专利名称：一种sars病毒的灭活及纯化方法以及制备含有所述灭活病毒疫苗的方法及所述疫苗的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种SARS病毒的灭活方法，所述灭活病毒的纯化方法，SARS灭活疫苗的制备工艺，以及含有所述灭活病毒的疫苗。
背景技术：
为有效防止重症急性呼吸综合症(Severe Acute RespiratorySyndrome，以下简称为SARS)在我国乃至全世界范围的蔓延，目前迫切需要能够有效预防引起所述病症的SARS病毒疫苗。
就常用的疫苗种类而言，主要可分为采用由基因工程方法获得的特定病毒表面抗原或其片段引发免疫反应的基因工程型疫苗，如基因工程乙型肝炎病毒疫苗；采用病毒经减毒后制备的减毒型活疫苗，如麻疹减毒活疫苗；以及由活体病毒株通过有效灭活后制备的灭活型疫苗，如甲型肝炎病毒灭活疫苗。
为了在短时间内获得可用于临床的SARS病毒疫苗，本发明人利用获自临床SARS患者的SARS病毒分离株，经工业化大规模培养得到高浓度的SARS病毒液，成功探索出有效灭活所述SARS病毒的灭活方法以及所述灭活病毒的纯化方法，并由此成功研制出含有所述灭活病毒的疫苗。
发明内容
本发明的一个方面涉及一种SARS病毒的灭活方法。在本发明所述的SARS病毒灭活方法中，选用福尔马林溶液或β-丙内酯作为灭活剂，能够有效实现SARS病毒灭活，尤其是大规模工业化培养的SARS病毒的灭活。与传统病毒灭活方式相比，本发明所述方法能够有效灭活SARS病毒至符合疫苗生产的水平，同时保持了所述灭活病毒的抗原性。
在本发明的一个具体实施方案中，选用与病毒样品总体积比为1∶1000-1∶4000的福尔马林溶液，37℃处理经大规模工业化培养的SARS病毒样品2.9-12.5小时，灭活SARS病毒。在本发明的又一具体实施方案中，选用与病毒样品总体积比为1∶4000-1∶8000的β-丙内酯，在2-8℃下灭活SARS病毒16-24小时。
在本发明中还可以在规模化制备SARS病毒的细胞工厂中原位灭活病毒。在本发明的一个具体实施方案中，将制备好的灭活剂(例如，以体积比1∶100稀释的福尔马林溶液)经密闭的管道系统加入盛有待灭活SARS病毒的细胞工厂内，福尔马林终浓度1∶1000-4000，混匀，在搅拌下，经37℃原位灭活2.9-12.5小时后收获。
在本发明的又一具体实施方案中，任选的，还包括对所得SARS病毒样品的超时灭活。具体的，以福尔马林为灭活剂，对收获于固定容器内的经首次灭活之SARS病毒样品，再经一定时间，优选为首次灭活时间的3倍(灭活条件同首次灭活)的超时灭活；在本发明的又一具体实施方案中，任选的，还包括对所得SARS病毒样品的二次灭活。具体地，以β-丙内酯溶液为灭活剂，以与病毒样品总体积比为1∶6000～1∶8000的量加入经前述处理的SARS病毒样品中，灭活过夜(16-24hr)后，再加入以与病毒样品总体积比为1∶4000～1∶6000(为两次加β-丙内酯工作浓度之和)的量进行二次灭活，第二次灭活条件是在2-8℃下灭活SARS病毒16-24小时，室温作用2天或37℃水浴作用2小时，以将SARS病毒彻底灭活。
在本发明所述方法实施病毒灭活后，对于灭活效果验证采用常规检测方法检测，例如，可将所得病毒灭活液样品在敏感细胞(如Vero-E6或Vero细胞)上盲传3代，验证其灭活效果。
本发明的另一个方面涉及一种所述灭活SARS病毒的纯化方法。在本发明所述的SARS灭活病毒的纯化工艺中，采用例如离心、超滤、组合层析等步骤，能够有效获得高度纯化的灭活SARS病毒，用于所述灭活SARS病毒疫苗的制备。
在本发明的一个具体实施方案中，采用了包括病毒澄清、超滤浓缩和柱层析的技术方案纯化灭活病毒，所得病毒纯化液可以用于疫苗生产，同时可以用于诊断试剂中参比抗原的制备。
