专利名称：以核糖体rna为目标的抗酸菌的检测方法
技术领域：
本发明涉及来自特定抗酸菌的核糖体RNA(rRNA)的检测方法。
背景技术：
rRNA是构成核糖体粒子的RNA，在细菌和高等生物中都存在。细菌具有3种rRNA(23S rRNA、16S rRNA、5S rRNA)，但其中特别是16SrRNA已成为细菌分类的目标，在多数菌中决定其序列，已被数据库化(database化)。以这些序列的数据为基础，开发了多种以16S rRNA为目标的检测试剂盒。
例如，在以检测出结核菌群鸟分枝杆菌(M.avium)或胞内分枝杆菌(M.intracellulare)那样的特定的抗酸菌群为目的的基因检查中，报告了将16S rRNA基因或16S rRNA的碱基序列中，作为目标的抗酸菌群中特异的，即与其他抗酸菌群不同的部分作为DNA探针使用的方法(例如，参见专利文献1，专利文献2)，并市售有试剂盒。另外，在这些试剂盒中，基因增幅中使用的引物与抗酸菌中共同的部分结合。
《专利文献1》日本专利3116353号公报《专利文献2》日本专利2675723号公报发明内容已知在以检测出结核菌群鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)或堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)那样的特定的抗酸菌群为目的的基因检查中，分离培养法通常灵敏度很低，因此希望进一步提高灵敏度。但是，由于已限定在16S rRNA上的特定的抗酸菌群中特异性的区域，在探针序列的选择中有限制，因此不能实现高灵敏度化。
因此，本发明的目的是提供检测出特定抗酸菌群的高灵敏度的基因检测方法。
本发明者们在构建以16S rRNA为目标的检测法时进行了反复深入的研究，首次揭示了由于在使用与抗酸菌群中共同区域结合的引物时，也会使目标以外的抗酸菌群扩增，因此由于竞争性扩增反应，灵敏度将降低。进而，本发明者们揭示了通过使用与抗酸菌群特异性结合的引物，仅使目标抗酸菌群扩增，即使是使用与抗酸菌群中共同区域结合的探针也可以特异性检测出。
本申请的第1项发明为一种检测特定的抗酸菌群的方法，该方法通过使用具有与特定的抗酸菌群的rRNA中特异性区域的碱基序列相同的或互补的序列的引物，仅使特定的抗酸菌群的rRNA特异性扩增来进行检测。
本申请的第2项发明为一种与来自结核菌的16S rRNA的特定部位结合的，用于DNA延伸反应的寡核苷酸，其特征在于，其序列是含有序列编号1和2所示的任一序列的至少10个或其以上碱基的序列。
本申请的第3项发明为一种与来自非结核性抗酸菌鸟分枝杆菌的16SrRNA的特定部位结合的，用于DNA延伸反应的寡核苷酸，其特征在于，其序列是含有序列编号3和4所示的任一序列的至少10个或其以上碱基的序列。
本申请的第4项发明为一种与来自非结核性抗酸菌胞内分枝杆菌的16S rRNA的特定部位结合的，用于DNA延伸反应的寡核苷酸，其特征在于，其序列是含有序列编号5和6所示的任一序列的至少10个或其以上碱基的序列。
本申请的第5项发明为一种与来自非结核性抗酸菌堪萨斯分枝杆菌的16S rRNA的特定部位结合的，用于DNA延伸反应的寡核苷酸，其特征在于，其序列是含有序列编号7和8所示的任一序列的至少10个或其以上碱基的序列。
本申请的第6项发明为一种利用了RNA扩增方法的检测法，该扩增方法是以试样中存在的来自特定的抗酸菌群的16S rRNA的特定序列为模板，通过依赖于RNA的DNA聚合酶合成cDNA，然后通过具有核糖核酸酶H活性的酶将RNA-DNA双链RNA分解并生成单链DNA，然后以该单链DNA为模板，通过依赖于DNA的DNA聚合酶，生成具有可转录由前述特定序列或与前述特定序列互补的序列构成的RNA的启动子序列的双链DNA，然后，在RNA聚合酶存在下，该双链DNA生成RNA转录产物，该RNA转录产物接着成为通过前述依赖于RNA的DNA聚合酶的cDNA合成的模板的来自特定的抗酸菌群的16S rRNA的扩增方法，其特征在于，使用具有与要被扩增的来自特定抗酸菌群16S rRNA序列的一部分相同的序列的第一引物，和具有与要被扩增的来自特定抗酸菌群16SrRNA序列的一部分互补的序列的第二引物(这里，第一引物或第二引物的任一者是在5’末端具有附加了RNA聚合酶的启动子序列后的序列的引物)。
本申请第7项发明为在第6项发明所述的扩增方法中，特定的抗酸菌群是结核菌，第一引物是由序列编号1所示的序列中或其互补链的至少10个或其以上连续碱基构成的，第二引物是由序列编号2所示的序列中或其互补链的至少10个或其以上连续碱基构成的扩增方法。
本申请的第8项发明是在第6项发明所述的扩增方法中，特定的抗酸菌群是鸟分枝杆菌，第一引物是由序列编号3所示的序列中或其互补链的至少10个或其以上连续碱基构成的，第二引物是由序列编号4所示的序列中或其互补链的至少10个或其以上连续碱基构成的扩增方法。
本申请的第9项发明是在第6项发明所述的扩增方法中，特定的抗酸菌群是胞内分枝杆菌，第一引物是由序列编号5所示的序列中或其互补链的至少10个或其以上连续碱基构成的，第二引物是由序列编号6所示的序列中或其互补链的至少10个或其以上连续碱基构成的扩增方法。
本申请的第10项发明是在第6项发明所述的扩增方法中，特定的抗酸菌群是堪萨斯分枝杆菌，第一引物是由序列编号7所示的序列中或其互补链的至少10个或其以上连续碱基构成的，第二引物是由序列编号8所示的序列中或其互补链的至少10个或其以上连续碱基构成的扩增方法。
