专利名称：一种芯片原位聚合酶链反应检测目标基因的方法
技术领域：
本发明涉及种芯片原位聚合酶链反应检测目标基因的方法，具体地讲是一种在基因芯片表面上进行原位聚合酶链反应(PCR)对目标基因进行检测的方法。
背景技术：
基因芯片是指将大量基因探针分子固定于固体支持物(如硅片、玻璃、塑料和尼龙膜等)上，然后与标记的样品进行杂交，反应结果用荧光法、酶标法、同位素法检出，再用扫描仪等仪器进行数据采集，最后用计算机软件进行数据分析，利用该技术可将大量的基因探针同时固定于支持物上，所以一次可对大量核酸分子进行检测分析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术操作复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、效率低等不足。目前，该技术应用领域主要有基因表达谱分析、新基因发现、基因突变及多态性分析、基因组文库作图、疾病诊断和预测、药物筛选、基因测序等。
目前用基因芯片来分析检测样品，待测样品与芯片杂交之前都必需进行扩增和标记，通过扩增来实现对待测基因片段的长度的降低和待测量的增加，一般用于基因芯片检测的片段长度都在200-300个碱基左右，而对于大片段和探针的杂交，由于其二级结构的存在而影响了其和探针的有效结合，因而对大片段的检测一直是基因芯片这种检测手段的一个技术难题。目前国内有报道用机械打碎或非限制性酶切来降低片段的长度，但这两种方法操作复杂，并且由于是对目的片段的随机打断故重现性不好，因此都不能从根本上解决对大片段目的基因的检测问题。国内张先恩等发明的一种固相载体上校读PCR检测基因突变的方法(申请号01133630.7)提出利用一对外引物和内引物对待测基因进行固相PCR检测，是以临床样品或以引物扩增产物为模板。直接以临床样品为模板，在固相PCR反应中相应存在内引物和外引物相互竞争的问题而影响了PCR的扩增效率；以外引物的扩增产物为模板然后在进行固相PCR反应，实际上还是需要了样品杂交前的预扩增，因此也不是一种十分理想的检测方法。而且采用巯基硅烷化修饰玻片，商品化的这种玻片十分少，给这种方法的应用推广带来了难度。
发明内容
本发明就基因芯片中大片段与核酸探针的杂交提出了一种新的检测方法—芯片原位PCR法对目标基因进行检测，从而实现了样品的处理、标记的同步化和原位检测，既省去了以往基因芯片检测前样品的扩增、标记又解决了大片段待测基因样品和探针的杂交问题，是基因芯片杂交技术中的一种突破。
本发明采用如下技术路线根据目标基因设计一对特异性引物，上游引物的5’端连接有15-20个碱基长的多聚胸腺嘧啶(polyT)结构，这种上游引物的5’端再经氨基修饰后点于醛基修饰的玻片上，然后以待测样品的基因组脱氧核糖核酸(DNA)为模板，在芯片上进行原位PCR反应，利用DNA聚合酶的特异性来实现对特定目的片段的扩增，在引物延伸过程中加入地高辛标记的dUTP，随后采用传统酶标技术对延伸产物进行检测，使检测结果通过底物颜色呈现于尼龙膜或硝酸纤维膜表面，检测结果可直接目测或用廉价的光学扫描仪读取数据。利用本方法可以实现对多位点的同步检测，也可以用于对多个SNP位点的检测。
本发明的实验过程如下引物设计遵循各个引物的退火温度(Tm值)大致相等的原则，用PrimerPremier5.0软件设计引物，每个待测基因设计一对引物。芯片的制备上游引物5’端氨基修饰且连有15-20个碱基长的poly(T)的臂结构，通过Cartesian microarray制作系统点阵于醛基修饰载波片(购于基因公司)表面，室温下固定48-72h。
