专利名称：自絮凝产氢细菌及其筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种产氢细菌新种及其筛选方法。
背景技术：
生物制氢技术是解决能源危机和环境污染问题的重要手段之一，由于其具有双重功效和可持续性特点，日益受到世界各国的重视。提高产氢效率是生物制氢技术工业化亟待解决的难题。筛选出高效产氢细菌是加快实现生物制氢工业化的有效途径。为了获得高效产氢发酵细菌，国外研究者分离了大量的产氢发酵细菌，分离的产氢发酵菌株多数集中在梭菌属和肠杆菌属。Kumar等从树叶榨出物中分离到阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)IIT-BT08，该菌株在36℃，培养液pH值6.0条件下，最大产氢速率为29.63mmol H2/g dry cell·h，是目前报道的产氢能力最高的细菌。
产氢细菌的连续流发酵工艺是发酵法生物制氢技术实现工业化生产的关键环节之一。如Rachman等(1998)利用自絮凝细菌采用填充床式反应器(PBR)对产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)HU-101和AY-2进行了18d连续培养。Kumar等(2000)，以椰子壳纤维固定阴沟肠杆菌(Enterobacter clocae)IIT-BT08进行了连续流培养。目前主要是采用固定化技术增加了运行成本，不易保持生物量。因此分离自絮凝细菌采取非固定化的产氢细菌更具有实际意义。
由于制氢反应器的生长条件与静态培养不同，尤其是产酸发酵过程中反应系统的pH均较低，因此目前所分离的高效发酵细菌虽然具有较高的产氢能力，但是在反应器内往往不能达到其最佳产氢和生长条件，高效产氢细菌不能成为微生物群落中的优势种群，只能采取固定化方式，限制了其产氢效能，增加了运行成本。为了进一步提高系统的产氢能力，需要分离既高效产氢和强耐酸性，又能成为优势生长的自絮凝细菌，更具有现实意义和工程应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有自絮凝能力、高产氢能力和强耐酸能力的产氢细菌(保藏日期2004.5.25，保藏单位名称中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号CGMCC No.1151。)及其筛选方法，自絮凝产氢细菌，命名为哈尔滨产乙醇杆菌W-1(EthanologenbacteriumHarbin W-1)，保藏编号为CGMCC1151。自絮凝产氢细菌的筛选方法，它采用常规的分离、纯化和筛选过程，在筛选过程中所使用培养基的成分为葡萄糖20g、胰蛋白胨4g、牛肉膏2g、酵母汁1g、NaCl 4g、K2HPO41.5g、L-半胱氨酸0.5g、FeSO4.7H2O 0.1g、MgCl20.1g、微量元素10ml、维生素10ml、刃天青0.2％w/v；上述微量元素由下述成分组成MnSO4.7H2O 0.01g、ZnSO4.7H2O0.05g、H3BO30.01、N(CH2COOH)34.5g、CaCl2.2H2O 0.01g、Na2MoO40.01g、CoCl2.6H2O 0.2g、AlK(SO4)2 0.01g，定容1000mL；上述维生素由下述成分组成钴铵素0.01g、抗坏血酸0.025g、核黄素0.025g、柠檬酸0.02g、吡多醛0.05g、叶酸0.01g、对氨基苯甲酸0.01g、肌酸0.025g，定容1000mL。本发明所述的产氢细菌新种Ethanologenbacterium Harbin W-1(其样品已送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，保存号为CGMCC No.1151)，是从连续流生物制氢反应器CSTR中取出一定量产氢发酵活性污泥，通过自主设计的培养基，采用改进的Hungate厌氧技术分离获得，它是一株既有高效的产氢效率强絮凝能力和耐酸特征的细菌，该株细菌在振荡培养时通过自絮凝作用，菌体形微絮凝体，直径0.5～1.0mm，培养基完全澄清，絮体致密很难被打碎。它有利于实际工程应用，有很大的推广价值。哈尔滨产乙醇杆菌W-1(Ethanologenbacterium Harbin W-1)生物学特点如下1、菌株的形态特征该菌株在液体培养基振荡培养时具有很强的自絮凝效果，可形成大的絮体颗粒，见图1。细菌为革兰氏阳性杆菌，有荚膜，无内生芽孢，专性厌养生长，细菌长短多变(宽0.4μm～0.5μm×长2μm～6μm)。透射电镜观测，发现菌体周生鞭毛，扫描电镜观测菌体有表面呈现凹凸不平。在固体培养基上生长时，为乳白色圆形菌落，表面光滑，边缘整齐。
2、菌株的生理生化特征菌株W-1的生长以OD600的吸光度值表示，通过细菌对数时期单位内数量的增长计算生长代时为3.8h。可以利用柠檬酸生长，牛乳石蕊试验、M.R.、V.P.、明胶试验均为阳性，硝酸盐试验和H2S试验均呈阴性。
