CAGGGCTAGTTCATTCGGCAGGTGAGTT GTTA(SEQ ID NO4)，长32个核苷酸，在5’端标记有荧光素(Fluorescein)，与连接探针的3’端互补。
1.2抓捕探针固定于酶标板抓捕探针的固定方法在预先包被有亲和素的酶标板(Pierce公司)的每一孔中加入100μl溶解于PBS(pH7.2)的40nM抓捕探针，37摄氏度静置2小时。用PBS洗三次备用。
1.3Sl酶保护分析将用f2培养基培养的海藻样品计数后，离心收集于1.5ml塑料管中，弃去上清，加入浓度为50nM S1酶保护分析探针(SEQ ID NO1)的1000μl裂解液(0.8％SDS，1.2M脲(Urea)，20％甲酰胺(Formamide)，0.3M NaCl，50mM Tris，pH7.0)。
进行特异性验证时，将裸甲藻、三角褐脂藻、中肋骨条藻、Parlova gyransButcher、膜胞藻、旋链角毛藻、卡氏球钙板藻、球等鞭金藻、等鞭金藻、塔玛亚历山大藻、膜质舟形藻、新月菱形藻、诺氏海链藻各约1000000个细胞分别进行上述处理。
进行角毛藻的检测曲线分析时，将离心得到的5×107角毛藻样品用含有S1酶保护分析探针的裂解液10倍逐级稀释五次共获得6个样品。
对于海藻样品和S1酶保护分析探针的混合物，超声波处理两分钟，将混合溶液在95摄氏度放置10分钟，然后70摄氏度杂交2小时。自然冷却后加入500μl含有800U S1酶(Promega公司)的S1酶解缓冲液(50mM ZnSO4，500mM NaAc，50mM NaCl pH4.5)，在50摄氏度酶切处理30分钟。
1.4DNA-RNA杂合体的变性加入250μl变性缓冲液(1.5M NaOH，300mM EDTA)，95摄氏度处理10分钟，自然冷却后用于夹心杂交。此时DNA-RNA杂合体变性形成单链DNA(即曾结合于靶序列的S1酶保护分析探针)和单链RNA。与此同时，单链RNA被降解，因此溶液中仅含曾结合于靶序列的S1酶保护分析探针。
1.5夹心杂交抓捕将100μl上述变性后的反应混合液分别移入到预固定有抓捕探针(SEQ IDNO2)的酶标板微孔中，50摄氏度杂交1小时，用含有0.1％SDS的0.1×SSC洗涤液洗6次。
夹心杂交每孔加入含有100μl 5nM连接探针(SEQ ID NO3)的杂交缓冲液(2×SSC，0.1％SDS)，于50摄氏度杂交30分钟，用含有0.1％SDS的0.1×SSC洗涤液洗6次；每孔加入含有100ul 5nM通用信号探针(SEQ ID NO4)的杂交缓冲液(2×SSC，0.5％SDS)于50摄氏度杂交30分钟，用含有0.1％SDS的0.1×SSC洗涤液洗6次。
1.6信号检测酶标板用磷酸缓冲液(PBS)洗6次；每孔加入含有标记了辣根过氧化物酶的抗荧光素抗体(购自Roche公司)，37摄氏度反应30分钟，然后用PBS洗6次；每孔加入TMB(购自Pierce公司)显色液100μl，37摄氏度处理15分钟后，每孔加入50μl 2M硫酸。将酶标板置于读板机上于450nm测定光吸收值。
1.6结果检测结果如图3和图4所示。
图3显示了用针对角毛藻的探针探测各种不同的藻的检测结果，证明了本发明方法具有极高的可行性和特异性。
图4显示了对不同细胞数的角毛藻的检测曲线。对数据用常规统计方法进行拟合，获得如下关系y＝2.6571x+13.617；R2＝0.9965；x为实际测定的0D.450的自然对数，y为样品中的细胞数的自然对数；R为相关系数。
下表列出了用本实施例方法测定的角毛藻样品数量与显微计数结果的比较
实施例2对应用针对rRNA的S1酶保护分析和夹心杂交技术实现对塔玛亚历山大藻的定性定量分析在本实施例中，将S1酶保护分析技术和多重夹心杂交技术联合用来实现对塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)的定性和定量分析，步骤如下2.1塔玛亚历山大藻rRNA特异区域的寻找和S1酶保护分析探针的设计与合成通过测定塔玛亚历山大藻核糖体小亚基18S rRNA序列并与其它藻类的rRNA序列进行多序列比较，找到其在小亚基rRNA的600～800区域与其它藻类不同，确定该区域序列为特征序列；根据特征序列设计和合成S1酶保护分析探针ALT S15’-CACACCACACAGTCAAGTGCAGTTGTGCTTTCAAGATAAATGCTCAGGCTGTGCCAAAT(SEQ IDNO5)。
根据S1酶保护分析探针设计和合成夹心杂交所需的其他探针抓捕探针ALT CAPT5’-Biotin-GACCTTTGGTGGGTACTCGATGTTG(SEQ ID NO6)，长24个核苷酸，与S1酶保护分析探针的5’端互补，在5’端有生物素标记；连接探针AlT LINK5’-ACAACTGCACTTGACTGTGTGGTGT GTAACAACTCACCTGCCGAATGAACTAGCCCTG(SEQID NO7)，在5’端的25个核苷酸与S1酶保护分析探针的3’端互补。
