专利名称：使用利用甲醇的细菌生产l-赖氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及用于微生物工业领域的技术，更具体地，本发明涉及一种通过发酵生产L-赖氨酸的方法。
背景技术：
L-赖氨酸是使用属于棒杆菌属(Corynebacterium)、芽胞杆菌属(Bacillus)、埃希氏菌属(Escherichia)等的微生物通过发酵生产的。(参见“氨基酸发酵”，由H.Aida等人编写，日本科学社出版[Gakkai Shuppan Center]，第一版，1986年5月30日出版)。由天然或其营养缺陷型突变株分离的细菌株已经用于改善这些微生物的生产。而且，现已公开了各种使用重组DNA技术增强L-赖氨酸生物合成酶来提高L-赖氨酸生产能力的技术(WO95/16042)。
通过培育微生物例如上述微生物以及改进生产方法可以显著提高L-赖氨酸的生产能力。但是，为了响应未来需求的增加，研发更有效的并以较低成本生产L-赖氨酸的方法显然是必需的，因此，仍是现有技术的需求。
甲醇是可以大量低成本获得的发酵原料。使用甲醇发酵生产L-氨基酸的方法是已知的，并包括使用微生物的方法，微生物属于无色杆菌属(Achrombacter)或假单胞菌属(Pseudomonas)(日本专利未审公开(Kokai)No.45-25273)，精蛋白杆菌属(Protaminobacter)(日本专利公告(Kokoku)No.49-125590)，精蛋白杆菌属(Protaminobacter)或甲烷单毛杆菌属(Methanomonas)(日本专利未审公开(Kokai)No.50-25790)，微环菌属(Microcyclus)(日本专利未审公开(Kokai)No.52-18886)，甲基菌属(Methylobacillus)(日本专利未审公开(Kokai)No.4-91793)，芽孢杆菌属(Bacillus)(日本专利未审公开(Kokai)No.3-505284)，嗜甲基菌属(Methylophilus)(WO00/61723)等。
而且，对于严格的利用甲醇的细菌，特别是嗜甲基菌属细菌，现已报道通过通常的方法很难得到营养缺陷的突变体((1983)，vol.129，pp.785-799；M.L.O’Conner和R.S.Hanson，Journal of General Microbiology(1978)，vol.104，pp.105-111)。因此，当试图得到谷氨酰胺营养缺陷株时，例如，只能得到温度敏感的营养缺陷株(Windass J.D.等人，Nature，287，pp.396-401(1980))。甚至当使用特殊的方法，例如，将菌株细胞悬浮在含有DNA诱变试剂的溶液中，并在细胞上施加电压强制在细胞膜上穿孔，从而使诱变试剂流进细胞(电穿孔)时，也只能得到三种突变株，即，叶酸营养缺陷株、丝氨酸和丙氨酸多种营养缺陷株以及谷氨酸和肌醇多种营养缺陷株(C.S.Kin和T.K.Wood，AppliedMicrobiol. & Biotechnology，48，pp.105-108(1997))。
此外，WO00/61723也描述了使用化学诱变试剂对食甲基嗜甲基菌(Methylophilus methylotrophus)进行诱变处理得到渗漏酪蛋氨基酸营养缺陷株，该株生产缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。但是，根据突变株的特征判断，很显然是因为细胞膜的变化使得培养基中的各种氨基酸渗透进细胞，所以该株成为渗漏酪蛋氨基酸营养缺陷株。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种改善使用利用甲醇的细菌生产L-赖氨酸的效率的方法。
本发明的另一目的是提供一种生产L-赖氨酸的方法，该方法包括培养利用甲醇的细菌，该细菌生长需要L-蛋氨酸并且具有在含有以甲醇为主要碳源的培养基中生产L-赖氨酸的能力，使L-赖氨酸在培养基中聚集，以及从培养基中收集L-赖氨酸。
本发明的另一个目的是提供一种如上所述的方法，其中细菌是嗜甲基菌属细菌。
本发明的另一个目的是提供一种如上所述的方法，其中嗜甲基菌属细菌是食甲基嗜甲基菌。
本发明的另一个目的是提供一种如上所述的方法，其中对嗜甲基菌属细菌进行修饰以便增强二氨基庚二酸合成酶的酶活性和L-赖氨酸分泌系统。
本发明的更进一步的一个目的是提供一种嗜甲基菌属细菌，其生长需要L-蛋氨酸并具有产生L-赖氨酸的能力。
本发明的另一目的是提供如上所述的嗜甲基菌属细菌，其为食甲基嗜甲基菌。
本发明的另一目的是提供如上所述的嗜甲基菌属细菌，该细菌经过修饰以便增强二氨基庚二酸合成酶的酶活性和L-赖氨酸分泌系统。
根据本发明，可以改善使用利用甲醇的细菌生产L-赖氨酸。
具体实施例方式
本发明的发明者为了实现上述目标勤奋研究，结果他们成功地将蛋氨酸营养缺陷赋予利用甲醇的细菌，并发现该特征能改善由利用甲醇的细菌从甲醇中生产L-赖氨酸的能力。
在本发明中，“生产L-赖氨酸的能力”是指当在培养基中培养时，本发明的细菌导致培养基中积累显著量的L-赖氨酸的能力，例如，0.1g/L或更多，或者本发明的细菌显著提高细胞中单位蛋白质总量中游离L-赖氨酸量的能力，例如，是原始野生株的1.5倍或更多。
本发明的细菌本发明的细菌是利用甲醇的细菌，它生长需要L-蛋氨酸，也称作L-蛋氨酸营养缺陷体，并且具有生产L-赖氨酸的能力。在本发明中，利用甲醇的细菌或食甲醇菌(methylotroph)是指可通过利用甲醇作为主要的碳源生长的细菌，其中可通过L-蛋氨酸营养缺陷体赋予或提高生产L-赖氨酸的能力。具体的例子包括嗜甲基菌属细菌如食甲基嗜甲基菌(Methylophilus methylotrophus)和甲基菌属细菌如糖原甲基菌(Methylobacillus glycogenes)和Methylobacillusflagellatum。
食甲基嗜甲基菌的例子包括AS1株(NCIMB10515)等。食甲基嗜甲基菌AS1株(NCIMB10515)从国立工业和海洋微生物保藏有限公司获得(地址NCIMB Lts，Torry Research Station，135，Abbey Road，Aberdeen AB98DG，英国)。
糖原甲基菌的例子包括T-11株(NCIMB11375)、ATCC21276株、ATCC21371株、ATR80株(在Appl.Microbiol.Biotechnol，42，pp.67-72(1994)中有描述)，A5 13株(在Appl.Microbiol.Biotechnol，42，pp.67-72(1994)中有描述)等。糖原甲基菌NCIMB11375株从国立工业和海洋微生物保藏有限公司获得(地址NCIMB Lts.，Torry Research Station，135，Abbey Road，Aberdeen AB9 8DG，英国)。Methylobacillus flagellatum的例子包括KT株(在Arch.Microbiol，149，pp.441-446(1988)中有描述)等。
其生长需要L-蛋氨酸并具有生产L-赖氨酸能力的利用甲醇的细菌可以使用不需要L-蛋氨酸(非L-蛋氨酸营养缺陷体)作为原料的利用甲醇的细菌加以衍生。其生长不需要L-蛋氨酸的利用甲醇的细菌的例子包括，但不限制于利用甲醇的细菌的野生株。
在本发明中，表述“其生长需要L-蛋氨酸”的意思是指，例如，当菌株在不含L-蛋氨酸或具有0.001g/L或更低含量的L-蛋氨酸的SEII培养基中在30-37℃培养2天时不会生长，而当其在含有至少0.05g/L或更多的L-蛋氨酸的同样的培养基中培养时，其以与野生型、未修饰的或亲代株可相比的速度生长，生长速度以单位时间细胞的质量增加测定，或以相应于野生型、未修饰的或亲代株的速度的5％或更多，优选20％或更多的速度生长。更进一步地，当甚至在典型的不含有L-蛋氨酸的SEII琼脂培养基板上涂上大约100个细胞，并在37℃培养2天后想要的菌株(L-蛋氨酸营养缺陷株)都不会形成具有1mm或更大直径的菌落，但是“其生长需要L-蛋氨酸”的菌株则具有在含有1g/L L-蛋氨酸的同样的培养基中，在相同条件下培养后形成具有1mm或更大直径的菌落的能力。
从L-蛋氨酸非营养缺陷株衍生L-蛋氨酸营养缺陷株的方法的例子包括用能使基因突变的物理刺激，例如紫外线、X-射线和γ-射线，处理L-蛋氨酸非营养缺陷株，或者用化学诱变试剂，例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)，处理L-蛋氨酸非营养缺陷株，随后选择转变成L-蛋氨酸营养缺陷体的菌株。其中，优选使用例如NTG的方法。虽然常规认为很难得到特定氨基酸的营养缺陷型食甲基嗜甲基菌株，但是本发明的发明者发现甚至使用化学诱变试剂都可以获得L-蛋氨酸的营养缺陷株。