菌株W-1在以葡萄糖为碳源时液相末端发酵产物主要为乙醇和乙酸还有少量的丙酸和丁酸，为典型的乙醇型发酵细菌。在培养28h后生物量达到最大OD600为1.19。此后，由于营养物质和代谢产物成为生长限制性因子导致细菌种内竞争，细菌进入衰亡期，细菌代谢活性低下，液相末端发酵产物增加平缓。培养48h后乙醇和乙酸的含量达到最大分别为3396.9mg/L和3009.6mg/L，占总挥发酸和醇含量的98.6％。
该菌株的发酵气体主要为氢气和二氧化碳，通过气相色谱分析氢气含量，计算累计产生气体中的氢气含量即为累计产氢量。在培养36h后累计产氢量增长缓慢，最大比产氢速率为25.3mmolH2/g drycell·h，最大累积产氢量为1917mL/L培养液。该菌株属高效产氢细菌，具有很好的生长能力和耐酸能力，可在pH3.5～8.5条件下生长。该株细菌为实现生物制氢产业化提供了宝贵的出发菌株，对生物制氢技术实现工业化生产具有重大理论意义和经济价值。
3、菌株的分子生物学鉴定结果菌株W-1的16S rRNA基因序列在GenBank的注册号为AY434721，与其最相近种属纤维素梭菌(Clostridium Cellulosi)的相似性为94％，为一新属细菌。16S-23S rRNA间隔区序列注册号为AY337017，序列比对结果显示保守区域仅为tRNAla和tRNAIle序列，变异区域与其它种属细菌16S-23S rRNA间隔区序列没有同源性区域。
所属分类学“属”为一新属，命名为产乙醇杆菌属(Ethanologenbacteriumssp.)，为首次命名的分类学新属。其特征是该属细菌为专性厌氧生长，革兰氏阳性菌；杆菌；周生鞭毛；无芽孢；代谢特征为乙醇发酵；通过16S rRNA基因序列比对分析与其最相近种属梭菌属的纤维素梭菌(Clostridium Cellulosi)的相似性为94％。
图1是自絮凝产氢细菌CGMCC1151电子显微镜形态结构图，图2是自絮凝产氢细菌CGMCC1151电子显微镜下形成大的絮体颗粒示意图。
保藏日期2004.5.25，保藏单位名称中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号CGMCC No.1151。
具体实施例方式自絮凝产氢细菌，命名为哈尔滨产乙醇杆菌W-1(EthanologenbacteriumHarbin W-1)，保藏编号为CGMCC1151。
自絮凝产氢细菌哈尔滨产乙醇杆菌W-1的筛选方法，它采用常规的分离、纯化和筛选过程。
一、菌株的分离、纯化和筛选采用改良的细菌分离培养基进行产氢细菌的分离。从连续流生物制氢反应器CSTR中取出1～2mL产氢发酵活性污泥，放入充满氮气的三角瓶中，加入数颗玻璃珠，在摇床上振荡1h，将污泥中菌胶团打碎，用无菌水进行倍比稀释，再接种于固体培养基中，制成滚管，培养7～10d。挑取单菌落转接入液体体培养基中。观测是否有絮体颗粒产生，有絮体形成的即为自絮凝细菌。重复以上操作若干次，直至絮凝状态良好，用电镜确认是否为纯菌株。将分离纯化的絮凝发酵细菌转接于液体培养基中，36℃，120r/min振荡培养3d，用1mL无菌注射器从其气相中取样，检测其气相成分中是否有氢气存在。如果有即为自絮凝产氢细菌哈尔滨产乙醇杆菌W-1。
培养基葡萄糖20g、胰蛋白胨4g、牛肉膏2g、酵母汁1g、NaCl 4g、K2HPO41.5g、L-半胱氨酸0.5g、FeSO4.7H2O 0.1g、MgCl20.1g、微量元素10ml、维生素10ml、刃天青0.2％w/v；上述微量元素由下述成分组成MnSO4.7H2O 0.01g、ZnSO4.7H2O 0.05g、H3BO30.01、N(CH2COOH)34.5g、CaCl2.2H2O 0.01g、Na2MoO40.01g、CoCl2.6H2O0.2g、AlK(SO4)20.01g，定容1000mL；上述维生素由下述成分组成钴铵素0.01g、抗坏血酸0.025g、核黄素0.025g、柠檬酸0.02g、吡多醛0.05g、叶酸0.01g、对氨基苯甲酸0.01g、肌酸0.025g，定容1000mL。
二、自絮凝高效产氢菌株优选将筛选出的自絮凝产氢菌株，重复分离、纯化操作，待其产气稳定后，测其产氢能力，并将产氢能力高的菌株，重复分离操作，取在固体培养基中产生气泡较大的细菌菌落进行纯化，反复上述步骤，直至滚管中细菌稳定产生大而多的气泡为止。富集后，再测其产氢能力。反复多次，直至优选出强自絮凝和产氢能力最高的菌株为止。
三、细菌的生理生化分析细菌的生长用紫外分光光度计，在600nm处测定样品的吸光度值，作为菌浊。不同菌浊的细菌干重测定是将样品在5000r/min下离心，弃上清液，用无菌纯水洗细菌沉淀2次，80℃干燥12h，用精密电子天平称其重量。形态学鉴定鉴定参照文献方法(东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京科学出版社，2001.)四、菌株分类鉴定提取细菌基因组DNA，用于16S rDNA扩增的PCR反应引物为通用引物正向引物BSF8/205′-AGAGTITGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物BSR1541/15225′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′，分别对应于大肠埃希氏菌(E.coli)16S rRNA的8～27和16S rRNA的1522～1541碱基。