专利名称：通过rt－pcr对核酸的绝对定量的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及分子生物学。更具体地，本发明涉及实时PCR方法以及基因表达的绝对定量。
背景技术：
基本PCR技术适用于扩增目的DNA序列。在反转录酶PCR(RT-PCR)中，将反转录步骤加入PCR方案中。这采用了用于检测并定量具体mRNA转录物的基本PCR方法。因此，RT-PCR适于测定并比较基因表达水平。有用比较的实例包括在单个生物体的不同组织类型中的表达，在不同生物体的相同组织类型中的表达，以及在相同组织类型中应答于实验处理的表达。定量可以是相对的(即表达为样品间的倍数差异)或绝对的(即表达为RNA的实际量)。
历史上，在反转录步骤中合成cDNA以后，在扩增步骤中使得PCR达到适宜的终点，随后在分离的检测中实施反应产物的定量(即测定步骤)。在已知为“实时”PCR(或″动力学PCR″)的各种RT-PCR中，扩增步骤与检测步骤是结合的。PCR产物随循环的增加(cycle-by-cycle increase)可进行实时定量。这通过在扩增反应中包括“探针”以及常规正向和反向引物来实现。在扩增的序列内发生杂交的所述探针通常为约20-25核苷酸长。可购得的TaqMan探针(Applied Biosystems，Foster City)CA)包括位于5′末端的荧光报道物部分(染料)和位于3′末端的猝灭部分(染料)。在完整的探针中，报道物的荧光通过猝灭部分的内部猝灭作用而受到强烈抑制。由于发展的Taq聚合酶的核酸外切酶作用消化经杂交的探针，所述报道物不被猝灭，产生可检测并可定量的荧光。
通过实时PCR定量mRNA可以是相对或绝对的。在每种情况下，样品中mRNA的定量通过与适宜标准曲线进行参比来进行。如果标准曲线用于相对定量，相对于通常称作“校准物(calibrator)”的基本样品(basis sample)表达所述量。对于试验样品，从标准曲线确定靶量并除以该校准物的值。因此，所述校准物成为lx样品，且所有其它量表达为相对与该校准物的n倍差异(n-fold difference)。例如，在关于药物对基因表达的影响的研究中，未经处理的对照可作为适宜的校准物。由于用实验量除以校准量，标准曲线单位例如荧光强度降低(drop out)。这表示对于相对定量而言，制备适宜的稀释系列(dilution series)以后，任何含有靶序列的RNA或DNA来源可用于产生标准曲线。
反之，通过实时PCR的mRNA绝对定量需要标准物，其中含靶序列的RNA的绝对定量已知是独立的。通常，含有包含靶序列的cDNA的质粒必须获得。含有cDNA(且没有开放读框)的该质粒的限制酶切片段通过凝胶纯化并进行反转录。测定产生的cRNA的A260，并利用所述cRNA制备标准曲线。从A260以及该mRNA的分子量计算互补RNA拷贝数。这在一种基因或少数基因的表达被重复测定时几乎没有困难，例如在HIV患者的临床病毒负荷测定时。然而，在大量不同靶必须通过实时PCR定量时，该绝对定量方法非常耗时费力，从而变得不可行。
发明内容
本发明提供了获得用于产生校准用数据例如标准曲线的cRNA的方法，所述校准用数据用于通过RT-PCR对RNA进行绝对定量。所述方法包括以下步骤(a)提供包含扩增子和位于该扩增子3’的启动子序列的合成的寡核苷酸；(b)通过该合成的寡核苷酸的体外转录合成互补RNA(cRNA)；(c)通过独立方法定量测定所述cRNA；和(d)利用已知量的cRNA产生校准用数据。
优选所述启动子序列是噬菌体启动子序列。用于本发明的启动子序列的实例是T7启动子序列，例如5′CCTATAGTGAGTCGTATTA3′(SEQ IDNO1)。合成的寡核苷酸可选包括与所述扩增子邻接的2-20，优选8-12个核苷酸的5’侧翼序列。本发明一些实施方案中，所述5’侧翼序列含有5-20个连续的胸腺嘧啶残基，即寡d(T)区。合成的寡核苷酸可选包含位于所述扩增子和启动子区之间的2-20，优选8-12个核苷酸的3′侧翼序列。
所述扩增子的长度优选30-70个核苷酸，更优选40-60个核苷酸。所述合成的寡核苷酸的长度优选60-140个核苷酸，更优选70-130个核苷酸，80-120个核苷酸或90-110个核苷酸。
