耐放射性异常球菌海藻糖合成酶基因及海藻糖制造方法

专利名称：耐放射性异常球菌海藻糖合成酶基因及海藻糖制造方法
技术领域：
本发明涉及一种海藻糖的制备方法，特别是利用生物技术获得的酶用于制造海藻糖的方法。
背景技术：
海藻糖，更确切地说是α，α-1，1-海藻糖是由两分子葡萄糖以α，α-1，1-糖苷键相连而成。海藻糖是一种天然性二糖，广泛地存在于微生物、虾类、酿酒酵母、蘑菇及各种真菌、昆虫、植物等。但含量甚微。过去主要是从干酵母中提取。由于含量低，提取过程较复杂，成本极高。如此昂贵的海藻糖只能局限于某些特殊领域如医学生物制品的活性保持的应用。随着人类社会的发展和进步，要求将海藻糖应用于各类食品的鲜味保持与质地改善的趋势越来越明显，因此必须要尽快地找到廉价而高效的海藻糖制造方法。
株式会社林原生物化学研究所在中国专利CN1106065A(1995年)中讲述了一种海藻糖制造方法。该法从Pimelobacter、Psceudomonas和Thermus三种菌属中分离纯化了海藻糖合成酶(TRES)，该酶能够以麦芽糖为原料制成海藻糖。这为廉价制造适合应用于食品、农业等需量大的领域的低价位海藻糖产品提供了极大的可能性。1996年，株式会社林原生物化学研究所的K.Tsusaki等人披露了克隆自Pimelobacter sp R48和Thermus aquaticus的海藻糖合成酶基因的DNA(脱氧核糖酸)序列及其构成该酶的氨基酸序列(K.Tsusaki，etal.1996，Biochim.Biophys，Acta，12901-3；K.Tsusaki，etal.1997，Biochim.Biophys.Acta，133428-32)。2000年，De Smet等人通过生物信息学的方法从测序完成的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis CDC1551)的基因组中分离，鉴定了海藻糖合成酶基因(K、A、L、De Smet etal.2000，Microbiology，146199-208)。发现它与来自Pimerlobacter sp R48的TRES在组成该酶的氨基酸序列有70％的同源性，而DNA水平上的同源性为69％，分离自Thermus aquaticus(水栖嗜热菌)的TRES是一种大分子酶蛋白，由963个氨基酸的单键多肽组成。Thermus aquaticus的与Pimerlobacter sp R48的TRES的氨基酸序列的同源性是55％，而DNA的同源性是36.4％。来自Thermus caldophilus GK24的TRES与Thermus aquaticus的非常相似。它由965个氨基酸组成，两者的氨基酸同源性为99％，DNA的同源性为98.9％，很可能是在进化进程中基因平移(genelateral transfer)造成的结果。
另外，通过检索，还查到有关海藻糖合成酶的一些科技文献1、中国专利<申请号>99816517<<发明名称>海藻糖合酶蛋白质、基因、质粒、微生物和生产海藻糖的方法<申请人>第一制糖株式会社，韩国汉城<文摘>本发明涉及生产海藻糖的微生物和生产海藻糖的方法。本发明还涉及新的海藻糖合酶蛋白质、海藻糖合酶基因、携带所述海藻糖合酶基因的重组质粒以及用所述重组质粒转化的微生物。
2、中国专利<申请号>01100417<发明名称>海藻糖基水解酶及其制备和用途<申请人>中国科学院微生物研究所，北京市海淀区中关村北一条13号<文摘>本发明公开了一种新型嗜酸耐热海藻糖基水解酶及其制备和用途，该酶可以从埃希氏菌属、芽孢杆菌属、酵母属的微生物中获得，能够在高温酸性条件下高效水解具有海藻糖结构作为一个末端单位且葡萄糖聚合度为3或更高的非还原多糖中，海藻糖部分和其余糖基部分之间的键。该酶分子量约55000到65000道尔顿；等电点约为5.5到6.6。该酶很容易通过微生物发酵大量制备，并用于工业化制备海藻糖。该海藻糖可广泛地用于食品、化妆品和药品组合物中。
3、中国专利<申请号>01123521<发明名称>新型嗜酸耐热海藻糖基合成酶及其制备和用途<申请人>吴襟，北京市海淀区中关村北一条13号<文摘>本文公开了一种新型嗜酸耐热海藻糖基合成酶及其制备和用途，该酶从埃希氏菌属、酵母属的微生物中获得，能够在高温酸性条件下不需海藻糖为底物，而利用还原性淀粉部分水解物，高效合成具有海藻糖结构作为末端单元的非还原性淀粉糖。该酶分子量约75000到85000道尔顿；等电点约为6.2到7.2。该酶很容易通过微生物发酵大量制备，并用于工业化制备非还原性淀粉糖和海藻糖。该非还原性淀粉糖和海藻糖可广泛地用于食品、化妆品和药品组合物中。
4、透性化细胞海藻糖合酶特性的研究作者薛璐 马莺机构哈尔滨工业大学生命科学与工程系，东北农业大学食品学院，刊名食品科学.2003，24(3).关键词海藻糖 透性化细胞海藻糖合酶 酶学特性文摘海藻糖是一种新型食品添加剂，目前多以微生物酶法生产。海藻糖合酶是近年来新发现的一种海藻糖合成酶。本文研究了经渗透细胞技术处理得到的透性化细胞海藻糖合酶的酶学特性。结果表明，该细胞酶的反应最适温度为35℃，最适pH7.4，Mg^2+及K^+对该细胞酶有明显激活作用，Zn^2+，Mn^2+及Cu^2+则可强烈地抑制酶活力。该酶对底物特异性极强，能特异性地将麦芽糖转化为海藻糖。
5、海藻糖微生物酶法合成机制的研究作者王绍校 吴襟 高春霄 陈萌 蔡同一 张树政机构中国科学院微生物研究所，中国农业大学食品学院刊名微生物学通报.2003，30(2).关键词海藻糖 麦芽寡糖基海藻糖合酶 麦芽寡糖基海藻糖海藻基水解酶 淀粉 微生物酶法合成 二糖文摘来源于嗜酸热古菌芝田硫化叶菌(Sulfolobus shibatae)B12的麦芽寡糖基海藻糖合酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖海藻糖水解酶(MTHase)基因在大肠杆菌中获得表达。将获得纯化的两个酶，分别以麦芽寡糖和淀粉为转化底物，在pH5.5，60℃条件下合成海藻糖。从反应产物分析结果可知，两个酶合成海藻糖时能利用的最小底物是麦芽四糖，海藻糖产率与麦芽寡糖链长正相关。同时还发现两个酶都具有轻微的□-1，4-葡萄糖苷酶活性，能在麦芽寡糖还原末端水解□-1，4糖苷键，生成葡萄糖分子，其反应最小底物分别是麦芽三糖和四糖。推测海藻糖合成酶可能有两个不同的催化活性中心。