16S-23S rRNAITS的扩增引物为PSA1486/15055′-GGGGTGAAGTCGTAACAAGG-3′；PLA209/1895′-GGTACTTAGATGT TTCAGTTC-3′。分别对应于E.coli16S rRNA的1486～1505和23S rRNA的189～209碱基。PCR反应体系(50μL)如下10×buffer(mg2+)5μL、2.5mmol/LdNTP 5μL、20pmol/L引物各1μL、ExTaq DNA酶0.25μL。PCR扩增条件95℃ 5min；94℃ 1min；60℃ 30S；72℃ 1min，30个循环；72℃ 8min。用pMD18-T载体克隆，进行序列测定。
五、产氢细菌发酵产氢工艺发酵产物的分析挥发酸和醇类测定，使用GC122型气相色谱仪，取1mL培养液，离心5000r/min，取上清液进样，柱长2m，担体GDX103，60～80目，氢火焰检测器，氮气作载气，流速60mL/min，氢气流速为50mL/min，空气流速为490mL/min，汽化室210℃，柱和检测室190℃。氢气和二氧化碳测定，使用SC-II型气相色谱仪，柱长2m，担体为TDS-01，60～80目，热导池检测器，氮气作载气，流速为70mL/min，柱和检测室150℃。通过静态试验优化发酵工艺。确定影响发酵工艺的最适底物、最佳生长和产氢温度、pH值等参数。
利用自絮凝产氢细菌CGMCC1151进行产氢时的发酵工艺条件以糖蜜和葡萄糖为底物，最适发酵产氢和自絮凝温度为36℃，最适生长pH为4.5，最适产氢pH为4.0。
附件序列表附一自絮凝产氢细菌哈尔滨产乙醇杆菌W-1(EthanologenbacteriumHarbin W-1)的16S rRNA序列(GenBank注册号为AY434721)<110>哈尔滨工业大学<120>自絮凝产氢细菌及其筛选方法<160>2<210>1<211>1495<212>RNA<213>产乙醇杆菌属(Ethanologenbacterium ssp.)<400>1agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgcgc ctaacacatg caagtcgagc 60ggagtccttc gggacttagc ggcggacggg tgagtaacgc gtgagcaacc tggccttcag120agggggataa cgtctggaaa cggacgctaa taccgcatga catggcggag tcgcatggct180ctgccatcaa aggagtaatc cgctgaggga tgggctcgcg tccgattagg tagttggtga240ggtaacggct caccaagccc gcgatcggta gccggactga gaggttggcc ggccacattg300ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt gggggatatt gcacaatgga360ggaaactctg atgcagcgac gccgcgtgag ggaagaaggt cttcggattg taaacctctg420tctttgggga cgaatcaatg acggtaccca aggaggaagc cacggctaac tacgtgccag480cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggaat tactgggtgt aaagggtgcg540caggcggggc ggcaagttgg atgtgaaaac tccgggctca acccggagcc tgcattcaaa600actgtcgctc ttgagtaagt agaggcaggc ggaattcccg gtgtagcggt gaaatgcgta660gatatcggga ggaacaccag tggcgaaggc ggcctgctgg gcttttactg acgctgaggc720acgaaagcat gggtagcaaa caggattaga taccctggta gtccatgccg taaacgatga780ttgctaggtg tggggggtct gaccccttcc gtgccggagt taacacaata agcaatccac840ctggggagta cggccgcaag gttgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcag900tggagtatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatccacc960gaatccccca gagatggggg agtgtccttc ggggagcggt gagacaggtg gtgcatggtt 1020gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgtga 1080
