专利名称：编码杜氏盐藻八氢番茄红素合成酶的基因的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种新的基因，具体地说涉及从杜氏盐藻(Dunaliellasaline)中分离的编码八氢番茄红素合成酶(PSY)的新基因。
背景技术：
β-胡萝卜素在人体内是维生素A的前体，广泛用于食品、化妆品的添加剂及药品和保健品方面。目前市场上对β-胡萝卜素的需求主要通过三孢布拉霉发酵、从养殖的盐藻中直接提取以及化学合成满足，但仍然是供不应求。杜氏盐藻(Dunaliella salina)简称盐藻，是一种单细胞绿藻，能在适宜的条件下累积大量的β-胡萝卜素，其含量最高可超过干重的10％，是公认的产β-胡萝卜素最好的天然资源。八氢番茄红素合成酶是β-胡萝卜素代谢过程中的关键酶，其功能为催化2分子的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)合成八氢番茄红素，而八氢番茄红素是β-胡萝卜素合成途径中的前体物质，是第一个无色的类胡萝卜素分子。有报道甚至称此酶为整个代谢途径的限速酶。关于PSY基因，最早于1987年在番茄中获得(GBAN A21360，L23424)。现已分离出PSY基因的植物及藻类还有辣椒(GBAN X68017)、拟南芥(GBANAF009954，L25812)、黄水仙(GBAN X78814)、甜瓜(GBANZ37543)、玉米(GBAN U32636)等。
藻类中，现已分离出该基因种类只有巴氏杜氏藻(Dunaliellabardawil)(GBAN U91900)和雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)(GBAN AF305430)，并且这两种藻均只报道了该基因的mRNA序列。
发明内容
本发明的目的在于提供从盐氏杜氏藻中分离获得的八氢番茄红素合成酶的基因完整的DNA序列。
本发明通过与盐藻亲缘关系较近的两种藻(Dunaliella bardawil，Haematococcus pluvialis)和六种植物(Arabidopsis thaliana，Oryzasative，Tagetes erecta，Lycopersicon esculentum，Capsicum annuum，Daucus carota)的八氢番茄红素合成酶基因(PSY)的氨基酸序列进行对比分析，推测可能的保守区，在保守区的位置直接按照Dunaliellabardawil的核苷酸序列设计一对特异引物上游引物F5’-GAGTACGCCAAGACCTTCTA-3’；下游引物R5’-GTTGTCATAGTCATTCTTCTC-3’，以盐藻基因组DNA为模板，扩增出盐藻PSY基因的部分序列。进而通过染色体步移技术获得psy基因的全长，根据已获得的PSY部分序列的5’端和3’端序列分别设计上游步行引物UWR5’-GTGCGTGGCTTGAGCGGCTTAGAAATG-3’；下游步行引物DWF5’-ATGGTCATCACAGCGGCTTGCTTCACAG-3’；以连接了Adaptor的基因组DNA为模板，以试剂盒提供的Adaptor上的引物AP1分别和UWR、DWF配对进行抑制性PCR扩增。进行抑制性PCR扩增，并进行测序后获得PSY基因序列(SEQ ID NO.1)。
盐藻中八氢番茄红素合成酶序列的获得，为利用基因重组技术获得高效产β-胡萝卜素工程菌或是对天然盐藻进行生物改造以提高β-胡萝卜素的产量奠定基础。
附图的简要说明
图1为本发明采用的抑制性PCR原理图。
发明的
具体实施例方式
通过与盐藻亲缘关系较近的两种藻(Dunaliella bardawil，Haematococcus pluvialis)和六种植物(Arabidopsis thaliana，Oryzasative，Tagetes erecta，Lycopersicon esculentum，Capsicum annuum，Daucus carota)的八氢番茄红素合成酶基因(PSY)的氨基酸序列进行对比分析，推测可能的保守区，在保守区的位置直接按照Dunaliellabardawil的核苷酸序列设计一对特异引物上游引物F5’-GAGTACGCCAAGACCTTCTA-3’；下游引物R5’-GTTGTCATAGTCATTCTTCTC-3’，以盐藻基因组DNA为模板，扩增出盐藻PSY基因的部分序列。PCR程序为94℃预变性5min进入循环过程；94℃变性45sec，46℃退火40sec，72℃延伸2min，接下来以每循环降0.5℃的退火温度循环22次，最后以35℃的退火温度循环5次，循环完成后以72℃延伸10min。经1.5％琼脂糖凝胶电泳后回收2条主扩增带，并分别连接到pMD18-Tvector上，最后用热激法把重组质粒转入E.coli DH5α。同时委托上海中科开瑞公司进行测序，并用BLAST对序列进行同源性分析，确定其中2.5kb的带为可能的盐藻八氢番茄红素合成酶片段。