6、酿酒酵母海藻糖合成酶基因的克隆和在大肠村菌中的表达作者杨波 戴秀玉等机构中国科学院微生物研究所，刊名遗传学报.2001，28(4).关键词TPS1基因 海藻糖 PCR克隆 表达 酿酒酵母 海藻糖合成酶文摘用PCR方法克隆了1.5kb的酿酒母Sacchromycescerevisiae海藻糖合成酶基因TPSI，将该片段连接到pUC19载体，通过转化分别引入海藻糖合成酶基因缺失和缺陷的大肠杆菌Escherichia coli FF4169和FF4050，对转化株的质粒DNA酶切分析表明均含有1.5kb PCR克隆片段，生长曲线实验证明，带有克隆片段的转化株在含0.5mol/L NaCl的高渗透压基础培养基中生长良好；用高效液相色谱(HPLC)结合蒸发散射(ELSD)技术测定细胞内海藻糖实验证明转化株能够合成海藻糖。
7、HPLC/RI与HPLC/ESI-MS方法研究细菌D-97酶合成海藻糖的过程作者荣绍丰 戴军等机构江南大学生物工程学院，中国发酵工业协会功能性低聚糖检测室，刊名色谱.2002，20(3).关键词细菌D-97酶合成 高效液相色谱 示差折光检测 电喷雾电离质谱 海藻糖 寡糖 定性分析 胞内酶 定量分析文摘通过高效液相色谱/示差折光检测系统(HPLC/RI)分析可获得细菌D-97利用糊精或淀粉水解物合成海藻糖的基本生物学信息，包括微生物培养碳源对细菌D-97胞内海藻糖合成酶系的影响以及该酶系利用不同种类或不同分子链长度的麦芽寡糖合成海藻糖的能力及作用过程。采用HPLC与RI及电喷雾电离质谱(ESI-MS)联用并结合其他生物学手段对由细菌D-97获得的纯酶组分(酶A)作用产物进行定量和定性分析，从而基本明确了D-97胞内合成海藻糖的过程。
8、肠杆菌海藻糖合成酶基因的克隆和表达作者戴秀玉 吴大鹏机构中国科学院微生物研究所，刊名遗传学报.2000，27(2).关键词OtsBA基因 海藻糖 细胞内克隆 抗逆性 作物育种文摘利用Mu转座子细胞内克隆了大肠杆菌海藻糖合成酶ots BA基因，克隆频率为1.45×10-3/KanΓ转导子。经遗传互补、酶切和部分序列分析表明ots BA基因位于克隆质粒。亚克隆2.87kb的DNA片段到表达质粒并分别转化大肠杆菌ots BA基因缺失菌株，转化菌株恢复在0.5mol/L NACI培养基上生长的功能，高渗透压诱导实验表明，转化株能够合成海藻糖。
这些公开文献虽然给出了一些通过微生物分离及克隆到与海藻糖合成相关的酶及技术方案，然后把这些酶用于制备海藻糖，但这些海藻糖合成酶的菌种来源不同，DNA序列和氨基酸序列相差甚远，酶活力不同，目前大部分还没有得到应用。

发明内容
本发明人在分析上百种微生物的基因组时，发现可以用生物信息学的方法在一系列未注释的脱氧核糖核酸中发现非常有用的信息。结合基因的克隆和异源基因表达技术，以及通过对表达的蛋白质进行特性特征鉴定，发现了在蛋白质的序列数据库Genbank中注释为“未知蛋白”或“推测是蛋白质”的极为有用基因，其中包括至今为止人们并未发现的海藻糖合成酶基因(treS)，并用这种合成酶基因经过克隆和培养，在麦芽糖浆或淀粉浆中用于制备得到产率极高的海藻糖。
本发明是这样实现的本发明所述的海藻糖合成酶基因选自耐放射性异常球菌(Deinococcus radiodurans)。该菌种可以从微生物中心购买，也可以通过野外采集和其他途径获得。
从耐放射性异常球菌(Deinococcus radiodurans)克隆得到的海藻糖合成酶具有以下特征1、分子量为62.8kD2、等电点约为PI＝4.93、酶的最适反应温度为30～37℃4、酶的反应的pH在6.5～8.5，优选pH为7.0～7.55、当Cu2+，Zn2+，Mn2+，Mg2+，Ca2+等二价金属离子的浓度在5ppm时，该酶的活力不受影响。
6、酶对底物的转化率会随着反应温度的提高而逐渐降低，例如在60℃反应的底物转化率要比在30℃的转化率低40％以上。
7、海藻糖合成酶在以麦芽糖浆为底物时，可催化底物生成40～70％的海藻糖。
8、该海藻糖合成酶在以麦芽糖为底物时，除了催化生成海藻糖外，还合成高达5～15％的葡萄糖。
7、葡萄糖对该酶的转化率有较强的抑制作用，即葡萄糖存在时会影响海藻糖生成量。
本发明的海藻糖合成酶基因制备海藻糖的方法，包括以下工艺步骤1)对选定的菌种接种进行扩大培养；2)从获得的扩大菌种中克隆海藻糖合成酶基因(Tres)；3)将海藻糖合成酶基因(Tres)在大肠杆菌中表达；4)收集重组海藻糖合成酶；5)以麦芽糖浆或淀粉浆为原料，用重组的海藻糖合成酶制造海藻糖，。
在上述5)中，所述的淀粉浆可以选用玉米淀粉、大米淀粉、小麦淀粉、木薯淀粉、马铃薯淀粉、红薯淀粉与水配成的淀粉溶液，优选大米淀粉和木薯淀粉。
在以上所述的海藻糖合成酶基因制备海藻糖的方法中，对选定的菌种接种进行扩大培养的工艺是将耐放射性异常球菌Deinococcus radiodurans接种于以下原料液体培养基中(克/升)葡萄糖5，酵母粉(yeast extract)5，蛋白胨(peptone)10，氯化钠(NaCl)5，pH7.4，然后在28-30恒温摇床上振荡18-36小时，于5000rpm离心10分钟收集菌体。
在以上所述的海藻糖合成酶基因制备海藻糖的方法中，从所获得的扩大菌种中克隆海藻糖合成酶基因(Tres)的工艺是先设计以下引物；1、上游引物(Sense primer)5-GAGCCATGGCCCAGGCACACCCGGAGTGGT-3；2、下游引物(Antisense Primer)5-TGGTCTCTGCAGTCAATTCAACCGCAGCCAGTAATAG-3，然后用聚合酶链式反应(PCR)技术获得目的基因，然后用Takara的专用试剂盒对PCR产物进行初步纯化，然后用NcoI和PstI对PCR产物进行双酶切，再与同样用NcoI和PstI酶切过的pSE380质粒连接，得到重组质粒pSE380-treS。