此外，在据信对于利用甲醇的细菌存在负责L-蛋氨酸合成的代谢途径，且已经阐明了编码该途径中的酶的基因的情况下，利用同源重组的基因破坏方法可被用于直接破坏基因并因此得到L-蛋氨酸营养缺陷株。而且，也可以通过利用基因重组技术抑制与L-蛋氨酸合成有关的酶的活性而赋予L-蛋氨酸营养缺陷。例如，在食甲基嗜甲基菌中，SEQ ID NO15中所显示的metA基因是一个可以编码一种可被破坏的、或被抑制酶活性的酶的基因的例子。该基因被认为是编码高丝氨酸邻乙酰基转移酶。如这里所更详细描述的，具有破坏的metA基因的食甲基嗜甲基菌需要L-蛋氨酸并显示出改善的L-赖氨酸生产能力。
此外，功能性缺陷导致L-蛋氨酸营养缺陷的酶的例子包括由天门冬氨酸半醛起始至L-蛋氨酸的代谢途径的酶。“酶功能性缺陷”包括酶活性减少到细菌具有L-蛋氨酸营养缺陷的程度，以及酶活性基本上完全消失。例如，当高丝氨酸脱氢酶不足时，所预期的表型为L-蛋氨酸和L-苏氨酸营养缺陷，而当邻琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶(例如，metZ基因产物)或蛋氨酸合酶(例如，metE、metH等)缺乏时，其表型预期为蛋氨酸营养缺陷。但是，其中，当催化相同的酶反应的两种或多种酶存在于利用甲醇的细菌中(例如在当催化相同酶反应的酶分别独立存在的情况性，例如，metE和metH)，优选这两种酶的功能同时被消除。
以下，将通过参照metA基因为例对消除L-蛋氨酸合成酶的活性的方法加以解释。metA基因可以一种从含有基因的微生物，例如食甲基嗜甲基菌的基因组DNA得到，使用聚合酶链反应方法(以下引作“PCR”)来扩增基因。基因组DNA可通过已知的方法制备。用作PCR引物的例子包括具有SEQ IDNOS7和10所显示的DNA序列的寡核苷酸。
抑制metA基因表达的方法包括，例如，在转录水平抑制基因的表达的方法，该方法通过在基因的启动子序列中引入一个或多个核苷酸的取代、缺失、插入、添加或反向来减少启动子的活性(参见M.Rosenberg & D.Court，Ann.Rev.Genetics，13，319(1979)；P.Youderian，S.Bouvier & M.Susskind，Cell，30，843-853(1982))。此外，也可通过在SD序列(Shine-Dalgamo序列)与起始密码子之间的区域中一个或多个核苷酸的取代、缺失、插入、添加或反向而在转录水平抑制MetA蛋白的表达(参见J.J.Dunn，E.Buzash-Pollert & F.W.Studier，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，75，p.2743(1978))。
此外，对于减少或消除高丝氨酸邻乙酰基转移酶的比活性，可通过在编码区域的核苷酸序列中的一个或多个核苷酸的取代、缺失、插入、添加或反向而完成metA基因编码区域的修饰或破坏。
可具体地应用定点诱变(W.Kramer & H.J.Frits，Methods in Enzymology，154，350(1987))和用化学试剂如硫代硫酸钠或羟胺处理含有目标基因的DNA的方法(D.Shortle & D.Nathans，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，75，270，(1978))，以便在基因中引入核苷酸的取代、缺失、插入、添加或反向。
定点诱变是一种使用合成的寡核苷酸的方法，该方法可以在特定的碱基对中引入任意的取代、缺失、插入、添加或反向。为了实现该方法，首先将具有想要的被克隆的和具有已知的DNA核苷酸序列的基因的质粒变性来制备单链。然后，合成一种与想要引入突变的区域互补的合成的寡核苷酸。在该合成中，合成的寡核苷酸序列不是以完整的互补序列被制备的，而是被制备成包括一种任意核苷酸的取代、缺失、插入、添加或反向。而后，将单链DNA和包括任意核苷酸的取代、缺失、插入、添加或反向的合成寡核苷酸退火，然后使用DNA聚合酶I的Klenow片断和T4连接酶合成完整的双链质粒，并引入到大肠杆菌感受态细胞中。一些如上所述得到的转化物具有一种含有想要的基因的质粒，该基因中固定了任意的核苷酸的取代、缺失、插入、添加或反向。
重组PCR方法(PCR Technology，Stockton Press(1989)可被用作一种能够引入突变并因此修饰或破坏基因的相似方法。
此外，使用化学试剂的处理方法是一种向包含目标基因的DNA片段中随机引入包括核苷酸的取代、缺失、插入、添加或反向的突变的方法，该方法包括通过使用硫代硫酸钠、羟胺等直接处理DNA片段。
MetA基因在细胞中的表达可以通过用如上所述得到的基因代替利用甲醇的细菌染色体上的天然基因而被抑制，上述得到的基因通过引入突变而被修饰或破坏。
基因取代的方法包括，但不限制于利用同源重组的方法(Experiments inMolecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1972)；S.Matsuyama & S.Mizushima，J.Bacteriol.，162，1196(1985))。导致同源重组的能力是利用甲醇的细菌所通常拥有的性质。当向细菌细胞中引入含有与染色体上的序列同源的序列的质粒等时，在具有某种频率同源性的序列的位点上发生重组，且整个质粒掺入到染色体中。此后，如果在染色体上在具有同源性的序列处导致重组，质粒则被再次从染色体上除去。此时，引入突变的基因可被固定在染色体上，而根据重组发生的位点，天然基因可连同质粒被一起去除。通过选择这样的菌株，可以得到一种菌株，其中通过引入包括核苷酸取代、缺失、插入、添加或反向的突变而修饰或破坏的基因取代染色体上的天然基因。
此外，本发明的发明者发现，在食甲基嗜甲基菌中，以线性DNA片段形式在染色体上引入一种与想要的基因同源的基因，引起染色体上的想要的基因与细胞中所引入的线性DNA片段的同源基因之间的同源重组，因此可以完成基因取代，并且这类技术也可被应用。使用该技术进行基因取代的例子在实施例部分有描述。
为确定基因取代物是否按预期进行，举例来说，可以将抵抗抗生素的药物抗性标记基因掺入将被引入的DNA片段。当以此方式使用药物抗性标记时，可使用一种赋予利用甲醇的细菌对药物，如卡那霉素、庆大霉素、四环素、氨苄青霉素或链霉素抗性的基因。诸如上述的标记基因可用于制备被引入的基因，该基因的编码区通过将其插入到基因中而被破坏。插入标记基因的破坏型基因可以使用实施例部分给出的质粒DNA，通过基因重组技术来制备，或者也可以通过同时进行所要引入的基因的扩增和通过交换PCR来插入标记基因来制备。
在实施例部分，其中metA基因的功能被破坏的食甲基嗜甲基菌株是通过以下方式构建的；用一种其中部分编码区域被去除的metA基因代替食甲基嗜甲基菌染色体上的metA基因，并使用上述的利用同源重组的方法插入一种卡那霉素抗性基因以代替部分编码区域。
本发明的细菌可以通过将L-蛋氨酸营养缺陷赋予具有上述生产L-赖氨酸能力的利用甲醇的细菌得到。本发明的细菌也可以通过将生产L-赖氨酸的能力赋予具有L-蛋氨酸营养缺陷的利用甲醇的细菌得到。利用甲醇的细菌，例如，具有生产L-赖氨酸能力的食甲基嗜甲基菌株可以通过将不具有生产L-赖氨酸能力或产生L-赖氨酸能力低的菌株进行诱变处理以赋予其对L-赖氨酸类似物例如S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(以下称作“AEC”)的抗性来得到。诱变处理方法的例子包括，但不限于用物理刺激例如紫外线、X-射线和γ-射线或用化学诱变试剂例如NTG，如上所述处理菌株，得到L-蛋氨酸营养缺陷株的方法。如上所述得到的具有产生L-赖氨酸能力的嗜甲基属细菌的具体例子包括，但不限于食甲基嗜甲基菌AJ13608。该菌株通过将AEC抗性赋予食甲基嗜甲基菌AS1株繁殖得到。食甲基嗜甲基菌AJ13608于1999年6月10日保藏在国立生命科学和人体技术研究所，Agency of Industrial Science and Technology，(现在为通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，国际专利生物保藏机构，Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，日本)，并得到PERM P-17416的保藏号。然后，于2000年3月31日该保藏物转至布达佩斯条约规定下的国际保藏机构并得到PERM BP-7112的保藏号。