本发明还说明了用于测定受试样品中具体核酸分子例如具体的RNA转录物的丰度的RT-PCR法。所述方法包括以下步骤(a)提供包含扩增子和位于该扩增子3’的启动子序列的合成的寡核苷酸；(b)通过该合成的寡核苷酸的体外转录合成互补cRNA；(c)利用该cRNA产生稀释系列；(d)通过对该cRNA的反转录合成单链cDNA；(e)产生RT-PCR校准用数据；(g)从受试样品获得RT-PCR受试样品；以及(h)比较PC受试样品数据与PCR校准用数据。在本发明优选实施方案中，所述cRNA通过独立方法例如A260定量测定，并且在合成单链cDNA之前与异源RNA例如酵母总RNA混合。
本文术语“扩增子”指在PCR反应中扩增的具体预选出的核苷酸序列。
本文术语“侧翼序列(flanking sequence)”指合成的寡核苷酸中与扩增子邻接的核苷酸序列。5’侧翼序列位于所述扩增子5′。3′侧翼序列位于所述扩增子的3′。
本文中“PCR校准用数据”指利用已知量的、与靶序列相对应的核苷酸序列产生的PCR数据，为进行定量将比较该PCR校准用数据(calibrationdata)与受试数据。所述校准用数据可以是相对或绝对的。
本文术语“标准曲线”指校准用数据的曲线(通常为半-对数型)。
本文术语“合成的寡核苷酸”指含有具体核苷酸序列的核酸，其通过合成有机化学而不是酶聚合在活细胞中产生。
本文术语“靶序列”指待检测的序列，例如目的基因、cDNA或RNA中的序列。
除非另有限定，本文所用所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。如果有冲突，以本发明包括定义在内为准。本文涉及的所有公开出版物，专利和其它对比文件都包含在内作为参考。
以下所述材料，方法和实例仅为示例性的，并且不是限制性的。本发明的其它特征和优点从详细描述和权利要求中也显而易见。
图1是本发明所用的合成的寡核苷酸的总体结构示意图。图1所示结果包括可选的5′和3′侧翼序列。
图2用于通过RT-PCR对mRNA进行绝对定量的标准曲线。纯化的cRNA经过六次连续1∶10逐级稀释，并随后置于(“加入到(spike)”)酵母总RNA背景中。cRNA的每个稀释度都用于合成cDNA，其可用作RT-PCR的起始模板。以一式四份进行RT-PCR(R2＝.9980)。Ct值(循环阈值(cyclethreshold))是RT-PCR实验的输出(output)。Ct是当反应变为指数型(exponential)时的循环数。当出现这种情况时，该等式为真正的(true)Ct＝2初始量。产生未知样品和标准品的Ct。未知样品的Ct值随后与Ct标准曲线进行比较。
图3是柱图，显示本发明mRNA绝对定量的结果。基于图2所示的标准曲线，在来自大鼠肺、肝、肾、心、脾、胸腺、胚胎和脑的组织中确定信使RNA的拷贝数。
发明内容本发明中，已知元件或步骤的新组合已经被集合成简化的方法用于获得cRNA，所述cRNA用于产生通过RT-PCR对RNA进行绝对定量所用的PCR校准用数据。该方法的提高的效率使得其适于在涉及多种不同靶序列的高处理量(high throughput)情况下通过实时RT-PCR对mRNA进行绝对定量。因此，该方法可用于诸如基本生物研究和药物发现程序的情况。
本发明优选避免了任何获得含有包含所述靶序列的cDNA的质粒的需要。此外，本发明避免了产生并纯化含有所述cDNA(并且没有其它可读框)的质粒的限制酶切片段的需要。该扩增是联合利用合成的寡核苷酸与体外转录步骤的结果。体外转录步骤以后，可在修饰后或不加修饰地使用传统的实时PCR法。对于体外转录步骤以后的各个步骤的各个方面的详述，通常见PCR Protocols in Molecular Toxicology，1997，CRC Press.See also，Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，1989，Cold SpringHarbor Press。
如果通过体外转录获得的RNA将用于产生用于RNA的绝对定量的PCR校准用数据，对在体外转录步骤中获得的样品RNA进行定量测定。这可例如通过测定RNA溶液在260nm的吸收(A260)来进行。A260值可转化成RNA浓度值，所述浓度值可基于计算的所涉及RNA分子的分子量转化成拷贝数。