在本发明所述病毒纯化的方法中，可以选择至少一种上述步骤，或其任意组合，以实现最终纯化灭活病毒至可用于灭活疫苗生产以及制备SARS检测试剂中的抗原的目的。
在本发明的又一具体实施方案中，1)将病毒灭活液进行离心澄清，具体的以2000～4000g离心力在2-8℃离心10～35分，吸上清，即为病毒澄清液；2)超滤浓缩将病毒澄清液用100-500kd(截留分子量)的膜包进行超滤浓缩10倍以上，等体积透析3-7次，透析液用0.01MPBS(pH7.0～7.6)获得病毒超滤液；以及3)柱层析将病毒超滤液用Sepharose four fast flow进行层析，洗脱液0.01M PBS，收集第一穿流峰即为病毒精纯液。
在本发明的又一具体实施方案中，1)将病毒灭活液进行离心澄清，具体的以2000～4000g离心力在2-8℃离心10～35分，吸上清，即为病毒澄清液；2)超滤浓缩将病毒澄清液用100-500kd(截留分子量)的膜包进行超滤浓缩10倍以上，等体积透析3-7次，透析液用0.01MPBS(pH7.0～7.6)获得病毒超滤液；3)向步骤2)所得的经纯化的灭活病毒液中加入终浓度为10-100单位的核酸酶，优选为Benzonase；消化体系中Vero细胞残留DNA；4)再次超滤；和5)柱层析将病毒超滤液用Sepharose four fast flow进行层析，洗脱液0.01M PBS，收集第一穿流峰即为病毒精纯液。
在本发明的又一具体实施方案中，1)将病毒灭活液进行离心澄清，具体的以2000～4000g离心力在2-8℃离心10～35分，吸上清，即为病毒澄清液；2)超滤浓缩将病毒澄清液用100-500kd(截留分子量)的膜包进行超滤浓缩10倍以上，等体积透析3-7次，透析液用0.01MPBS(pH7.0～7.6)获得病毒超滤液；3)柱层析将病毒超滤液用Sepharosefour fast flow进行层析，洗脱液0.01M PBS，收集第一穿流峰；4)向步骤3)中收集的经纯化的灭活病毒液中加入终浓度为10-100单位的核酸酶，优选为Benzonase；消化体系中Vero细胞残留DNA；和5)再次超滤，获得病毒精纯液。
在本发明中所使用的DNA酶可以为本领域已知的能够有效降解Vero细胞残留DNA的DNA酶，优选的，所述DNA裂解酶为Benzonase(默克公司)本发明的又一方面涉及一种灭活SARS病毒疫苗，其中含有免疫有效量的灭活SARS病毒，以及药学上可接受的载体，任选的，还含有合适量的佐剂。在本发明中，所述免疫有效量是指能够在接种后有效产生免疫反应的量。本领域技术人员能够知晓如何依据疫苗接种的途径选择适当的接种量。在适于本发明所述的疫苗中，所述疫苗中灭活病毒的含量为1-1000ug/ml，优选为20-500ug/ml，特别优选为40-100ug/ml。
本发明所述疫苗中可以不使用佐剂，或者使用疫苗制备领域中常用的佐剂包括但不限于，氢氧化铝佐剂或流感病毒血凝素。
本发明还涉及一种制备灭活SARS病毒疫苗的方法。具体的，将经过上述方法纯化后所获得的病毒纯化液进一步经过如下处理1)将病毒精纯液用选自0.2μm滤器或辐照方法除菌，获得疫苗原液；2)将疫苗原液稀释到总蛋白10-50微克/毫升，分装为灭活疫苗。
本发明所述SARS病毒疫苗制备方法中，步骤1)中所述过滤除菌优选为采用0.2μm滤器除菌，而辐照灭菌优选的采用4-10千戈瑞剂量的钴60照射样品60分钟。