具有产生L-赖氨酸能力的嗜甲基菌属细菌也可以通过引入或增强与用基因重组技术生物合成L-赖氨酸有关信息的DNA来繁殖。基因或要被引入的基因编码L-赖氨酸生物合成途径的酶，例如二氢吡啶二羧酸合成酶和琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶。在一种受到L-赖氨酸的反馈抑制的酶如二氢吡啶二羧酸合成酶(DDPS)的基因的情况下，优选使用一种编码酶的突变基因，该酶的抑制被脱敏。这样的突变基因的例子包括，但不限于在WO95/16042等中描述的大肠杆菌的dapA*24基因(编码DDPS，DDPS在118位上的组氨酸残基被酪氨酸残基取代)。以上所述的其它基因也在该国际专利公开中有描述。在该国际专利公开的说明书中，编码四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶的基因和编码琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶的基因可以相互交换。
此外，产生L-氨基酸的能力也可以通过提高与L-赖氨酸分泌到细胞外有关的蛋白质的活性来改进。例如，作为与L-赖氨酸分泌到细胞外有关的蛋白质，由lysE基因编码的LysE蛋白质是已知的(M.Vrljic，H.Sahm和L.Eggeling，Molecular Microbiology 22，pp.815-826(1996)；国际专利公开WO97/23597)。本发明的发明者证实衍生于短杆菌属(Brevibacterium)细菌的野生型lysE基因在嗜甲基菌属或甲基菌属细菌中不起作用，但是它经修饰后在嗜食甲基菌中起作用。这样修饰的lysE蛋白的例子包括本文实施例中描述的LysE24。
由lysE基因编码的LysE蛋白具有六个疏水性螺旋区域。这些疏水性区域中的一些据推测是跨膜域。而且与N-末端有关的第三和第四区域之间的区域据推测是亲水性的，且具有环状结构。在本发明中，此亲水性区域被称作环状区域。野生型lysE的核苷酸序列和乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)2256的LysE蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NOS17和18中分别给出。在该氨基酸序列中，疏水性螺旋区域相当于氨基酸编号5-20、37-58、67-93、146-168、181-203和211-232。环状区域相当于氨基酸编号94-145。
本发明的发明者发现lysE基因在利用甲醇的细菌中是致死的，但是编码LysE蛋白的变体的DNA，其没有环状区域或基本上仅由疏水性螺旋组成，可以促进L-赖氨酸和/或L-精氨酸分泌到利用甲醇的细菌的外面。本发明的DNA编码这样的缺乏上述环状区域的突变LysE蛋白，该环状区域包含于野生型LysE蛋白中或基本上仅由疏水性螺旋组成。
上述突变LysE没有特别的限制，只要其具有一个或多个疏水性螺旋和当其被引入到利用甲醇的细菌时，表达导致L-赖氨酸、L-精氨酸或二者的分泌增加。具体地，包含了一种编码突变LysE的DNA，该突变LysE具有全部与N-末端有关的第一到第六个疏水性螺旋。更具体地，包含了一种编码含有与N-末端有关的第一到第三个疏水性螺旋的肽，及编码含有与N-末端有关的第四到第六个疏水性螺旋的肽的DNA。上述lysE24是突变型lysE的一个例子，它编码含有第一到第三个疏水性螺旋的肽和含有第四到第六个疏水性螺旋的肽。LysE24基因是通过用编码第三个疏水性螺旋的区域下游的终止密码子的突变被引入的。本发明的发明者证实，如果该终止密码子的下游区域被去除，当突变lysE基因在食甲基嗜甲基菌AS1株中表达时，突变lysE基因不会导致L-赖氨酸在培养基中聚集。因此，据推测含有第一到第三疏水性螺旋的肽和含有第四到第六疏水性螺旋的肽被单独地翻译并在利用甲醇的细菌中起作用。结果显示将lysE基因引入到利用甲醇的细菌中会导致L-赖氨酸或L-精氨酸生产能力的改善。
任何微生物可用于产生编码与L-赖氨酸分泌到细胞外有关的蛋白的DNA，即，lysE基因或其同源基因，只要基因的变体在利用甲醇的细菌中表达L-赖氨酸的分泌活性。具体地，这样微生物的例子包括但不限于棒状细菌如谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)和乳发酵短杆菌，埃希氏菌属细菌如大肠杆菌，假单胞菌属细菌如绿脓杆菌，分支杆菌属细菌如结核杆菌等等。
LysE的同源基因的例子包括编码一种蛋白的DNA，该蛋白在严格的条件下与具有SEQ ID NO17或其部分的核苷酸序列的探针杂交，且作为上述氨基酸取代的结果，编码一种在利用甲醇的细菌中显示出LysE蛋白的作用的蛋白。上述“严格条件”包括在其中形成所谓的特异性杂交体而不形成非特异性杂交体的条件。很难使用任何数值来明确表达这一条件。但是，例如，该严格条件包括一种在其下具有高度同源的DNAs，例如，具有80％或更高，优选90％或更高，更优选95％或更高同源性的DNAs相互杂交的条件，然而同源性低于上述比例的DNAs不能相互杂交。或者，严格条件包括DNA在相应于Southern杂交的典型的洗涤条件的盐浓度下相互杂交的条件，即在60℃下，1×SSC，0.1％SDS，优选0.1×SSC，0.1％SDS。
SEQ ID NO17的核苷酸序列的部分序列也可以用作探针。这样的探针可以使用寡核苷酸通过PCR制备，寡核苷酸基于作为引物的核苷酸序列SEQ IDNO17和含有作为模板的核苷酸序列SEQID NO17的DNA片段制备。当使用具有大约300bp长度的DNA片段作为探针时，杂交的洗涤条件可以是，例如，在50℃下，2×SSC，0.1％SDS。
为了提高利用甲醇的细菌中氨基酸分泌基因或L-赖氨酸生物合成系统的基因的表达，将基因片段连接于能够在利用甲醇的细菌中起作用的载体，优选一种多拷贝型载体，来制备重组DNA，然后将其用于转化宿主，即利用甲醇的细菌。或者，可以将基因掺入转座子中和引入到染色体中。此外，可将在利用甲醇的细菌中诱导有效转录的启动子连接于基因的上游。
为了将基因引入到嗜甲基菌属细菌中和提高其表达，可将基因连接于可在嗜甲基菌属细菌细胞中自主复制的载体来构建一种重组DNA，然后将其通过电穿孔等方式用于嗜甲基菌属细菌的转化。另外，也可以通过使用转导、转座子(D.E.Berg和C.M.Berg，Bio/Technol.，1，p.417，1983)，Mu噬菌体(日本专利未审公开(Kokai)No.2-109985)或同源重组(Experiments in MolecularGenetics，Cold Spring Harbor Lab.(1972))的方法将靶基因掺入宿主染色体中。
在嗜甲基菌属细菌中起作用的载体包括，但不限于，在嗜甲基菌属细菌中可自主复制的质粒。具体的例子包括RSF1010，它是一种宽范围宿主载体，和其衍生物，例如，pAYC32(A.Y.Chistorerdov，Y.D.Tsygankov，Plasmid，16，pp.161-167，(1986)、pMFY42(Gene，44，p.53(1990))、pRP301、pTB70(Nature，287，p.396，(1980))等等。
在嗜甲基菌属细菌中起作用的载体包括，但不限于，在嗜甲基菌属细菌中可自主复制的质粒。具体的例子包括RSF1010，它是一种宽范围宿主载体，和其衍生物，例如，pMFY42(Gene，44，p.53(1990))等等。
可以使用任何将重组DNA分子引入到嗜甲基菌属细菌中的方法，只要该方法可提供足够的转化效率。例如，可以使用电穿孔(Canadian Journal ofMicrobiology，43，p.197，(1997))。
使用被赋予了L-蛋氨酸营养缺陷的利用甲醇的细菌生产L-赖氨酸在添加了适量的L-蛋氨酸的培养基中培养一种通过metA基因的破坏或诱变处理被赋予了L-蛋氨酸营养缺陷并具有产生L-赖氨酸能力的如上所述获得的利用甲醇的细菌，可导致产生显著量的L-赖氨酸和所产生的L-蛋氨酸在培养基中的聚集。因此，被赋予了L-蛋氨酸营养缺陷和具有产生L-赖氨酸能力的本发明的利用甲醇的细菌的利用有效地改善了L-赖氨酸的聚集量。
用于产生L-赖氨酸的培养基是一种含有所需碳源、氮源、无机离子和其它有机微量营养物的典型培养基。主要的碳源是甲醇。但是，可以同时使用糖类例如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖和淀粉水解产物；醇类例如甘油和山梨醇，和有机酸例如富马酸、枸橼酸、琥珀酸和丙酮酸。表述“以甲醇为主要碳源”是指在总碳源中甲醇的含量是50％(w/w)或更多，优选80％或更多。如果甲醇用作主要的碳源，其浓度通常在0.001％至4％(w/v)之间，优选在0.1％至2％(w/v)之间。此外，当加入葡萄糖等时，其浓度通常在0.1％至3％(w/w)之间，优选在0.1％至1％(w/w)之间。