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1.一株自絮凝产氢细菌，命名为哈尔滨产乙醇杆菌W-1(Ethanologenbacterium Harbin W-1)，保藏编号为CGMCC1151。
2.根据权利要求1所述的自絮凝产氢细菌，其特征在于乙醇杆菌W-1的16S rRNA序列的GenBank注册号为AY434721，16S rRNA序列为agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgcgc ctaacacatg caagtcgagc 60ggagtccttc gggacttagc ggcggacggg tgagtaacgc gtgagcaacc tggccttcag120agggggataa cgtctggaaa cggacgctaa taccgcatga catggcggag tcgcatggct180ctgccatcaa aggagtaatc cgctgaggga tgggctcgcg tccgattagg tagttggtga240ggtaacggct caccaagccc gcgatcggta gccggactga gaggttggcc ggccacattg300ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt gggggatatt gcacaatgga360ggaaactctg atgcagcgac gccgcgtgag ggaagaaggt cttcggattg taaacctctg420tctttgggga cgaatcaatg acggtaccca aggaggaagc cacggctaac tacgtgccag480cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggaat tactgggtgt aaagggtgcg540caggcggggc ggcaagttgg atgtgaaaac tccgggctca acccggagcc tgcattcaaa600actgtcgctc ttgagtaagt agaggcaggc ggaattcccg gtgtagcggt gaaatgcgta660gatatcggga ggaacaccag tggcgaaggc ggcctgctgg gcttttactg acgctgaggc720acgaaagcat gggtagcaaa caggattaga taccctggta gtccatgccg taaacgatga780ttgctaggtg tggggggtct gaccccttcc gtgccggagt taacacaata agcaatccac840ctggggagta cggccgcaag gttgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcag900tggagtatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatccacc960gaatccccca gagatggggg agtgtccttc ggggagcggt gagacaggtg gtgcatggtt 1020gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgtga 1080atagttgcta cgaaagagca ctctattcag accgccgttg acaaaacgga ggaaggtggg 1140gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtacta caatggccat 1200caacagaggg aagcaaggcc gcgaggtgga gcgaacccct aaaaatggtc tcagttcaga 1260ttgcaggctg aaacccgcct gcatgaagat ggaattgcta gtaatcgcgg atcagcatgc 1320cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatga gagccgggga 1380cacccgaagt cggttgggta accgtaagga gcccgccgcc gaaggtggaa tcggtaattg 1440gggtgaagtc gtaacaaggt agccgtatcg gaaggtgcgg ctagatcacc tcctt1495。