信号探针SIGNAL PROBE5’-Fluorescein-CAGGGCTAGTTCATTCGGCAGGTGAGTTGTTA(SEQ ID NO4)，长32个核苷酸，在5’端标记有荧光素，与连接探针的3’端互补(同实施例1)。
2.2抓捕探针固定于酶标板方法同实施例1.1，不同点仅在于用塔玛亚历山大藻的抓捕探针替换角毛藻的抓捕探针。
2.3S1酶保护分析方法同实施例1.3，不同点在于用塔玛亚历山大藻待分析样品替换角毛藻待分析样品。
2.4DNA-RNA杂合体的变性方法同实施例1.4。
2.5夹心杂交方法同实施例1.5，不同点仅在于用塔玛亚历山大藻的连接探针替换角毛藻的连接探针。
2.6信号检测方法同实施例1.6。
2.7结果检测结果如图5和图6所示。
图5显示了用针对塔玛亚历山大藻的探针探测各种不同的藻的检测结果，证明了本发明方法具有极高的可行性和特异性。
图6显示了对不同细胞数的塔玛亚历山大藻的检测曲线。对数据用常规统计方法进行拟合，获得如下关系y＝2.1496x+9.6158R2＝0.9993x为实际测定的OD.450的自然对数，y为样品中的细胞数的自然对数；R2为相关系数。
下表列出了用本实施例方法测定的塔玛亚历山大藻样品数量与显微计数结果的比较
实施例3对应用针对rRNA的S1酶保护分析和夹心杂交技术实现对角毛藻的定性定量分析在本实施例中，重复实施例1的各步骤，不同点仅在于不使用通用的信号探针，而是在专一信号探针的5′端直接标记荧光素(即将连接探针和信号探针的功能合二为一)。
结果获得了与实施例1完全相同的角毛藻的定性结果，和几乎完全相同定量检测结果。然而，该实施例的缺点是在针对每一组检测探针都需要合成一个带有标记的专一信号探针，合成的成本较高，而实施例1和2使用的通用信号探针可以广泛通用，不必为每一个新设计的微藻S1酶保护分析探针合成一个专一的高成本的信号探针。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>中国海洋大学上海交通大学<120>对藻类进行定性与定量分析的方法<130>045545<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>60<212>DNA<213>角毛藻(Chaetoceros sp)<400>1ttaatgccag gacgaaccac tcaaggatgg cgcgacaaca tcgagtaccc accaaaggtc 60<210>2<211>25<212>DNA<213>角毛藻(Chaetoceros sp)<400>2gacctttggt gggtactcga tgttg 25<210>3<211>57<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>连接探针<400>3cttgagtggt tcgtcctggc attaataaca actcacctgc cgaatgaact agccctg57<210>4<211>32<212>DNA<213>人工序列
<220〉<221>misc_feature<223>信号探针<400>4cagggctagt tcattcggca ggtgagttgt ta 32<210>5<211>59<212>DNA<213>塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)<400>5cacaccacac agtcaagtgc agttgtgctt tcaagataaa tgctcaggct gtgccaaat 59<210>6<211>25<212>DNA<213>塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)<400>6gacctttggt gggtactcga tgttg 25<210>7<211>58<212>DNA<213>人工序列<400>7acaactgcac ttgactgtgt ggtgtgtaac aactcacctg ccgaatgaac tagccctg 58
权利要求