此外，培养基中必须含有适量的L-蛋氨酸。虽然含量优选根据培养的条件进行调节，它通常在L-蛋氨酸含量不充分的范围内，因此细菌的生长应受到限制，并允许由细菌最有效地产生L-赖氨酸。例如，培养基中L-蛋氨酸的含量优选在0.01至1g/L之间。
作为氮源，可使用无机铵盐例如硫酸铵、氯化铵和磷酸铵，有机氮例如大豆水解产物、氨气、氨水等。
作为无机离子(或其来源)，可向培养基中加入少量的磷酸钾、硫酸镁、铁离子、镁离子等。作为有机微量营养物，可向培养基中以适当量加入维生素B1、酵母提取物等。
培养优选在需氧条件下进行大约16至72小时。培养温度控制在25℃至45℃之间，pH在培养过程中控制在5至8之间。可以使用无机或有机酸性或碱性物质、氨气等调节pH值。
在培养完成后，可通过例如利用离子交换树脂、沉淀和其它已知的方法组合的典型方法从发酵培养液中收集L-赖氨酸。
实施例以下，将参照下面的非限制性的实施例更具体地解释本发明。
实施例1从嗜甲基菌属细菌的野生株制备L-蛋氨酸营养缺陷株如以下所述，将食甲基嗜甲基菌的野生株，AS1株(NCIMB 10515)用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)处理来分离L-蛋氨酸营养缺陷株。首先，用NTG处理之前一天，将野生株AS1接种到50ml SEII培养基中(组成1.9g/LK2HPO4、5.0g/L(NH4)2SO4、1.56g/L NaH2PO4·2H2O、0.2g/L MgSO4·7H2O、0.72mg/L CaCl2·6H2O、5μg/L CuSO4·5H2O、25μg/L MnSO4·5H2O、23μg/LZnSO4·7H2O、9.7mg/L FeCl3·6H2O、1％(v/v)甲醇)，在37℃摇动培养过夜。通过将NTG溶于二甲亚砜(DMSO)中制备成浓度为10mg/ml的NTG溶液。
第二天，在4℃离心收集所培养的细胞，并向细胞中加入50mL冰冷却的50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)来悬浮它们。然后，将悬浮液再次离心，除去上清液，洗涤细胞一次。将细胞悬浮在2ml相同的缓冲液中并以相等体积分在两个Eppendorf管中。其中一个用于NTG处理，另一个用作对照，不用NTG处理。在每个管中加入10μl NTG溶液或不含有NTG的DMSO溶液。在该阶段，经受NTG处理的试样中NTG的最后浓度是0.1mg/ml。将这些试样在37℃处理5分钟并在冰上放置2分钟，然后将每个试样在15000rpm离心2分钟来收集细胞。
将从每个试样收集的细胞用冰冷却的SEII培养基洗涤两次，然后悬浮在3ml SEII+MT培养基(组成含有L-蛋氨酸(1g/L)和L-苏氨酸(10g/L)的SEII培养基)中，在37℃培养过夜。在该阶段，提取各试样的一部分并接种在SEII琼脂培养基(组成含有1.5％(v/v)琼脂的SEII培养基)上，用出现的菌落数(活细菌的数目)来计算由NTG处理所导致的死亡率。死亡率以[经受NTG处理的试样中的活细胞数目/仅用DMSO溶液处理的试样中的活细胞数目]表示。
在NTG处理的第二天，将部分上述培养液接种到SEII+MT培养基中，并在37℃培养来增殖细菌。当培养液在660nm波长的吸光度(OD 660nm)变成大约0.5时，加入相等体积的20％DMSO溶液(最后浓度10％)以保存细胞，充分搅拌培养液，然后在-80℃储存。
进一步地，将部分培养液接种到SEII-MT琼脂培养基上，SE-II琼脂培养基含有50μg/ml的抗生素—链霉素(Sm)，并测定Sm-抗性株的出现频率，即突变率。结果，突变率是大约4×10-6。
将用NTG处理的细菌的储液在室温下解冻，制备其1至1/107倍的系列稀释液并接种在SEII-MT琼脂培养基上。细胞在37℃培养2天，证实稀释水平为每个琼脂板上形成100至200个菌落。然后，将细菌储液重新稀释到该浓度，并接种到SEII+MT琼脂培养基上。将细胞在37℃培养3天，然后在SEII琼脂培养基板上和SEII+MT琼脂培养基板上复制出现的菌落，挑选能在SEII+MT琼脂培养基上生长，但不能在SEII琼脂培养基中生长的菌落。然后，将挑选出的菌落连续接种在各个SEII琼脂培养基、SEII+M琼脂培养基(组分在SEII培养基中含有L-蛋氨酸(1g/L)的琼脂培养基)、SEH+T琼脂培养基(组分在SEII培养基中含有L-苏氨酸(10g/L)的琼脂培养基)和SEII+MT琼脂培养基中，证实这些克隆的氨基酸营养缺陷体是否是L-蛋氨酸、L-苏氨酸或者二者的营养缺陷体。
结果能够得到两种L-蛋氨酸营养缺陷株和一种L-苏氨酸营养缺陷株。它们分别被指定为MR 102株、MR 103株和TR 115株。在本实验中不能得到生长同时需要这两种氨基酸的任何菌株。
实施例21、向嗜甲基菌属细菌中引入衍生自短杆菌属(Brevibacterium)细菌的lysE基因(1)pRSlysE24的构建为了向嗜甲基菌属细菌中引入LysE基因(其在谷氨酸棒杆菌中编码显示出分泌赖氨酸活性的蛋白)，使用已知的质粒pRS(参见以日语公开的国际专利公开(Kohyo)No.3-501682)来构建用于lysE表达的质粒pRSlysE。pRS是一种具有pVIC40质粒(国际专利公开WO90/04636，日语公开的国际专利公开No.3-501682)的载体片段的质粒，并且由pVIC40通过去除编码质粒中包含的苏氨酸操纵子的DNA区域得到。质粒pVIC40衍生自宽范围宿主载体质粒pAYC32(Chistorerdov，A.Y.，Tsygankov，Y.D.，Plasmid，1986，16，161-167)，而pAYC32衍生于RSF1010。
首先，由pRS构建具有tac启动子的质粒pRStac。pRStac质粒是如下构建的。将pRS载体用限制酶EcoR1和PstI消化，加入到苯酚/氯仿溶液中并混合来中止反应。将反应混合物离心后，收集上层，通过用乙醇沉淀收集DNAs，在0.8％的琼脂糖凝胶上分离。用EASY TRAP Ver.2(DNA收集试剂盒，TakaraShuzo)收集8000碱基对(“kbp”)的DNA片段。另一方面，通过使用作为模板的pKK223-3质粒(表达载体，Pharmacia)和SEQ ID NOS1和2中所示的引物进行PCR来扩增tac启动子区域(将由在94℃变性20秒，在55℃退火30秒和在72℃延伸反应60秒组成的循环重复循环30次)。使用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo)进行PCR。将含有扩增的tac启动子的DNA片段用PCRpep(Promega)纯化，然后在引物上预先设计的限制酶位点上消化，即在EcoR1和EcoT22I位点。然后，将反应混合物加入到苯酚/氯仿溶液中，混合终止反应。将反应混合物离心后，收集上层并通过乙醇沉淀收集DNAs和在0.8％琼脂糖凝胶上分离。使用EASY TRAP Ver.2.收集大约0.15kbp的DNA片段。
使用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo)，将pRS载体的消化产物和如上制备的tac启动子区域片段连接起来。该连接反应溶液用于转化大肠杆菌(大肠杆菌JM109感受态细胞，Takara Shuzo)。将细胞铺板于含有20mg/L的链霉素的LB琼脂培养基上，在37℃培养过夜。将每个在琼脂培养基上出现的菌落接种到含有20mg/L链霉素的LB液体培养基上，在37℃振荡培养8小时。通过碱-SDS方法从各培养液提取质粒DNA，各个质粒的结构通过限制酶消化来证实，从而得到pRStac。选择在pRS载体和tac启动子上的链霉素抗性基因的转录方向彼此相同的质粒作为pRStac。
将如上所述得到的pRStac用Sse8387I(Takara Shuzo)和SapI(New EnglandBiolabs)消化，加入到苯酚/氯仿溶液中，通过混合来终止反应。将反应混合物离心后，收集上层并通过用乙醇沉淀收集DNAs，并且在0.8％琼脂糖凝胶上分离，得到大约9.0kbp的DNA片段。