本发明所述制备疫苗的方法中，步骤2)中可以采用注射用水稀释疫苗原液，还可以采用含有氢氧化铝浓度为0.7-1.2mol/L，0.01MPBS，pH6.8-7.2，的氢氧化铝稀释液稀释疫苗原液，最终将疫苗原液稀释到总蛋白10-50微克/毫升或10-100SU/毫升SARS抗原(SARS抗原单位用SU表示，1SU是指能使小鼠产生64个中和抗体单位所需的抗原量)。或者采用含有流感血凝素的流感疫苗原液将SARS疫苗原液配比到含有如上所述效剂量SARS抗原，H1N1、H3N2、B型流感病毒血凝素分别大于12微克。
在本发明所述灭活SARS病毒疫苗中，可包含灭活的至少一种选自如下的冠状病毒属SARS病毒的毒株Sino1，Sino2，Sino3，Sino4，和Sino5。所述病毒毒株分别于2003年6月27日保藏在国际保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国北京市海淀区中关村北一条13号)，保藏号分别为0962，0963，0964，0965和0966。
本发明还涉及预防哺乳动物尤其是人免受SARS病毒感染的方法，包括给需要的个体接种免疫有效量的本发明的疫苗。优选地，接种途径包括但不限于皮下、鼻内、口服、皮内、肌内、或肠胃外途径。
图1.选择不同福尔马林溶液浓度进行灭活对SARS病毒感染滴度的影响。
图2.选择不同β-丙内酯溶液浓度对SARS病毒感染滴度的影响。
实施例实施例1 SARS病毒灭活在本发明中，采用选自福尔马林溶液和β-丙内酯的灭活剂，对含有SARS病毒的样品进行灭活。
1)福尔马林溶液灭活分别以等体积向待处理的SARS病毒样品中加入经1∶100(体积比)稀释的福尔马林溶液，在37℃下用工作浓度分别为1∶1000、1∶2000、1∶4000(体积比)稀释的福尔马林溶液处理SARS病毒液，得到SARS病毒推算灭活时间分别为2.9小时、6.0小时和12.5小时。结果详见表1灭活动力学曲线参见图1。
表1 不同浓度福尔马林溶液灭活SARS病毒时间灭活前 推算灭活时间福尔马林 斜率CCID50/ml (hr)1∶1000 6.7 -2.4 2.91∶2000 6.7 -1.13 6.01∶4000 6.7 -0.53 12.52)β-丙内酯溶液灭活分别以等体积向待处理的SARS病毒样品中加入经1∶10(体积比)稀释的β-丙内酯溶液，在4℃下用工作浓度分别为1∶4000、1∶6000、1∶8000(体积比)稀释的β-丙内酯溶液处理SARS病毒液，得到SARS病毒推算灭活时间分别为2.9小时、7.2小时和11.6小时，结果见表2。在此基础上延长至少2倍时间即为首次灭活时间。灭活动力学曲线参见图2。
表2 不同浓度β-丙内酯灭活SARS病毒时间灭活前 推算灭活时间β-丙内酯浓度斜率CCID50/ml(hr)1∶40007.2 -2.42.91∶60007.2 -1.025 7.21∶80007.2 -0.63 11.6实施例2 在规模化制备SARS病毒的细胞工厂中原位灭活SARS病毒在本发明中还可以在规模化制备SARS病毒的细胞工厂中原位灭活SARS病毒。
将制备好的灭活剂，即经1∶100(体积比)稀释的福尔马林溶液，等量加入盛有待灭活SARS病毒的细胞工厂(购自丹麦NUNC公司)内，混匀，在搅拌下，经37℃原位灭活2.9～12.5小时后收获。
或者当采用β-丙内酯溶液作为灭活剂时，将1∶10稀释后加入，使得β-丙内酯溶液与总样品体积比为1∶6000～1∶8000。灭活温度2～8℃16～24小时。
实施例3 SARS病毒超时灭活或二次灭活1)对由实施例2所得采用福尔马林为灭活剂处理得到的病毒灭活液，将其在与如实施例2所述相同的灭活条件下以首次灭活时间的3倍进行超时灭活。
2)对由实施例2所得采用β-丙内酯为灭活剂处理得到的灭活病毒液，进行二次灭活。再次加入与病毒样品总体积比为1∶4000～1∶6000(为两次加β-丙内酯工作浓度之和)的量进行二次灭活，第二灭活条件是在2-8℃下灭活SARS病毒16-24小时，室温作用2天或37℃水浴作用2小时，以将SARS病毒彻底灭活。
