甘蓝型油菜细胞分裂原激活的蛋白激酶9蛋白编码序列的利记博彩app

专利名称：甘蓝型油菜细胞分裂原激活的蛋白激酶9蛋白编码序列的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及的是一种用于基因工程技术领域的蛋白编码序列，特别是一种甘蓝型甘蓝型油菜细胞分裂原激活的蛋白激酶9(BnMPK9)蛋白编码序列。
背景技术：
农作物在生长过程中会遇到各种各样的自然灾害而造成减产，如干旱、滞涝和病虫害等。当前一个重要的育种手段是将各种抗逆基因对农作物进行基因工程改造，以获得抗逆农作物新品种。植物为抵抗不良的外界环境的胁迫，在长期的自然进化中发展起复杂的信号传递系统帮助自己度过当前的困境，其中MAP激酶(Mitogen-actived protein kinase)信号传递系统在抗逆过程中扮演了极其重要的作用。MAPKs是由MAP激酶(MAPK)与MAP激酶的激酶(mitogen-activated proteinkinase kinase，MAPKK)和MAP激酶的激酶的激酶(mitogen-activated pro2teinkinase kinase kinase，MAPKKK)3种类型组成。植物细胞感受环境胁迫(如损伤、干旱、低温等)和生长发育信号(生长素、乙烯、脱落酸等)后，可以通过受体蛋白激酶等上游激活子顺次激活MAPKKK、MAPKK、MAPK。其中，MAPK是该传递链中最后一个激酶直接作用于下游的转录因子和功能基因，使植物表现出各种抗逆性能，是植物信号传递过程中重要的一环。
在对现有技术文献的分析中，虽然杂志《Proceeding Natural Academic Science，United States of America美国自然科学院院刊》在2002，99(24)15812-1581717发表了文章“Mitogen-activated protein kinase signaling in postgerminationarrest of development by abscisic acid(植物激素脱落酸在抑制植物萌发后期，细胞分裂原激活的蛋白激酶的信号传递)”，对基因MPK9在植物激素脱落酸处理下的表达做了简单的描述，是脱落酸ABA诱导表达相关的基因，与植物的水势有关，但尚不清楚该基因的耐盐、抗旱和抗虫等其它环境因素的效果，此外MPK9属于D型MAP激酶，是至今研究最不清晰的一类激酶。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种甘蓝型油菜细胞分裂原激活的蛋白激酶9蛋白编码序列。使其所公开的与甘蓝型油菜BnMPK9密切相关的蛋白基因和甘蓝型油菜BnMPK9蛋白序列及其核酸序列，应用于转基因技术改良植物抗逆研究中，使该植物具有明显的抗各种环境胁迫的作用，能够明显降低在干旱、水淹和病虫害土地上种植的各种农作物在生物产量上的损失。
本发明是通过以下技术方案实现的本发明所分离出的DNA分子，该分子包括编码具有甘蓝型油菜BnMPK9蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且该核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第111-1613位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者该核苷酸序列能与SEQ ID NO.3中从核苷酸第111-1613位的核苷酸序列杂交。该编码序列具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽，或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。该编码序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸第111-1613位的核苷酸序列。
所述的甘蓝型油菜BnMPK9蛋白质活性的多肽，是本发明分离出的包含细胞分裂原激活的蛋白激酶甘蓝型油菜BnMPK9蛋白质活性的多肽，它包括具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽，该多肽是具有SEQ ID NO.3序列的多肽，该多肽能够在盐、旱、冷、活性氧以及水杨酸处理下均能发挥作用，提供植物的抵抗各种不良环境的能力。
所述的DNA分子，它包含在本发明所提供的一种载体，该载体是一种核酸分子，它包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。
本发明用所述的DNA分子转化的宿主细胞，它是真核细胞。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其蛋白质分开。
在本发明中，术语“甘蓝型油菜抗逆信号传递激酶”指编码具有甘蓝型油菜BnMPK9蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第111-1613位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框第111-1613位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中第111-1613位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.3所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件(70-85％一致性)下，更佳的在高度严紧条件(85％以上一致性)下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第111-1613位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸第111-1613位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与天然的甘蓝型油菜BnMPK9相同功能的蛋白的SEQID NO.3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，术语“甘蓝型油菜抗逆信号传递的蛋白激酶编码序列”指具有甘蓝型油菜BnMPK9蛋白活性的SEQ ID NO.3序列的多肽。该术语还包括具有与天然甘蓝型油菜BnMPK9相关相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括甘蓝型油菜BnMPK9蛋白的活性片段和活性衍生物。
本发明的甘蓝型油菜BnMPK9多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与甘蓝型油菜BnMPK9相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用甘蓝型油菜BnMPK9多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。
在本发明中，“甘蓝型油菜BnMPK9保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.3的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。
表1


