专利名称：一种生产7-氨基头孢烷酸的方法及其专用重组酶的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及生物技术特别是生物工程领域中一种生产7-氨基头孢烷酸的方法及其专用重组酶。
背景技术：
7-氨基头孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid，7-ACA)是目前半合成头孢菌素的重要原料，主要由头孢菌素C(Cephalosporin C，CPC)通过化学法或酶法裂解脱去7-位的D-α-氨基己二酰侧链得到的。
使用酶法替代传统的化学法裂解头孢菌素C生产7-ACA，具有工艺简单、高效、安全、无污染及产品质量稳定等优点，在经济和保护环境上均有较大的竞争优势。近年来，人们已对酶法生产半合成抗生素的研究和开发投入了大量人力和物力。用酶法裂解生产7-ACA，分为一步酶法和两步酶法。其中一步酶法，利用头孢菌素C酰化酶(Cephalosporin C acylase)直接催化头孢菌素C，脱去7-位的D-α-氨基己二酰侧链，生成7-ACA。虽然该法步骤简单，但目前已发现的CPC酰化酶活力都十分低，远不能满足工业催化的需要。两步酶法是利用来源不同的两个酶进行两步催化，首先，头孢菌素C在D-氨基酸氧化酶(D-Amino Acid Oxidase，DAAO)的作用下，产生一个具有酮基的中间体，这个中间体较不稳定，很容易被同时生成的H2O2化学氧化脱羧，转变成戊二酰基-7-氨基头孢烷酸(Glutaryl-7-amidocephalosporanicAcid，GL-7-ACA)；然后在GL-7-ACA酰化酶的作用下脱去其侧链，生成7-ACA(如图1所示)。
两步酶法中用到的DAAO是一种典型的黄素蛋白(辅酶为黄素腺嘌呤二核苷酸)，广泛存在于动物内脏及微生物中，如猪肾、三角酵母、红酵母、腐皮镰孢霉和曲霉等。DAAO的底物专一性较低，可以作用于几乎所有的D-氨基酸和各种具有D-氨基的化合物(如头孢菌素C)。
大部分产生GL-7-ACA酰化酶的菌株为假单胞菌(Pseudomonas sp.)。可把具有催化GL-7-ACA活性，生成7-ACA的酶分为5类，同一类酶的基因都有95％以上的同源性，且酶学性质几乎完全相同。
目前，利用两步酶法催化裂解头孢菌素C制造7-ACA的技术在国外已经工业化，国内也已经引进国外技术进行7-ACA生产，但是从国外购买酶进行生产的成本高，经济上缺乏与化学法的竞争力。随着中国加入WTO，国外生产的头孢菌素大量涌入中国，国内抗生素工业将面临严峻的形势。因此，加紧开发具有先进水平的酶法生产7-ACA的自主技术，满足国内需求和增强国际市场竞争力已迫在眉睫。
随着生物技术的发展，人们越来越重视用基因工程的方法来生产酶和改造酶。本发明的发明人所在实验室从三角酵母中克隆得到了DAAO基因，并已将其成功构建了基因工程菌BL21(DE3)/pET-DAAO，实现了DAAO在大肠杆菌中的高效表达，DAAO酶活可达175U/mL，大大超过了文献报道值。(D-氨基酸氧化酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达，微生物学报，已录用；其物理图谱如图4所示)对于GL-7-ACA酰化酶，人们一般都是通过大量的筛选，得到具有GL-7-ACA酰化酶活性的野生菌株，然后再经过复杂的分子生物学操作，对GL-7-ACA酰化酶基因进行克隆和表达。但菌种筛选工作量大，耗时长，而且难度也大，往往需要几年的时间才能取得一定的进展。本发明的发明人发明了一种快速获取GL-7-ACA酰化酶基因的方法，即利用微生物学和分子生物学相结合的方法，经过微生物选择性培养和特异性PCR扩增的方法从自然界中快速获取目的基因，大大减少了筛选野生菌株及克隆目的基因的工作量，已申请中国专利(申请号03143198.4)。并已将所得基因用于构建基因工程菌BL21(DE3)/pET-ACY(GL-7-ACA酰化酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达，微生物学通报，已录用；其物理图谱如图4所示)，实现了GL-7-ACA酰化酶的快速表达。
在用D-氨基酸氧化酶和GL-7-ACA酰化酶催化生产7-ACA的研究中，人们通常都是先对两个菌株分别培养和表达，然后分别进行酶的分离纯化，接着再分别进行酶的固定化，最后，将固定化酶混合起来一步催化CPC或分两步进行催化。几十年来，人们的研究重点都集中在提高酶的活力和稳定性上，而对头孢菌素C催化工艺改进的研究则相对较少，因此，在现有的催化工艺中，还有许多可以进行简化和改进的地方。
在实际多步酶催化生产中，为了简化工艺，人们常将两个或多个酶进行共固定化，使多步反应可以同时进行。但仍需要对每个酶分别培养、分离纯化，而且，每个酶的最佳固定化条件可能各不相同，需要对共固定化条件进行反复优化。
近年来，结构生物学和基因工程技术的发展使得人们能够对酶分子进行有效的改造，甚至可以有针对性地设计自然界中本来不存在的新酶，使其性能更加优良或赋予其新的功能，融合基因即是其中的一个重要研究方向。所谓融合基因，是指将两个或多个基因的编码区首尾相连，置于同一套调控序列(包括启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子等)控制之下构成的嵌合基因。现代DNA重组技术的发展使得不同基因或基因片段的融合可以方便地进行，融合基因经由合适的表达系统表达后，即可获得由不同功能蛋白拼合在一起而形成的新型多功能蛋白，我们称其为融合蛋白(Fusion protein)。