本申请第11项发明是第6～10项发明涉及的扩增方法，该扩增方法如下构成在可与通过扩增生成的RNA转录产物特异性结合的，且被插入性荧光色素标识的寡核苷酸存在下实施，测定反应液的荧光特性(条件是，该被标识的寡核苷酸是与前述第一和第二引物不同的序列)。
本申请第12项发明是第11项发明所述的检测方法，其特征在于，前述寡核苷酸被设计成与RNA转录产物的至少一部分序列互补结合，与未形成复合体的场合相比，荧光特性将发生变化的寡核苷酸。而且，本申请的第13项发明是前述第12项发明涉及的检测方法，其特征在于，前述寡核苷酸是，序列编号9所示的任一序列中的至少10个或其以上连续碱基构成的序列，或其互补序列。下面，将详细说明本发明。
本发明虽然对于5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA中任一者都可应用，但从已被报告了碱基序列的抗酸菌种最多这一点出发，优选使用16SrRNA。
在16S rRNA中的特定的抗酸菌群中的特异性的区域，虽然可从基因文库等得到碱基序列，通过详细研究其来决定，但根据本发明者的发现，优选的是来自结核菌的16S rRNA的碱基序列(GenBank编号Z83862)中，碱基序号70～200所示的区域，更优选相当于序列编号1、3、5、7中碱基序号70～92所示的区域，和相当于序列编号2、4、6、8的碱基序号183～200所示的区域(这里，碱基序号是将Z83862的序列中，来自结核菌的16S rRNA的起始位置作为1)。
本发明的扩增工程包括PCR法、NASB法、3SR法、TRC法(例如，参见特开2000-14400号公报)，但其中优选通过逆转录酶和RNA聚合酶的协同作用(使之在逆转录酶和RNA聚合酶将进行协同作用的条件下反应)进行16S rRNA序列扩增的NASBA法，3SR法、TCR法等恒温核酸扩增法。这里，关于温度虽没有特别的限制，但优选35～50℃。
在上述扩增工程中，添加对于与构成特定抗酸菌群16S rRNA序列中的特定序列区域的5’末端区域重复(1～10碱基)并邻接的区域互补的寡核苷酸，用特定序列的5’末端区域切割(通过具有核糖核酸酶H活性的酶进行)前述16S rRNA并作为核酸扩增初期的模板，特定序列不在5’末端的16S rRNA也可被扩增。为了进行该切割，例如，可使用序列编号10的寡核苷酸。另外，为了抑制从3’末端的延伸反应，前述切割用寡核苷酸，优选是3’末端羟基被化学修饰(例如氨基化)的寡核苷酸。
虽然用上述核酸扩增方法得到的扩增产物可用已知的核酸检测方法检测出，但在优选的方案中，优选在用插入性荧光色素标识的寡核苷酸存在下实施上述核酸扩增，测定反应液的荧光特性的变化。该寡核苷酸的特征在于，是通过接头使插入性荧光色素与寡核苷酸中的磷结合的寡核苷酸，如果与目标核酸(互补的核酸)形成2条链，则插入部分插入2条链部分中，因而荧光特性将变化，所以没有必要进行分离分析。(参见Ishiguro，T.ら等(1996)Nucleic Acids Res.24(24)4992-4997)。
该寡核苷酸要结合的序列，可以是特定的抗酸菌群中的特定的序列，以及在抗酸菌群中共同的序列中的任一者，没有特别的限定，但优选是序列编号9中所示序列中的至少10个连续碱基构成的序列，或其互补序列。另外，为了抑制该寡核苷酸作为引物的延伸反应，优选该寡核苷酸的3’末端的羟基进行化学修饰(例如，加成乙醇酸)。
由此，可以在一试管内，一定温度，一段扩增与来自特定的抗菌群的16Sr RNA中的特定序列相同的序列构成的RNA，可进行检测，并可容易地适用于自动化。
如以上所说明的那样，本发明的检测方法，在特异性且高灵敏度地检测出来自特定抗酸菌的16S rRNA中是有用的。
本发明的寡核苷酸，并不限于序列表中记载的碱基序列(18个碱基到23个碱基)的序列，只要是这些序列中的至少10个或其以上连续碱基构成的寡核苷酸都可以，它们对于目标核酸具有极高的特异性。另外表明，这些寡核苷酸或其至少10个或其以上连续碱基构成的寡核苷酸，即使在较低的温度(优选44℃)条件下，作为引物或探针也可确保对目标核酸的充分的特异性，通过使用本发明的寡核苷酸，可以实现在一定温度(较低的温度)的rRNA的特异性的扩增、检测。
图1显示在实施例1和2中使用的各寡核苷酸的位置和扩增区域[(A)组合(a)、(B)组合(b)]。图中的碱基序号以来自结核菌的16S rRNA的碱基序列(基因文库序号Z83862)中的16S rRNA的起始位置为1。另外，双箭头表示在来自抗酸菌群的16S rRNA中的结核菌的特异性区域。
图2是在实施例1进行的使用各寡核苷酸的组合，使抗酸菌的核酸提取物实验体试样进行RNA扩增反应时的电泳照片(黑白反转)。泳道1是结核菌16S rRNA阳性标准(104拷贝)，泳道2是海分枝杆菌(M.marinum)、泳道3是堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、泳道4是胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、泳道5是戈登分枝杆菌(M.gordonae)、泳道6是胃分枝杆菌(M.gastri)、泳道7是土分枝杆菌(M.terrae)、泳道8是蟾分枝杆菌(M.xenopi)、泳道9是田鼠分枝杆菌(M.microti)、泳道10是无色分枝杆菌(M.nonchromogenicum)、泳道11是瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)、泳道12是非洲分枝杆菌(M.africanum)、泳道13是斯氏分枝杆菌(M.szulgai)、泳道14是鸟分枝杆菌(M.avium)、泳道15是结核菌、泳道N是阴性对照(不用核酸提取物而仅用稀释液)。另外，分子量标记使用φX174/Hae III消化的标记4，ニツポンジ一ン(株)制)(泳道M)。另外，图中的箭头表示使用各寡核苷酸的组合时的特异性扩增带。相对于图2(A)中使用[组合(a)]，对于所有的抗酸菌的核酸提取物都可看到特定的带，在图2(B)中使用[组合(b)1在结核菌群的抗酸菌(结核菌，非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌)和海分枝杆菌中可看到特定的带。