表290％ identity in 1329nt overlapQuery46 ttgttagagatttcgatttgtctggtttgaagcgcattagggttccaagaaggaatcata 105||||||||||||| |||||||||||||||| ||||||||||| | ||||||||| |||Sbjct28 ttgttagagattttaatttgtctggtttgaactgcattagggtttctagaaggaattata 87Query106 ttcttatggatcctcataaaaaggttacactggagacggagttctttacagaatacggtg 165|||| ||||||||||||||||||||| |||||||||| ||||||||||||||||||||||Sbjct88 ttctcatggatcctcataaaaaggttgcactggagactgagttctttacagaatacggtg 147
Query166 aagcgagtcggtatcagatccaagaagttatagggaaaggaagttacggggttgtggcat 225|||| || || || || |||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||Sbjct148 aagctagccgataccaaatccaagaagttatagggaaaggaagttacggtgttgtggcat 207Query226 ctgcaatcgacactcacacgggagaaaaggttgccattaagaaaatcaatgatgtctttg 285||||||||||||| || | | |||||||||||||||||||||| ||||||||| ||||Sbjct208 ctgcaatcgacacacattcatgcgaaaaggttgccattaagaaaagcaatgatgtgtttg 267Query286 agcacgtctctgatgctacgaggattctgagagagatcaagctcctcaggctgctcaggc 345|||||||||||||||| ||| ||||||| |||||||||||||| |||||| ||||| | |Sbjct268 agcacgtctctgatgcaacgcggattctaagagagatcaagcttctcaggttgctccgcc 327Query346 atcctgatatagtggagattaagcacgttatgcttcctccttcgcgtagagagttcagag 405||||||||||||||||||| ||||| || |||||||||||||| || | || |||||||Sbjct328 atcctgatatagtggagataaagcatgtaatgcttcctccttcacgccgtgatttcagag 387Query406 atatttatgttgtttttgagctcatggagtcagaccttcaccaagtcatcaaagccaacg 465| |||||||||||||| ||| | ||||| ||||| ||||||||||| ||||| || ||||Sbjct388 acatttatgttgttttcgagttgatggaatcagatcttcaccaagttatcaaggcgaacg 447Query466 atgatttgacccctgagcattaccagtttttcttgtaccagcttctccgtggcctgaagt 525||||| | || |||||||| |||||||||||| | ||||||||||| ||||| |||||||Sbjct448 atgatcttacacctgagcactaccagtttttcctctaccagcttcttcgtggtctgaagt 507Query526 ttattcacacagccaatgtgtttcaccgtgatttaaagcctaaaaacattctagccaact 585| || |||||||| ||||||||||| |||||||| ||||||||||| |||||||||||||Sbjct508 tcatacacacagctaatgtgtttcatcgtgatttgaagcctaaaaatattctagccaact 567Query586 ctgattgcaagctgaagatttgcgactttggacttgcacgtgtgtcgtttaacgatgcac 645||||||||||| ||||||||||||||||||| ||||| || ||||| ||||| |||||||Sbjct568 ctgattgcaagttgaagatttgcgactttgggcttgctcgagtgtcctttaatgatgcac 627Query646 cttctgctatattctggactgactatgtcgctacaagatggtaccgtgcaccagaacttt 705|||| ||||||||||||||||||||||| |||| ||||||||||||| ||||||||||
Sbjct628 cttcggctatattctggactgactatgttgctaaccgatggtaccgtgcgccagaacttt 687Query706 gtggctctttcttctccaaatatactcctgccattgatatatggagcataggatgcatat 765||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct688 gtggctctttcttctccaaatatactcctgccattgatatatggagcataggatgcatat 747Query766 ttgcagaaatgctcaccgggaagccattgtttcctgggaagaacgtggtgcaccaattgg 825|||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||Sbjct748 ttgcagaaatgctcactgggaagccattgtttcctgggaagaatgtggtgcaccaattgg 807Query826 atattatgactgatttgcttggtactccttcacccgaagcgatctcaaggatccgtaatg 885||||||||||||||||||||||||||||| | |||||||| || ||||||| |||||||Sbjct808 atattatgactgatttgcttggtactcctcctcccgaagctattgcaaggattcgtaatg 867Query886 aaaaggcgaggagatatctgggcaacatgaggagaaaaccgccagttccattcactcaca 945||||||||||||||||||| ||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct868 aaaaggcgaggagatatctcggcaatatgaggagaaaaccgccagttccattcactcaca 927Query946 aatttcctcatgtagacccgttggctcttcgcttgctgcaccgccttcttgcatttgatc 1005||||||||||||||||||| ||||| |||||||| |||||||| ||||||||||||||||Sbjct928 