合成的寡核苷酸的设计是本领域熟练技术人员的能力范围内。通常，所述合成的寡核苷酸含有扩增子，启动子序列以及可选的扩增子-侧翼序列(图1)。合成的寡核苷酸的核苷酸序列有赖于这样的考虑，包括扩增子序列、靶序列中该扩增子的侧翼序列以及启动子序列选择。
所述扩增子的长度不重要。优选所述扩增子的长度为30-70个核苷酸。更优选，所述长度为40-60个核苷酸。具体扩增子在PCR系统中的扩增通过设计并合成适宜的正向引物和适宜的反向引物来实现。PCR引物的设计和合成是本领域已知的，引物设计软件，试剂和工具都是可购得的。这种商业化软件的实例是PrimerExpress(Applied Biosystems，Foster City，CA)。
5′侧翼序列和/或3′侧翼序列可以以与所述扩增子相邻的方式被包括。优选，所述侧翼序列都被包括。所述侧翼序列如果存在，其序列和长度不同。可选侧翼序列的长度不重要。优选每种侧翼序列为2-20个核苷酸，更优选8-12个核苷酸。侧翼序列的核苷酸序列不重要。例如，其可设计为与靶基因杂交，但这种互补性不是必要的。在本发明一些实施方案中，所述合成的寡核苷酸中的5’侧翼序列包括聚T尾(poly T tail)或由聚T尾组成。这导致随后产生的cRNA中的相应聚A尾，其可用于引发反转录反应。适宜聚T(聚A)尾的长度为5-20个核苷酸，优选约16个核苷酸。
启动子序列被掺入合成的寡核苷酸。任何在体外转录反应中所用反应条件下有效起作用的启动子序列可使用。噬菌体启动子序列通常用于体外转录反应。用于本发明的启动子的具体实例是T7，SP6和T3启动子。优选的T7启动子序列是T7启动子序列，例如5′CCTATAGTGAGTCGTATTA3′(SEQ ID NO1)。本领域技术人员将认识到启动子末端不总是清楚地限定，且天然存在的启动子序列中可出现较小改变并同时通常可保留(或甚至改进)启动子功能。适宜的启动子序列的选择和掺入可通过本领域技术人员在适当实验中进行。适合用于本发明的启动子序列通常可购得。
合成的寡核苷酸的总长度(即包含扩增子，启动子，以及可选扩增子侧翼序列)必须足够短以允许化学合成并足够长以允许体外转录。在大多数情况下，所述长度为60-140个核苷酸。优选所述长度为70-130个，80-120个或90-110个核苷酸。
合成的寡核苷酸的确切序列根据在上述亚序列组分方面进行的具体选择来设计。一旦设计出，合成的寡核苷酸可通过本领于技术人员利用已知方法，材料和仪器来合成。适用于本发明的合成寡核苷可购得，例如购自Biosearch Technologies，Inc.(Novato，CA和Invitrogen，Inc.(Carlsbad，CA)。
应理解本发明涉及通常可用的分析法。因此，本发明并非对任何具体靶序列，扩增子或合成的寡核苷酸特异。
用于本发明的合成的寡核苷酸可通过任何适宜合成法获得。用于合成具有超过100个核苷酸的预定序列的寡核苷酸的方法、材料和仪器是本领域已知的。见例如Cheng等，2002，Nucleic Acids Research 30(18)e93。用于本发明的常规合成的(custom-synthesized)寡核苷酸可购得，例如购自Biosearch Technologies Inc.(Novato，CA)；Invitrogen(Carlsbad，CA)。所述合成的寡核苷酸的纯化可利用常规技术获得，例如反相HPLC。合成的寡核苷酸的序列可通过标准测序技术确定。
本发明的体外转录步骤可利用已知方法和材料进行。所需产量的获得可包括优化的反应条件，所述条件用于在存在高核苷以及聚合酶浓度时的RNA合成。用于实施体外转录步骤的试剂以及试剂盒时可购得的。适宜的商业化试剂盒为MEGAshortscript T7试剂盒(Ambion，Inc.，Austin，TX；cat.#1354)。部分单链模板可用于体外转录反应。例如，与T7启动子互补的引物可用于产生短的双链区，T7聚合酶可与该区结合并启动转录。可选，双链模板可使用。例如，可使得引物与合成的寡核苷酸的启动子区退火并用DNA聚合酶例如Klenow片段延长它。随后纯化产生的双链模板并用于体外转录。在不同的双链模板法中，与合成的寡核苷酸互补的完整的第二条链可被合成并发生退火。cRNA产物可作为单个种类获得。这可通过例如凝胶电泳证实。
