专利名称：以水溶性共轭聚合物为敏感材料的基因探针的构建方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种以水溶性共轭聚合物为敏感材料的基因探针构建方法。
背景技术：
一般将一段人工合成的具有特定碱基序列的寡核苷酸单链，标记上用于检测的敏感物质(如荧光物质、纳米金等)，并将该标记链连接到玻璃、尼龙膜、硝酸纤维素等固体支持物质上，从而构建成基因探针。在实施检测时，将基因探针与未标记的样品进行杂交，根据碱基互补配对原理，基因探针上的碱基序列与样品中的对应碱基序列杂交配对，改变了探针上标记的敏感物质物理化学性质，通过检测这些性质的改变，从而达到对样品中基因片断的测序目的。基因探针技术广泛应用于分子生物学研究、医学临床检测及生物化学分析中。
1996年Tyagi等人建立了一种叫分子灯塔(Molecular Beacons)的基因探测技术(Tyagi S and Kramer FR，Molecular beaconsProbes that fluoresce uponhybridization，Nature Biotechnology，14(3)303-308，1996)。分子灯塔就是具有“发夹”样结构的寡核苷酸单链，结构上包含茎部(stem)和环状部分(loop)，环状部分是15-25个核苷酸单链，茎部是由5-7个碱基对构成的互补的核苷酸双链，茎部的末端5′和3′分别连有荧光素和荧光猝灭剂。由于茎部碱基对互补配对，使得荧光素和猝灭剂靠近一起，导致荧光素荧光猝灭，不能激发出荧光信号。当分子灯塔中的环状部分与目标单链特异性杂交结合时，所形成的双链结构的刚性大于茎部的双链，分子灯塔产生构型重组，茎部双链分离，荧光素远离荧光猝灭剂，荧光素激发出特定的荧光。据文献报道分子灯塔技术可以精确分辩出只有一个核苷酸差异的目标DNA链。Fang XH等进一步实现了表面固定化分子灯塔的DNA杂交技术(Fang XH，Liu XJ，et al.，Designing anovel molecular beacon for surface-immobilized DNA hybri dization studies，Journal of the American Chemical Society，121(12)2921-2922，1999)。尽管分子灯塔具有特异性高、操作方便、省时等优点，分子灯塔技术仍然存在着不少缺陷，如分子灯塔的结构设计繁琐，需要精心设计环状结构和茎部结构；荧光素的选择不当会造成的荧光漂白；分子灯塔的“发夹”型结构有时会自身发生构型改变，出现不正常的荧光增强反应；环状的单链结构不如线性的基因探针容易与目标单链的杂交等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作方便、特异性高、所需设备简单的基因探针构建方法。
本发明提出的基因探针构建方法，是以水溶性共轭聚合物为荧光指示剂，以核酸肽PNA(Peptide Nucleic Acid)为分子识别元件，通过一条线性的DNA单链将核酸肽PNA结合到水溶性共轭聚合物上，不需要对被检测的目标单链进行化学修饰，即实现对生化分子的识别。
一般基因检测过程中，都是将已知碱基序列的DNA(或者PNA)单链与未知序列的DNA单链进行杂交，如果这两条单链的碱基完全配对，便形成稳定性极高的二聚体，并且采用敏感物质(如荧光物质)来指示这种结合过程。将这种已知碱基序列的DNA或者PNA单链称为分子识别元件，将需要检测的未知碱基序列的DNA单链称为目标单链。
