专利名称：棉花Nodulin－like基因及其启动子的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种棉花的Nodulin-like基因及其启动子，该基因及其启动子在棉花纤维中呈显著优势表达。这种基因及其启动子可应用于棉花纤维发育研究及品质改良。本发明还涉及一种获得该基因及其启动子的方法技术。
背景技术：
棉花是世界性的重要经济作物。棉纤维是一种优良的天然纤维，是重要的纺织工业原料。人类的现代生活需求和纺纱工业技术的发展都对棉花纤维品质提出了更高的要求，优良的纤维品质已成为世界棉花育种的主要目标之一。在过去几十年里，传统育种在棉纤维品质改良方面起到重要作用，但由于受到育种周期长、外源种质利用困难、棉花纤维品质与产量性状之间呈负相关等因素的限制，用常规育种技术进行纤维品质改良进展缓慢。利用基因工程来改良现有棉花品种的纤维品质，由此获得具有优良纤维品质的棉花新品种，加速优质棉的育种进程。而此项工作的开展依赖于对棉纤维发育相关基因及其调控元件的识别与分离(贾士荣，郭三堆，2002，转基因棉花，p265-270)。
棉纤维发育过程中有几千个基因表达，其相关基因的分离鉴定以及调控研究起步较晚，但进展很快。John和Crow首次报道运用cDNA文库差异筛选方法克隆出纤维特异表达基因E6。用E6反义基因转化棉花，可将植株中E6的转录水平降低60％-98％，但转化植株的生长发育以及纤维特性并未发生变化，说明E6在棉纤维的发育中并不起到决定性作用(Jhon M E，1996，Plant Molecular Biology 30297-306)。美国棉纤维发育相关基因研究走在世界前列，也是这方面申请专利最多的国家，其中大部分如H6、Rac13、Fb12A、FS5、FS6和GhEX1等为纤维细胞特异表达或优势表达类型基因(Orford S J.，1998，Biochim Biophy Acta，1398342-346)。从目前国内外的研究进展来看，己克隆的棉纤维发育相关基因多数是在纤维伸长阶段的纤维细胞中特异或优势表达。但绝大部分基因在棉纤维发育中的确切功能还不清楚或有待确定，因此，还不能有效地应用于纤维品质的遗传改良(贾士荣，郭三堆，2002，转基因棉花，p265-270)。
分离鉴定与棉纤维发育相关的基因，了解这些基因对棉纤维强度、长度和细度等内在品质性状的建成可能起到的重要作用，可以为棉纤维品质改良基因工程提供目的基因。此外，分离这些基因的启动子、增强子或决定纤维特异性表达或优势表达的DNA序列，可以为棉纤维品质改良基因工程提供表达调控元件。
棉纤维品质的分子育种方面，目前已经申请了十几项专利。棉纤维发育相关基因及其启动子的专利目前有20多项(郭旺珍，张天真，2003，科学通报，5410-417)。
Nodulin基因是一类在豆科植物根瘤中特异表达的致瘤基因(Hardin SC，2003，Plant J.，35(5)588-603；Klebl F，2003，FEBS Lett.，1769-74；Amor BB，2003，Plant J.，34(4)495-506；Fedorova M，2002，PlantPhysiol.130(2)519-537；Kevei Z，2002，Mol Plant Microbe Interact.，15(9)922-931)，目前尚未见到这类基因在棉花纤维及其生殖器官中表达的报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种新的棉纤维发育优势表达基因Nodulin-like基因(如序列表SEQ ID2所示)。它全长为2353bp，具有6个外显子和5个内含子(如图2所示)，其cDNA全长1436bp(如序列表SEQ ID3所示)。其含有一个1125bp的ORF结构。Northern blot结果证明，它在棉纤维中呈优势表达(如图4所示)，在国内外尚未见到有类似报道。
本发明的另一个目的是提供一种新的棉纤维优势表达启动子(如序列表SEQ ID1所示)，该启动子DNA序列上具有Initiator、TATA box、CCAAT-like box等明显启动子特征序列(如图2所示)。Northern blot结果证明，该启动子驱动的Nodulin-like基因在棉纤维细胞中优势表达(如图4所示)。在国内外尚未见到有类似报道。
本发明的再一个目的是提供一种新的棉纤维优势表达的蛋白质。Nodulin-like蛋白，它具有375个氨基酸(如序列表SEQ ID4所示)。与几种植物Nodulin蛋白具有一定同源性(最高为51％)，在国内外尚未见到有类似报道。
本发明再一个目的是提供一种我们自己独创的同尾酶反向PCR(isocaudarner inverse PCR，II-PCR)技术，在棉花基因组上连续步移，获得了棉花Nodulin-like基因2090bp的DNA序列(如图1所示)。再用我们自己独创的快速分离目的基因cDNA-5”未知序列和启动子(rapid isolation of cDNA 5’unknown sequence andpromoter，RICUP)的技术，获得了Nodulin-like基因的全长cDNA序列和启动子(如图2所示)。