cRNA的正确连续稀释是产生可信的标准曲线所需的。制备和定性RNA标准品通常参见Collins等，1995，Analytical Biochemistry 226120-129。优选的载体RNA是浓度约25ng/ml的酵母总RNA(Ambion，Inc.，Austin，TX；cat.#7118)。
在根据本发明的方法中，cDNA的合成可在传统的反转录反应中实现。用于反转录反应的方法和材料是本领域已知的。见Sambrook等(上述)。用于反转录反应的试剂盒可得自各商业渠道，例如High Capacity cDNAArchive Kit(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)。
本发明还通过以下实施例说明。所述实施例完全为举例目的。它们不限制本发明的范围和内容。
实施例引物，探针设计和寡核苷酸模板Taqman正向和反向引物以及5′FAM标记的MGB探针利用PrimerExpress(Applied Biosystems)从Affymetrix共有序列设计。用于体外转录的寡核苷酸模板可如下构建向所述扩增子的5′和3′末端添加基因特异性序列的10个碱基对，然后将T7启动子区加入3’10碱基对的外部，所述T7启动子由5′CCTATAGTGAGTCGTATTA 3′(SEQ ID NO1)组成。
利用合成的寡核苷酸的体外转录利用部分单链寡核苷酸模板的体外转录反应是利用可购得的试剂盒(T7-MEGAshortscript Kit，Ambion Inc.，Austin，TX)实施的。部分单链模板通过使T7引物(5′AATTTAATACGACTCACTATAGG 3′)，其仅与等摩尔量(20uM)的合成的寡核苷酸模板中的T7启动子区(在10mMTris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA，0.1 MNaCl)中)互补，加热至95℃、5分钟并冷却至室温。部分单链模板(1.5反应浓度)用于根据生产商(Ambion Inc.，Austin，TX)的方案，在37℃进行体外转录反应4小时。寡核苷酸模板DNA通过在37C加入2U无RNase DNase 1(Ambion Inc.，Austin，TX)并保持15分钟而去除。通过加入20μl甲酰胺(50％v/v)、涡旋并在95C加热3分钟终止反应。体外转录反应通过利用可购得的试剂盒根据售出商(vendor)推荐的方案进行纯化(MEGAclear KitTM，Ambion)。
cRNA的浓度通过测定260nm的uv吸收确定。cRNA的质量通过使150ng等分试样在10％TBEurea聚丙烯酰胺(BioRad，Inc.，Hercules，CA)上进行电泳来评估。
合成用于标准曲线的cDNA在大小分级凝胶(sizing gel)上产生正确大小的单个带的RNA制备物被加入(添加入(spike))酵母的经剪切的RNA。首先，对cRNA进行8次连续1∶10的逐级稀释。每个稀释度的等分试样被加入酵母的经剪切的RNA(1μg/μL)(Ambionlnc.，Austin，TX)背景。在8个相应反转录反应(100pL)中产生的互补DNA利用10μg加入的酵母总(sheared)RNA作为模板。该反转录反应利用可购得的试剂盒根据售出商(High-CapacitycDNA Archive Kit，Applied Biosystems)推荐的方案进行。
从试验样品合成cDNA来自肺、肝、肾、心、脾、胸腺、胚胎和脑的大鼠总RNA(10Rg)(Ambion，Inc.)用作cDNA合成反应的模板，所述反应利用反转录试剂盒根据试剂盒售出商(High CapacitycDNA Archive Kit，Applied Biosystems)提供的方案进行。来自每种cDNA合成反应的1μl等分试样(100ng总RNA起始模板)用作每个定量RT-PCR反应的试验样品。
Taqman热循环一式四份的PCR反应(用于标准和试验样品)在96孔板中混合，转入384-孔光板(optical plate)(Applied Biosystems，Foster City，CA)。实时反应在标准7900HT热循环仪(model 7900HT thermal cycler)(Applied Biosystems，Foster City，CA)中循环。热循环仪的条件为50℃、2分钟(尿嘧啶N-去糖基酶消化)；95℃、10分钟(Taq热稳定聚合物酶的活化)；以及利用900nM正向和反向引物，200nM Taqman MGB探针以及1X Universal master mix(Applied Biosystems)在95℃ 15秒、60℃ 60秒进行40个循环。在每个反应孔中，在整个反应过程中每7秒钟测定荧光发射。从利用所述标准品获得的PCR数据产生标准曲线(图2)。