实施例4 SARS病毒灭活效果验证将如实施例2或3中所述完成病毒灭活或者病毒超时灭活(或二次灭活)的SARS病毒液，分别取样(20～100ml)，采用敏感细胞连续盲传3代，进行灭活效果验证试验，用标准的细胞病变检测法(CPE)或直接、间接免疫荧光法(IF)，监测病毒是否被彻底灭活，验证其灭活效果，保证疫苗生产的安全性。
实施例5 经本发明所述方法灭活的SARS病毒之抗原性采用反向间接血凝方法检测SARS病毒灭活前后的抗原性，抗原含量无明显差异，结果如表3所示
表3 三批SARS病毒液灭活前后抗原性检测结果抗原含量(血凝效价)批号灭活前 灭活后F30307-008 1∶224 1∶192F30308-022 1∶160 1∶128F30308-024 1∶160 1∶192上述结果表明，经过本发明前述实施例1-3中所述方法处理的SARS病毒，经灭活后仍具有适于制备疫苗的抗原性。
实施例6 灭活SARS病毒的纯化将如实施例3所得病毒灭活液进行如下操作，以纯化所得病毒灭活液1)离心澄清，即以2000～4000g离心力在2-8℃离心10～35分，吸上清，得到病毒澄清液；2)超滤浓缩将病毒澄清液用100-500kd(截留分子量)的膜包进行超滤浓缩10倍以上，等体积透析3-7次，透析液用0.01M PBS(pH7.0～7.6)，获得病毒超滤液；3)柱层析将病毒超滤液用Sepharose four fast flow进行层析，收集第一穿流峰即为病毒纯化液。洗脱液0.01M PBS。
或者，将如实施例3所得病毒灭活液进行如下操作，以纯化所得病毒灭活液1)将病毒灭活液进行离心澄清，具体的以2000～4000g离心力在2-8℃离心10～35分，吸上清，即为病毒澄清液；2)超滤浓缩将病毒澄清液用100-500kd(截留分子量)的膜包进行超滤浓缩10倍以上，等体积透析3-7次，透析液用0.01M PBS(pH7.0～7.6)获得病毒超滤液；
3)向步骤2)所的经纯化的灭活病毒液中加入终浓度10-100单位Benzonase(默克公司)，1-10mM Mg2+室温处理4小时以上，消化体系中Vero细胞残留DNA和体系的RNA；消化体系中Vero细胞残留DNA；4)再次超滤；5)柱层析将病毒超滤液用Sepharose four fast flow进行层析，洗脱液0.01M PBS，收集第一穿流峰即为病毒精纯液。
或者，将如实施例3所得病毒灭活液进行如下操作，以纯化所得病毒灭活液1)将病毒灭活液进行离心澄清，具体的以2000～4000g离心力在2-8℃离心10～35分，吸上清，即为病毒澄清液；2)超滤浓缩将病毒澄清液用100-500kd(截留分子量)的膜包进行超滤浓缩10倍以上，等体积透析3-7次，透析液用0.01M PBS(pH7.0～7.6)获得病毒超滤液；3)柱层析将病毒超滤液用Sepharose four fast flow进行层析，洗脱液0.01M PBS，收集第一穿流峰；4)向步骤3)中收集的经纯化的灭活病毒液中加入终浓度10-100单位Benzonase(默克公司)，1-10mM Mg2+室温处理4小时以上，消化体系中Vero细胞残留DNA和体系的RNA；5)再次超滤，获得病毒精纯液。