图3是在实施例2进行的对于将结核菌4至4×106个菌分散于1mL的阴性咳痰中的检体，反应时间与随检体中的RNA生成同时增大的荧光强度比的曲线图[(A)组合(a)、(B)组合(b)]。用组合(a)可检测出4×103菌/1mL(咳痰)的检体、用组合(b)可检测出4个菌/1mL(咳痰)的检体。
具体实施例方式
以下，通过实施例详细地说明本申请的发明，但本发明并不限于这些实施例1确认图1中所示组合(a)和(b)是否在结核菌中是特异的。
(1)将以下所示各菌种的克隆悬浮于已加入了胍异氰酸酯的注射用蒸馏水中，在玻璃珠(150～212μm，シグマ制)存在下搅拌5分钟。然后，将该菌体液用Extragen(東ソ一制造)进行核酸提取，将其作为抗酸菌的核酸提取物。
评价实验体一览表海分枝杆菌(M.marinum(ATCC 927))堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii(ATCC 12478))胞内分枝杆菌(M.intracellulare(ATCC 13950))戈登分枝杆菌(M.gordonae(ATCC 14470))胃分枝杆菌(M.gastri(ATCC 15754))土分枝杆菌(M.terrae(ATCC 15755))蟾分枝杆菌(M.xenopi(ATCC 19250))田鼠分枝杆菌(M.microti(ATCC 19422))无色分枝杆菌(M.nonchromogenicum(ATCC 19530))瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum(ATCC 19981))非洲分枝杆菌(M.africanum(ATCC 25420))斯氏分枝杆菌(M.szulgai(ATCC 35799))鸟分枝杆菌(M.avium(临床分离株))结核菌(临床分离株)(2)将20μL以下组成的反应液分装入PCR用管(容量0.5mL；GeneAmp Thin-Walled Reaction Tubes，商品名，パ一キンェルマ一制)，向其中添加上述核酸提取物5μL。另外，将第1·第2·第3寡核苷酸和用插入性色素标识的寡核苷酸的组合配制为表1所示的组合的溶液。
反应液的组成(各浓度是30μL最终反应液量中的浓度)60mM Tris-盐酸缓冲液(PH8.6)17mM氯化镁100mM氯化钾6U RNase抑制剂(タカラバィォ(株)制)1mM DTT
各0.25mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP3.6mM ITP各3.0mM的ATP、CTP、GTP、UTP0.16μM的第1寡核苷酸1.0μM的第2寡核苷酸1.0μM的第3寡核苷酸25nM的插入性荧光色素标识的寡核苷酸13％DMSO容量调节用蒸馏水(3)将上述反应液在44℃保温5分钟，添加下述组成的，且预先在44℃保温了2分钟的酶液5μL。
酶液的组成(各浓度是30μL最终反应液量中的浓度)2.0％山梨糖醇3.6μg牛血清白蛋白142U T7RNA聚合酶(ィンビトロジェン制)6.4U AMV逆转录酶(タカラバィォ(株)制)容量调节用蒸馏水(4)接着，使用可直接测定PCR管的带温度调节功能的荧光分光光度计，在44℃保温，在激发波长470nm、荧光波长520nm，实时测定反应溶液。
(5)各个核酸提取物的上升时间(到达在荧光增加比为阴性的平均值上加上3倍标准偏差后的值的1.2倍的时间)的结果示于表2。另外，在图2中显示电泳结果的照片(黑白反转)。以上升时间的判断结果显示，通过用插入性荧光色素标识的寡核苷酸识别的组合(a)，特异性地检测出了结核菌的抗酸菌(结核菌，非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌)，通使用过本发明的寡核苷酸的组合(b)，特异性地检测出了结核菌的抗酸菌(结核菌，非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌)和海分枝杆菌。
(6)为了进行反应后的RNA扩增部分的确认，实施琼脂糖凝胶(琼脂糖浓度4％)电泳。电泳后的染色通过SYBR Green II(タカラバィォ(株)制)进行。电泳的结果，是组合(a)时，对于所有核酸提取物都可看到特异性的扩增产物。另一方面，是组合(b)时，结核菌群的抗酸菌(结核菌，非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌)可看到明显的扩增带，但在海分枝杆菌中只可看到很小的扩增带。
表1