lysE基因片段也通过使用从乳发酵短杆菌2256株(Corynebacteirumglutamicum ATCC13869)提取的染色体为模板和SEQ ID NOS5和6所示的引物进行PCR来扩增(在94℃变性20秒，在55℃退火30秒和在72℃延伸反应90秒)。使用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo)用于PCR。为了能够在嗜甲基菌属细菌中表达lysE基因，对引物进行设计以使来源于lysE基因的翻译起始密码子的9-15bp的核苷酸应当被已知的在嗜甲基菌属细菌中起作用的序列代替(Wybon，N.R.，Mills，J.，Williamis，S.G.和Jones，C.W.，Eur.J.Biochem.，240，314-322(1996))。使用PCRprep(Promega)纯化得到的片段，然后用Sse8387I和SapI消化。将反应混合物加入到苯酚/氯仿溶液中，混合以终止反应。将反应混合物离心后，收集上层并通过乙醇沉淀收集DNAs，并进一步在0.8％琼脂糖凝胶中收集。
使用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo)，将pRStac载体的消化产物和如上制备的lysE基因区域片段连接起来。该连接反应溶液用于转化大肠杆菌(大肠杆菌JM109感受态细胞，Takara Shuzo)。将细胞铺板于含有20mg/L的链霉素的LB琼脂培养基上，在37℃培养过夜。将每个在琼脂培养基上出现的菌落接种到含有20mg/L链霉素的LB液体培养基上，在37℃振荡培养8小时。通过碱-SDS方法从各培养液提取质粒DNA，各个质粒的结构通过限制酶消化和核苷酸序列的测定来证实，从而得到pRSlysE。在pRSlysE中，使lysE基因定位以便其转录方向与tac启动子的转录方向相同。
(2)将pRSlysE引入到嗜甲基菌属细菌将如上所述得到的pRSlysE通过电穿孔(Canadian Journal of Microbiology，43，197(1997))引入到食甲基嗜甲基菌AS1株(NCIMB10515)。此外，还以与pRSlysE相同的方式将pRS引入到AS1株中作为对照。结果每1μg用作为对照的pSR的DNA得到数千个菌落，而用pRSlysE则仅获得几个菌落。
当从据判断含有pRSlysE的转化菌株中提取质粒并研究其核苷酸序列时，发现对于所有被研究的质粒在编码lysE的区域中都引入了一种自发的突变，在一些情况下，无义突变被引入，其中编码氨基酸的密码子被终止翻译的终止密码子代替。此外，在其它质粒中，观察到lysE基因缺失。可以认为在上述任一情况下，由这样的质粒所携带的lysE功能已丧失。
如上所述，向食甲基嗜甲基菌中引入带有完整长度lysE基因的pRSlysE的频率非常低，并且只有具有包含消除功能的突变的lysE突变基因的质粒才能被引入。结合考虑这些因素，得出向食甲基嗜甲基菌中引入lysE基因将有致命作用的判断。这暗示lysE基因对异源的细菌中的L-赖氨酸分泌普遍不起作用。
将引入突变的具有pRSlysE的食甲基嗜甲基菌AS1株涂在含有20mg/L链霉素的SEII板上，在37℃培养过夜。然后，刮取大约0.3cm2培养基表面的细胞，接种到含有20mg/L链霉素的SEII生产培养基(20ml)中，在37℃振荡培养34小时。培养完成之后，离心除去细胞，并使用氨基酸分析仪(NihonBunko，高速液相色谱)测定培养物上清液中L-赖氨酸的浓度。结果，尽管引入突变lysE基因，基本上没有得到L-赖氨酸分泌增强的菌株。
2、提供在嗜甲基菌属细菌中分泌L-赖氨酸的活性的基因的获得如上一部分所述，暗示已知的lysE基因在嗜甲基菌属细菌中是致命的，结果随后得到了许多失去了功能的突变基因。
在进行含有突变的pRSlysE的分析中，得到了在嗜甲基菌属细菌中起作用但不致命的突变的lysE基因。
该突变的lysE基因称作lysE24基因。当分析lysE24基因的核苷酸序列时，发现该突变不能导致氨基酸的取代，而是得到一种在lysE翻译区域中心周围引入终止密码子的无义突变。在lysE24中，T(胸腺嘧啶)插入在SEQ ID NO17所示的野生型lysE基因的355位的G(鸟嘌呤)之后。这个带有lysE24的质粒被指定为pRSlysE24。
被pSRlysE24转化的大肠杆菌JM109株被指定为AJ13830，该菌株于2001年6月4日保藏在独立的管理机构，独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，国际专利组织保藏中心，并得到FERM P-18369的保藏号。然后，于2002年5月13日将其转移到布达佩斯条约规定下的国际保藏中心，得到FERM BP-8040的保藏号。
实施例3生产赖氨酸的质粒pSEA10和pSEA12的构建1、具有dapA*基因的质粒pRSdapA的构建制备了具有编码二氢吡啶二羧酸合酶的基因(dapA*)的质粒，其作为L-赖氨酸生物合成系统酶基因，不受L-赖氨酸的反馈抑制。
将实施例2中制备的pRStac用Sse8387I和XbaI消化，加入到苯酚/氯仿溶液中，混合以终止反应。将反应混合物离心后，收集上层并通过乙醇沉淀收集DNAs，并在0.8％琼脂糖凝胶上分离以收集大约9kbp的DNA片段。
使用已知的含有dapA*基因片段的质粒RSFD80(参见WO90/16042)作为模板，使用SEQ ID NO3和4所示的引物通过PCR来扩增dapA*(在94℃变性20秒，在55℃退火30秒和在72℃延伸反应60秒)。使用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo)进行PCR。将得到的dapA*片段用PCR prep(Promega)纯化，然后用限制酶Sse8387I和XbaI消化。将反应混合物加入到苯酚/氯仿溶液中，混合终止反应。将反应混合物离心后，收集上层并通过乙醇沉淀收集DNAs，并在0.8％琼脂糖凝胶上分离以收集大约0.1kbp的DNA片段。
使用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo)，将pRStac载体的消化产物和如上制备的dapA*基因区域片段连接起来。该连接反应溶液用于转化大肠杆菌(大肠杆菌JM109感受态细胞，Takara Shuzo)。将细胞铺板于含有20mg/L的链霉素的LB琼脂培养基上，在37℃培养过夜。将每个在琼脂培养基上出现的菌落接种到含有20mg/L链霉素的LB液体培养基上，在37℃振荡培养8小时。通过碱-SDS方法从各培养液提取质粒DNA，各个质粒的结构通过用限制酶消化和核苷酸序列的测定来证实，从而得到pRSdapA质粒。在pRSdapA质粒中，对dapA*基因定位，以使其转录方向与tac启动子的转录方向相同。
用PSRdapA质粒转化的大肠杆菌JM109株被指定为AJ13831，该菌株于2001年6月4日保藏在独立的管理机构，独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，国际专利组织保藏中心，并得到FERM P-18370的保藏号。然后，于2002年5月13日将其转移到布达佩斯条约规定下的国际保藏中心，得到FERMBP-8041的保藏号。
2、具有lysE24和dapA*的质粒pSEA10和pSEA12的构建构建了由插入dapA*基因的pRSlysE24组成的质粒，用来评价lysE24和dapA*的结合效果。
将实施例2中制备的pRSlysE24用限制酶SapI消化，使用DNA平端化试剂盒(Takara Shuzo)产生平端。将具有dapA*的质粒pRSdapA用限制酶EcoRI和SapI消化，并将大约1kbp的含有tac启动子和dapA*区域的片段在0.8％琼脂糖凝胶上分离。使用EASY TRAP Ver.2(Takara Shuzo)收集该片段。如上所述将使片段产生平端，并使用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo)连接在上述的pRSlysE24消化产物上。
使用上述连接反应溶液来转化大肠杆菌(大肠杆菌JM109感受态细胞，Takara Shuzo)。将细胞铺板于含有20mg/L的链霉素的LB琼脂培养基上。将琼脂板在37℃培养过夜之后，在琼脂培养基上出现许多菌落。其中，分别将八个菌落接种到含有20mg/L链霉素的LB液体培养基上，在37℃振荡培养8小时。通过碱-SDS方法从各培养液提取质粒DNA，各个质粒的结构通过用限制酶消化和测定核苷酸序列来证实，得到pSEA10和pSEA12质粒。对于这些质粒，对lysE24基因和dapA*基因定位，以使这些质粒的转录方向在前者中相互相反，且在后者中转录方向相互一致。
实施例4将pSEA12引入到食甲基嗜甲基菌AS1株和L-蛋氨酸营养缺陷株(MR102株和MR103株)中(赋予L-蛋氨酸营养缺陷对赖氨酸生产的效果)通过接合转移方法，将携带基因的质粒引入到食甲基嗜甲基菌野生株--AS1株，和两种L-蛋氨酸营养缺陷株-MR102株和MR103株中。在接合过程的前一天，将作为接受株的AS1株、MR102株和MR103株分别在15mlSEII+M培养基(组分含有0.5g/L L-蛋氨酸的SEII培养基)中培养。将具有pRK2013的大肠杆菌HB101株作为移动物接种到10ml的LB(Km)培养基(含有25μg/ml卡那霉素的LB培养基)中，将具有pSEA12的大肠杆菌JM109株作为供体接种到3ml LB(Sm)培养基(含有20μg/ml链霉素的LB培养基)中，并对它们进行培养。