在以上所述的海藻糖合成酶基因制备海藻糖的方法中，将海藻糖合成酶基因(Tres)在大肠杆菌中表达的工艺是制备大肠杆菌BL21的感受态细胞，然后用pSE380-treS转化BL21感受态细胞，于30～37℃培养10～16小时，然后加入IPTG至终浓度为0.5mM，再继续于28～32℃培养24～36小时。离心收集菌体后，即可进行细胞破碎和重组海藻糖合成酶的提取和底物转化试验。
在以上所述的海藻糖合成酶基因制备海藻糖的方法中，收集含有重组海藻糖合成酶的工艺是将转化试验合格的大肠杆菌菌体接种到500ml的下述培养基中氨苄青霉素50μg/ml，葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠3g/L。在33℃培养13小时，然后用2×500ml种子接种到含20升同样培养基的40升发酵罐中。在33℃，200rpm，通风量为0.9vvm的条件下发酵培养15小时。然后加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导。再继续培养17小时即终止。于5000rmp离心10分钟以收集菌体。用等体积的去离子水洗涤细胞一次，同样条件离心后重悬于二分之一体积的细胞破碎液液(含有3mg/ml溶菌酶，1％ Triton-X100，0.05mMEDTA，用pH为6.9的磷酸缓冲液配制)中，在37℃振荡反应20小时，然后在45℃水浴中处理2小时。于3000g离心15分钟，收集上清液得到重组海藻糖合成酶。
在以上所述的海藻糖合成酶基因制备海藻糖的方法中，用重组海藻糖合成酶制造海藻糖的工艺是以麦芽糖浆或淀粉浆为原料，先加去离子水兑成含30％的溶液。取100升置于200升容积的不锈钢反应罐中，加入磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配成的缓冲液，使该缓冲液的终浓度为5mM，pH为6.9左右。取上述第1步中制得的海藻糖合成酶10升，加入到100升30％麦芽糖浆或淀粉浆中，然后在25-30℃条件下反应24-36小时。用高效液相色谱仪(HPLC)如安捷伦Agilent 1100型对反应液进行测定其海藻糖含量。
以下给出本发明海藻糖合成酶的研究过程及制备方法本发明人在研究海藻糖合成酶的过程中，对耐放射性异常球均Deinococcus radiodurans的基因组序列中的一段在Genbank中标记为“假定海藻糖合成酶基因”(putative trehalose synthase)的基因作了深入细致的研究。发现这一段DNA序列与已发表的海藻糖合成酶基因有较高的同源性，其DNA序列的平均同源性接近50％，而其编码的假定的蛋白质的氨基酸序列与已发表的海藻糖合成酶、糖苷酶、淀粉酶家族蛋白的氨基酸同源性平均相差不大，一般57％，很难通过氨基酸序列确定其为何种酶。
本发明人用基因克隆方法，包括众所周知的聚合酶链式反应(PCR)技术、酶切、连接等把这一段标记为“假定蛋白质”(hypothetical protein)克隆到质粒上，例如pGEM-3zf，pUC19等专用于克隆的商品质粒上，然后再转移到诸如pET5a、pSE380等表达质粒上，再通过已成熟的质粒转化技术，例如通过制备细胞膜的通透性大为增加的大肠杆菌感受态细胞等技术，把质粒导入到大肠杆菌中。后者在培养生长过程中就会把此段DNA所含的信息翻译成为某种蛋白质，而其DNA序列也一一对应于该种蛋白质的氨基酸序列。宿主大肠杆菌在一定生长条件下，特别是在有“诱导物”如IPTG、半乳糖、乳糖等存在的情况下，会大量地合成该种蛋白质。
经过细胞破碎，例如利用溶菌酶、超声波或机械碾磨法等破碎细胞后，可以对该段DNA所编码的蛋白质进行特性特征研究，特别是鉴别出这段DNA所编码的蛋白质是一种什么东西？是一种酶还是结构蛋白质？如果是酶，又是一种什么酶？发明者经过基因克隆，外源基因表达，表达产物的提取和纯化，以及将目标基因产物进行酶学研究等多种复杂的实验步骤，证实这一段“假定蛋白质”编码的是一种特性特征与前人发现的完全不同的海藻糖合成酶。这些不同的特性特征包括了氨基酸序列和DNA序列的不同，酶的分子大小不同，酶的最适反应温度不同，酶的最适pH，反应条件的不同以及酶对底物麦芽糖转化为海藻糖比例的差异等特性，因此判定是一种新的发现。
本发明所述的海藻糖合成酶的基因是耐放射性异常球菌，拉丁学名是Deinococcusradiodurans。该种细菌能够耐受高剂量的放射性辐射，这可能和它含有较高的海藻糖有关。通过本发明才知道该细菌还含有编码海藻糖合成酶基因，并且能产生海藻糖合成酶，该酶在天然的耐放射性异常球菌中是一种胞内酶，需要用细胞破碎的方法才能检查到；在天然菌中该酶的含量也非常低，经过高达500～800倍浓缩都不一定检验到海藻糖合成酶的活力。而应用基因重组菌来表达本发明所述的海藻糖合成酶基因。可以使酶的活力比天然菌株高数千倍。
编码本发明所述的海藻糖合成酶的基因(treS)是一段以前未知的DNA片段，长度为1659个碱基对，编码552个氨基酸。基因的碱基组成是表1 耐放射性异常球菌Deinococcus radiodurans的海藻糖合成酶基因的碱基组成