aatttcctcatgtagacccattggcccttcgcttactgcaccgtcttcttgcatttgatc 987Query1006 ccaaagaccgtcctacagctgaagaggcactggcagatccttacttttatggactggcaa 1065||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||| ||||| |||||||Sbjct988 ccaaagaccgtccctcagctgaagaggcactggcagatccttacttctatggtctggcaa 1047Query1066 acgtggatcgggaaccatctactcaaccgattccaaaacttgagtttgagtttgaaagaa 1125|||| ||||||||||||||||||||||||||||| ||||| |||||||||||||||||||Sbjct1048 acgttgatcgggaaccatctactcaaccgattccgaaactcgagtttgagtttgaaagaa 1107Query1126 ggaagattatgaaagaagatgtcagggagttaatctacagagagatattagagtatcatc 1185||||| | | ||||||||||| || || || ||||||||||||||||||||||||||||Sbjct1108 ggaagttaacaaaagaagatgtgagagaattgatctacagagagatattagagtatcatc 1167Query1186 ctcggatgctacaagaatatcttcgaggtggagaacagacgagcttcatgtaccctagtg 1245
||| |||||| ||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||| ||||Sbjct1168 ctcagatgctgcaagaatatcttcgaggtggagaacagactagcttcatgtacccaagtg 1227Query1246 gtgttgatcggtttaagagacagtttgcacatcttgaagaacattacggtaagggtgaga 1305|||||||||| ||||||||||| ||||| |||||||| ||| ||||||||||||||||||Sbjct1228 gtgttgatcgctttaagagacaatttgctcatcttgaggaaaattacggtaagggtgaga 1287Query1306 gaagcgctcctcttcaacaacgccacgcttctttgcctagagagagagtccctgcgccta 1365| || | |||||||||| | |||||||| |||||||||||| |||||||||| ||||Sbjct1288 aaggctcacctcttcaacgccaacacgcttccttgcctagagagcgagtccctgctccta 1347Query1366 aggaagagaa 1375|| |||||||Sbjct1348 agaaagagaa 135788％ Identities in 169nt overlapQuery1425 caacacgagggctcaaattacatgaatgggatgagccagacgggttacagtgcccggagc 1484||||||||||| ||| | |||| |||||||| ||||||| ||||||||| || || |||Sbjct1434 caacacgaggggtcagactacaggaatgggacgagccagcagggttacagcgctcgcagc 1493Query1485 ttgctgaaaagtgccagcatcagtgcatctaaatgcattggcgtgaaacaaaggaaccag 1544|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||| ||| ||| ||Sbjct1494 ttgctgaaaagtgccagcatcagtgcatctaaatgcattggcatgaaaccaagaaacaag 1553Query1545 tccgagcacggggaatcgaacagtgatgcaactgatgctttgtctcaaaaggccgcggct 1604|||||| |||||||||| |||| |||| | ||||||| |||||||||||| |||||||Sbjct1554 tccgagtacggggaatcaaacaatgatacggttgatgctctgtctcaaaaggtcgcggct 1613Query1605 ctccacacttga 1616||||||||||||Sbjct1614 ctccacacttga 1625Query甘蓝型油菜BnMPK9的核酸序列Sbjct拟南芥AtMPK9的核酸序列(AB038694)
表2为本发明的甘蓝型油菜BnMPK9蛋白与拟南芥AtMPK9蛋白的核苷酸序列的同源比较(GAP)表。
表390％ identity in 501aa overlapQuery1 MDPHKKVTLETEFFTEYGEASRYQIQEVIGKGSYGVVASAIDTHTGEKVAIKKINDVFEH 60MDPHKKV LETEFFTEYGEASRYQIQEVIGKGSYGVVASAIDTH+ EKVAIKK NDVFEHSbjct1 MDPHKKVALETEFFTEYGEASRYQIQEVIGKGSYGVVASAIDTHSCEKVAIKKSNDVFEH 60Query61 VSDATRILREIKLLRLLRHPDIVEIKHVMLPPSRREFRDIYVVFELMESDLHQVIKANDD 120VSDATRILREIKLLRLLRHPDIVEIKHVMLPPSRR+FRDIYVVFELMESDLHQVIKANDDSbjct61 VSDATRILREIKLLRLLRHPDIVEIKHVMLPPSRRDFRDIYVVFELMESDLHQVIKANDD 120Query121 LTPEHYQFFLYQLLRGLKFIHTANVFHRDLKPKNILANSDCKLKICDFGLARVSFNDAPS 180LTPEHYQFFLYQLLRGLKFIHTANVFHRDLKPKNILANSDCKLKICDFGLARVSFNDAPSSbjct121 LTPEHYQFFLYQLLRGLKFIHTANVFHRDLKPKNILANSDCKLKICDFGLARVSFNDAPS 180Query181 AIFWTDYVATRWYRAPELCGSFFSKYTPAIDIWSIGCIFAEMLTGKPLFPGKNVVHQLDI 240AIFWTDYVA RWYRAPELCGSFFSKYTPAIDIWSIGCIFAEMLTGKPLFPGKNVVHQLDISbjct181 AIFWTDYVANRWYRAPELCGSFFSKYTPAIDIWSIGCIFAEMLTGKPLFPGKNVVHQLDI 240Query241 MTDLLGTPSPEAISRIRNEKARRYLGNMRRKPPVPFTHKFPHVDPLALRLLHRLLAFDPK 300MTDLLGTP PEAI+RIRNEKARRYLGNMRRKPPVPFTHKFPHVDPLALRLLHRLLAFDPKSbjct241 MTDLLGTPPPEAIARIRNEKARRYLGNMRRKPPVPFTHKFPHVDPLALRLLHRLLAFDPK 300Query301 DRPTAEEALADPYFYGLANVDREPSTQPIPKLEFEFERRKIMKEDVRELIYREILEYHPR 360DRP+AEEALADPYFYGLANVDREPSTQPIPKLEFEFERRK+ KEDVRELIYREILEYHP+Sbjct301 DRPSAEEALADPYFYGLANVDREPSTQPIPKLEFEFERRKLTKEDVRELIYREILEYHPQ 360Query361 MLQEYLRGGEQTSFMYPSGVDRFKRQFAHLEEHYGKGERSAPLQQRHASLPRERVPAPKE 420MLQEYLRGGEQTSFMYPSGVDRFKRQFAHLEE+YGKGE+ +PLQ++HASLPRERVPAPK+Sbjct361 MLQEYLRGGEQTSFMYPSGVDRFKRQFAHLEENYGKGEKGSPLQRQHASLPRERVPAPKK 420