表1显示的是在实施例1和2中使用的第1·第2·第3寡核苷酸和用插入性色素标识的寡核苷酸的组合，以及使用该组合扩增的特定带的链长。通过各寡核苷酸的组合的来自结核菌16S rRNA中的寡核苷酸的位置和扩增区域在图1中显示。第1寡核苷酸的碱基序列中，3’末端的羟基被氨基化了。第2寡核苷酸的碱基序列中，5’末端侧从第1个“A”到第22个“A”为止的区域是T7启动子区域，与其相接的第23个“G”到第28个“A”的区域是增强子区域。在被插入性色素标识的寡核苷酸中，YO-MT16S-S-G(序列编号15)是5’末端的第16个“C”和第17个“C”之间的磷被插入性色素标识，YO-MYR-S-G(序列标号9)是5’末端的第7个碱基“A”和第8个碱基“G”之间的磷被插入性色素标识，且它们的3’末端侧的羟基被乙二醇基修饰。
第1寡核苷酸MTR-1S(序列编号11、碱基序号135～158)MYR-1S-10(序列编号10、碱基序号52～75)第2寡核苷酸MTR-1F(序列编号12、碱基序号153～175)MYR-1F-10(序列编号13、碱基序号70～92)第3寡核苷酸
MTR-7R(序列编号14、碱基序号444～463)MYR-3RT18(序列编号2、碱基序号183～200)插入性色素标识的寡核苷酸YO-MT16S-S-G(序列编号15、碱基序号183～202)YO-MYR-S-G(序列编号9、碱基序号147～166)表2
表2是使用各寡核苷酸的组合测定抗酸菌的核酸提取物的结果。另外，结果是用上升时间表示的。表中的N.D.表示用组合(a)在60分钟以内，用组合(b)在20分钟以内未看到上升(未被检测出)的试样。用组合(a)，检测出结核菌群的抗酸菌(结核菌，非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌)，用组合(b)，检测出结核菌群的抗酸菌(结核菌，非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌)和海分枝杆菌。
实施例2使用插入性荧光色素标识的寡核苷酸识别特异性的组合(a)和本发明的寡核苷酸组合(b)，以各种的菌数浓度进行咳痰中某种结核菌的检测。
(1)作为咳痰中某种结核菌的检测灵敏度测定用检体，使用将来自结核菌的4～4×106个菌悬浮于1mL的阴性咳痰中的试样。另外，作为检体中的核酸提取法，将该检体进行NALC处理后，将使用胍异氰酸酯和玻璃珠(150～212μm，シグマ制)进行处理后的溶液用Extragen(東ソ一制造)提取出。
(2)将20μL以下组成的反应液分装入PCR用管(容量0.5mL；GeneAmp Thin-Walled Reaction Tubes，パ一キンェルマ一制)，向其中添加上述RNA试样5μL。另外，将第1·第2·第3寡核苷酸和用插入性色素标识的寡核苷酸的组合配制为表1所示的组合的溶液。
反应液的组成(各浓度是30μL最终反应液量中的浓度)60mM Tris-盐酸缓冲液(PH8.6)17mM氯化镁120mM氯化钾6U RNase抑制剂(タカラバィォ(株)制)1mM DTT各0.25mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP3.6mMITP各3.0mM的ATP、CTP、GTP、UTP0.16μM的第1寡核苷酸1.0μM的第2寡核苷酸1.0μM的第3寡核苷酸25nM的插入性荧光色素标识的寡核苷酸13％DMSO容量调节用蒸馏水(3)将上述反应液在44℃保温5分钟，添加下述组成的，且预先在44℃保温了2分钟的酶液5μL。
酶液的组成(各浓度是30μL最终反应液量中的浓度)2.0％山梨糖醇3.6μg牛血清白蛋白142U T7RNA聚合酶(ィンビトロジェン制)6.4U AMV逆转录酶(タカラバィォ(株)制)容量调节用蒸馏水(4)接着，使用可直接测定PCR管的带温度调节功能的荧光分光光度计，在44℃保温，在激发波长470nm、荧光波长520nm，实时测定反应溶液。
(5)以添加酶时的时刻为0分，各检体的荧光强度比(规定时刻的荧光强度÷背景的荧光强度值)随时间的变化示于图3，各检体的检测结果示于表3。这些的结果是，用本发明的寡核苷酸的组合[组合(b)]的检测灵敏度是4菌/1mL(咳痰)，比通过用插入性色素标识的寡核苷酸进行特异性识别的组合(a)[4×103菌/1mL(咳痰)]具有更高的灵敏度。另外，在表3中显示了使用了本发明的寡核苷酸的组合[组合(b)]的结果，和市售试剂盒(商品名，アンプリコアマィコバクテリゥムツベルクロ一シス、ロシュダィアグノスティツクス社制)的灵敏度比较。确认了使用本发明的寡核苷酸的组合测定试剂的灵敏度与市售试剂盒相比是高灵敏度的。
表3
表3是使用表1所示的各寡核苷酸的组合[组合(a)、组合(b)]和市售试剂盒(商品名，アンプリコアマィコバクテリゥムツベルクロ一シス)测定咳痰中的结核菌的结果。另外，使用组合(a)和(b)试验时检出的有无通过是否能在30分钟内看到上升进行判定。检测灵敏度，在组合(a)是4×103菌/1mL(咳痰)、在组合(b)是4菌/1mL(咳痰)、在市售试剂盒是4×102菌/1mL(咳痰)。
实施例3确认本发明的寡核苷酸的组合，在非结核性抗酸菌鸟分枝杆菌(Mycobacterium.avium)中是否是特异性的。
(1)将以下所示各菌种的克隆悬浮于已加入了胍异氰酸酯的注射用蒸馏水中，在玻璃珠(150～212μm，シグマ制)存在下搅拌5分钟。然后，将该菌体液用Extragen(東ソ一制造)进行核酸提取，将其作为抗酸菌的核酸提取物。