表2.克隆自D.radiodurans的海藻糖合成酶基因全序列和氨基酸序列D.radiodurans海藻糖合成酶基因的DNA序列ATGACCCAGG CACACCCGGA GTGGTACAAG AGCGCTGTCT TCTACGAACT GTCCGTGCGG ACCTTTCAGGACGGCAACGG CGACGGCAAG GGCGATTTTC CCGGCCTGAC CTCGCGGCTG GACTACCTGA AAAACCTCGGCGTGGACTGC CTGTGGTTGC TGCCCTGGTT TCCCAGCCCA CTGCGCGACG ACGGGTACGA CGTGGCCGACTACCGGGGGA TTCACCCTGA CCTCGGCACG CTCGACGACT TCAAGGTCTT TCTGCGCGAA GCCCACGCCCGGGGCCTGCG GGTCATCGGC GACCTGGTGA CCAACCACAC GTCCAGCGAC CACCCCTGGT TTCAGGCGGCGCGGCGCGGC CCGACCCTGC CCGACGGCTC GCCCAACGAG TACCACGACT ACTACGTCTG GAGCGACGAGGGCAAGGAAT ACGCCGACAC CCGCATCATC TTCACCGACA CCGAGGTCAG CAACTGGACG CTCGACGAGCAGGCAGGCAA GTATTACTGG CACCGCTTTT TCGCCAGCCA GCCGGACCTG AACTACGACA ACCCGAAAGTGGTGGAAGAA CTTCACGGCG CCGCCCGCTT CTGGCTCGAC CTCGGCCTCG ACGGGTTCCG GGTGGACGCCGTGCCCTACC TCATCGAGCG CGAGGGCACG AGCTGCGAGA ATCTGCCCGA AACACACGAG ATTCTCAAGG
GCTTCCGGGC GATGGTGGAC CGCGAGTATC CGGGGCGGCT GCTGCTTGCC GAGGCGAACC AGTGGCCCGAGGAAGTCGTC GAGTACTTCG GCACCGAAGC CGAGCCCGAG TTCCACATGT GCTTCAACTT CCCGGTGATGCCCCGGCTGT ACATGAGCCT GAAAAGGGAG GACACCTCCA GCATCCGCGA GATCATGGGC CGCCTGCCGAAAATCCCGAG TTTCGGCCAG TGGTGCACCT TCCTGCGCAA CCACGACGAA CTGACGCTGG AAATGGTCACCGACGACGAG CGCGCCTTCA TGTATGCCGC CTACGCGCCC GACGCCCGCA TGAAAATCAA CGTGGGCATCCGCCGTCGCC TCGCGCCGCT GCTCGACAAC GACCGGCGCC GCATCGAGCT GCTGAACACT GTGCTCCTCGCCCTGCCCGG CAGCCCCATC CTGTACTACG GCGACGAAAT CGGCATGGGC GACGACCTCG GCCTGCCCGACCGCAACGGC GTGCGCACCC CGATGCAGTG GAACGCGGGC ACCAGCGGCG GTTTTTCCAC TGCGCAGCCCTCCGACTGCT TTTTCCCGCC GATTCAGGAC CCGGTGTACG GCTTCGGGCG CGTCAACGTG CAGAGCCAGCTCCAAGACCC CAGCAGCCTG CTGAAGTGGA CCGCCCGGCA ACTCGAACTG CGCCGCGCCC ACCCCGCCTTTGCGCACGGC GACCTCACCT TCATCGAAAC CGGCAACCCC GCCATCCTCG CCTTTACCCG CCAGTACGACGGCGAAACGC TGCTCATCGT CAGCAACTTC GCGGGCAACG CCCAGGCCGG GCTGCTCGAT CTCGCGCCCTTCGTGGGCCG CGCCCCGGTC ACACTTTCCG GGGCCAGCCC GCTGCCGGTG GTCACTGGAA ACGGCCAGTACCCGGTGGTG ATGGGCAAGT ACGACTATTA CTGGCTGCGG TTGAATTGAD.radiodurans海藻糖合成酶基因的氨基酸序列Met Thr Gln Ala His Pro Glu Trp Tyr Lys Ser Ala Val Phe Tyr Glu Leu Ser Val ArgThr Phe Gln Asp Gly Asn Gly Asp Gly Lys Gly Asp Phe Pro Gly Leu Thr Ser Arg LeuAsp Tyr Leu Lys Asn Leu Gly Val Asp Cys Leu Trp Leu Leu Pro Trp Phe Pro Ser ProLeu Arg Asp Asp Gly Tyr Asp Val Ala Asp Tyr Arg Gly Ile His Pro Asp Leu Gly ThrLeu Asp Asp Phe Lys Val Phe Leu Arg Glu Ala His Ala Arg Gly Leu Arg Val Ile GlyAsp Leu Val Thr Asn His Thr Ser Ser Asp His Pro Trp Phe Gln Ala Ala Arg Arg GlyPro Thr Leu Pro Asp Gly Ser Pro Asn Glu Tyr His Asp Tyr Tyr Val Trp Ser Asp GluGly Lys Glu Tyr Ala Asp Thr Arg Ile Ile Phe Thr Asp Thr Glu Val Ser Asn Trp ThrLeu Asp Glu Gln Ala Gly Lys Tyr Tyr Trp His Arg Phe Phe Ala Ser Gln Pro Asp LeuAsn Tyr Asp Asn Pro Lys Val Val Glu Glu Leu His Gly Ala Ala Arg Phe Trp Leu AspLeu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Val Asp Ala Val Pro Tyr Leu Ile Glu Arg Glu Gly ThrSer Cys Glu Asn Leu Pro Glu Thr His Glu Ile Leu Lys Gly Phe Arg Ala Met Val AspArg Glu Tyr Pro Gly Arg Leu Leu Leu Ala Glu Ala Asn Gln Trp Pro Glu Glu