芯片上的原位PCR反应配制PCR反应混合液，在混合液中加入地高辛标记-dUTP，混合液滴加于芯片方阵上，用Sigma公司司产的盖片(coverwell)封片，然后置于PCR仪内反应。
芯片的洗脱及显色PCR结束后，用洗液摇洗去除游离成份及非特异性杂交分子，然后和抗地高辛抗体(anti-digoxigenin-AP)反应，滴加显色液(NBT/BCIP Stock Solution)并盖膜使其显色于膜上。
图1本发明—芯片原位PCR检测目标基因方法的原理图(1)加入目标基因后，目标基因和芯片上固定的特异性引物探针进行杂交反应；(2)目标基因和特异性探针能够互补配对就能进行延伸反应而被检测到，而和探针不匹配的目标基因就不能延伸，因而无信号出现。
图2用本发明方法对质粒pCAMBIA1301检测，对其所含的GUS、35S、hptII、aadA基因检测的结果图。位点2、4是阴性对照，位点1、3、5、6分别对应于GUS、35S启动子、hpt、aadA基因，位点7是阳性对照。
具体实施实例实施实例1利用本发明提供的方法探讨了对转基因植物中常用的质粒载体pCAMBIA1301的检测，对质粒中含有的4个基因GUS、35S启动子、hpt、aadA做出了初步的检测。运用的芯片原位PCR方法，减少了传统芯片检测前的样品的扩增和标记步骤，能够一步实现对质粒pCAMBIA1301中的4个基因的检测，在检测时间上大大缩短，又克服了多步PCR的繁琐，为以后用生物芯片对转基因水稻以及转基因植物的全面检出提出了一种可行性方法。具体检测步骤是1、引物设计针对在转基因水稻中常出现的35S启动子、报告基因hpt、aadA、GUS基因的保守序列，遵循各个引物的退火温度(Tm值)大致相同的原则，用Primer Premier5.0软件设计引物，序列如下
2、芯片的制备上游引物5’端氨基修饰且连有16个碱基长的poly(T)的臂结构，将上游引物用去离子水溶解(吸光值2O.D+40ulH2O)，并与点样缓冲液(ArrayIt公司2×点样缓冲液spotting solution)等体积混合，通过Cartesian microarray制作系统点阵于醛基修饰载波片表面，室温下固定72h。
3、芯片上的原位PCR反应PCR扩增体系如下试剂 每份用量10×缓冲液 1.5uldNTP(5∶2)(2.5mM) 1.2uldig-dUTP 0.5ul模板(15ng/ul) 1.5ul引物(reverse，10pmol/ul) 1ul×4Taq酶(1U/ul) 1ulH2O 5.3ul总体积 15ul取PCR混合液50ul滴于芯片方阵上，然后用coverwell封片，置于PCR仪上采用如下程序进行循环94℃预变性4min，94℃变性1min-58℃退火1min-72℃延伸30s，共10个循环，最后72℃延伸5min。
4、芯片的洗脱及显色PCR结束后，去除coverwell后置于洗液I(0.1×SSC 0.1％SDS)中室温摇洗10-30分钟，洗液II(100mM顺丁烯二酸(maleic acid)、150mM NaClPH7.5、0.3％(v/v)Tween 20)摇洗5分钟，吸干洗液后于方阵上滴加15-20ul抗体，盖上盖玻片后避光室温反应30分钟。最后经洗液II、检测缓冲液冲洗、吸干后，滴加显色液并盖膜使其显色于膜上，室温避光显色30min-2h。
权利要求
1.一种芯片原位PCR检测目标基因的方法，其特征在于根据目标基因设计一对特异性引物，上游引物的5’端连接有15-20个碱基长的多聚胸腺嘧啶结构，这种上游引物的5’端再经氨基修饰后点于醛基修饰的玻片上，然后以待测样品的基因组脱氧核糖核酸为模板，在芯片上进行原位PCR反应，利用DNA聚合酶的特异性来实现对特定目的片段的扩增，在引物延伸过程中加入地高辛标记的dUTP，随后采用传统酶标技术对延伸产物进行检测，使检测结果通过底物颜色呈现于尼龙膜或硝酸纤维膜表面，检测结果可直接目测或用廉价的光学扫描仪读取数据，从而实现样品的处理、标记同步化和原位检测。