评价实验体一览表海分枝杆菌(M.marinum(ATCC 927))偶发分枝杆菌(M.fortuitum(ATCC 6841))堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii(ATCC 12478))胞内分枝杆菌(M.intracellulare(ATCC 13950))外来分枝杆菌(M.peregrinum(ATCC 14467))戈登分枝杆菌(M.gordonae(ATCC 14470))胃分枝杆菌(M.gastri(ATCC 15754))土分枝杆菌(M.terrae(ATCC 15755))蟾分枝杆菌(M.xenopi(ATCC 19250))田鼠分枝杆菌(M.microti(ATCC 19422))无色分枝杆菌(M.nonchromogenicum(ATCC 19530))脓肿分枝杆菌(M.abscessus(ATCC 19977))瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum(ATCC 19981))
次要分枝杆菌(M.triviale(ATCC 23292))猿分枝杆菌(M.simiae(ATCC 25275))非洲分枝杆菌(M.africanum(ATCC 25420))龟分枝杆菌(M.chelonae(ATCC 35752))斯氏分枝杆菌(M.szulgai(ATCC 35799))鸟分枝杆菌(M.avium(临床分离株))结核菌(临床分离株)(2)将20μL以下组成的反应液分装入PCR用管(容量0.5mL；GeneAmp Thin-Walled Reaction Tubes，商品名，パ一キンェルマ一制)，向其中添加上述RNA试样5μL。
反应液的组成(各浓度是30μL最终反应液量中的浓度)60mM Tris-盐酸缓冲液(PH8.6)17mM氯化镁100mM氯化钾6U RNase抑制剂(タカラバィォ(株)制)1mM DTT各0.25mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP3.6mMITP各3.0mM的ATP、CTP、GTP、UTP0.16μM的第1寡核苷酸(MYR-1S-10，序列编号10，3’末端侧的羟基被氨基化了。)1.0μM的第2寡核苷酸(MYR-1FA-10，序列编号16，5’末端侧从第1个“A”到第22个“A”为止的区域是T7启动子区域，与其相接的第23个“G”到第28个“A”为止的区域是增强子序列。)1.0μM的第3寡核苷酸(MYR-3RA18，序列编号4)25nM的插入性荧光色素标识的寡核苷酸(YO-MYR-S-G、序列编号9，5’末端的第7个“A”和第8个“G”之间的磷被插入性色素标识。并且，3’末端侧的羟基被乙二醇基修饰。)13％ DMSO
容量调节用蒸馏水(3)将上述反应液在44℃保温5分钟，添加下述组成的，且预先在44℃保温了2分钟的酶液5μL。
酶液的组成(各浓度是30μL最终反应液量中的浓度)2.0％山梨糖醇3.6μg牛血清白蛋白142U T7RNA聚合酶(ィンビトロジェン制)6.4U AMV逆转录酶(タカラバィォ(株)制)容量调节用蒸馏水(4)接着，使用可直接测定PCR管的带温度调节功能的荧光分光光度计，在44℃保温，在激发波长470nm、荧光波长520nm，实时测定反应溶液。
(5)各个核酸提取物的上升时间(到达在荧光增加比为阴性的平均值上加上3倍标准偏差后的值的1.2倍的时间)的结果示于表4。这些结果显示，本发明的寡核苷酸组合特异性检测出鸟分枝杆菌(M.avium)。
表4
表4是使用本发明的寡核苷酸的组合测定抗酸菌的核酸提取物的结果。另外，结果是用上升时间表示的。表中的N.D.表示在20分钟以内未看到上升(未被检测出)的试样。本发明的寡核苷酸组合特异性地检测出了鸟分枝杆菌(M.avium)。
实施例4确认了本发明的寡核苷酸的组合在非结核性抗酸菌胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)中是否为特异性的。
(1)将以下所示各菌种的克隆悬浮于已加入了胍异氰酸酯的注射用蒸馏水中，在玻璃珠(150～212μm，シグマ制)存在下搅拌5分钟。然后，将该菌体液用Extragen(東ソ一制造)进行核酸提取，将其作为抗酸菌的核酸提取物。
评价实验体一览表海分枝杆菌(M.marinum(ATCC 927))偶发分枝杆菌(M.fortuitum(ATCC 6841))堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii(ATCC 12478))胞内分枝杆菌(M.intracellulare(ATCC 13950))外来分枝杆菌(M.peregrinum(ATCC 14467))戈登分枝杆菌(M.gordonae(ATCC 14470))胃分枝杆菌(M.gastri(ATCC 15754))土分枝杆菌(M.terrae(ATCC 15755))蟾分枝杆菌(M.xenopi(ATCC 19250))田鼠分枝杆菌(M.microti(ATCC 19422))无色分枝杆菌(M.nonchromogenicum(ATCC 19530))脓肿分枝杆菌(M.abscessus(ATCC 19977))瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum(ATCC 19981))次要分枝杆菌(M.triviale(ATCC 23292))猿分枝杆菌(M.simiae(ATCC 25275))非洲分枝杆菌(M.africanum(ATCC 25420))龟分枝杆菌(M.chelonae(ATCC 35752))斯氏分枝杆菌(M.szulgai(ATCC 35799))鸟分枝杆菌(M.avium(临床分离株))结核菌(临床分离株)(2)将20μL以下组成的反应液分装入PCR用管(容量0.5mL；GeneAmp Thin-Walled Reaction Tubes，パ一キンェルマ一制)，向其中添加上述RNA试样5μL。