1.一种检测样品中藻类的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(a)将待检测样品和S1酶保护分析探针的混合并杂交，形成混合溶液；(b)在适合条件下，用S1酶处理步骤(a)的混合溶液，从而切割单链核酸以及降解双链核酸中的单链部分；(c)对步骤(b)的溶液进行变性处理，从而释放出S1酶保护分析探针；(d)用固定于固相载体上的抓捕探针，将被保护的S1酶保护分析探针特异地抓捕在固相载体上；(e)用带有可检测信号的专一信号探针与S1酶保护分析探针杂交；或者用连接探针与S1酶保护分析探针杂交，然后用带有可检测信号的通用信号探针再与连接探针杂交；(f)检测可检测信号，从而确定样品中藻类的种类和/或数量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的S1酶保护分析探针的长度为40-100个核苷酸，并且特异性结合于一种或多种藻类的rRNA特定区域。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的抓捕探针的长度为12～50个核苷酸，并特异性结合于S1酶保护分析探针的一端。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的连接探针的长度为40～100个核苷酸，并且在一端约有15～35个核苷酸的S1酶保护分析探针结合区，与S1酶保护分析探针的不结合抓捕探针的一端互补，并且在另一端具有15-50个核苷酸的信号探针结合区，与信号探针互补。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的专一信号探针的长度为15～50个核苷酸，与S1酶保护分析探针的不结合于抓捕探针的一端互补，并且所述的在5’端或3’端带有选自下组的标记物地高辛、荧光素、生物素、辣根过氧化物酶、或其它组合；或者，所述的通用信号探针的长度为15～50个核苷酸，与连接探针的不结合于S1酶保护分析探针的一端互补，并且所述的在5’端或3’端带有选自下组的标记物地高辛、荧光素、生物素、辣根过氧化物酶、或其它组合。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法用于定性或定量检测角毛藻，并且S1酶保护分析探针、抓捕探针序列、连接探针序列和信号探针序列分别具有SEQ ID NO1、2、3、4所示的核苷酸序列。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法用于定性或定量检测塔玛亚历山大藻，并且S1酶保护分析探针、抓捕探针序列、连接探针序列和信号探针序列分别具有SEQ ID NO5、6、7、4所示的核苷酸序列。
8.一种检测样品中藻类的试剂盒，其特征在于，它包括以下组件(a)S1酶保护分析探针，所述的S1酶保护分析探针的长度为40-100个核苷酸，并且特异性结合于藻类的rRNA特定区域；(b)抓捕探针，所述的抓捕探针的长度为12～50个核苷酸，并特异性结合于S1酶保护分析探针的一端；(c)连接探针，所述的连接探针的长度为40～100个核苷酸，并且在一端约有15～35个核苷酸的S1酶保护分析探针结合区，与S1酶保护分析探针的不结合抓捕探针的一端互补，并且在另一端具有15-50个核苷酸的信号探针结合区，与信号探针互补，附加条件是当信号探针为(d1)所述的专一信号探针则无连接探针(d)信号探针，所述的连接探针选自下组(d1)所述的专一信号探针的长度为15～50个核苷酸，与S1酶保护分析探针的不结合于抓捕探针的一端互补，并且所述的在5’端或3’端带有选自下组的标记物地高辛、荧光素、生物素、辣根过氧化物酶、或其它组合；(d2)所述的通用信号探针的长度为15～50个核苷酸，与连接探针的不结合于S1酶保护分析探针的一端互补，并且所述的在5’端或3’端带有选自下组的标记物地高辛、荧光素、生物素、辣根过氧化物酶、或其它组合。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒用于定性或定量检测角毛藻，并且S1酶保护分析探针、抓捕探针序列、连接探针序列和信号探针序列分别具有SEQ ID NO1、2、3、4所示的核苷酸序列。
10.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒用于定性或定量检测塔玛亚历山大藻，并且S1酶保护分析探针、抓捕探针序列、连接探针序列和信号探针序列分别具有SEQ ID NO5、6、7、4所示的核苷酸序列。
全文摘要
本发明公开了一种采用针对rRNA的S1酶保护分析探针和夹心杂交技术，从而快速鉴定藻的种类和数量的方法，该方法包括以下步骤(a)将待检测样品和S1酶保护分析探针混合并杂交；(b)用S1酶酶切处理步骤(a)的混合溶液；(c)变性处理，从而释放出S1酶保护分析探针；(d)用固定于固相载体上的抓捕探针，捕获保留下来的S1酶保护分析探针；(e)用连接探针与S1酶保护分析探针杂交，然后与带可检测信号的信号探针杂交；(f)检测可检测信号，从而确定样品中藻类的种类和/或数量。本发明方法还快速、简便、可靠的鉴定微藻种类和数量。
文档编号C12Q1/68GK1730662SQ20041005353
公开日2006年2月8日 申请日期2004年8月6日 优先权日2004年8月6日
发明者于志刚, 李荣秀, 蔡青松, 米铁柱, 甄毓 申请人:中国海洋大学, 上海交通大学