第二天，离心各培养液以收集细胞，并用具有pRK2013的大肠杆菌HB101株和具有pSEA12的大肠杆菌JM109株的LB培养基将细胞洗涤一次。更进一步，还收集上述三株利用甲醇的细菌的细胞，然后用SEII培养基洗涤。然后，将各种大肠杆菌细胞悬浮在LB培养基中，将利用甲醇的细菌的细胞悬浮在SEII培养基中。然后，用环将适量体积的悬浮液在LB琼脂培养基上混合，并在37℃培养4小时，以使pSEA12接合转移到每个AS1株、MR102株和MR103株。然后，从琼脂培养基上刮取各个菌株的细胞并分散在SEII+M(Sm)琼脂培养基(培养基组分含有Sm(50μg/(ml))的SEII+M琼脂培养基)上，在37℃培养两天来选择转化物。将培养基上出现的各个单个菌落再在新鲜的SEII+M(Sm)琼脂培养基上分散两次，以便分离作为目的菌株的MR102(pSEA12)菌株和MR103(pSEA12)菌株，以及作为对照菌株的AS1(pSEA12)菌株。
将上述三种菌株的每一种涂在SEII+M(Sm)琼脂板上，在37℃培养过夜。然后，刮取大约0.3cm2(平方厘米)培养基表面上生长的细胞，接种到含有各种不同浓度L-蛋氨酸的SEII生产培养基(20ml)中，在37℃振荡培养48小时。培养完成之后，离心除去细胞，并使用氨基酸分析仪(Nihon Bunko，高速液相色谱)测定培养物上清液中L-赖氨酸的浓度。结果，用AS1(pSEA12)菌株所得到的培养基中L-赖氨酸的聚集最多为0.96g/L。然而，MR102株和MR103株的被引入pSEA12的菌株则显示出培养基中L-赖氨酸的聚集分别为1.675g/L和1.57g/L，当向生产培养基中加入0.0075g/L L-蛋氨酸时，培养基中L-赖氨酸的聚集被显著提高。
实施例5从食甲基嗜甲基菌AS1株制备L-蛋氨酸营养缺陷株(MR701)和通过将pSEA10引入到相同的菌株制备产生赖氨酸的细菌1、metA基因破坏的菌株的制备从食甲基嗜甲基菌AS1株，通过基因破坏制备基因破坏片段，从而获得L-蛋氨酸营养缺陷株。对于要被破坏的基因，选择与结核分支杆菌H37Rv株的metA基因(GenBank登记号CAA17113)高度同源的基因区域，该基因被认为可以编码高丝氨酸邻乙酰基转移酶。将该区域使用SEQ ID NOS7和10所示的DNA引物通过PCR进行扩增(反应条件使用TaKaRa Ex Taq，将94℃变性30秒，60℃退火30秒和72℃进行DNA链延伸反应4分钟的反应步骤组成的循环重复25次)。该区域的DNA序列和被其编码的氨基酸序列在SEQ IDNOS15和16中给出，并且将该基因指定为metA基因。
为了得到来自野生株AS1的染色体DNA，将AS1株接种到50ml SEII培养基(组成5g/L(NH4)2SO4、1.9g/L K2HPO4、1.56g/L NaH2PO4·2H2O、200mg/LMgSO4·7H2O、72mg/L CaCl2·6H2O、5μg/L CuSO4·5H2O、25μg/L MnSO4·5H2O、23μg/L ZnSO4·7H2O、9.7mg/L FeCl3·6H2O、0.5％(v/v)甲醇)并且在37℃振荡培养过夜。然后，离心培养液收集细胞，使用市场上可以购买的试剂盒(Genomic DNA纯化试剂盒(由Edge Biosystems生产)制备染色体的DNA。
使用所得到的染色体的DNA作为模板，用SEQ ID NOS7和8所示的DNA引物来进行PCR(反应条件使用TaKaRa Ex Taq，将94℃变性30秒，60℃退火30秒和72℃进行DNA链延伸反应2分钟的反应步骤组成的循环重复25次)，并由此得到大约1.3kb的片段。也可以在相同条件下使用SEQ ID NOS9和10所示的引物进行PCR，得到具有大约2.0kb大小的DNA片段。
还可以使用作为模板的质粒pKD4(GenBank登记号AY048743，Datsenko，K.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，97(12)，6640-6645，2000)和在SEQ IDNOS11和12中所示的引物在上述相同条件下进行PCR，得到含有卡那霉素抗性基因的DNA片段(大约1.5kb)。
将上述三种DNA片段混合并作为模板与SEQ ID NOS13和14所示的引物一起进行PCR(反应条件使用TaKaRa Ex Taq，将94℃变性30秒，60℃退火30秒和72℃进行DNA链延伸反应4分30秒的反应步骤组成的循环重复25次)，并由此得到大约4.2kb的片段。使用市场上可以购买到的试剂盒(由Promega生产的Wizard PCR Preps DNA纯化系统)纯化片段，然后用乙醇沉淀，将沉淀悬浮在TE中。该DNA溶液作为用于基因破坏的片段被用于以下的操作。该基因片段具有由插入卡那霉素抗性基因的metA基因组成的结构。
然后，将上述基因片引入到食甲基嗜甲基菌AS1株中。使用电穿孔方法(Canadian Journal of Microbiology，43，197(1997))进行转化。将电穿孔的细胞涂在SEII琼脂培养基上(加入了20mg/L卡那霉素和0.5g/L的L-蛋氨酸)。培养48小时后，出现数十个菌落。其中，随机挑选13个菌株并检测L-蛋氨酸营养缺陷体。结果，所有这些菌株显示出L-蛋氨酸营养缺陷。将通过基因破坏得到的L-蛋氨酸营养缺陷株称作MR701株。
用PCR方法证实目的基因的破坏。也就是，将上述出现的菌落悬浮在20μl无菌水中，加入5μl 1mg/ml蛋白酶K和25μl缓冲液(40mM Tris、0.5％Tween20、1％Nonidet P-40、1mM EDTA(用HCl将pH调至8.0))，在60℃反应20分钟和在95℃反应5分钟。将该反应混合物用作PCR的模板。使用SEQ ID NOS7和10所示的序列作为引物进行PCR(反应条件使用TaKaRa Ex Taq，将94℃变性30秒，60℃退火30秒和72℃进行DNA链延伸反应4分30秒的反应步骤组成的循环重复25次)，来证实目的基因的破坏。
2、metA基因破坏的菌株的L-赖氨酸生产能力的评价随后，将实施例3描述的pSEA10引入到上述得到的MR701株中，研究该菌株的L-赖氨酸的产生能力。通过电穿孔将pSEA10引入到MR701株，并将得到转化物称作MR701(pSEA10)。将AS1(pSEA10)株分散在SEII(Sm)琼脂培养基上(含有50μg/ml链霉素的SEII琼脂培养基)，将MR701(pSEA10)株分散在SEII+M(Sm Km)琼脂培养基上(含有0.5g/ml L-蛋氨酸、50μg/ml链霉素和20μg/ml卡那霉素的SEII琼脂培养基)。细胞在37℃培养过夜后，刮取大约0.3cm2(平方厘米)生长在培养基表面的细胞，接种到含有0.075g/L L-蛋氨酸(加入50μg/ml链霉素)的SEII生产培养基(20ml)中，在37℃振荡培养48小时。培养完成之后，离心除去细胞，并使用氨基酸分析仪(Nihon Bunko，高速液相色谱)测定培养物上清液中L-赖氨酸的浓度。结果发现聚集在AS1(pSEA12)株的培养基中L-赖氨酸的量为0.97g/L，然而在MR701((pSEA10)株的培养基中L-赖氨酸的聚集量为1.52g/L，因此可以证实通过赋予L-蛋氨酸营养缺陷改善了L-赖氨酸的生产能力。
SEQ ID NO1扩增tac启动子区域的引物SEQ ID NO2扩增tac启动子区域的引物SEQ ID NO3扩增dapA*基因的引物
SEQ ID NO4扩增dapA*基因的引物SEQ ID NO5扩增lysE基因的引物SEQ ID NO6扩增lysE基因的引物SEQ ID NO7扩增metA基因的引物SEQ ID NO8扩增metA基因的引物SEQ ID NO9扩增metA基因的引物SEQ ID NO10扩增metA基因的引物SEQ ID NO11扩增卡那霉素抗性基因的引物SEQ ID NO12扩增卡那霉素抗性基因的引物SEQ ID NO13扩增metA基因破坏片段的引物SEQ ID NO14扩增metA基因破坏片段的引物SEQ ID NO15metA的核苷酸序列SEQ ID NO16由metA编码的氨基酸序列SEQ ID NO17lysE的核苷酸序列SEQ ID NO18由lysE编码的氨基酸序列序列表<110>Ajinomoto Co.，Inc.