接下来通过染色体步移技术获得psy基因的全长染色体步移按照CLONTECH Laboratories公司试剂盒说明书进行，用限制性内切酶EcoRV，Dra I，Pvu II和Stu I分别对盐藻基因组DNA完全酶切，酶切产物经纯化后与试剂盒提供的Adaptor连接。根据已获得的PSY部分序列的5’端和3’端序列分别设计上游步行引物UWR5’-GTGCGTGGCTTGAGCGGCTTAGAAATG-3’；下游步行引物DWF5’-ATGGTCATCACAGCGGCTTGCTTCACAG-3’；以连接了Adaptor的基因组DNA为模板，以试剂盒提供的Adaptor上的引物AP1分别和UWR、DWF配对进行抑制性PCR扩增。
所谓抑制性PCR是指由于Adaptor是具有3’凹端的一小段双链核苷酸，在进行步移的PCR扩增过程中，有一小部分的Adaptor的3’端会延伸形成平端接头，这样在扩增的结果中就会有一部分是由接头上的引物直接扩增出来的模板链，而非已知序列的特意引物和接头引物扩增出来的目的片段。抑制性PCR就是通过把退火温度设置在一定的范围之类，保证大部分具有平端接头的模板形成锅柄结构，而不与接头引物结合，已减少非目的片段的背景扩增(如图1)PCR程序为94℃变性2sec，以72℃为退火和延伸温度3min，如此进行7个循环；再以67℃为退火和延伸温度进行32个循环；循环完成后以67℃延伸4min。将上下游步移分别获得的片段委托北京三博远志生物技术有限责任公司测序，拼接3次的测序结果获得PSY的全序列。PSY的基因序列如SEQ ID.1所示。
序列.ST25.txtSEQUENCE LISTING<110>华南理工大学<120>编码杜氏盐藻八氢番茄红素合成酶的基因<130>200403<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2983<212>DNA<213>杜氏盐藻(Dunaliella salina)<400>1atgccctcca cttccggtgc gtcgcccttc ctcccagcag cgccagcact tgccaggcgg 60tgcagtcgcg gccccaacgg cagcagcagg cggtgcagca gggcggtgcc agcctccagt120gtcagcagga gcccgacggt ggccgtgcag gcgacgcttg ccatgcccag ccccgattcc180cagcgcctgc gcctgcagca gcagctgcag cagcaagccc agcagcagca ggcccagcag240cagctgtccg gcaaggacgt ggagcaggca gcgatgcagg cgtgcatacg gacagccacc300tccgtgcccc cctcgtccgg cgtgctggac cccagcggcc tgcgctggag gggcggagcg360ctggaggcag cgtacgagcg gtgtggcgcg gtgtgcaagg agtacgccaa gaccttctac420ctgggcacgc agctcatgac ccccgtccag gcacgctgca tctgggccat ctacgtgtgg480tgcaggcgca cggatgagct ggtggatggc cctaatgcct ccaagatcac accacaggtg540cgcgtgcggg tgctgcggca gcgcaggaga tgatggggag cgggcatctt gcgtgggagc600atgcgcgcga gcggttggtc cagtgttagc attcgtgtgt gcacgctgtg gccaatcctg660ctgcacagcc agctgcagtg aggagtgcag atgcaagcag ctgtgtgttg ctcctggtgt720cacgcgtccg gtggacatgt ggacttagaa atgggggtta catttctaac ccgctcaagc780cacgcacacc tgagcattgc cacacggtcg ctcatgcacc ctctgcatcc cacactacct840gcgcatggaa catctgcacg gcatgaaggg ttcattggca ttgtgcactc acatggtgca900
序列.ST25.txtttccacactg cctcctgcca cacacacaca tgcgctctct gctgcactcg tatctgattg 960ccacgactcc tcactgccaa catgcaccag cagcttcatg ctcattcact gtagtactgg1020agggggagca tgcactcatg gcccaactga aggcacctgc tgccaggaca agccactgtg1080tactcccaac agcagcaagg gatgcagcac cagctcctca gcatcctcct gttgtcataa1140tgccagggtt ccagacaaat gacacgcatg catacacatg cacgcgcatg cacgcatcca1200tggacttgcg cgcacgcgcc aacgcacacc cctccccccc ttcacacgca cacacaggcc1260ctggaccggt gggaggagcg gctaaacggc gtcttccaag gcaggcctta cgacgtgctg1320gacgcagcgc