本发明的基因探针构建方法，其具体步骤如下(1)先对石英玻璃表面预清洗后进行活化处理；(2)通过自组装或者共价键方法，在石英玻璃上固定上阳离子水溶性共轭聚合物。在激发光作用下固定于石英玻璃表面的水溶性共轭聚合物会激发出荧光；(3)设计并合成单链DNA作为捕获探针DNA；(4)设计并合成核酸肽PNA分子链作为分子识别元件。PNA分子不带电荷，该链上的碱基序列从功能上分为两部分，靠近5′端碱基序列为捕获探针PNA，可以与步骤(3)得到的捕获探针DNA上的碱基序列互补配对；靠近3′的碱基序列称为分子探针PNA，能与目标单链上的碱基序列互补配对；(5)将步骤(4)得到的核酸肽PNA分子的5′端通过共价键连接的方法将核酸肽PNA连接上水溶性共轭聚合物猝灭剂；(6)将步骤(5)得到的PNA和步骤(3)得到的捕获探针DNA按照摩尔比0.9∶1～1∶0.9关系配置成混合溶液；(7)将步骤(2)所得的固定有水溶性共轭聚合物的石英玻璃放置于步骤(6)所得的混合溶液中，控制温度使得捕获探针DNA的碱基序列与PNA分子链上的捕获探针PNA碱基互补配对；同时通过静电作用，带负电荷的捕获探针DNA与带正电荷的水溶性共轭聚合物结合起来，从而将核酸肽PNA固定于石英玻璃表面的水溶型共轭聚合物上。核酸肽PNA的5′的荧光猝灭剂导致固定于石英玻璃表面的水溶性共轭聚合物荧光猝灭；
(8)取出石英玻璃后做进一步干燥处理，即得到特定目标单链的探针。固定于石英玻璃表面上PNA分子3′端的分子探针PNA可以与目标单链DNA杂交。
本发明中，上述核酸肽PNA不带电荷，以多肽为骨架的核苷酸类似物，其骨架是由重复的N-(2-氨基乙基)甘氨酸残基通过酰胺键重复连接而成，通过亚甲基羰基连接上碱基，连接的碱基能与互补的DNA单链分子和RNA分子上的碱基配对杂交。
PNA分子的结构如下式所示 本发明中的DNA单链结构如下式所示
本发明中，作为敏感材料的水溶性共轭聚合物是一类具有激发荧光特性的高分子共轭化合物。如聚对苯撑乙烯(PPV)及其衍生物，如带正电荷的聚芴类水溶性共轭聚合物，其结构式如下式所示 本发明的荧光猝灭剂具有荧光猝灭作用，与水溶性共轭聚合物结合，会产生电荷转移作用，导致水溶性共轭聚合物荧光猝灭。所用的荧光猝火剂可以是纳米金、甲基紫晶苯等。
本发明的基因探针的作用机理如下固定于石英玻璃表面的水溶性共轭聚合物带正电荷，在激发光作用下可激发出荧光。捕获探针DNA分子与分子识别元件PNA分子链的5’端的捕获探针PNA杂交结合。捕获探针DNA带负电荷，与带正电荷的水溶性共轭聚合物通过静电作用结合，从而将PNA分子与水溶性共轭聚合物紧密结合在一起。连接于PNA分子末端5′端的荧光猝灭剂导致水溶性共轭聚合物荧光猝灭，这样就构成了本发明的基因探针。基因探针上PNA分子3′端的分子探针PNA与目标单链杂交后，带动PNA分子脱离开水溶性共轭聚合物，PNA分子5′端的荧光猝灭剂远离水溶性共轭聚合物，水溶性共轭聚合物激发的荧光又开始恢复，从而实现对目标单链的识别作用。
本发明的捕获探针DNA是一段线性寡聚核苷酸链，起辅助连接作用。通过碱基配对杂交作用结合上不带电荷的PNA分子，通过电荷静电作用与水溶性共轭聚合物结合在一起，从而将PNA分子与水溶性共轭聚合物结合在一起，连接在PNA分子上的荧光猝灭剂对水溶性共轭聚合物产生猝灭效果。基因探针设计时，捕获探针DNA需要能有效将PNA分子结合在水溶性共轭聚合物上，产生荧光猝灭效果，同时又要能使PNA分子3′端的分子探针PNA容易与目标单链杂交结合，并且能使PNA分子能容易离开水溶性共轭聚合物，这样才能使探针起到分子识别作用。本发明中真正起分子识别作用的是PNA分子3′端的分子探针PNA部分，它直接与目标单链DNA杂交，识别未知序列DNA碱基序列。
本发明具有特出的实质性特点和显著的技术进步，具体如下(1)利用核酸肽PNA作为分子识别元件，有利于提高基因探针分子识别效果。主要因为PNA分子自身不带电荷，PNA与DNA分子杂交，二者之间没有电荷排斥作用，可以形成稳定性极高的二聚体结构，比相应的DNA/DNA双螺旋结构的稳定性更高。并且PNA/DNA杂交结合强度与盐浓度和离子强度没有关系，专一性也更高，不会受到核酸酶和蛋白酶分解作用。
(2)选用可激发荧光的水溶性共轭聚合物作为敏感材料。水溶性共轭聚合物在基因探针中既起着敏感指示剂作用，同时也起固定分子识别元件作用。从而避免了一般基因检测过程中繁琐的荧光指示剂的标记和分离过程。通过选择合适的水溶性共轭聚合物，可以得到大大高于一般小分子的荧光指示剂的荧光猝灭效率。