Val ValGlu Tyr Phe Gly Thr Glu Ala Glu Pro Glu Phe His Met Cys Phe Asn Phe Pro Val MetPro Arg Leu Tyr Met Ser Leu Lys Arg Glu Asp Thr Ser Ser Ile Arg Glu Ile Met GlyArg Leu Pro Lys Ile Pro Ser Phe Gly Gln Trp Cys Thr Phe Leu Arg Asn His Asp GluLeu Thr Leu Glu Met Val Thr Asp Asp Glu Arg Ala Phe Met Tyr Ala Ala Tyr Ala ProAsp Ala Arg Met Lys Ile Asn Val Gly Ile Arg Arg Arg Leu Ala Pro Leu Leu Asp AsnAsp Arg Arg Arg Ile Glu Leu Leu Asn Thr Val Leu Leu Ala Leu Pro Gly Ser Pro IleLeu Tyr Tyr Gly Asp Glu Ile Gly Met Gly Asp Asp Leu Gly Leu Pro Asp Arg Asn GlyVal Arg Thr Pro Met Gln Trp Asn Ala Gly Thr Ser Gly Gly Phe Ser Thr Ala Gln ProSer Asp Cys Phe Phe Pro Pro Ile Gln Asp Pro Val Tyr Gly Phe Gly Arg Val Asn ValGln Ser Gln Leu Gln Asp Pro Ser Ser Leu Leu Lys Trp Thr Ala Arg Gln Leu Glu LeuArg Arg Ala His Pro Ala Phe Ala His Gly Asp Leu Thr Phe Ile Glu Thr Gly Asn ProAla Ile Leu Ala Phe Thr Arg Gln Tyr Asp Gly Glu Thr Leu Leu Ile Val Ser Asn PheAla Gly Asn Ala Gln Ala Gly Leu Leu Asp Leu Ala Pro Phe Val Gly Arg Ala Pro ValThr Leu Ser Gly Ala Ser Pro Leu Pro Val Val Thr Gly Asn Gly Gln Tyr Pro Val ValMet Gly Lys Tyr Asp Tyr Tyr Trp Leu Arg Leu Asn
本发明与现有技术相比，具有的实质性特点和显著的进步是1、与日本林原研究所报道的来自Pimerlobacter sp.R48的海藻糖合成酶相比，本发明的酶的氨基酸个数少了46个，而又比同样是林原研究所报道的来自水栖嗜热菌Thermus aquaticus的海藻糖合酶又少412个氨基酸，但催化的又是同一个反应。这是已经鉴定功能分子量最小的海藻糖合成酶，酶的分子少412个氨基酸这意味着小分子的蛋白质更加容易地通过基因重组与表达技术来进行工业化生产，因而更有市场竞争力。
2、酶的最适反应温度为30～37℃，工业化生产中可节省能源。
3、一些金属离子，如Cu2+，Zn2+，Mn2+，Mg2+，Ca2+等二价金属离子的浓度在5ppm时，该酶的活力不受影响，这样反应的条件就不受限制。
4、葡萄糖对该酶具有较强的抑制作用。
5、它能够在正常的生化反应条件下将麦芽糖转化为海藻糖，该酶的底物转化率会随着反应温度的降低而升高。
具体实施例方式
以下是本发明的实验和实例，下述实验和实例所述内容属于本发明的主要内容，但并不仅仅限于这些内容。有些可以显而易见地扩展的内容虽然并未在本专利说明书中出现，但也应属于本发明的专利请求范围。
实施例1一、海藻糖合成酶基因(treS)的克隆将耐放射性异常球菌(Deinococcus radiodurans)接种于以下液体培养基(g/L)葡萄糖5，酵母粉(yeast extract)5，蛋白胨(peptone)10，氯化钠(NaCl)5，pH7.4，然后在30℃恒温摇床上振荡24小时，于5000rpm离心10分钟收集菌体。然后按《分子克隆实验室手册(第二版)》(Sambrook，et al.1989，Molecular Cloninga Laboratory Manual)中所述的方法进行耐放射性异常球菌的总DNA提取。
设计以下引物1、上游引物(Sense primer)5-GAGCCATGGCCCAGGCACACCCGGAGTGGT-32、下游引物(Antisense Primer)5-TGGTCTCTGCAGTCAATTCAACCGCAGCCAGTAATAG-3然后按PCR Cloning Protocols中所讲的步骤进行94℃60秒，然后进行27个环径95℃45秒，55℃60秒，72℃10分钟。
用Takara的专用试剂盒对PCR产物进行初步纯化，然后用NcoI和PstI对PCR产物进行双酶切，再与同样用NcoI和PstI酶切过的pSE380质粒连接，获得重组质粒pSE380-treS。
二、海藻糖合成酶基因(Tres)在大肠杆菌中的表达表达质粒pSE380-treS构建完毕，先转化DH5α大肠杆菌，大量制备pSE380-treS表达质粒，所得质粒可用一部分用于DNA测序以确认读码框的正确性，另一部分则可以用来进行海藻糖合成酶基因表达试验。
按《分子克隆实验室手册》(1989年第二版)所述的方法，制备大肠杆菌BL21的感受态细胞，然后用pSE380-treS转化BL21感受态细胞，于37℃培养10～16小时，然后加入IPTG至终浓度为0.5mM，再继续于32℃培养24～36小时。离心收集菌体后，即可进行细胞破碎和重组海藻糖合成酶的提取和底物转化试验。