<120>使用利用甲醇的细菌生产L-赖氨酸的方法<130>OP1631<150>JP 2003-20513<151>2003-01-29<160>18<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明引物<400>1agggaattcc ccgttctgga taatgttttt tgcgccgac39<210>2<211>58<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明引物<400>2cggatgcatc tagagttaac ctgcagggtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacac 58<210>3<211>35<212>DNA<213>人工序列
<220>
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<223>人工序列的说明引物<400>7tgagtgcaaa tttgacctca tcgtcagcaa 30<210>8<211>64<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明引物<400>8ccagcctaca caatcgctca agacgtgtaa tgcaaggttt cataagcaag atggtattgt 60ggca 64<210>9<211>63<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明引物<400>9ggctaattcc catgtcagcc gttaagtgtt gcagataacg ccttgcccgt caaatatgcc 60gag 63<210>10<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明引物<400>10acaggctgtt ccatgcctct gcagagggcg 30<210>11<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明引物<400>11gcattacacg tcttgagcga ttgtgtaggc 30<210>12<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明引物<400>12ggaacactta acggctgaca tgggaattag cc 32<210>13<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明引物<400>13atgacccaca cttgcaacaa ggcgatttgc 30<210>14<211>30<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明引物<400>14gaaggggttg ccttgtttga tgccactggc 30<210>15<211>4310<212>DNA<213>食甲基嗜甲基菌(Methylophilus methylotrophus)<220>
<221>CDS<222>(1236)..(2363)<400>15tgagtgcaaa tttgacctca tcgtcagcaa cccgccttat atcgaaggca atgacccaca 60cttgcaacaa ggcgatttgc gcttcgaacc tttatcagcc ctggcatccg gtgctgatgg 120tctgcaagat atccgccaga tcattgccca ggcacccgcc tacttaaatg aagggggctg 180gttgatgctg gaacatggtt acaaccaagc tccagcagtc caaaaattat tgaacgcaca 240tggttttcaa gacatccaaa ccatcaagga tctgggcgat aatcctcgcg tcacccttgg 300acaaataggc agcaccaacc cagtatgatt tttgcttgag taaagatacg ttagtctcaa 360gtatcatttt ctggaaaaaa cattatgcaa tctatcccac atatcaaagc cgttttattt 420gacctggatg gcgtgctcta catcggcaaa cagctgattc ccggcgcatt gtccgctgtg 480gcacagttgc gcaaagcagg gattgccgtg cgctttgtca ccaataccag cacactttcc 540ctaaactcac tccagcaaaa gctgaacgac ctcggcttca atacggtgcc cgaagaaatc 600atgagtgcac cacaagcgac catccagtat ttaaaaaagc aatccaatcc ggtttgcaaa 660ctattgctgg cagaggacgt taaaaaggac tttgcctgct ttgaccagtc tgcaaccgca 720gccaattatg tggtgattgg tgatatcggt gaccagtggt cttatgagtt attgaatgaa 780gtgtttcatt gcctggtgaa tggtgctcag ttaatcgcga ttcataaaaa ccgtttctgg 840caaaccgaaa ctggcttgca aatggatatt ggtgcctttg ttaccggcct ggaatatgcc 900agcaacaccc aggccatgct catgggtaaa ccttcccgcc attttttcaa tcaggtggtg 960gatacattac ggatgaagcc ttctgatatc gtgatggtgg gtgacgatat tgatgccgat 1020gtgggtggcg cgcaggatgc tggactgcat ggcattctgg tgaaaaccgg caagtaccgc 1080gaaacctata cccgcctttc agcgattgag ccagatgcga ttatccaatc cgtcgcagac 1140cttcccacgt tgctgggttg tttatcgatt cagacccatt aaacgcaact tagcctgtct 1200cgccgtttcg gcatgctgca tagtataatc gcggc atg tct gaa tcg aat tct1253Met Ser Glu Ser Asn Ser1 5
gtt ggt atc gtt aaa gcg cag gtt gcg cac ttc acc cag ccg ctg acc 1301Val Gly Ile Val Lys Ala Gln Val Ala His Phe Thr Gln Pro Leu Thr10 15 20ctt aaa agc ggc gct gtg ttg cca caa tac cat ctt gct tat gaa acc 1349Leu Lys Ser Gly Ala Val Leu Pro Gln Tyr His Leu Ala Tyr Glu Thr25 30 35tat ggt gaa ctc aac gcg gcc aaa acc aat gcg gta ttg att tgt cac 1397Tyr Gly Glu Leu Asn Ala Ala Lys Thr Asn Ala Val Leu Ile Cys His40 45 50gcc ttg tcc ggc aat cat cat gtc gct ggt cgc tat tcg ccg gaa gat 1445Ala Leu Ser Gly Asn His His Val Ala Gly Arg Tyr Ser Pro Glu Asp55 60 65 70aaa tat cct ggc tgg tgg gat aac ctt gtt ggc ccc ggt aag cca ctg 1493Lys Tyr Pro Gly Trp Trp Asp Asn Leu Val Gly Pro Gly Lys Pro Leu75 80 85gat acc aac aag ttt ttt gtg att ggc ctc aac aat ctg ggc ggc tgt 1541Asp Thr Asn Lys Phe Phe Val Ile Gly Leu Asn Asn Leu Gly Gly Cys90 95 100cac ggt agt agc ggc cct tcc agc gta aat cca ctc act gac cgg cct 1589His Gly Ser Ser Gly Pro Ser Ser Val Asn Pro Leu Thr Asp Arg Pro105 110 115tac agt gca acg ttc cca gtc gtg acg gta gaa gac tgg gtg gaa tct 1637Tyr Ser Ala Thr Phe Pro Val Val Thr Val Glu Asp Trp Val Glu Ser120 125 130cag gcg cgc ctg ttg gat tat ctt gga att gac caa ctg gca gcc gtg 1685Gln Ala Arg Leu Leu Asp Tyr Leu Gly Ile Asp Gln Leu Ala Ala Val135 140 145 150att ggt ggc agc ctg gga ggc atg caa gcg ctg cac tgg aat att gtc 1733Ile Gly Gly Ser Leu Gly Gly Met Gln Ala Leu His Trp Asn Ile Val155 160 165tac ccc gag cgt gta cgg cat gcc ttt gtc att gcc tct gcg ccc aac 1781Tyr Pro Glu Arg Val Arg His Ala Phe Val Ile Ala Ser Ala Pro Asn170 175 180ctg acc gca cag aac atg gcc ttt aac gaa gtg gca cgc cag gcg att 1829Leu Thr Ala Gln Asn Met Ala Phe Asn Glu Val Ala Arg Gln Ala Ile185 190 195att acc gac ccc gag ttt ttt gac ggc gat tat tat aat cat ggc acc 1877Ile Thr Asp Pro Glu Phe Phe Asp Gly Asp Tyr Tyr Asn His Gly Thr200 205 210gtc ccc cgc cgc ggc ttg cgt att gcc cgt atg ctg ggg cat atc acc 1925Val Pro Arg Arg Gly Leu Arg Ile Ala Arg Met Leu Gly His Ile Thr
215 220 225 230tac ttg tca gat gac gcc atg ggt gaa aaa ttt ggc cgc aaa ttg cgc 1973Tyr Leu Ser Asp Asp Ata Met Gly Glu Lys Phe Gly Arg Lys Leu Arg235 240 245cat ggc gat gtg aag tac agc ttt gat gtc gaa ttt gaa atg gaa tct 2021His Gly Asp Val Lys Tyr Ser Phe Asp Val Glu Phe Glu Met Glu Ser250 255 260tac ttg cgc tat cag ggc gac aag ttt gcc ggg gaa ttt gat gcc aac 2069Tyr Leu Arg Tyr Gln Gly Asp Lys Phe Ala Gly Glu Phe Asp Ala Asn265 270 275acc tat ttg cgc atg aca cgc gca ctg gac tat ttt gac ccg gcc ctc 2117Thr Tyr Leu Arg Met Thr Arg Ala Leu Asp Tyr Phe Asp Pro Ala Leu280 285 290gat tat gac ggc aat tta agc aag gcg ctc agc cgt gcc aag gcc aag 2165Asp Tyr Asp Gly Asn Leu Ser Lys Ala Leu Ser Arg Ala Lys Ala Lys295 300 305 310ttt gtc gtc atc tcg ttt acc act gac tgg cgc ttt tcg cct gcc cgc 2213Phe Val Val Ile Ser Phe Thr Thr Asp Trp Arg Phe Ser Pro Ala Arg315 320 325tca cgc gaa att gtc cag gcc ttg ctg gat aac gcc ttg ccc gtc aaa 2261Ser Arg Glu Ile Val Gln Ala Leu Leu Asp Asn Ala Leu Pro Val Lys330 335 340tat gcc gag gta act tct gcc cat ggc cat gac gct ttc ttg atg ccg 2309Tyr Ala Glu Val Thr Ser Ala His Gly His Asp Ala Phe Leu Met Pro345 350 355gat gcg cat tac cac gcc atc atg cgc gcc tac ctg gag caa atc aaa 2357Asp Ala His Tyr His Ala Ile Met Arg Ala Tyr Leu Glu Gln Ile Lys360 365 370gta tga cgaatgcaaa tattaccaat attcgcccag actttgcatt aattacaaac2413Val375tgggtgcaag caaaagccaa agtgctggat ctcggttgtg gcgatggcac actgctcacg 2473catttacatg aaaccctgag caccaccggc tatggcatcg aaaaagatga tggtaactgg 2533ctggcagcct taaaaaacgg ggtggacgtg attcaaatga accttgaaga aggcctgtcc 2593ggctttgaag accagtcatt cgacacggtc atcctgtcgc agactttgca agccatgcac 2653aatactgaga gcatcgtgca cgaaatgctg cgtgttggcc gcgaaatcat cgtgactttc 2713cccaattttg gctattggcg caaccgcctg caaatcacgc tggggaatat gccggtctcc 2773aaaagcctgc catatcaatg gtatgacacg cccaacgtgc atttatgcac catccacgac 2833tttgaccact tttgccgcca gcacaacatt caagtcattg aacgtaaagt gattaccgat 2893ggccaggata ttcatttttt gcctaacctg ctgggcaatc tcgcaatgta ccggttgaaa 2953cgcgccgcct aatcccgaca agagaccaaa gggtgccctt aagaaagatt gagcgctttc 3013