Query421 ---------ENRPAATLATTPESPQSSQHEGSNYMNGMSQTGYSARSLLKSASISASKCI 471ENR A+L TT ESP +SQHEGS+Y NG SQ GYSARSLLKSASISASKCISbjct421 ENGSHNHDIENRSIASLVTTLESPPTSQHEGSDYRNGTSQQGYSARSLLKSASISASKCI 480Query472 GVKQRNQSEHGESNSDATDALSQKAAALHT 501G+K RN+SE+GESN+D DALSQK AALHTSbjct481 GMKPRNKSEYGESNNDTVDALSQKVAALHT 510Query甘蓝型油菜BnMPK9的氨基酸序列Sbjct拟南芥AtMPK9的氨基酸序列(BAA92223)表3为本发明的甘蓝型油菜BnMPK9蛋白与拟南芥AtMPK9的氨基酸序列的同源比较(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。
发明还包括甘蓝型油菜BnMPK9蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然甘蓝型油菜BnMPK9相关多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的甘蓝型油菜BnMPK9多肽时，可以将甘蓝型油菜BnMPK9编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成甘蓝型油菜BnMPK9蛋白表达载体。
如本发明所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。
还可用Northern印迹法和一步法RT-PCR法技术分析甘蓝型油菜BnMPK9基因产物的表达，即分析甘蓝型油菜BnMPK9的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。
此外，本发明还提供了一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有甘蓝型油菜BnMPK9核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码甘蓝型油菜BnMPK9相关的核酸分子。
本发明还提供了检测样品中是否存在甘蓝型油菜BnMPK9相关核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于甘蓝型油菜BnMPK9相关核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。
此外，根据本发明的甘蓝型油菜BnMPK9核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选甘蓝型油菜BnMPK9相关同源基因或同源蛋白。
为了得到与甘蓝型油菜BnMPK9相关基因相关的甘蓝型油菜cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选甘蓝型油菜cDNA文库，这些探针是在低严谨条件下，用32P对甘蓝型油菜BnMPK9相关的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自甘蓝型油菜的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。这种筛选方法可以识别与甘蓝型油菜BnMPK9相关相关的基因家族的核苷酸序列。
本发明的甘蓝型油菜BnMPK9相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH FreemanCo.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。
利用本发明的甘蓝型油菜BnMPK9蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与甘蓝型油菜BnMPK9相关发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。
本发明具有在抗各种环境胁迫具有明显的作用，能够明显降低在干旱、水淹和病虫害土地上种植的各种农作物在生物产量上的损失。干旱、水淹和病虫害能够造成大部分农作物如水稻、棉花、甘蓝型油菜和小麦等生长缓慢甚至死亡，从而使其明显减产甚至颗粒无收。我国存在大面积的干旱半干旱、盐碱半盐碱地区，及世界范围内也存在干旱半干旱、盐碱半盐碱地区，此外大面积的应用各种农药也严重污染环境，因此，本发明具有很大的应用价值。
具体实施例方式
下面结合实验室试验数据，以具体实施例来进一步阐述本发明说明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1甘蓝型油菜BnMPK9基因的克隆
1.组织分离(isolation)甘蓝型油菜(品种为“沪油15”)从市场上购得，将甘蓝型油菜置于28℃发芽24小时，然后播种于温室中，待甘蓝型油菜叶片为3-5片时，准备抽取DNA或RNA。
2.RNA的分离(RNA isolation)取部分组织，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(TRIzol Reagents，GIBCOBRL，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。
3.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)根据拟南芥AtMPK9基因的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(GibcoBRL试剂盒)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行(1)RT-PCRPCR[M901(SEQ ID NO.1)+M902(SEQ ID NO.2)]得到PCR产物(620bp)进行回收，连接到pGEMT-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知十字花科植物如拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtMPK9基因的同源性很高，故初步认为它是一个细胞分裂原激活的蛋白激酶基因。