(3)在结构设计上选用捕获探针DNA将分子识别元件PNA与水溶性共轭聚合物连接在一起，PNA分子链从功能上包括捕获探针PNA和分子探针PNA，捕获探针PNA与捕获探针DNA杂交，分子探针PNA这部分用于对目标单链的杂交和识别作用。这种基因探针不需要对目标单链的预处理，简化了检测的过程。
(4)本发明中起分子识别作用的是线性基因探针，更容易与目标单链结合。
(5)发明制备方法简单，不需要复杂的设备，通过改变PNA链上的分子探针PNA碱基序列可以制作各种生物探针。
本发明可广泛应用于分子生物学、临床检测、生物传感器、人类基因组研究等领域，实现基因片断的检测。
图1以水溶性共轭聚合物为敏感材料的基因探针制备过程示意图。
图2本发明的基因探针作用过程示意图。
图中标号1.石英玻璃，2.表面活化后的石英玻璃，3.激发的荧光，4.表面固定化水溶性共轭聚合物(水溶性共轭聚合物带正电荷)，5.PNA单链，6.PNA单链上的捕获探针PNA，7.PNA单链上的分子探针PNA，8.水溶性共轭聚合物的荧光猝灭剂，9.捕获探针DNA，10.目标单链，11.基因探针分子识别后恢复的荧光。
具体实施例方式
实施例，以纳米金为荧光猝灭剂，以静电自组装技术固定水溶性共轭聚合物的基因探针的构建方法，其流程如下(见图1所示)(1)石英玻璃基片的清洗和活化成带负电荷的表面；石英玻璃基片用煮沸10分钟，再用去离子水反复冲洗三次，放入烘箱内烘干。然后将基片表面进行修饰，使其活化成带负电荷，步骤如下①将基片放入40℃恒温的H2O/H2O2/NH3.H3O混合物中(v/v 5∶1∶1)30分钟；②用去离子水或超声波清洗基片；③将基片侵入热的H2O2/H2SO4(v/v 3∶7)的混和溶液中30分钟；④用去离子水或超声波清洗基片；⑤将基片置入干燥箱中，在80℃下干燥1小时或用氮气吹干。
(2)通过静电自组装技术在石英玻璃基片上固定上水溶性共轭聚合物；①配置浓度为0.05mg/ml～15g/ml的水溶性共轭聚合物溶液，水溶性共轭聚合物为聚阳离子；②将石英玻璃基片置于该水溶性共轭聚合物溶液中，吸附平衡10分钟至数小时；③取出基片用去离子水彻底清洗干净，并用氮气或者氩气吹干。
(3)设计并合成单链DNA作为捕获探针DNA；该探针的长度由5～20个核苷酸组成；(4)设计并合成核酸肽PNA分子作为分子识别元件，所述PNA分子由25～30个核苷酸组成，靠近5′端碱基序列须与(3)得到的核苷酸链互补配对，3′碱基序列根据不同用途设计成不同的碱基序列。5′端修饰上带有脂肪烃臂，臂的末端偶联上活性基团巯基(-SH)；(5)分子识别元件PNA核酸肽的5′修饰上10～15nm纳米金作为水溶性共轭聚合物的猝灭剂；纳米金的制备
①将制备需要的玻璃用王水彻底清洗，在用三次过滤的水清洗，在放于烤箱烘干；所用的HAuCl4溶液、柠檬酸三钠盐溶液均先用0.8微米孔径的滤膜过滤；②将100ml的0.01％的HAuCl4置于烧瓶中加热煮沸；③在剧烈搅拌下加4ml的1％的柠檬酸三钠盐于HAuCl4煮沸溶液中；④继续加热回流30分钟，反应溶液颜色由深蓝色转变为紫色，再变为深酒红色；⑤移去热源，然后继续搅拌至室温下，再用0.8微米孔径的滤膜过滤溶液，即得到孔径为10～15nm的纳米胶体金颗粒。
PNA分子修饰纳米金的流程①将核酸肽PNA溶解于新配置的金胶溶液中，于室温下静置16～20小时，使SH-PNA分子与金胶颗粒充分作用；②将上述混和溶液转移至0.1mol/L NaCl-10mmol/L的磷酸缓冲溶液中，再静置40小时；③金胶溶液修饰的PNA溶液放置以10000～16000r/min高速离心，去除未反应的过量的PNA；④再用0.1mol/L NaCl-10mmol/L磷酸缓冲溶液洗涤沉淀，再高速离心，去除上层清液，去除未反应的过量的PNA；⑤再用0.1mol/L NaCl-10mmol/L磷酸缓冲溶液制备出一定浓度的修饰上纳米金颗粒的核酸肽PNA溶液。