在利用基因融合所构建的融合蛋白分子中，如果各个酶分子的完整编码序列保留在新的融合蛋白分子中，而且在表达过程中融合蛋白能够正确折叠，融合蛋白一般会保留所构成的酶分子各自的酶活性。与单个的酶相比，融合蛋白的酶比活可能会有所降低，但对于多酶顺序催化的反应来说，由于“邻近效应”(proximityeffect)，有可能提高多酶反应的总转化效率。也即通过基因工程的手段对催化工艺进行改进，可以使之变得更为简单、高效。因此，构建融合蛋白是继几种酶共固定化(co-immobilization)以及化学交联等方法之后又一极具应用价值的新方法。
总之，无论是在基础理论还是在工业应用方面，融合蛋白都有很高的研究价值，是生物技术领域大有发展前景的研究方向。
发明创造内容本发明的目的是提供一种具有戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶和D-氨基酸氧化酶活性的重组酶及其编码基因。
本发明所提供的重组酶，是具有序列表中SEQ ID №6氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №6的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №6的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №6衍生的蛋白质。
序列表中的SEQ ID №6是由1060个氨基酸残基组成的蛋白质。
一种上述重组酶的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №5的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №6蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №5限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中序列5的DNA序列由3183个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第1位到第3183位碱基。
含有该重组酶编码基因的表达载体和细胞系也属于本发明的保护范围，利用现有分子生物学的方法可以得到不同的表达载体和工程菌，如重组表达载体pET-ALD(图谱如图2所示)和工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-ALD。
本发明的第二个目的是提供一种生产7-氨基头孢烷酸的方法。
本发明所提供的生产7-氨基头孢烷酸的方法，是由上述重组酶催化头孢菌素C生产7-氨基头孢烷酸。
本发明的重组酶保留了GL-7-ACA酰化酶和DAAO的原本活力，并能用于头孢菌素C直接催化生产7-ACA。本发明的方法与传统的两个基因分别表达和两步催化的方法相比，可以使得基因工程菌的培养表达、酶的分离纯化及头孢菌素C的催化工艺都得到简化，也即是通过基因工程的手段对下游催化工艺进行改进，为7-ACA的催化提供了一条新思路，并加快了头孢菌素C催化生产7-ACA的工业化的步伐，具有重要的理论意义和实际意义。
图1为两步酶法生产7-ACA的示意2为含有重组酶编码基因的重组质粒pET-ALD的物理图谱图3为重组酶基因工程菌诱导表达后的全菌SDS-PAGE电泳4为含有重组酶编码基因的重组质粒pET-ALD的构建过程示意5为重组酶催化头孢菌素C 60min和120min的反应产物的HPLC色谱图具体实施方式
实施例1、含有重组酶编码基因(ACY-linker-DAAO，简称ALD)的重组质粒pET-ALD的构建重组质粒pET-ALD的构建过程如图4所示，具体步骤如下1、D-氨基酸氧化酶基因的克隆(1)以带有DAAO基因的重组质粒pET-DAAO(其相关性状为Kanr，T7 lacpromotor，DAAO；其物理图谱如图4所示)为模板，以序列表中序列1和序列2为引物进行PCR扩增，序列表中序列1由25个核苷酸残基组成，序列2由29个核苷酸残基组成。在一已灭菌的0.2mL PCR薄壁管中，依次加入5μL无菌水、10μL扩增缓冲液、1μL四种脱氧核苷酸(2.5mM，TAKARA公司)、1μL引物1(终浓度50pmol)、1μL引物2(终浓度50pmol)、0.5μL质粒pET-DAAO溶液(浓度为50ng/μL)、0.2μLpfu DNA聚合酶(5U/μL，上海生工生物工程技术服务有限公司)，用无菌水补足至总体积为20μL，将离心管置于变温系统中。在PCR反应中，PCR反应的温度变化过程为先升温至94℃，保持1分钟，接着按以下温度变化程序循环30次升温至94℃，保持1分钟，降温至56℃，保持1.5分钟，升温至72℃，保持2.5分钟，最后于72℃保持10分钟，结束扩增反应。