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Asn Asn Leu Gly Gly Cys His Gly Ser Ser Gly Pro Ser Ser Val Asn100 105 110Pro Leu Thr Asp Arg Pro Tyr Ser Ala Thr Phe Pro Val Val Thr Val115 120 125Glu Asp Trp Val Glu Ser Gln Ala Arg Leu Leu Asp Tyr Leu Gly Ile130 135 140Asp Gln Leu Ala Ala Val Ile Gly Gly Ser Leu Gly Gly Met Gln Ala145 150 155 160Leu His Trp Asn Ile Val Tyr Pro Glu Arg Val Arg His Ala Phe Val165 170 175Ile Ala Ser Ala Pro Asn Leu Thr Ala Gln Asn Met Ala Phe Asn Glu180 185 190Val Ala Arg Gln Ala Ile Ile Thr Asp Pro Glu Phe Phe Asp Gly Asp195 200 205Tyr Tyr Asn His Gly Thr Val Pro Arg Arg Gly Leu Arg Ile Ala Arg210 215 220Met Leu Gly His Ile Thr Tyr Leu Ser Asp Asp Ala Met Gly Glu Lys225 230 235 240Phe Gly Arg Lys Leu Arg His Gly Asp Val Lys Tyr Ser Phe Asp Val245 250 255Glu Phe Glu Met Glu Ser Tyr Leu Arg Tyr Gln Gly Asp Lys Phe Ala260 265 270Gly Glu Phe Asp Ala Asn Thr Tyr Leu Arg Met Thr Arg Ala Leu Asp275 280 285Tyr Phe Asp Pro Ala Leu Asp Tyr Asp Gly Asn Leu Ser Lys Ala Leu290 295 300Ser Arg Ala Lys Ala Lys Phe Val Val Ile Ser Phe Thr Thr Asp Trp305 310 315 320Arg Phe Ser Pro Ala Arg Ser Arg Glu Ile Val Gln Ala Leu Leu Asp325 330 335Asn Ala Leu Pro Val Lys Tyr Ala Glu Val Thr Ser Ala His Gly His340 345 350Asp Ala Phe Leu Met Pro Asp Ala His Tyr His Ala Ile Met Arg Ala355 360 365Tyr Leu Glu Gln Ile Lys Val370 375<210>17<211>711<212>DNA<213>乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)
<220>
<221>CDS<222>(1)..(711)<400>17atg gtg atc atg gaa atc ttc att aca ggt ctg ctt ttg ggg gcc agt 48Met Val Ile Met Glu Ile Phe Ile Thr Gly Leu Leu Leu Gly Ala Ser1 5 10 15ctt tta ctg tcc atc gga ccg cag aat gta ctg gtg att aaa caa gga 96Leu Leu Leu Ser Ile Gly Pro Gln Asn Val Leu Val Ile Lys Gln Gly20 25 30att aag cgc gaa gga ctc att gcg gtt ctt ctc gtg tgt tta att tct 144Ile Lys Arg Glu Gly Leu Ile Ala Val Leu Leu Val Cys Leu Ile Ser35 40 45gac gtc ttt ttg ttc atc gcc ggc acc ttg ggc gtt gat ctt ttg tcc 192Asp Val Phe Leu Phe Ile Ala Gly Thr Leu Gly Val Asp Leu Leu Ser50 55 60aat gcc gcg ccg atc gtg ctc gat att atg cgc tgg ggt ggc atc gct 240Asn Ala Ala Pro Ile Val Leu Asp Ile Met Arg Trp Gly Gly Ile Ala65 70 75 80tac ctg tta tgg ttt gcc gtc atg gca gcg aaa gac gcc atg aca aac 288Tyr Leu Leu Trp Phe Ala Val Met Ala Ala Lys Asp Ala Met Thr Asn85 90 95aag gtg gaa gcg cca cag atc att gaa gaa aca gaa cca acc gtg ccc 336Lys Val Glu Ala Pro Gln Ile Ile Glu Glu Thr Glu Pro Thr Val Pro100 105 110gat gac acg cct ttg ggc ggt tcg gcg gtg gcc act gac acg cgc aac 384Asp Asp Thr Pro Leu Gly Gly Ser Ala Val Ala Thr Asp Thr Arg Asn115 120 125cgg gtg cgg gtg gag gtg agc gtc gat aag cag cgg gtt tgg gta aag 432Arg Val Arg Val Glu Val Ser Val Asp Lys Gln Arg Val Trp Val Lys130 135 140ccc atg ttg atg gca atc gtg ctg acc tgg ttg aac ccg aat gcg tat 480Pro Met Leu Met Ala Ile Val Leu Thr Trp Leu Asn Pro Asn Ala Tyr145 150 155 160ttg gac gcg ttt gtg ttt atc ggc ggc gtc ggc gcg caa tac ggc gac 528Leu Asp Ala Phe Val Phe Ile Gly Gly Val Gly Ala Gln Tyr Gly Asp165 170 175acc gga cgg tgg att ttc gcc gct ggc gcg ttc gcg gca agc ctg atc 576Thr Gly Arg Trp Ile Phe Ala Ala Gly Ala Phe Ala Ala Ser Leu Ile
180 185 190tgg ttc ccg ctg gtg ggt ttc ggc gca gca gca ttg tca cgc ccg ctg 624Trp Phe Pro Leu Val Gly Phe Gly Ala Ala Ala Leu Ser Arg Pro Leu195 200 205tcc agc ccc aag gtg tgg cgc tgg atc aac gtc gtc gtg gca gtt gtg 672Ser Ser Pro Lys Val Trp Arg Trp Ile Asn Val Val Val Ala Val Val210 215 220atg acc gca ttg gcc atc aaa ctg atg ttg atg ggt tag 711Met Thr Ala Leu Ala Ile Lys Leu Met Leu Met Gly225 230 235<210>18<211>236<212>PRT<213>乳发酵短杆菌<400>18Met Val Ile Met Glu Ile Phe Ile Thr Gly Leu Leu Leu Gly Ala Ser1 5 10 15Leu Leu Leu Ser Ile Gly Pro Gln Asn Val Leu Val Ile Lys Gln Gly20 25 30Ile Lys Arg Glu Gly Leu Ile Ala Val Leu Leu Val Cys Leu Ile Ser35 40 45Asp Val Phe Leu Phe Ile Ala Gly Thr Leu Gly Val Asp Leu Leu Ser50 55 60Asn Ala Ala Pro Ile Val Leu Asp Ile Met Arg Trp Gly Gly Ile Ala65 70 75 80Tyr Leu Leu Trp Phe Ala Val Met Ala Ala Lys Asp Ala Met Thr Asn85 90 95Lys Val Glu Ala Pro Gln Ile Ile Glu Glu Thr Glu Pro Thr Val Pro100 105 110Asp Asp Thr Pro Leu Gly Gly Ser Ala Val Ala Thr Asp Thr Arg Asn115 120 125Arg Val Arg Val Glu Val Ser Val Asp Lys Gln Arg Val Trp Val Lys130 135 140Pro Met Leu Met Ala Ile Val Leu Thr Trp Leu Asn Pro Asn Ala Tyr145 150 155 160Leu Asp Ala Phe Val Phe Ile Gly Gly Val Gly Ala Gln Tyr Gly Asp165 170 175Thr Gly Arg Trp Ile Phe Ala Ala Gly Ala Phe Ala Ala Ser Leu Ile180 185 190
Trp Phe Pro Leu Val Gly Phe Gly Ala Ala Ala Leu Ser Arg Pro Leu195 200 205Ser Ser Pro LyS Val Trp Arg Trp Ile Asn Val Val Val Ala Val Val210 215 220Met Thr Ala Leu Ala Ile Lys Leu Met Leu Met Gly225 230 23权利要求
1.一种生产L-赖氨酸的方法，包括a)培养利用甲醇的细菌，该细菌生长需要L-蛋氨酸并且具有在含有以甲醇为主要碳源的培养基中生产L-赖氨酸的能力b)使L-赖氨酸在培养物中聚集，和c)从培养物中收集L-赖氨酸。
2.根据权利要求1的方法，其中所述细菌是嗜甲基菌属细菌。
3.根据权利要求2的方法，其中所述嗜甲基菌属细菌是食甲基嗜甲基菌。
4.根据权利要求1的方法，其中所述嗜甲基菌属细菌被修饰以便增强二氨基庚二酸合成酶的酶活性和L-赖氨酸分泌系统。
5.一种生长需要L-蛋氨酸且具有产生L-赖氨酸能力的嗜甲基菌属细菌。
6.根据权利要求5的嗜甲基菌属细菌，它是食甲基嗜甲基菌。
7.根据权利要求5的嗜甲基菌属细菌，它被修饰以便增强二氨基庚二酸合成酶的酶活性和L-赖氨酸分泌系统。
全文摘要
通过培养利用甲醇的细菌生产L－赖氨酸，该细菌生长需要L－蛋氨酸并且具有在含有以甲醇为主要碳源的培养基中生产L－赖氨酸的能力，以便在培养物中生产和聚集L－赖氨酸并从培养物中收集L－赖氨酸。
文档编号C12P13/08GK1530438SQ200410007408
公开日2004年9月22日 申请日期2004年1月29日 优先权日2003年1月29日
发明者浅原贵之, 平野圣子, 安枝寿, 子 申请人:味之素株式会社