取100ml上述发酵液，在5000r/min离心10分钟，用pH6.5的5mM磷酸缓冲液洗涤一次。然后将悬于100ml含有2mg/ml溶菌酶的5mM磷酸缓冲液中，于37℃水溶中进行破胞12小时。于8000r/min离心15分钟，取上清液1ml，与1ml 30％的麦芽糖溶液混合，置于25℃中反应24小时，还原糖下降至原来的60％，径HPLC检测，25℃反应24小时后溶液中含有海藻糖、麦芽糖和葡萄糖的浓度如下

*HPLC检测样品稀释20倍，进样10μl，30℃、压力46bar，流动相为乙腈∶水(84∶16)三、从麦芽糖浆制造海藻糖1、基因重组海藻糖合成酶的制备按《分子克隆实验室手册》(第二版)所述方法，将连接有海藻糖合成酶基因(序列如表1所示)的表达质粒pSE380-treS转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。在每毫升含有100微克氨苄青霉素的LB固体培养基涂布并分离出单菌落。将单菌落接种到5ml含有10g/L葡萄糖的LB液体培养基中，在33℃培养12小时，然后接种到500ml的下述培养基中氨苄青霉素50μg/ml，葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠3g/L。在33℃培养13小时，然后用2×500ml种子接种到含20升同样培养基的40升发酵罐中。在33℃，200rpm，通风量为0.9vvm的条件下发酵培养15小时。然后加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导。再继续培养17小时即终止。于5000rmp离心10分钟以收集菌体。用等体积的去离子水洗涤细胞一次，同样条件离心后重悬于二分之一体积的细胞破碎液液(含有3mg/ml溶菌酶，1％Triton-X100，0.05mM EDTA，用pH为6.9的磷酸缓冲液配制)中，在37℃振荡反应20小时，然后在45℃水浴中处理2小时。于3000g离心15分钟。收集含有重组海藻糖合成酶的上清液。
1、麦芽糖浆转化为海藻糖取70％的市售麦芽糖浆，加去离子水兑成含30％麦芽糖的溶液。取100升置于200升容积的不锈钢反应罐中，加入磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配成的缓冲液，使该缓冲液的终浓度为5mM，pH为6.9左右。取上述第1步中制得的海藻糖合成酶10升，加入到100升30％麦芽糖浆中，然后在25℃条件下反应32小时。用高效液相色谱仪(HPLC)如安捷伦Agilent 1100型对反应液进行测定，结果如下来自D.radiodurans的海藻糖合成酶催化麦芽糖转化为海藻糖

即底物麦芽糖中有57.6％转化为海藻糖(由于底物浓度是30％/(100升+10升)＝27.27％，总的转化率便是15.7％/27.27％＝57.6％)。也就是说，在110升总反应体积中共形成了17.28千克海藻糖。
实施例2以木薯淀粉为出发原料，经α淀粉酶液化后再由β-淀粉酶作用后生成的麦芽糖，将获得的麦芽糖按实例1进行反应，实验表明100公斤淀粉可以得到约40公斤的海藻糖，除去淀粉中水份和杂质，转化效率和利用直接用麦芽糖做底物的转化效率相同。
权利要求
1.一种新的海藻糖合成酶，其特征在于海藻糖合成酶基因是从耐放射性异常球菌(Deinococcus radiodurans)中获得。
2.如权利1要求所述的海藻糖合成酶，其特征在于其基因的DNA和氨基酸如下所示D.radiodurans的海藻糖合成酶基因DNA序列ATGACCCAGG CACACCCGGA GTGGTACAAG AGCGCTGTCT TCTACGAACT GTCCGTGCGG ACCTTTCAGGACGGCAACGG CGACGGCAAG GGCGATTTTC CCGGCCTGAC CTCGCGGCTG GACTACCTGA AAAACCTCGGCGTGGACTGC CTGTGGTTGC TGCCCTGGTT TCCCAGCCCA CTGCGCGACG ACGGGTACGA CGTGGCCGACTACCGGGGGA TTCACCCTGA CCTCGGCACG CTCGACGACT TCAAGGTCTT TCTGCGCGAA GCCCACGCCCGGGGCCTGCG GGTCATCGGC GACCTGGTGA CCAACCACAC GTCCAGCGAC CACCCCTGGT TTCAGGCGGCGCGGCGCGGC CCGACCCTGC CCGACGGCTC GCCCAACGAG TACCACGACT ACTACGTCTG GAGCGACGAGGGCAAGGAAT ACGCCGACAC CCGCATCATC TTCACCGACA CCGAGGTCAG CAACTGGACG CTCGACGAGCAGGCAGGCAA GTATTACTGG CACCGCTTTT TCGCCAGCCA GCCGGACCTG AACTACGACA ACCCGAAAGTGGTGGAAGAA CTTCACGGCG CCGCCCGCTT CTGGCTCGAC CTCGGCCTCG ACGGGTTCCG GGTGGACGCCGTGCCCTACC TCATCGAGCG CGAGGGCACG AGCTGCGAGA ATCTGCCCGA AACACACGAG ATTCTCAAGGGCTTCCGGGC GATGGTGGAC CGCGAGTATC CGGGGCGGCT GCTGCTTGCC GAGGCGAACC AGTGGCCCGAGGAAGTCGTC GAGTACTTCG GCACCGAAGC CGAGCCCGAG TTCCACATGT GCTTCAACTT CCCGGTGATGCCCCGGCTGT ACATGAGCCT GAAAAGGGAG GACACCTCCA GCATCCGCGA GATCATGGGC CGCCTGCCGAAAATCCCGAG TTTCGGCCAG TGGTGCACCT TCCTGCGCAA CCACGACGAA CTGACGCTGG AAATGGTCACCGACGACGAG CGCGCCTTCA TGTATGCCGC CTACGCGCCC GACGCCCGCA TGAAAATCAA