(2)经PCR扩增，得到带有BamH I和Hind III酶切位点的DAAO基因，并将得到的DAAO基因用BamH I和Hind III进行酶切，并与同样BamH I和Hind III酶切的大肠杆菌表达质粒pET-28(购自Novagen公司，其相关性状为Kanr，T7 lacpromotor；其物理图谱如图4所示)用T4 DNA连接酶进行连接，连接样品转化大肠杆菌TOP-10F’(购自Invitrogen公司，相关性状有F-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80lacZΔM15ΔlacX74deoRrecAlaraD139(ara-leu)7697galU galK rpsL(StrR)endAl nupG)感受态细胞，在含有100μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上培养16hr后，挑取若干单菌落于液体LB培养基中培养过夜，收集菌体并提取质粒，0.7％琼脂糖凝胶电泳检测，筛选得到带有新的DAAO基因的重组质粒pET-DAAO fusion(其相关性状为Kanr，T7 lac promotor，DAAOfusion)。
2、带有连接肽序列的GL-7-ACA酰化酶基因的克隆(1)以带有GL-7-ACA酰化酶基因的重组质粒pET-ACY(其相关性状为Kanr，T7lac promotor，ACY；其物理图谱如图4所示)为模板，以序列表中序列3和序列4为引物进行PCR扩增，序列3由31个核苷酸残基组成，序列4由58个核苷酸残基组成。在一已灭菌的0.2mL PCR薄壁管中，依次加入5μL无菌水、10μL扩增缓冲液、1μL四种脱氧核苷酸(2.5mM)、1μL引物1(终浓度50pmol)、1μL引物2(终浓度50pmol)、0.5μL质粒pET-ACY溶液(浓度为50ng/μL)、0.2μLLA Taq DNA聚合酶(5U/μL，TAKARA公司)，用无菌水补足至总体积20μL，将离心管置于变温系统中。在PCR反应中，PCR反应的温度变化过程为先升温至94℃，保持1分钟，接着按以下的温度变化程序循环30次升温至94℃，保持1分钟，降温至58℃，保持1.5分钟，升温至72℃，保持2.5分钟，最后于72℃保持10分钟，结束扩增反应。
(2)经PCR扩增得到的带有Nde I和BamHI酶切位点的GL-7-ACA酰化酶基因，同时在PCR下游引物中引入了一段对应(Gly-Ser)6的连接肽编码序列GGATCAGGCTCTGGGTCTGGCTCTGGATCAGGATCC。
这个连接肽的插入是为增加两个酶分子之间的距离，减小它们的空间位阻，使融合蛋白最大限度地保持其原有生物学活性。而且扩增得到GL-7-ACA酰化酶基因被去除了终止密码子TGA，融合基因在翻译到GL-7-ACA酰化酶C端时不会终止，而会继续翻译连接肽和D-氨基酸氧化酶基因，从而表达成一个完整的融合蛋白。
将PCR得到的GL-7-ACA酰化酶基因用Nde I和BamH I进行酶切，并将得到的GL-7-ACA酰化酶基因用BamH I和Nde I进行酶切，并与同样BamH I和Nde I酶切的DAAO重组质粒pET-DAAO fusion用T4 DNA连接酶进行连接，连接样品转化大肠杆菌TOP-10F’感受态细胞，在含有100μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上培养16hr后，挑取若干单菌落于液体LB培养基中培养过夜，收集菌体并提取质粒，0.7％琼脂糖凝胶电泳检测，筛选得到带有DAAO和GL-7-ACA酰化酶融合蛋白基因的重组质粒pET-ALD，其物理图谱如图2所示，它是双链环状DNA，长度为8.5kb，其相关性状为Kanr，T7 lac promotor，ALD。经此法构建得到的重组酶(融合蛋白)的基因序列和对应的氨基酸序列如序列表中序列5和序列6所示。
实施例2、重组酶(融合蛋白)的表达将重组pET-ALD转化宿主细胞E.coli BL21(DE3)(购自Promega公司，相关性状有M15 Tn10(terr)HsdS gal(λcIts857 indl Sam7 nin5 lacUV5-T7 Genel))，得到重组酶(融合蛋白)的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-ALD。
将基因工程菌接种于LB液体培养基中(LB培养基组成为酵母粉0.5％、胰蛋白胨1％、NaCl 1％，pH7.0)，37℃摇床培养过夜，再以5％的接种量转接到装有50mL LB培养基的300mL摇瓶中，继续37℃培养2hr，加入0.5mM IPTG，于28℃进行诱导，20hr后，离心收集菌体。分别测定基因工程菌中DAAO和GL-7-ACA酰化酶的活性，测得DAAO酶活为3.4U/mL，GL-7-ACA酰化酶酶活为54U/L。
将收集得到的菌体进行全菌SDS-PAGE电泳，如图3所示，表明基因工程菌表达出了重组酶(融合蛋白)，图中标准蛋白质分子量分别为94、67、43、31、21、14kD，泳道1为IPTG诱导前的菌体样品，泳道2为IPTG诱导后的菌体样品，泳道3为标准蛋白样品。在18kD和94kD左右表达出了两条明显的蛋白条带，其中18kD蛋白条带对应GL-7-ACA酰化酶的α亚基，94kD左右的蛋白条带对应GL-7-ACA酰化酶的β亚基、连接肽和D-氨基酸氧化酶的融合片段。说明重组酶(融合蛋白)中的GL-7-ACA酰化酶的α亚基和β亚基被正确加工，重组酶(融合蛋白)已成功表达。