(2)3’-RACEPCR[AP+M301(5’-ATAGAGCACCTGAGCTTCTG-3’)]得到M3’(875bp)，回收，连接到T-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知十字花科植物如拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtMPK9基因的同源性很高，故初步认为它是一个与MAPK相关基因。
(3).5’-RACE第一轮PCR[AAP+M501(5’-GCGTTCA(A/G)(C/G)AGAAGATTGCT-3’)]
第二轮PCR[(AUAP+M502(5’-TGGTGG(A/T)GGAAC(C/A)ACATCTC-3’)]得到M5’(约712bp)(过程同(1))将测序结果的重叠区拼接，发现得到的片段既是该基因的完整编码区。
BLAST的结果证明从甘蓝型油菜中新得到的基因确为一个与拟南芥AtMPK9相关的基因。
通过组合使用上述3种方法，获得了候选的甘蓝型油菜BnMPK9蛋白的全长编码序列(SEQ ID NO.3)。
实施例2甘蓝型油菜BnMPK9基因的序列信息与同源性分析本发明新的甘蓝型油菜BnMPK9全长cDNA的长度为1897bp，详细序列见SEQ IDNO.3，其中开放读框位于111-1613位核苷酸(1503个核苷酸)。根据全长cDNA推导出甘蓝型油菜BnMPK9的氨基酸序列，共501个氨基酸残基，分子量为57423.37道尔顿，等电点(pI)为8.57。详细序列见SEQ ID NO.3。
将甘蓝型油菜BnMPK9的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与拟南芥基因AtMPK9在核苷酸水平上具有90％的相同性，(附表2)；在氨基酸水平上，它与拟南芥基因AtMPK9(BAA92223)也有90％的相同性(附表3)。由此可见，甘蓝型油菜基因BnMPK9与拟南芥基因AtMPK9无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性。拟南芥基因AtMPK9(AB038694)已经被证明在脱水条件下明显增强表达，并发挥着重要的作用，可以认为甘蓝型油菜基因BnMPK9在抗逆方面也具有相似的作用。
实施例3甘蓝型油菜基因BnMPK9蛋白或多肽在酵母中进行真核细胞表达及转化酵母的抗逆性鉴定含目的基因(甘蓝型油菜基因BnMPK9基因)的表达载体的构建根据甘蓝型油菜基因BnMPK9的全长序列(SEQ ID NO.3)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将甘蓝型油菜基因BnMPK9基因cDNA克隆至表达载体(如pYES2.1)，进一步转化大肠杆菌TOP10或DH5α，在保证阅读框架正确的前提下鉴定表达载体，再利用LiAc法将其转化酵母INVSIC。
1.准备配制液体YPD培养基，1×TE，1×LiAc，1×LiAc/0.5×TE，变性的鲑鱼精DNA，包含该基因的pYES2.1载体，1×LiAc/40％/1×TE，不含尿嘧啶的培养基的筛选平板，以及其它试剂和器皿。
2.制备酵母感受态挑单克隆的酵母菌株到10ml的YPD培养基中，在摇床上30℃过夜。在OD600值为0.4时转入到50mlYPD培养基中摇2-4小时。
2500rpm下离心沉淀细胞，用40ml的1×TE重新悬浮。
再在2500rpm下离心沉淀细胞，用2ml的1×LiAc/0.5×TE重新悬浮细胞，在室温放置10min。
3.转化取100μl的酵母悬浮液，加入1μg已构建好的pYES2.1载体和100变性的鲑鱼精DNA，然后在30℃温浴30min。
加88μl DMSO，混匀，然后在42℃热激7min。
离心10s沉淀酵母细胞，除去上清液。然后用1ml 1×TE重新悬浮。
离心沉淀酵母细胞，用50-100μl 1×TE重悬。
4.筛选培养将上述重悬液平铺在筛选培养基平板上。
5.转化酵母的抗性鉴定挑单克隆的酵母菌株到10ml的YPD培养基中，在摇床上30℃过夜。在OD600值为0.4，取100μl的酵母分别稀释为1/3，1/9，1/27，1/81，1/243，然后依次取10μl点到含600mM甘露醇和0.4mM t-BuOOH的YPGR培养基平板上，30℃培养过夜。
含600mM甘露醇的YPGR培养基/升1％酵母抽提物，2％胰蛋白胨，2％琼脂，2％半乳糖，1％棉子糖，600mM甘露醇含0.4mM t-BuOOH的YPGR培养基/升1％酵母抽提物，2％胰蛋白胨，2％琼脂，2％半乳糖，1％棉子糖，0.4mM t-BuOOH鉴于编码BnMPK9，如拟南芥的AtMPK9基因已被证明在脱水条件下增强表达，而甘蓝型油菜基因BnMPK9转录水平与拟南芥的AtMPK9具有较高的同源性，可进一步对含甘蓝型油菜基因BnMPK9的转化酵母进行抗性鉴定。用600mM甘露醇和0.4mMt-BuOOH处理处理转化酵母后研究BnMPK9基因是否能够提高酵母的抗干旱和抗氧化的能力。酵母的生长结果证明，转化酵母BnMPK9在600mM甘露醇的培养基上生长量比对照处理多3个数量级；在0.2mM t-BuOOH的培养基上生长量比对照处理多一个数量级。这证明甘蓝型油菜BnMPK9基因确实能够提高真核细胞的抗旱和抗氧化的能力。而抗氧化的能力通常与植物的抗涝和抗病虫害的能力密切相关，故甘蓝型油菜BnMPK9基因具有更有效而广泛的抗逆境的功能，将可用于利用转基因技术改良植物抗旱耐涝和抗病虫害的研究和产业化生产中。
实施例4甘蓝型油菜基因BnMPK9在甘蓝型油菜中的拷贝数分析采用常规方法从甘蓝型油菜叶片中提取DNA(参考《分子克隆》，Sambrook等，1989)，分别用HindIII Xba I BamH和EcoR I酶切DNA[13μg(微克)/样品]后，将DNA转至杂交膜(尼龙膜)上后。使用Amersham Pharmacia公司Gene ImagesTMContents CDP-StarTMlabelling module(PRN3540)，我们将BnMPK9基因编码区标记为探针，然后进行杂交(于60℃杂交16小时)。取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于60℃漂洗3次，每次15分钟。转入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于60℃漂洗3次，每次同样15分钟。用X光片压片60-90分钟，然后显影、定影(方法参照Roche DIG labeled试剂盒说明书)。结果(Southern blot)发现在杂交膜上出现多条杂交带，说明甘蓝型油菜基因BnMPK9在甘蓝型油菜中是基因家族中的一员。
实施例5甘蓝型油菜BnMPK9基因在甘露醇、4℃低温、水杨酸和脱落酸ABA的不同时间处理的表达谱分析1.RNA的提取将生长了3-5片叶的甘蓝型油菜幼苗经200mM甘露醇、4℃低温和50μM水杨酸和脱落酸ABA处理0分钟、2分钟、5分钟、20分钟、1小时、2小时、6小时、12小时和24小时，然后按照华舜公司提供的RNA抽提试剂盒抽提RNA，并进行定量。