反应液的组成(各浓度是30μL最终反应液量中的浓度)60mM Tris-盐酸缓冲液(PH8.6)17mM氯化镁100mM氯化钾6U RNase抑制剂(タカラバィォ(株)制)1mM DTT各0.25mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP3.6mM ITP各3.0mM的ATP、CTP、GTP、UTP0.16μM的第1寡核苷酸(MYR-1S-10，序列编号10，3’末端侧的羟基被氨基化了。)1.0μM的第2寡核苷酸(MYR-1FA-10，序列编号17，5’末端侧从第1个“A”到第22个“A”为止的区域是T7启动子区域，与其相接的第23个“G”到第28个“A”为止的区域是增强子序列。)1.0μM的第3寡核苷酸(MYR-3RI18，序列编号6)25nM的插入性荧光色素标识的寡核苷酸(YO-MYR-S-G、序列编号9，5’末端的第7个“A”和第8个“G”之间的磷被插入性色素标识。并且，3’末端侧的羟基被乙二醇基修饰。)13％ DMSO容量调节用蒸馏水(3)将上述反应液在44℃保温5分钟，添加下述组成的，且预先在44℃保温了2分钟的酶液5μL。
酶液的组成(各浓度是30μL最终反应液量中的浓度)2.0％山梨糖醇3.6μg牛血清白蛋白142U T7RNA聚合酶(ギブコ制)6.4U AMV逆转录酶(タカラバィォ(株)制)容量调节用蒸馏水(4)接着，使用可直接测定PCR管的带温度调节功能的荧光分光光度计，在44℃保温，在激发波长470nm、荧光波长520nm，实时测定反应溶液。
(5)各个核酸提取物的上升时间(到达在荧光增加比为阴性的平均值上加上3倍标准偏差后的值的1.2倍的时间)的结果示于表5。这些结果显示，本发明的寡核苷酸组合特异性检测出胞内分枝杆菌(M.intracellulare)。
表5
表5是使用本发明的寡核苷酸的组合测定抗酸菌的核酸提取物的结果。另外，结果是用上升时间表示的。表中的N.D.表示在20分钟以内未看到上升(未被检测出)的试样。本发明的寡核苷酸的组合特异性地检测出了胞内分枝杆菌(M.intracellulare)。
实施例5确认了本发明所示的寡核苷酸的组合，在非结核性抗酸菌堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)中是否是特异性的。
(1)将以下所示各菌种的克隆悬浮于已加入了胍异氰酸酯的注射用蒸馏水中，在玻璃珠(150～212μm，シグマ制)存在下搅拌5分钟。然后，将该菌体液用Extragen(東ソ一制造)进行核酸提取，将其作为抗酸菌的核酸提取物。
评价实验体一览表海分枝杆菌(M.marinum(ATCC 927))偶发分枝杆菌(M.fortuitum(ATCC 6841))堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii(ATCC 12478))胞内分枝杆菌(M.intracellulare(ATCC 13950))外来分枝杆菌(M.peregrinum(ATCC 14467))戈登分枝杆菌(M.gordonae(ATCC 14470))胃分枝杆菌(M.gastri(ATCC 15754))土分枝杆菌(M.terrae(ATCC 15755))蟾分枝杆菌(M.xenopi(ATCC 19250))田鼠分枝杆菌(M.microti(ATCC 19422))无色分枝杆菌(M.nonchromogenicum(ATCC 19530))脓肿分枝杆菌(M.abscessus(ATCC 1 9977))瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum(ATCC 19981))次要分枝杆菌(M.triviale(ATCC 23292))猿分枝杆菌(M.simiae(ATCC 25275))非洲分枝杆菌(M.africanum(ATCC 25420))龟分枝杆菌(M.chelonae(ATCC 35752))
斯氏分枝杆菌(M.szulgai(ATCC 35799))鸟分枝杆菌(M.avium(临床分离株))结核菌(临床分离株)(2)将20μL以下组成的反应液分装入PCR用管(容量0.5mL；GeneAmp Thin-Walled Reaction Tubes，商品名，パ一キンェルマ一制)，向其中添加上述RNA试样5μL。
反应液的组成(各浓度是30μL最终反应液量中的浓度)60mM Tris-盐酸缓冲液(PH8.6)17mM氯化镁100mM氯化钾6U RNase抑制剂(タカラバィォ(株)制)1mM DTT各0.25mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP3.6mM ITP各3.0mM的ATP、CTP、GTP、UTP0.16μM的第1寡核苷酸(MYR-1S-10，序列编号10，3’末端侧的羟基被氨基化了。)1.0μM的第2寡核苷酸(MYR-1FK-10，序列编号18，5’末端侧从第1个“A”到第22个“A”为止的区域是T7启动子区域，与其相接的第23个“G”到第28个“A”为止的区域是增强子序列。)1.0μM的第3寡核苷酸(MYR-3RKl8，序列编号8)25nM的插入性荧光色素标识的寡核苷酸(YO-MYR-S-G、序列编号9，5’末端的第7个“A”和第8个“G”之间的磷被插入性色素标识。并且，3’末端侧的羟基被乙二醇基修饰。)13％ DMSO容量调节用蒸馏水(3)将上述反应液在44℃保温5分钟，添加下述组成的，且预先在44℃保温了2分钟的酶液5μL。