tgacagacac catctccaag ttccctctgg aggtgcagcc attccgtgac1380atgattgagg gcatgcgcat ggacctgttc aagtcacggt accagacgtt tgacgagctg1440tatgagtact gctatcgggt agccgggact gtgggcctga tgaccgtgcc tgtcatgggc1500atcgacccca actacaaggt gagtgggcat atgcggaaac tgagcaaggc tttgccaacc1560tgctcctgga atcaagggca tggtattttt caagtgggat tgccttcgcc gattccttga1620tgaatgattt gaaggtacac tcatcaaaag gagggttgga actggcgctg cattcattca1680tgcgtggctg ccgcatgctg aagcactgca accacgtgca cttatgtgtc cgggcagcca1740cctgctcctt cgttgcaacc acactgcaca cacttgctca agcactgcaa ccacatgcac1800gcactcacag ggccccttgg acaaggtgta ccgggctgcg ctcgcgctgg gcaccgccaa1860ccagctgaca aacattctga gagacgtagg agaggacatt cgggaacggg accgcatcta1920cctgcccttg gatgagctac ggggagtttg gcatctcgga agatgaggta tgtgtgcggc1980gtcaacgtcg tttctcatct catttcctcc gcaaaactgc ttgtgccgat atcagcagta2040ggcctggcct tgagagcctg catttcatgc agaggaggtc tggaagggcg gtttcacctg2100gcaggcttgt gagagtgttt cttatggtca tcacagcggc ttgcttcaca gccctcaaca2160agcactctga gcctgaccta aactctttgt tcccaccact gccaactcgt aaccacaggt2220gcgggcaggc atccacaagc cctcacaagg caaggtcgac gagcggtggc gcaagttcat2280gaagttccag atacagcggg cgcgggagta cttccaggag gctgaggatg gtgtggacta2340cttggacgtg aaggcgcggt ggcctgtgtg gtgagtggca gcagtagctg tgtgtcttgc2400tttgttccct tgaagggctt ctctttggac tgccggtgca gcctgtgttc agaggcgctc2460gtttcgaact tccctctcct gtgacttaca ggaggtatct cgaatgcttg actgccatga2520atgtcgtgaa ccagacagct gagggcctgc ctgcagaaat gcaagcctgc ctgcttaaat2580gaaaaagtgt tctagccaaa agatgatcca tgctaggttc acagctgcat gttcatagcg2640agacagtcgc tcctcctgaa tccttcttat ctcagcagct gtgattgtgt gacctcgcag2700ggctcgctgc ccttcttggt ggaatcacaa aagcaagcgg aattctcatg ccgagagcgc2760agcaagcgct ctgtaagcaa tattaaacgg actgtcgagt attgaccctc cctatgtcga2820
序列.ST25.txtctgtcgcagg tctgcgctca tcttgtaccg ccagatcctt gatgtcattg agaagaacga2880ctacgacaac ttctccatgc gtgcgtatgt gtccaagtca aagaagctgg cctccctgcc2940cctggccttg ctgcgtgcca tgatgcccaa gagcccacag tag 298权利要求
1.具有SEQ ID NO.1序列的核苷酸。
2.权利要求1所述的核苷酸，其特征在于其从杜氏盐藻中分离。
3.由权利要求1的核苷酸编码的氨基酸序列。
4.含有权利要求1所述核苷酸的表达载体。
5.含有权利要求1所述核苷酸的宿主细胞。
全文摘要
本发明提供从杜氏盐藻(Dunaliella saline)中分离的编码八氢番茄红素合成酶(PSY)的新基因，为利用基因重组技术获得高效产β－胡萝卜素工程菌或是对天然盐藻进行生物改造以提高β－胡萝卜素的产量奠定基础。
文档编号C12N15/63GK1563068SQ20041002648
公开日2005年1月12日 申请日期2004年3月15日 优先权日2004年3月15日
发明者姜建国, 严媛 申请人:华南理工大学