3.根据权利要求1所述的自絮凝产氢细菌，其特征在于哈尔滨产乙醇杆菌W-1的16S-23S rRNA间隔区序列的GenBank注册号为AY337017，16S-23SrRNA间隔区序列为aattcgagct cggtacccgg ggatcctcta gagattaaag atgttgttta attttgaggg 60tccgggcgga cgcggttcgc ttttaagccg ccggccatgc agatcggatt gggagcgaac120agccccgatg caggaagcat gacggcagtt tgaagacggg cggcgtccca aagaaccttc180aaacggtgga aaagagaata ggacgaccga ttcccaggca aagcgtgggg tatagctttc240aggctgagca gtccgagaac aggagatttt cctgaacttg cgccgcgcag cggtgaactt300gccgctacgg tgagtagggg gtgtagctca gctgggagag cacctgcttt gcacgcaggg360ggtcaggagt tcgattctcc tcatctccac cacgcctgcg gcggatatga cgcgccaagg420cagccgaaaa cgaaaatgca aagccgcgag gccaagcgtc gacgttgagg aagccaaagc480atgcatgccg gttgcaggca aaccaaatgg cccgggcggg aacggacgac cgagatgctc540ggattgcatg ggctcatagc tcaggtggtt agagcgtgcg cctgataagc gcaaggtcgg600tggttcgagt ccacttgagc ccaccagcgg gcagtgcccg cacacaattc gcgggaagtt660tgttcaaagc agaggtcggc cgccgcgaaa gcgagacgga tcgaagcaag aacagatgga720tcgcaaaacc gcttgcaaaa gaggtaagat ttcaggctga gcagccgcgt aagcaacgac780tttcctgaac ttgcctccgc cgcaggcggg gggaccttga aaactgaata atgttctaat840ctgcaatttt tttaatgaac gaagcgagta gcggcggaag tttcaggctg agcagctgtg900taagcagtgg gcttgcttga acatacgtct tgcgaagcaa gttcgttggg taaaattccg960attgacacat aaggtcaagc tacaaagagc gcaaggggaa tgccttggca ccaggagccg 1020atgaaggacg cagcgatctg cgaaaagcca cggggagtcg aaagcaggca ttgatccgtg 1080gatatccgaa tggggcaacc cggcggagcc atactccgtc agcgtgcagt gaatccatag 1140ctgcacgtgg ggaaccgcct gaactgaaac atctaagtac caatcgtcga cctgcaggca 1200tgcaagcttg gcactgg 1217。
4.一种自絮凝产氢细菌的筛选方法，它采用常规的分离、纯化和筛选过程，其特征在于在筛选过程中所使用培养基的成分为葡萄糖20g、胰蛋白胨4g、牛肉膏2g、酵母汁1g、NaCl 4g、K2HPO41.5g、L-半胱氨酸0.5g、FeSO4.7H2O0.1g、MgCl20.1g、微量元素10ml、维生素10ml、刃天青0.2％w/v；上述微量元素由下述成分组成MnSO4.7H2O 0.01g、ZnSO4.7H2O 0.05g、H3BO30.01、N(CH2COOH)34.5g、CaCl2.2H2O 0.01g、Na2MoO40.01g、CoCl2.6H2O0.2g、AlK(SO4)20.01g，定容1000mL；上述维生素由下述成分组成钴铵素0.01g、抗坏血酸0.025g、核黄素0.025g、柠檬酸0.02g、吡多醛0.05g、叶酸0.01g、对氨基苯甲酸0.01g、肌酸0.025g，定容1000mL。
全文摘要
自絮凝产氢细菌及其筛选方法，它涉及一种产氢细菌新种及其筛选方法。为了进一步提高系统的产氢能力，需要分离既高效产氢和强耐酸性，又能成为优势生长的自絮凝细菌，更具有现实意义和工程应用价值。本发明自絮凝产氢细菌，命名为哈尔滨产乙醇杆菌W－1(Ethanologenbacterium Harbin W－1)，保藏编号为CGMCC1151。自絮凝产氢细菌的筛选方法，其特征在于在筛选过程中使用了新的培养基。本发明的自絮凝产氢细菌哈尔滨产乙醇杆菌W－1是一株既有高效的产氢效率强絮凝能力和耐酸特征的细菌，该株细菌在振荡培养时通过自絮凝作用，菌体形微絮凝体，直径0.5～1.0mm，培养基完全澄清。
文档编号C12N1/20GK1648235SQ20041004383
公开日2005年8月3日 申请日期2004年8月27日 优先权日2004年8月27日
发明者邢德峰, 任南琪, 宫曼丽, 李秋波 申请人:哈尔滨工业大学