实施例7 灭活病毒疫苗的制备将经过实施例1-3所述方法灭活的病毒灭活液依照实施例6所述方法纯化后，将所得病毒纯化液进一步经过如下处理1)将病毒精纯液用选自0.2μm滤器或4-10千戈瑞剂量的钴60照射样品(体积不限)60分，除菌，获得疫苗原液；2)将疫苗原液用注射用水稀释到总蛋白10-50微克/毫升或10-100SU/毫升SARS抗原(SARS抗原单位用SU表示，1SU是指能使小鼠产生64个中和抗体单位所需的抗原量)，分装为灭活疫苗；3)任选的，采用含有佐剂氢氧化铝的铝稀释液氢氧化铝浓度为0.7-1.2mol/L，0.01MPBS，pH6.8-7.2，将疫苗原液稀释到总蛋白10-50微克/毫升或10-100SU/毫升SARS抗原(SARS抗原单位用SU表示，1SU是指能使小鼠产生64个中和抗体单位所需的抗原量)，氢氧化铝含量为0.35-0.62mol/L，pH6.8-7.2，分装为灭活疫苗；4)或者任选的，用含有流感血凝素的流感疫苗原液(总蛋白100-300微克/毫升，H1N1、H3N2、B型流感病毒血凝素分别大于12微克)稀释上述SARS疫苗原液，得到以流感血凝素为佐剂的SARS疫苗。
实施例8 SARS疫苗的安全性评价、免疫原性和有效性试验结果将如实施例7所制备的灭活病毒疫苗，按照40～100ug/1.0ml剂量通过肌肉注射接种恒河猴或按照20～40ug/1.0ml剂量通过腹腔注射接种小鼠，进行疫苗的安全性、免疫原性和有效性试验。结果接种疫苗组与未接种疫苗组(接种吸附剂)的动物，经观察均无临床症状，其粪便、排泄物均未检测到SARS病毒，组织器官也无病理改变，动物试验结果初步验证了灭活疫苗的安全性。
疫苗接种后10、15、30天采血，采用常规EIA法检测SARS病毒IgG抗体及常规细胞中和试验法检测保护性中和抗体，其结果IgG总抗体10天均已阳转，表明该疫苗具有良好的免疫原性，结果详见表4。
用10、15、30天猴免疫血清与不同SARS毒株中和后进行细胞中和试验，结果证实其免疫血清对不同SARS毒株均有良好的中和作用，其中和抗体效价平均可达1∶16-1∶32，即疫苗的有效性得以初步证实，结果详见表5。
表4 SARS灭活疫苗免疫接种后10、15、30天IgG总抗体检测结果
表5 SARS灭活疫苗免疫接种后10、15、30天中和抗体检测结果
动物预试验结果基本证实该本发明所制备的灭活疫苗，不仅具有良好的安全性和免疫原性，中和试验结果进一步证实了该疫苗的有效性。
权利要求
1.一种SARS病毒的灭活方法，其包括如下步骤1)在37℃以与待处理样品总体积比为1∶1000-1∶4000的福尔马林溶液为灭活剂处理浓度为1∶128-192(血凝效价)的SARS病毒样品液，2.9-12.5小时；或者2)在2-8℃以与待处理样品总体积比为1∶6000-1∶8000的β-丙内酯处理浓度为1∶128-192(血凝效价)的SARS病毒样品液，16-24小时；3)任选的，还包括二次灭活或超时灭活的步骤。
2.权利要求1所述的灭活方法，其中，1)在37℃下用与待处理样品总体积比分别为1∶1000、1∶2000、1∶4000的福尔马林溶液处理2.9小时、6.0小时和12.5小时，得到完全灭活的SARS病毒灭活液；或者2)在2-8℃用与待处理样品总体积比分别为1∶6000、1∶8000的β-丙内酯溶液处理SARS病毒样品16-24小时SARS病毒样品。
3.权利要求1所述的灭活方法，其中所述超时灭活是指以福尔马林溶液为灭活剂时，将所得灭活SARS病毒经过首次灭活时间的3倍的超时灭活；所述二次灭活是指以β-丙内酯为灭活剂时，加入与病毒样品总体积比为1∶4000～1∶6000(为两次加β-丙内酯工作浓度之和)的量进行二次灭活，第二灭活条件是在2-8℃下灭活SARS病毒16-24小时，室温作用2天或37℃水浴作用2小时。
4.一种按照权利要求1所述方法制备的SARS病毒灭活液。