(6)将步骤(3)得到的捕获DNA溶解于步骤(5)的溶液中，控制摩尔比浓度在0.9∶1～1∶0.9之间；(7)将步骤(2)得到的基片静置于步骤(6)得到的混和溶液中，控制温度使得捕获DNA与PNA充分杂交，并且使捕获DNA分子与固定于基片上的水溶性共轭聚合物结合；直至观察到基片上水溶性共轭聚合物激发的荧光充分猝灭；(8)取出基片用大量去离子水洗涤后，进一步干燥处理，即获得了以纳米金为荧光猝灭剂的基因探针。
基因探针对目标链的杂交检测将探针放置于DNA杂交溶液中，该溶液组成10mM Tris-HCl，0.2M NaCl缓冲溶液，pH在5～8之间，控制温度(低于杂交链的溶解温度Tm)使PNA分子上的分子探针PNA与目标链杂交，然后用缓冲溶液充分搅拌，目标链带动PNA分子离开固定有水溶性共轭聚合物的基片表面，导致基片表面上的水溶性共轭聚合物荧光恢复。
权利要求
1.以水溶性共轭聚合物为敏感材料的基因探针的构建方法，其特征是以水溶性共轭聚合物为荧光指示剂，以核酸肽PNA为分子识别元件，通过一段线性的DNA单链将核酸肽PNA结合到水溶性共轭聚合物上；其步骤如下(1)石英玻璃表面清洗后进行活化处理；(2)通过自组装或者共价键方法在石英玻璃上固定带正电荷的水溶性共轭聚合物；(3)设计并合成单链DNA作为捕捉探针DNA；(4)设计并合成核酸肽PNA分子链作为分子识别元件；(5)将(4)得到的核酸肽PNA分子的5′端通过共价键连接的方法连接上水溶性共轭聚合物的荧光猝灭剂；(6)将步骤(3)得到的捕捉探针DNA和步骤(5)得到的PNA按照摩尔比为0.9∶1～1∶0.9关系配置成混合溶液；(7)将步骤(2)所得的固定有水溶性共轭聚合物的玻璃放置于步骤(6)所得的混合溶液中，控制温度使得捕捉探针DNA与PNA分子杂交，同时捕捉探针DNA通过静电作用与(2)得到水溶性共轭聚合物结合在一起，从而将PNA分子锚定于石英玻璃表面上的水溶性共轭聚合物上；(8)取出玻璃后做进一步干燥处理，即得到针对特定碱基序列的目标单链的探针。
2.根据权利要求1所述的以水溶性共轭聚合物为敏感材料的基因探针的构建方法，其特征在于作为敏感材料的水溶性共轭聚合物是具有激发荧光我的高分子共轭化合物。
3.根据权利要求2所述的以水溶性共轭聚合物为敏感材料的基因探针的构建方法，其特征在于所说共轭化合物为聚对苯撑乙烯及其衍生物，或带正电荷的聚芴类水溶性共轭聚合物。
4.根据权利要求1所述的以水溶性共轭聚合物为敏感材料的基因探针的构建方法，其特征在于核酸肽PNA不带电荷，以多肽为骨架的核苷酸类似物，其骨架是由重复的N-(2-氨基乙基)甘氨酸残基通过酰胺键重复连接而成，通过亚甲基羰基连接上碱基，连接的碱基能与互补的DNA单链分子和RNA分子上的碱基配对杂交。
5.根据权利要求1所述的基于水溶性共轭聚合物为敏感材料的基因探针的构建方法，其特征在于分子识别元件PNA分子上的碱基序列从功能上分为两部分，靠近5′端碱基序列为捕捉探针PNA，与捕捉探针DNA碱基序列互补配对；靠近3′的碱基序列为分子探针PNA，与目标单链的碱基序列互补配对。
6.根据权利要求4所述的以水溶性共轭聚合物为敏感材料的基因探针的构建方法，其特征在于所说的核酸肽PNA分子的结构式如下
7.根据权利要求1所述的以水溶性共轭聚合物为敏感材料的基因探针的构建方法，其特征在于所说的DNA单链的结构式如下
全文摘要
本发明涉及一种以水溶性共轭聚合物为敏感材料的基因探针的构建方法。它以水溶性共轭聚合物为敏感材料，以核酸肽PNA为分子识别元件，以DNA单链作为捕捉探针；将核酸肽PNA结合到水溶性共轭聚合物上，连接于PNA分子上的荧光猝灭剂导致水溶性共轭聚合物荧光猝灭，PNA分子与目标单链杂交后，使得PNA分子上的荧光猝灭剂离开水溶性共轭聚合物，水溶性共轭聚合物荧光恢复，从而实现对目标单链的检测。本发明简化了探针的构建方法，使得线性探针容易与目标单链杂交结合，可广泛运用于分子生物学、临床诊断及各种生化分析。
文档编号C12Q1/68GK1600866SQ20041005306
公开日2005年3月30日 申请日期2004年7月22日 优先权日2004年7月22日
发明者黄维, 陈国平, 范曲立 申请人:复旦大学