图1为同尾酶反向PCR进行染色体步移扩增到棉花Nodulin-like基因上游3059bp DNA序列琼脂糖凝胶电泳图及II-PCR流程示意图。M为DNA Marker，I、II分别为第一和第二次反向PCR步移的PCR反应电泳图。
图2为棉花Nodulin-like基因全长cDNA的步移和启动子定位过程琼脂糖凝胶电泳图及RICUP流程示意3为用Southern blot确定Nodulin-like在棉花基因组中的拷贝数。M为DNA Marker，1、2、3和4分别代表用EcoRI、HindIII、BamHI、BglII四种限制性内切酶完全消化棉花基因组DNA的电泳泳道。
图4为用Northern blot确定启动子在在棉花纤维中优势表达。1、2、3、4、5、6、7和8分别代表棉花根、茎、叶、蕾、花、铃壳、纤维和后期纤维中提取的总RNA电泳泳道。
具体实施例方式
下文通过实施例对本发明做进一步说明实施例1新型棉花纤维发育相关基因Nodulin-like基因DNA序列的分离和克隆。
1DNA模板的制备用改良的CTAB法提取陆地棉品种Y18基因组DNA，要求DNA片段大于50Kb，OD260/OD280大于1.8。
2Nodulin-like基因全长为4506bp棉花染色体DNA序列的获取是在棉花arf1基因启动子序列克隆的基础上进行的，在获取棉花arf1基因启动子序列之后，我们进行了两次同尾酶反响PCR步移得到了Nodulin-like基因及其启动子全长为4506bp的DNA序列，具体实施过程如下第一次反向PCR选用BglII同尾酶BamHI充分消化棉花基因组DNA，选用DFP1和DIP1作为PCR引物(见PCR引物表)，环化后反向PCR扩增出2925bp的带(图1A)。克隆测序结果表明，序列向前推进1987bp(图1C)。第二次反向PCRPCR引物表
先选用Bcll(BglII同尾酶)彻底消化棉花基因组DNA，选用DFP2和DIP2作为PCR引物(见PCR引物表)，环化后未有特异条带扩增；于是再选用BglII切割上述酶切产物，环化后反向PCR得到2661bp条带(图1B)，扣除1589bp重叠序列，最终使序列向5’端步移1072bp(图1C)。经由两次反向PCR将序列推进3059bp，计入原来得到的棉花arf1基因启动子序列上游1447bp，共获全长4506bp棉花基因组DNA序列。
3棉花基因组4506bp DNA序列外显子的捕获及全长cDNA步移引物的设计在NCBl/GenBank中进行该序列Blast搜索，GenBank中未发现有与该序列同源的序列，进一步查询表明，核酸(nr)库中无任何与4506bp侧翼序列同源的序列；EST库检索结果显示，仅有一条亚洲棉纤维EST序列与之高度同源；而在蛋白库中搜索发现其与多种植物Nodulin蛋白同源，其中与拟南芥的Nodulin蛋白同源性最高达49％。根据以上信息加之用DNAStar软件对上游DNA序列外显子的进一步捕获，可初步将Nodulin-like基因可能的外显子定位在该DNA序列上。进一步试验中，在各可能外显子处设计用于Nodulin-like基因5’端cDNA步移引物(见PCR引物表)NCF1、NCF2、NCF3、NCF4、NCF5、NCF6、NCF7和NCR1(如图2所示)。
实施例2棉花Nodulin-like基因全长cDNA及启动子的分离和定位1RNA模板的制备采用改良的热硼酸法提取陆地棉品种Y187-10dpa纤维总RNA，OD260/OD280大于1.8。用于cDNA序列扩增和未知cDNA序列步移。
2全长cDNA的步移及启动子位置的确定用NCF1与Oligo(dT18)配成引物对(见PCR引物表)，从棉花7-10dpa纤维总RNA中RT-PCR扩增出862bp的Nodulin-like cDNA3’端全长(图2A)，初步将Nodulin-like基因转录终止位点定位于4506bp处。CDNA5’端第一次步移是将NCF2、NCF3、NCF4、NCF5、NCF6分别与NCR1组成5对引物(见PCR引物表)从棉花7-10dpa纤维总RNA中RT-PCR。结果分别从NCF3和NCF4组合各扩出一条1176bp和1341bp的cDNA条带(图2B)。序列分析发现，NCF4上游1969bp处具有一个典型Initiator结构。在附近设计引物NFP7，与NCR1组成引物对，扩增到一条1432bp的cDNA条带(图2C)。与基因组DNA同源序列比较发现，Nodulin-like基因全长为2353bp，具有6个外显子和5个内含子，其cDNA全长1436bp。因NCF2位于内含子中，NCF5与NCF6位于转录起始位点外，故它们均未有扩增。利用DNASTAR的Geneqest软件对1436bp的cDNA序列分析发现，其含有一个1125bp的ORF结构，编码375个氨基酸。利用GenBank的blastp对其氨基酸序列进行查询，发现其与几种植物Nodulin蛋白具有一定同源性。对上游DNA序列分析发现，Initiator上游具有典型TATA box、CCAAT-like box等明显启动子特征序列(图2D)。由此，可将Nodulin-like基因启动子定位于1969bp以上位置(图2D)。