酶液的组成(各浓度是30μL最终反应液量中的浓度)
2.0％山梨糖醇3.6μg牛血清白蛋白142U T7RNA聚合酶(ギブコ制)6.4U AMV逆转录酶(タカラバィォ(株)制)容量调节用蒸馏水(4)接着，使用可直接测定PCR管的带温度调节功能的荧光分光光度计，在44℃保温，在激发波长470nm、荧光波长520nm，实时测定反应溶液。
(5)各个核酸提取物的上升时间(到达在荧光增加比为阴性的平均值上加上3倍标准偏差后的值的1.2倍的时间)的结果示于表6。这些结果显示，本发明的寡核苷酸的组合特异性检测出了堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)和胃分枝杆菌(M.gastri)(该抗酸菌的16S rRNA与堪萨斯分枝杆菌相同)。
表6
表6是使用本发明的寡核苷酸的组合测定抗酸菌的核酸提取物的结果。另外，结果是用上升时间表示的。表中的N.D.表示在20分钟以内未看到上升(未被检测出)的试样。本发明的寡核苷酸的组合特异性地检测出了堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)和胃分枝杆菌(M.gastri)。
序列表<110>东曹株式会社<120>以核糖体RNA为目标的抗酸菌的检测方法<130>211-0934<160>18<170>patentIn version 3.1<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MYR-1F-10-T7<400>1cggaaaggtc tcttcggaga tac23<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>MYR-3RT18<400>2acaagacatg catcccgt 18<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MYR-1FA-10-T7<400>3cggaaaggcc tcttcggagg tac23<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MYR-3RA18<400>4agaagacatg cgtcttga 18
<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MYR-1FI-10-T7<400>5cggaaaggcc ccttcggggg tac23<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MYR-3RI18<400>6taaagacatg cgcctaaa 18<210>7<211>23<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>MYR-1FK-10-T7<400>7cggaaaggtc tcttcggaga cac 23<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MYR-3RK18<400>8acaaggcatg cgccaagt 18<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>YO-MYR-S-G
<400>9agacccagtt tcccaggctt20<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MYR-1S-10<400>10tttccgttcg acttgcatgt gtta24<210>11<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MTR-1S<400>11tttcccaggc ttatcccgaa gtgc24<210>12
<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MTR-1F<400>12aattctaata cgactcacta tagggagagg gaaactgggt ctaataccgg a 51<210>13<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MYR-1F-10<400>13aattctaata cgactcacta tagggagacg gaaaggtctc ttcggagata c 51<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MTR-7R<400>14agaacccgga ccttcgtcga20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>YO-MT16S-S-G<400>15ccacaagaca tgcatcccgt20<210>16<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MYR-1FA-10<400>16aattctaata cgactcacta tagggagacg gaaaggcctc ttcggaggta c51