CGTGGGCATCCGCCGTCGCC TCGCGCCGCT GCTCGACAAC GACCGGCGCC GCATCGAGCT GCTGAACACT GTGCTCCTCGCCCTGCCCGG CAGCCCCATC CTGTACTACG GCGACGAAAT CGGCATGGGC GACGACCTCG GCCTGCCCGACCGCAACGGC GTGCGCACCC CGATGCAGTG GAACGCGGGC ACCAGCGGCG GTTTTTCCAC TGCGCAGCCCTCCGACTGCT TTTTCCCGCC GATTCAGGAC CCGGTGTACG GCTTCGGGCG CGTCAACGTG CAGAGCCAGCTCCAAGACCC CAGCAGCCTG CTGAAGTGGA CCGCCCGGCA ACTCGAACTG CGCCGCGCCC ACCCCGCCTTTGCGCACGGC GACCTCACCT TCATCGAAAC CGGCAACCCC GCCATCCTCG CCTTTACCCG CCAGTACGACGGCGAAACGC TGCTCATCGT CAGCAACTTC GCGGGCAACG CCCAGGCCGG GCTGCTCGAT CTCGCGCCCTTCGTGGGCCG CGCCCCGGTC ACACTTTCCG GGGCCAGCCC GCTGCCGGTG GTCACTGGAA ACGGCCAGTACCCGGTGGTG ATGGGCAAGT ACGACTATTA CTGGCTGCGG TTGAATTGAD.radiodurans的海藻糖合成酶基因的氨基酸序列Met Thr Gln Ala His Pro Glu Trp Tyr Lys Ser Ala Val Phe Tyr Glu Leu Ser Val ArgThr Phe Gln Asp Gly Asn Gly Asp Gly Lys Gly Asp Phe Pro Gly Leu Thr Ser Arg LeuAsp Tyr Leu Lys Asn Leu Gly Val Asp Cys Leu Trp Leu Leu Pro Trp Phe Pro Ser ProLeu Arg Asp Asp Gly Tyr Asp Val Ala Asp Tyr Arg Gly Ile His Pro Asp Leu Gly ThrLeu Asp Asp Phe Lys Val Phe Leu Arg Glu Ala His Ala Arg Gly Leu Arg Val Ile GlyAsp Leu Val Thr Asn His Thr Ser Ser Asp His Pro Trp Phe Gln Ala Ala Arg Arg GlyPro Thr Leu Pro Asp Gly Ser Pro Asn Glu Tyr His Asp Tyr Tyr Val Trp Ser Asp GluGly Lys Glu Tyr Ala Asp Thr Arg Ile Ile Phe Thr Asp Thr Glu Val Ser Asn Trp ThrLeu Asp Glu Gln Ala Gly Lys Tyr Tyr Trp His Arg Phe Phe Ala Ser Gln Pro Asp LeuAsn Tyr Asp Asn Pro Lys Val Val Glu Glu Leu His Gly Ala Ala Arg Phe Trp Leu AspLeu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Val Asp Ala Val Pro Tyr Leu Ile Glu Arg Glu Gly ThrSer Cys Glu Asn Leu Pro Glu Thr His Glu Ile Leu Lys Gly Phe Arg Ala Met Val AspArg Glu Tyr Pro Gly Arg Leu Leu Leu Ala Glu Ala Asn Gln Trp Pro Glu Glu Val ValGlu Tyr Phe Gly Thr Glu Ala Glu Pro Glu Phe His Met Cys Phe Asn Phe Pro Val MetPro Arg Leu Tyr Met Ser Leu Lys Arg Glu Asp Thr Ser Ser Ile Arg Glu Ile Met GlyArg Leu Pro Lys Ile Pro Ser Phe Gly Gln Trp Cys Thr Phe Leu Arg Asn His Asp GluLeu Thr Leu Glu Met Val Thr Asp Asp Glu Arg Ala Phe Met Tyr Ala Ala Tyr Ala ProAsp Ala Arg Met Lys Ile Asn Val Gly Ile Arg Arg Arg Leu Ala Pro Leu Leu Asp AsnAsp Arg Arg Arg Ile Glu Leu Leu Asn Thr Val Leu Leu Ala Leu Pro Gly Ser Pro IleLeu Tyr Tyr Gly Asp Glu Ile Gly Met Gly Asp Asp Leu Gly Leu Pro Asp Arg Asn GlyVal Arg Thr Pro Met Gln Trp Asn Ala Gly Thr Ser Gly Gly Phe Ser Thr Ala Gln ProSer Asp Cys Phe Phe Pro Pro Ile Gln Asp Pro Val Tyr Gly Phe Gly Arg Val Asn ValGln Ser Gln Leu Gln Asp Pro Ser Ser Leu Leu Lys Trp Thr Ala Arg Gln Leu Glu LeuArg Arg Ala His Pro Ala Phe Ala His Gly Asp Leu Thr Phe Ile Glu Thr Gly Asn ProAla Ile Leu Ala Phe Thr Arg Gln Tyr Asp Gly Glu Thr Leu Leu Ile Val Ser Asn PheAla Gly Asn Ala Gln Ala Gly Leu Leu Asp Leu Ala Pro Phe Val Gly Arg Ala Pro ValThr Leu Ser Gly Ala Ser Pro Leu Pro Val Val Thr Gly Asn Gly Gln Tyr Pro Val ValMet Gly Lys Tyr Asp Tyr Tyr Trp Leu Arg Leu Asn