利用序列检测软件(Sequence Detection Software)(Applied Biosystems)，通过与cRNA标准曲线比较，测定每个实验样品的转录物量。多种实验样品的拷贝数通过比较实验样品PCR数据与标准曲线而获得。拷贝数结果在图3中总结。
其它实施方案见权利要求。
序列表<110>Allaire，Normand比奥根艾迪克MA公司(BIOGEN IDEC MA INC.)<120>通过RT-PCR对核酸的绝对定最<130>2159.034PC01<140>PCT/US2003/036522<141>2003-11-14<150>10/294,781<151>2002-11-14<160>1<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成<223>合成<400>1cctatagtga gtcgtatta 19
权利要求
1.产生用于通过RT-PCR对RNA进行绝对定量的校准用数据的方法，所述方法包括(a)提供合成的寡核苷酸，其包含扩增子和位于该扩增子3’的启动子序列；(b)通过该合成的寡核苷酸的体外转录合成互补RNA(cRNA)；(c)通过独立方法定量测定所述cRNA；以及(d)利用已知量的cRNA产生校准用数据。
2.权利要求1的方法，其中所述启动子序列是噬菌体启动子序列。
3.权利要求2的方法，其中所述噬菌体启动子序列是T7启动子序列。
4.权利要求3的方法，其中所述T7启动子序列主要由5′CCTATAGTGAGTCGTATTA 3′(SEQ ID NO1)组成。
5.权利要求1的方法，还包含5’侧翼序列，所述5’侧翼序列由与所述扩增子邻接的2-20个核苷酸组成。
6.权利要求5的方法，其中所述5’侧翼序列由8-12个核苷酸组成。
7.权利要求5的方法，其中所述5’侧翼序列包含聚T尾。
8.权利要求1的方法，其中所述合成的寡核苷酸还包含3′侧翼序列，所述3’侧翼序列由在所述扩增子和所述启动子之间的2-20个核苷酸组成。
9.权利要求8的方法，其中所述3′侧翼序列由8-12个核苷酸组成。
10.权利要求1的方法，其中所述扩增子的长度为30-70个核苷酸。
11.权利要求10的方法，其中所述扩增子的长度为40-60个核苷酸。
12.权利要求1的方法，其中所述合成的寡核苷酸的长度为60-140个核苷酸。
13.权利要求12的方法，其中所述合成的寡核苷酸的长度为70-130个核苷酸。
14.权利要求13的方法，其中所述合成的寡核苷酸的长度为80-120个核苷酸。
15.权利要求14的方法，其中所述合成的寡核苷酸的长度为90-110个核苷酸。
16.测定受试样品中核酸分子的丰度的方法，所述核酸分子包含扩增子，所述方法包括(a)提供合成的寡核苷酸，其包含扩增子和位于该扩增子3’的启动子序列；(b)通过该合成的寡核苷酸的体外转录合成cRNA；(c)利用该cRNA产生稀释系列；(d)通过该cRNA的反转录合成单链cDNA；(e)产生RT-PCR校准用数据；(g)从受试样品获得RT-PCR受试样品；以及(h)比较PCR受试样品数据与PCR校准用数据。
17.权利要求16的方法，还包括对所述cRNA进行定量。
18.权利要求17的方法，还包括在合成所述单链cDNA以前将所述cRNA与异源RNA进行混合。
全文摘要
公开了获得用于产生校准用数据例如标准曲线的cRNA的方法，所述校准用数据用于通过RT－PCR对RNA进行绝对定量。所述方法包括以下步骤提供包含扩增子、位于该扩增子3’的启动子序列的合成的寡核苷酸；通过该合成的寡核苷酸的体外转录合成互补RNA(cRNA)；通过独立方法定量测定所述cRNA；以及利用已知量的cRNA产生校准用数据。
文档编号C12P19/34GK1759190SQ200380107504
公开日2006年4月12日 申请日期2003年11月14日 优先权日2002年11月14日
发明者诺曼德·E·阿莱尔 申请人:比奥根艾迪克Ma公司