2.采用一步反应法定量进行表达分析，利用One Step RNA PCR Kit(TaKaRaBiotechnology Co.，Ltd)，具体操作按照试剂盒说明书进行。每个反应包括2.5μl10×0ne Step RNA PCR buffer，5μl 25mM MgCl2，5μl dNTP混合液，20U RNase抑制剂，0.5U AMV Rtase XL，0.5U AMV-Optimized Taq，特异引物1(5’-ATGAACAACGCCGGCGGCCA-3’)和特异引物2(5’-CTAAGCATATGTTGGATTGAGTGC-3’)各10μMol，各种时间处理的RNA 2μl，然后补充无RNase水到25μl。PCR反应条件如下50℃ 30分钟，94℃ 2分钟，然后进行94℃ 30秒，60℃ 30秒和72℃ 1分钟共30循环，最后72℃延伸5分钟。
3.反应结束后，取15μl PCR反应液在1％琼脂糖凝胶中进行电泳，5V/cm电压电泳1小时左右，在凝胶成像系统上观察DNA量。
定量RT-PCR结果显示，甘蓝型油菜BnMPK9在甘露醇和冷处理20分钟后启动表达，并达到最高峰，随后表达降低，但冷处理6小时后才达到最高峰；但H2O2处理中2小时后就达到最高峰随后降低。水杨酸能更快的启动BnMPK9的表达，即在2分钟就启动表达，并在1小时内达到最高峰随后降低。但脱落酸ABA负调控BnMPK9的表达。这些表达特点说明甘蓝型油菜BnMPK9是典型的信号传递蛋白，属于各种逆境处理早期表达基因，并启动各种与抗逆有关的基因的表达，提高植株的抗逆能力。
本发明涉及的序列及记号分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)长度23bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.1ATGGA(A/T/C/G)(A/T)C(A/T)GATCT(C/T)CA(C/T)CAA(A/G)T(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征
(A)长度23bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.2TA(A/T/C/G)GGAT(C/G)(A/T)GC(A/T/C)A(A/G)(A/T)GC(A/T/C/G)TCTTCSEQ ID NO.3的信息<110>上海交通大学<120>甘蓝型油菜细胞分裂原激活的蛋白激酶9蛋白编码序列<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1897<212>DNA<213>Brassica napus
<220>
<221>CDS<222>(111)..(1613)<400>1tcgaagaaga agaagaagaa gaagaagaag ctagaagatt cgcccttgtt agagatttcg 60atttgtctgg tttgaagcgc attagggttc caagaaggaa tcatattctt atg gat 116Met Asp1cct cat aaa aag gtt aca ctg gag acg gag ttc ttt aca gaa tac ggt 164Pro His Lys Lys Val Thr Leu Glu Thr Glu Phe Phe Thr Glu Tyr Gly5 10 15gaa gcg agt cgg tat cag atc caa gaa gtt ata ggg aaa gga agt tac 212Glu Ala Ser Arg Tyr Gln Ile Gln Glu Val Ile Gly Lys Gly Ser Tyr20 25 30ggg gtt gtg gca tct gca atc gac act cac acg gga gaa aag gtt gcc 260Gly Val Val Ala Ser Ala Ile Asp Thr His Thr Gly Glu Lys Val Ala35 40 45 50att aag aaa atc aat gat gtc ttt gag cac gtc tct gat gct acg agg 308Ile Lys Lys Ile Asn Asp Val Phe Glu His Val Ser Asp Ala Thr Arg55 60 65att ctg aga gag atc aag ctc ctc agg ctg ctc agg cat cct gat ata 356Ile Leu Arg Glu Ile Lys Leu Leu Arg Leu Leu Arg His Pro Asp Ile70 75 80gtg gag att aag cac gtt atg ctt cct cct tcg cgt aga gag ttc aga 404Val Glu Ile Lys His Val Met Leu Pro Pro Ser Arg Arg Glu Phe Arg
85 90 95gat att tat gtt gtt ttt gag ctc atg gag tca gac ctt cac caa gtc 452Asp Ile Tyr Val Val Phe Glu Leu Met Glu Ser Asp Leu His Gln Val100 105110atc aaa gcc aac gat gat ttg acc cct gag cat tac cag ttt ttc ttg 500Ile Lys Ala Asn Asp Asp Leu Thr Pro Glu His Tyr Gln Phe Phe Leu115 120125 130tac cag ctt ctc cgt ggc ctg aag ttt att cac aca gcc aat gtg ttt 548Tyr Gln Leu Leu Arg Gly Leu Lys Phe Ile His Thr Ala Asn Val Phe135140 145cac cgt gat tta aag cct aaa aac att cta gcc aac tct gat tgc aag 596His Arg Asp Leu Lys Pro Lys Asn Ile Leu Ala Asn Ser Asp Cys Lys150155 160ctg aag att tgc gac ttt gga ctt gca cgt gtg tcg ttt aac gat gca 644Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Val Ser Phe Asn Asp Ala165170 175cct tct gct ata ttc tgg act gac tat gtc gct aca aga tgg tac cgt 692Pro Ser Ala Ile Phe Trp Thr Asp Tyr Val Ala Thr Arg Trp Tyr Arg180 185 190gca cca gaa ctt tgt ggc tct ttc ttc tcc aaa tat act cct gcc att 740Ala Pro Glu Leu Cys Gly Ser Phe Phe Ser Lys Tyr Thr Pro Ala Ile195 200205 210gat ata tgg agc ata gga tgc ata ttt gca gaa atg ctc acc ggg aag 788Asp Ile Trp Ser Ile Gly Cys Ile Phe Ala Glu Met Leu Thr Gly Lys215220 225