实施例3棉花Nodulin-like基因的拷贝数分析用EcoRI、HindIII、BamHI、BglII四种限制性内切酶完全消化棉花基因组40μg DNA，用0.8％的琼脂糖凝胶对DNA进行电泳分级分离，然后按照试剂盒说明书进行转膜、Southern杂交，杂交探针为地高辛标记的Southern基因DNA特异片段。进行Southern杂交，四个泳道中均出现预期的条带，这表明Nodulin-like在棉花基因组中以单拷贝存在(图3)。
实施例4棉花Nodulin-like基因启动子表达特性分析Northern blot分别棉花根、茎、叶、蕾、花、纤维和铃壳中提取总RNA，各取总RNA 15μg，用1.5％的甲酰胺-甲醛琼脂糖凝胶对RNA进行电泳分级分离，然后按照试剂盒说明书进行转膜、Northern杂交，杂交探针为地高辛标记的Nodulin-like cDNA特异片段。结果表明Nodulin-like在棉花纤维中呈显著优势表达(图4)。
实施例5棉花Nodulin-like基因启动子功能区域的确定将棉花Nodulin-like基因的启动子序列构建了350bp、896bp和1913bp三种启动子缺失片段，各自的引物对分别是NPF1/NPR1、NPF2/NPR1、NPF3/NPR1(见PCR引物表)。将这三种启动子片段与pBI121植物表达载体上的gus基因融合，然后用花粉管通道技术将其导入到棉花品种Y18中。用gus染色法对阳性后代植株的根、茎、叶、蕾、花、纤维和玲壳进行染色，结果表明1913bp的启动子区段在棉花的蕾、花、纤维和玲壳中的表达效果最好。
棉花Nodulin-like基因及启动子.ST25生物材料的分类命名大肠埃希氏菌保藏单位名称中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏单位地址北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所保藏日期2003年11月25日保藏编号CGMCC No.1046SEQUENCE LISTING<110>中国农业科学院生物技术研究所<120>棉花Nodulin-like基因及其启动子<130>棉花Nodulin-like基因及其启动子<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2090<212>DNA<213>陆地棉Y18<400>1tcgattcaat tttgacatca ttagctgtgc cataattaca attatatggt gacgttatcc 60atgctgtcac tttttcattt gtagttcata aatgtgatga tatattatgt tattaaaaat 120gtgactgtgt ttctttcgtc atctgtatgt tgaatgttat ttcattatag ataacgattt 180aaccaataat cagcaatgaa cttgtacata acttggtgat aaaaaaagta gttgtcacta 240aaaactaatt aaggatgaac ataacctaat agttagtaaa atgtaccatt aactatagag 300ctaaagtgat agatgtggtg ttccgttact aaaaacaaat agtggcgcaa acatcaaatt 360tgagtgatat tattttaaat gctacaaact tgttgtagtg atgagttaag ctaactttta 420ggactcaacc atgattcaat tattgaaata ttttaatcaa caatgattgg atttcatccc 480aatacatgat gattattcat ttattatgca acatatacat acatgcatca tgtgacacat 540atatgatctt ttgcacgtat ctttttcttg taaatattaa tgaacttata taaccaccat 600atttcgtgtc gtacatttct tcatgcttgg gatactctga aatgtttgcc caaaacagaa 660tcctcccata gctaagcttt attgcaatct cataagagac gaattaatca ttgcatttcc 720ataattaatg ctgacaccca ttcttcatat gttccatcat tttcattaat taatgttaat 780tataagttta aaacacttta ttcaaacatt taataaatat aattaatcta cattatctta 840agttaaatct tttgggattt tgtcatgtaa ggctttcttt taagcttacc atatatatgt 900agaaatatgc aaatatcaag ttgatccata tgaataaaca aatattaaca tctccaatcc 960ctaaccatag aaatgttatg cacatatacg taaagtacat aaacgtggca aagattgagc1020tgagaaacat ggacaaaaag ttgacaacta agatcatagt gggttcaaac aaggatccca1080taatcaaccc tttttccatt tatatatgca gattatgaat ataaatatta tatagtgata1140tactgataca tgctgatgta aattcccata atataacacc aacttgttaa aaaaaatgga1200