<210>17<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MYR-1FI-10<400>17aattctaata cgactcacta tagggagacg gaaaggcccc ttcgggggta c 51<210>18<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MYR-1FK-10<400>18aattctaata cgactcacta tagggagacg gaaaggtctc ttcggagaca c 5权利要求
1.一种检测特定的抗酸菌群的方法，其特征在于，通过使用具有与特定的抗酸菌群的rRNA中特异性区域的碱基序列相同的或互补的序列的引物，仅使特定的抗酸菌群的rRNA特异性扩增来进行检测。
2.一种与结核菌的16S rRNA的特定部位结合的，用于DNA延伸反应的寡核苷酸，其特征在于，其序列是含有序列编号1和2所示的任一序列的至少10个或其以上碱基的序列。
3.一种与来自非结核性抗酸菌鸟分枝杆菌的16S rRNA的特定部位结合的，用于DNA延伸反应的寡核苷酸，其特征在于，其序列是含有序列编号3和4所示的任一序列的至少10个或其以上碱基的序列。
4.一种与来自非结核性抗酸菌胞内分枝杆菌的16S rRNA的特定部位结合的，用于DNA延伸反应的寡核苷酸，其特征在于，其序列是含有序列编号5和6所示的任一序列的至少10个或其以上碱基的序列。
5.一种与来自非结核性抗酸菌堪萨斯分枝杆菌的16S rRNA的特定部位结合的，用于DNA延伸反应的寡核苷酸，其特征在于，其序列是含有序列编号7和8所示的任一序列的至少10个或其以上碱基的序列。
6.在一种利用了RNA扩增方法的检测法中，该扩增方法是以试样中存在的来自特定的抗酸菌群的16S rRNA的特定序列为模板，通过依赖于RNA的DNA聚合酶合成cDNA，然后通过具有核糖核酸酶H活性的酶将RNA-DNA双链RNA分解并生成单链DNA，然后以该单链DNA为模板，通过依赖于DNA的DNA聚合酶，生成具有可转录由前述特定序列或与前述特定序列互补的序列构成的RNA的启动子序列的双链DNA，然后，在RNA聚合酶存在下，该双链DNA生成RNA转录产物，该RNA转录产物接着成为通过前述依赖于RNA的DNA聚合酶的cDNA合成的模板的来自特定的抗酸菌群的16S rRNA的扩增方法，其特征在于，使用具有与要被扩增的来自特定抗酸菌群16S rRNA序列的一部分相同的序列的第一引物，和具有与要被扩增的来自特定抗酸菌群16S rRNA序列的一部分互补的序列的第二引物(这里，第一引物或第二引物的任一者是在5’末端具有附加了RNA聚合酶的启动子序列的序列的引物)。
7.权利要求6所述的扩增方法，其特征在于，特定的抗酸菌群是结核菌，第一引物是由序列编号1所示的序列中或其互补链的至少10个或其以上连续碱基构成的，第二引物是由序列编号2所示的序列中或其互补链的至少10个或其以上连续碱基构成的。
8.权利要求6所述的扩增方法，其特征在于，特定的抗酸菌群是鸟分枝杆菌，第一引物是由序列编号3所示的序列中或其互补链的至少10个或其以上连续碱基构成的，第二引物是由序列编号4所示的序列中或其互补链的至少10个或其以上连续碱基构成的。
9.权利要求6所述的扩增方法，其特征在于，特定的抗酸菌群是胞内分枝杆菌，第一引物是由序列编号5所示的序列中或其互补链的至少10个或其以上连续碱基构成的，第二引物是由序列编号6所示的序列中或其互补链的至少10个或其以上连续碱基构成的。
10.权利要求6所述的扩增方法，其特征在于，特定的抗酸菌群是堪萨斯分枝杆菌，第一引物是由序列编号7所示的序列中或其互补链的至少10个或其以上连续碱基构成的，第二引物是由序列编号8所示的序列中或其互补链的至少10个或其以上连续碱基构成的。
11.权利要求6～10所述的RNA扩增方法，其特征在于，该扩增方法如下构成在可与通过扩增生成的RNA转录产物特异性结合的，且在插入性荧光色素标识的寡核苷酸存在下实施，测定反应液的荧光特性(条件是，该被标识的寡核苷酸是与前述第一和第二引物不同的序列)。
12.权利要求11所述的检测方法，其特征在于，前述被插入性荧光色素标识的寡核苷酸，被设计成与RNA转录产物的至少一部分序列互补结合，与未形成复合体的情况相比，荧光特性将变化的寡核苷酸。
13.权利要求12所述的检测方法，其特征在于，前述被插入性荧光色素标识的寡核苷酸是序列编号9所示的序列中的至少10个连续碱基构成的序列，或其互补序列。
全文摘要
本发明的目的是提供检测特定的抗酸菌群的高灵敏度基因检查法，以及为实施那样的高灵敏度基因检查法的合适的寡核苷酸。通过使用具有与特定的抗酸菌群的rRNA中特异性区域的碱基序列相同的或互补的序列的引物，仅使特定抗酸菌群的rRNA的特异性扩增而进行检测的方法，和与结核菌16S rRNA的特定部位结合的寡核苷酸、与来自特定的非结核性菌的16S rRNA的特定部位结合的寡核苷酸，来达到上述目的。
文档编号C12Q1/68GK1508546SQ20031012154
公开日2004年6月30日 申请日期2003年12月18日 优先权日2002年12月19日
发明者益田升佳, 伊泽祐一, 堀江隆一, 保川清, 一 申请人:东曹株式会社