cca ttg ttt cct ggg aag aac gtg gtg cac caa ttg gat att atg act 836Pro Leu Phe Pro Gly Lys Asn Val Val His Gln Leu Asp Ile Met Thr230 235240gat ttg ctt ggt act cct tca ccc gaa gcg atc tca agg atc cgt aat 884Asp Leu Leu Gly Thr Pro Ser Pro Glu Ala Ile Ser Arg Ile Arg Asn245 250255gaa aag gcg agg aga tat ctg ggc aac atg agg aga aaa ccg cca gtt 932Glu Lys Ala Arg Arg Tyr Leu Gly Asn Met Arg Arg Lys Pro Pro Val260 265 270cca ttc act cac aaa ttt cct cat gta gac ccg ttg gct ctt cgc ttg 980Pro Phe Thr His Lys Phe Pro His Val Asp Pro Leu Ala Leu Arg Leu275 280 285 290ctg cac cgc ctt ctt gca ttt gat ccc aaa gac cgt cct aca gct gaa 1028Leu His Arg Leu Leu Ala Phe Asp Pro Lys Asp Arg Pro Thr Ala Glu295300 305gag gca ctg gca gat cct tac ttt tat gga ctg gca aac gtg gat cgg 1076Glu Ala Leu Ala Asp Pro Tyr Phe Tyr Gly Leu Ala Asn Val Asp Arg310 315 320gaa cca tct act caa ccg att cca aaa ctt gag ttt gag ttt gaa aga 1124Glu Pro Ser Thr Gln Pro Ile Pro Lys Leu Glu Phe Glu Phe Glu Arg325 330 335agg aag att atg aaa gaa gat gtc agg gag tta atc tac aga gag ata 1172Arg Lys Ile Met Lys Glu Asp Val Arg Glu Leu Ile Tyr Arg Glu Ile340 345 350
tta gag tat cat cct cgg atg cta caa gaa tat ctt cga ggt gga gaa 1220Leu Glu Tyr His Pro Arg Met Leu Gln Glu Tyr Leu Arg Gly Gly Glu355 360 365 370cag acg agc ttc atg tac cct agt ggt gtt gat cgg ttt aag aga cag 1268Gln Thr Ser Phe Met Tyr Pro Ser Gly Val Asp Arg Phe Lys Arg Gln375 380 385ttt gca cat ctt gaa gaa cat tac ggt aag ggt gag aga agc gct cct 1316Phe Ala His Leu Glu Glu His Tyr Gly Lys Gly Glu Arg Ser Ala Pro390 395 400ctt caa caa cgc cac gct tct ttg cct aga gag aga gtc cct gcg cct 1364Leu Gln Gln Arg His Ala Ser Leu Pro Arg Glu Arg Val Pro Ala Pro405 410 415aag gaa gag aac aga cct gca gct act tta gcc acc aca ccc gaa agc 1412Lys Glu Glu Asn Arg Pro Ala Ala Thr Leu Ala Thr Thr Pro Glu Ser420 425 430cct cag agt tct caa cac gag ggc tca aat tac atg aat ggg atg agc 1460Pro Gln Ser Ser Gln His Glu Gly Ser Asn Tyr Met Asn Gly Met Ser435 440 445 450cag acg ggt tac agt gcc cgg agc ttg ctg aaa agt gcc agc atc agt 1508Gln Thr Gly Tyr Ser Ala Arg Ser Leu Leu Lys Ser Ala Ser Ile Ser455 460 465gca tct aaa tgc att ggc gtg aaa caa agg aac cag toc gag cac ggg 1556Ala Ser Lys Cys Ile Gly Val Lys Gln Arg Asn Gln Ser Glu His Gly470 475 480gaa tcg aac agt gat gca act gat gct ttg tct caa aag gcc gcg gct 1604
Glu Ser Asn Ser Asp Ala Thr Asp Ala Leu Ser Gln Lys Ala Ala Ala485 490 495ctc cac act tgattatgat gttggagagg ggagtgaaac tccttgctaa 1653Leu His Thr500tagtagggga tgatcatata cacatccctc acagggaaga aaacagaaga agagaagaga 1713tagcatgtgt ctctggttct ctgctgcata catttacgaa ctaatcttga taacttctga 1773aagacttgag atattgtctg aacaaaaaaa accttctacc ttcaactgtt ttcaatttgc 1833tcaacggttc aagttgtatg aaatgaatgg agtaatttaa ggcaaataaa aaaaaaaaaa 1893aaaa1897<210>2<211>501<212>PRT<213>Brassica napus<400>2Met Asp Pro His Lys Lys Val Thr Leu Glu Thr Glu Phe Phe Thr Glu1 5 10 15Tyr Gly Glu Ala Ser Arg Tyr Gln Ile Gln Glu Val Ile Gly Lys Gly20 25 30