5.一种纯化权利要求3所述的SARS病毒灭活液以制备纯化的灭活SARS病毒的方法，其包括选自如下方案A)纯化方案一1)将病毒灭活液进行离心澄清，具体的以2000～4000g离心力在2-8℃离心10～35分，吸上清，即为病毒澄清液；2)超滤浓缩将病毒澄清液用100-500kd(截留分子量)的膜包进行超滤浓缩10倍以上，等体积透析3-7次，透析液用0.01M PBS(pH7.0～7.6)获得病毒超滤液；以及3)柱层析将病毒超滤液用Sepharose four fast flow进行层析，洗脱液0.01M PBS，收集第一穿流峰即为病毒精纯液；B)纯化方案二1)将病毒灭活液进行离心澄清，具体的以2000～4000g离心力在2-8℃离心10～35分，吸上清，即为病毒澄清液；2)超滤浓缩将病毒澄清液用100-500kd(截留分子量)的膜包进行超滤浓缩10倍以上，等体积透析3-7次，透析液用0.01M PBS(pH7.0～7.6)获得病毒超滤液；3)向步骤2)所得的经纯化的灭活病毒液中加入终浓度为10-100单位的核酸酶，优选为Benzonase；消化体系中Vero细胞残留DNA；4)再次超滤；5)柱层析将病毒超滤液用Sepharose four fast flow进行层析，洗脱液0.01M PBS，收集第一穿流峰即为病毒精纯液；C)纯化方案三1)将病毒灭活液进行离心澄清，具体的以2000～4000g离心力在2-8℃离心10～35分，吸上清，即为病毒澄清液；2)超滤浓缩将病毒澄清液用100-500kd(截留分子量)的膜包进行超滤浓缩10倍以上，等体积透析3-7次，透析液用0.01M PBS(pH7.0～7.6)获得病毒超滤液；3)柱层析将病毒超滤液用Sepharose four fast flow进行层析，洗脱液0.01M PBS，收集第一穿流峰；4)向步骤3)中收集的经纯化的病毒灭活液中加入终浓度为10-100单位的核酸酶，优选为Benzonase；消化体系中Vero细胞残留DNA；5)再次超滤，获得病毒精纯液。
6.一种按照权利要求5方法所得的经纯化的灭活SARS病毒精纯液。
7.一种灭活SARS病毒疫苗，其中含有免疫有效量的灭活SARS病毒，以及药学上可接受的载体，任选的，还含有合适量的佐剂。
8.权利要求7所述的灭活SARS病毒疫苗，其中含有至少一种选自保藏号为CGMCC 0962，0963，0964，0965和0966的经灭活的SARS病毒。
9.权利要求8所述的灭活SARS病毒疫苗，其中所述灭活的SARS病毒按照权利要求3和5所述方法制备。
10.权利要求7所述的灭活SARS病毒疫苗，其中所述佐剂选自Al(OH)3和流感血凝素。
11.一种制备权利要求7所述灭活SARS病毒疫苗的方法，包括1)将权利要求6所述病毒精纯液用选自过滤除菌或辐照灭菌的方法除菌，获得疫苗原液；2)将权利要求6的疫苗原液稀释到总蛋白10-50微克/毫升或10-100SU/毫升SARS抗原，分装为灭活疫苗。
12.权利要求11所述的方法，其中步骤1)中所述过滤除菌采用0.2μm滤器，辐照灭菌采用4-10千戈瑞剂量的钴60照射样品60分钟。
13.权利要求11所述的方法，其中步骤2)采用的稀释液选自注射用水，含有氢氧化铝浓度为0.7-1.2mol/L，0.01MPBS，pH 6.8-7.2的氢氧化铝稀释液，和含有流感血凝素的流感疫苗原液，其中总蛋白100-300微克/毫升，H1N1、H3N2、B型流感病毒血凝素分别大于12微克。
全文摘要
本发明涉及一种SARS病毒的灭活方法，所述灭活病毒的纯化方法，SARS灭活疫苗的制备工艺，以及含有所述灭活病毒的疫苗。
文档编号C12N7/01GK1616654SQ20031011434
公开日2005年5月18日 申请日期2003年11月12日 优先权日2003年11月12日
发明者张振山, 张建三, 韩中山, 刘长民, 高强, 刘瑜瑄, 陈江婷, 公雪杰, 尹卫东 申请人:北京科兴生物制品有限公司