3.如权利要求1所述的海藻糖合成酶，其特征在于分子量为62.8kD；等电点约为PI＝4.9；酶的最适反应温度为30～37℃；酶的最适反应的pH是7.0～7.5；pH在6.5～8.5范围内，酶的活力均表现为较高；当Cu2+，Zn2+，Mn2+，Mg2+，Ca2+等二价金属离子的浓度在5ppm时，该酶的活力不受影响；海藻糖合成酶在以麦芽糖浆为底物时，可催化底物生成40～70％的海藻糖；该海藻糖合成酶在以麦芽糖为底物时，除了催化生成海藻糖外，同时还合成高达5～15％的葡萄糖；葡萄糖对该酶的转化律有较强的抑制作用。
4.如权利要求1所述的海藻糖合成酶基因制备海藻糖的方法，其特征在于包括以下工艺步骤1)对选定的菌种接种进行扩大培养；2)从所获得的扩大菌种中克隆海藻糖合成酶基因；3)将海藻糖合成酶基因在大肠杆菌中表达；4)收集含有重组海藻糖合成酶；5)以麦芽糖浆或淀粉浆为原料，用海藻糖合成酶再制造海藻糖，所述的淀粉浆可以选用玉米淀粉、大米淀粉、小麦淀粉、木薯淀粉、马铃薯淀粉、红薯淀粉与水配成的淀粉溶液，优选大米淀粉和木薯淀粉。
5.根据权利要求4所述的海藻糖合成酶基因制备海藻糖的方法，其特征在于对选定的菌种接种进行扩大培养的工艺是将耐放射性异常球菌(Deinococcus radiodurans)接种于以下葡萄糖5克/升，酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，氯化钠5克/升，pH7.4，然后在30℃恒温摇床上振荡24小时，于5000rpm离心10分钟收集菌体提取DNA。
6.根据权利要求4所述的海藻糖合成酶基因制备海藻糖的方法，其特征在于从所获得的耐放射性异常球菌中克隆海藻糖合成酶基因的工艺是先设计以下引物1、上游引物5-GAGCCATGGCCCAGGCACACCCGGAGTGGT-3；2、下游引物5-TGGTCTCTGCAGTCAATTCAACCGCAGCCAGTAATAG-3，然后用聚合酶链式反应技术获得目的基因，用Takara的专用试剂盒对PCR产物进行初步纯化，然后用NcoI和PstI对PCR产物进行双酶切，再与同样用NcoI和PstI酶切过的pSE380质粒连接，待表达质粒pSE380-treS。
7.根据权利要求4所述的海藻糖合成酶基因制备海藻糖的方法，其特征在于将海藻糖合成酶基因在大肠杆菌中表达的工艺是制备大肠杆菌BL21的感受态细胞，然后用重组质粒pSE380-treS转化BL21感受态细胞，于30-37℃培养10～16小时，然后加入IPTG至终浓度为0.5mM，再继续于28-32℃培养24～36小时，离心收集菌体后，即可进行细胞破碎和重组海藻糖合成酶的提取和底物转化试验。
8.根据权利要求4所述的海藻糖合成酶基因制备海藻糖的方法，其特征在于收集含有重组海藻糖合成酶的工艺是将转化试验合格的大肠杆菌菌体接种到500ml的下述培养基中氨苄青霉素50μg/ml，葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠3g/L，在33℃培养13小时，然后用2×500ml种子接种到含20升同样培养基的40升发酵罐中，在33℃，200rpm，通风量为0.9vvm的条件下发酵培养15小时，然后加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导，再继续培养17小时即终止，于5000rmp离心10分钟以收集菌体，用等体积的去离子水洗涤细胞一次，同样条件离心后重悬于二分之一体积的含有3mg/ml溶菌酶，1％Triton-X100，0.05mM EDTA，用pH为6.9的磷酸缓冲液配制的细胞破碎液中，在37℃振荡反应20小时，然后在45℃水浴中处理2小时，于3000g离心15分钟，收集上清液得到重组海藻糖合成酶。
9.根据权利要求4所述的海藻糖合成酶基因制备海藻糖的方法，其特征在于用重组海藻糖合成酶制造海藻糖的工艺是以麦芽糖浆或淀粉浆为原料，先加去离子水兑成含30％的溶液。取100升置于200升容积的不锈钢反应罐中，加入磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配成的缓冲液，使该缓冲液的终浓度为5mM，pH为6.9左右，取上述第1步中制得的海藻糖合成酶10升，加入到100升30％麦芽糖浆或淀粉浆中，然后在25-30℃条件下反应24-36小时，用高效液相色谱仪(HPLC)如安捷伦Agilent 1100型对反应液进行测定其海藻糖含量。
全文摘要
本发明涉及一种全新的海藻糖合成酶基因的克隆及其在相关宿主中的表达，该酶的基因克隆自耐放射性异常球(Deinococcus radioduran)菌，它能够在正常的生化反应条件下将麦芽糖转化为海藻糖，该酶的底物转化率会随着反应温度的降低而升高，它可以利用麦芽糖或淀粉为原料，再由克隆得到的酶转化为α，α－1，1－海藻糖。这种海藻糖可应用于食品工业，海产品冷藏以及药物的活性保持等领域。
文档编号C12N15/61GK1570098SQ200410013008
公开日2005年1月26日 申请日期2004年4月8日 优先权日2004年4月8日
发明者韦宇拓, 黄日波, 蒙健宗, 卢福燊, 庞中文, 朱绮霞, 陈发忠, 罗兆飞, 卢运琨, 王青艳, 黄鲲 申请人:南宁中诺生物工程有限责任公司