2.按权利要求1所述的一种芯片原位PCR检测目标基因的方法，其特征在于包括如下步骤(1)引物设计遵循各个引物的退火温度(Tm值)大致相同的原则，用PrimerPremier5.0软件设计引物，一个目标基因设计一对引物；(2)芯片的制备上游引物5’端氨基修饰且连有15-20个碱基长的polyT的臂结构，通过Cartesian microarray制作系统点阵于醛基修饰载波片表面，室温下固定48-72h；(3)芯片上的原位PCR反应PCR混合液滴于芯片方阵上，用盖片封片，然后置于PCR仪内反应；(4)芯片的洗脱及显色PCR结束后，用洗液摇洗去除游离成份及非特异性杂交分子，然后和抗地高辛抗体反应，滴加显色液并盖膜使其显色于膜上。
3.按权利要求1或2所述的一种芯片原位PCR检测目标基因的方法，其特征在于用于质粒载体pCAMBIA1301的检测的具体步骤是(1)引物设计遵循各个引物的退火温度(Tm值)大致相同的原则，用PrimerPremier5.0软件设计引物，序列如下
(2)芯片的制备上游引物5’端氨基修饰且连有16个碱基长的polyT的臂结构，将上游引物用去离子水溶解并与点样缓冲液等体积混合，通过Cartesian microarray制作系统点阵于醛基修饰载波片表面，室温下固定72h；(3)芯片上的原位PCR反应PCR扩增体系如下试剂 每份用量10×缓冲液1.5uldNTP(5∶2)(2.5mM) 1.2uldig-dUTP 0.5ul模板(15ng/ul) 1.5ul引物(reverse，10pmol/ul) 1ul×4Taq酶(1U/ul) 1ulH2O 5.3ul总体积15ul取PCR混合液50ul滴于芯片方阵上，然后用coverwell封片，置于PCR仪上采用如下程序进行循环94℃预变性4min，94℃变性1min-58℃退火1min-72℃延伸30s，共10个循环，最后72℃延伸5min；(4)芯片的洗脱及显色PCR结束后，去除coverwell后置于0.1×SSC 0.1％SDS洗液I中室温摇洗10-30分钟，100mM顺丁烯二酸、150mM NaCl PH7.5、0.3v/v％Tween20洗液II摇洗5分钟，吸干洗液后于方阵上滴加15-20ul抗体，盖上盖玻片后避光室温反应30分钟；最后经洗液II、检测缓冲液冲洗、吸干后，滴加显色液并盖膜使其显色于膜上，室温避光显色30min-2h。
4.按权利要求3所述的一种芯片原位PCR检测目标基因的方法，其特征在于所述的上游引物用去离子水溶解的吸光值2O.D+40ulH2O。
全文摘要
一种利用基因芯片的检测方法，是在芯片表面进行原位PCR反应对待测基因进行检测的方法。将普通PCR反应中的上游引物连接poly(T)的臂结构后，5’端氨基修饰后连接于醛基修饰的玻片等载体上，在芯片表面上进行的一种芯片原位PCR反应。利用本发明能有效解决目前基因芯片杂交中小片断探针和待测大片段不能有效杂交的问题，实现了样品处理和标记同步化和原位检测。本发明可用于SNP检测、转基因植物检测、疾病检测等方面。
文档编号C12Q1/68GK1557964SQ20041001601
公开日2004年12月29日 申请日期2004年1月19日 优先权日2004年1月19日
发明者赵建龙, 高秀丽, 杨剑波, 景奉香 申请人:中国科学院上海微系统与信息技术研究所, 中国科学院上海微系统与信息技术研究