Ser Tyr Gly Val Val Ala Ser Ala Ile Asp Thr His Thr Gly Glu Lys35 40 45Val Ala Ile Lys Lys Ile Asn Asp Val Phe Glu His Val Ser Asp Ala50 55 60Thr Arg Ile Leu Arg Glu Ile Lys Leu Leu Arg Leu Leu Arg His Pro65 70 75 80Asp Ile Val Glu Ile Lys His Val Met Leu Pro Pro Ser Arg Arg Glu85 90 95Phe Arg Asp Ile Tyr Val Val Phe Glu Leu Met Glu Ser Asp Leu His100 105 110Gln Val Ile Lys Ala Asn Asp Asp Leu Thr Pro Glu His Tyr Gln Phe115 120125Phe Leu Tyr Gln Leu Leu Arg Gly Leu Lys Phe Ile His Thr Ala Asn130 135140Val Phe His Arg Asp Leu Lys Pro Lys Asn Ile Leu Ala Asn Ser Asp145 150155 160Cys Lys Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Val Ser Phe Asn
165 170175Asp Ala Pro Ser Ala Ile Phe Trp Thr Asp Tyr Val Ala Thr Arg Trp180 185190Tyr Arg Ala Pro Glu Leu Cys Gly Ser Phe Phe Ser Lys Tyr Thr Pro195 200205Ala Ile Asp Ile Trp Ser Ile Gly Cys Ile Phe Ala Glu Met Leu Thr210 215 220Gly Lys Pro Leu Phe Pro Gly Lys Asn Val Val His Gln Leu Asp Ile225 230 235 240Met Thr Asp Leu Leu Gly Thr Pro Ser Pro Glu Ala Ile Ser Arg Ile245 250 255Arg Asn Glu Lys Ala Arg Arg Tyr Leu Gly Asn Met Arg Arg Lys Pro260 265 270Pro Val Pro Phe Thr His Lys Phe Pro His Val Asp Pro Leu Ala Leu275 280 285Arg Leu Leu His Arg Leu Leu Ala Phe Asp Pro Lys Asp Arg Pro Thr290295 300
Ala Glu Glu Ala Leu Ala Asp Pro Tyr Phe Tyr Gly Leu Ala Asn Val305 310 315 320Asp Arg Glu Pro Ser Thr Gln Pro Ile Pro Lys Leu Glu Phe Glu Phe325 330 335Glu Arg Arg Lys Ile Met Lys Glu Asp Val Arg Glu Leu Ile Tyr Arg340 345 350Glu Ile Leu Glu Tyr His Pro Arg Met Leu Gln Glu Tyr Leu Arg Gly355 360 365Gly Glu Gln Thr Ser Phe Met Tyr Pro Ser Gly Val Asp Arg Phe Lys370 375 380Arg Gln Phe Ala His Leu Glu Glu His Tyr Gly Lys Gly Glu Arg Ser385 390 395 400Ala Pro Leu Gln Gln Arg His Ala Ser Leu Pro Arg Glu Arg Val Pro405 4l0 415Ala Pro Lys Glu Glu Asn Arg Pro Ala Ala Thr Leu Ala Thr Thr Pro420 425 430
Glu Ser Pro Gln Ser Ser Gln His Glu Gly Ser Asn Tyr Met Asn Gly435 440445Met Ser Gln Thr Gly Tyr Ser Ala Arg Ser Leu Leu Lys Ser Ala Ser450 455 460Ile Ser Ala Ser Lys Cys Ile Gly Val Lys Gln Arg Asn Gln Ser Glu465 470 475 480His Gly Glu Ser Asn Ser Asp Ala Thr Asp Ala Leu Ser Gln Lys Ala485490 495Ala Ala Leu His Thr500
权利要求
1.一种甘蓝型油菜细胞分裂原激活的蛋白激酶9蛋白编码序列，其特征在于，所分离出的DNA分子，该分子包括编码具有甘蓝型油菜BnMPK9蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且该核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第111-1613位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者该核苷酸序列能与SEQ ID NO.3中从核苷酸第111-1613位的核苷酸序列杂交。
2.根据权利要求1所述的甘蓝型油菜BnMPK9蛋白编码序列，其特征是，所述的编码序列具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽，或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
3.根据权利要求1或2所述的甘蓝型油菜BnMPK9蛋白编码序列，其特征是，所述的编码序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸第111-1613位的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的甘蓝型油菜BnMPK9蛋白编码序列，其特征是，所述的甘蓝型油菜BnMPK9蛋白质活性的多肽，是分离出的包含细胞分裂原激活的蛋白激酶甘蓝型油菜BnMPK9蛋白质活性的多肽，它包括具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽，该多肽是具有SEQ ID NO.3序列的多肽。
5.根据权利要求1所述的甘蓝型油菜BnMPK9蛋白编码序列，其特征是，所述的DNA分子，它包含在本发明所提供的一种载体，该载体是一种核酸分子，它包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。
6.根据权利要求1或5所述的甘蓝型油菜BnMPK9蛋白编码序列，其特征是，用所述的DNA分子转化的宿主细胞，它是真核细胞。
全文摘要
一种用于基因工程技术领域的甘蓝型油菜细胞分裂原激活的蛋白激酶9蛋白编码序列，包括编码具有甘蓝型油菜BnMPK9蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第111－1613位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能与SEQ ID NO.3中从核苷酸第111－1613位的核苷酸序列杂交。本发明在植物抗旱病虫害等不良环境胁迫具有明显的作用，具有很大的应用价值，能够明显减少农作物在干旱半干旱、病虫害等不良环境条件下生物产量的损失。
文档编号C12N15/29GK1594569SQ20041002568
公开日2005年3月16日 申请日期2004年7月1日 优先权日2004年7月1日
发明者余舜武, 唐东芹, 张利达, 左开井, 唐克轩 申请人:上海交通大学