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棉花Nodulin-like基因及启动子.ST25Ser Gly Gln Ala Lys Val Ile Gly Thr Leu Val Cys Val Gly Gly Ala130 135 140Met Leu Leu Ser Phe Tyr His Gly His Ile Ile Gly Ile Gly Glu Ser145 150 155 160Ser Ile His Trp Asn Tyr Ala Asn Lys Met Ala Asn Ser Ser Pro Ser165 170 175Pro Ser Gly Ser Asn Phe Phe Leu Gly Pro Phe Leu Val Met Ala Ser180 185 190Ala Val Ala Trp Ala Leu Trp Phe Ile Ile Gln Gly Gln Thr Ser Lys195 200 205Ser Phe Pro Ala Pro Tyr Thr Ser Thr Thr Leu Met Cys Phe Met Ala210 215 220Ser Ile Glu Cys Thr Ile Ile Gly Ile Phe Ser Asp Pro Lys Pro Ser225 230 235 240Ala Trp Ser Leu Ser Ser Ser Met Arg Leu Ile Ala Ala Leu Tyr Ala245 250 255Gly Ile Ile Cys Ash Ala Val Ala Phe Cys Val Met Ser Trp Cys Ile260 265 270Gln Lys Arg Gly Pro Leu Tyr Val Ser Val Phe Ser Pro Leu Leu Leu275 280 285Val Ile Val Ala Ile Leu Ser Trp Ala Leu Leu Arg Glu Lys Leu Tyr290 295 300Val Gly Thr Val Val Gly Ser Leu Leu Ile Val Gly Gly Leu Tyr Ala305 310 315 320Val Leu Trp Gly Lys Asp Lys Glu Met Lys Gln Met Lys Gly Asn Glu325 330 335Lys Gly Gly Glu Glu Gln Val Val Val Glu Glu Gly Ala Val Glu Val340 345 350Thr Lys Ala Gly Asp Arg Asp His Asp Leu Glu Met Gln Leu Gln Gln355 360 365Gly Gly Ala Ala Cys Gly370
权利要求
1一种启动子序列，它具有如序列表SEQ ID1所示的核苷酸序列及其功能等同序列。
2按照权利要求1所述的启动子，其特征在于能够驱动基因在棉花纤维中呈显著优势表达，并且在棉花的花蕾、花、铃壳中也能优势表达。
3一种蛋白质，它具有如序列表SEQ ID4所示的氨基酸序列及其功能等同序列。
4按照权利要求3所述的蛋白质，其特征在于能够在棉花纤维中呈显著优势表达，并且在棉花的花蕾、花、铃壳中也能优势表达。
5一种编码权利要求3所述蛋白质的cDNA序列及其功能等同序列。
6按照权利要求5所述的cDNA序列，它具有如序列表SEQ ID3所示的核苷酸序列。
7一种编码权利要求3所述蛋白质的棉花基因组DNA序列。
8按照权利要求7所述的棉花基因组DNA序列及其功能等同序列，其特征在于含有5个内含子和6个外显子，它具有如序列表SEQ ID2所示的核苷酸序列。
9一种从真核生物基因组中分离目的基因及其启动子的方法。
10按照权利要求9所述的方法，其特征在于利用限制性内切酶及其同尾酶切割棉花基因组DNA，使反向PCR能够应用于棉花基因组连续步移。
全文摘要
本发明提供了一种棉花的Nofulin－like基因及其启动子，该基因及其启动子在棉花纤维中呈显著优势表达。这种基因及其启动子可应用于棉花纤维发育研究及品质改良。本发明还提供一种获得该基因及其启动子的方法技术。
文档编号C12N15/11GK1696288SQ200310113798
公开日2005年11月16日 申请日期2004年5月14日 优先权日2004年5月14日
发明者郭三堆, 任茂智, 张锐 申请人:中国农业科学院生物技术研究所