实施例3、重组酶(融合蛋白)直接催化头孢菌素C生产7-ACA将实施例2中诱导表达的基因工程菌液离心，收集菌体，用0.1mol磷酸盐缓冲液(pH8.0)在50mL三角瓶中重悬，加入用同样磷酸盐缓冲液溶解的头孢菌素C溶液(终浓度为5g/L)，28℃摇床反应60min和120min。采用Shimadzu C18柱的HPLC法检测反应产物，流动相为7.5％乙腈-15％甲醇-1％乙酸，流速为1mL/min，色谱分离结果如图5所示，表明样品反应60min时，CPC尚未反应完，已有7-ACA生成，但同时存在相当多量的GL-7-ACA。这说明在重组酶(融合蛋白)中，DAAO和GL-7-ACA酰化酶的活性不均衡，DAAO的过量导致了中间产物GL-7-ACA的部分积累。样品反应120min时，CPC已基本反应完全，GL-7-ACA也基本都转化成了7-ACA，其生成率约为78％。
序列表<160>6<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1cgggatccat ggctaaaatc gttgt25<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2gctcaagctt ctaaaggttt ggacgagta29<210>3<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>
ggaattccat atggagccga cctcgacgcc g31<210>4<211>58<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4atggatcctg atccagagcc agacccagag cctgatcctg gcttgaagtt gaagggcg 58<210>5<211>3183<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5atggagccga cctcgacgcc gcaggcgccg attgcggcct ataaaccgag aagcaatgag60atcctgtggg acggctacgg cgtcccgcac atctacgggg tcgacgcgcc ctccgccttc120tacggctacg gctgggccca ggcgcgaagc cacggcgaca atatcctgcg cctgtatgga180gaagcgcggg gcaagggggc cgaatactgg ggcccggatt acgaacagac gaccgtctgg240ctgctgacca acggcgtgcc ggagcgcgcc cagcagtggt atgcgcagca gtcgctggat300ttccgcgcca acctcgacgc cttcgcggcg ggcatcaacg cctatgccga acagaaccca360gacgacatct cgcccgaggt gcggcaggtg ctgccggttt ccggcgccga cgtggtggcg420cacgcccatc gcctgatgaa cttcctctat gtcgcgtcgc ccggccgcac cctgggcgag480ggcgatccgc cggacctggc cgatcagggg tccaactcct gggccgtggc gccgggcaag540acggcgaacg ggaacgccct gctgctgcag aacccgcacc tgtcctggac gacggactac600
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100 105 110Asn Ala Tyr Ala Glu Gln Asn Pro Asp Asp Ile Ser Pro Glu Val Arg115 120 125Gln Val Leu Pro Val Ser Gly Ala Asp Val Val Ala His Ala His Arg130 135 140Leu Met Asn Phe Leu Tyr Val Ala Ser Pro Gly Arg Thr Leu Gly Glu145 150 155 160Gly Asp Pro Pro Asp Leu Ala Asp Gln Gly Ser Asn Ser Trp Ala Val165 170 175Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asn Gly Asn Ala Leu Leu Leu Gln Asn Pro180 185 190His Leu Ser Trp Thr Thr Asp Tyr Phe Thr Tyr Tyr Glu Ala His Leu195 200 205Val Thr Pro Asp Phe Glu Val Tyr Gly Ala Thr Gln Ile Gly Leu Pro210 215 220Val Ile Arg Phe Ala Phe Asn Gln Arg Met Gly Ile Thr Asn Thr Val225 230 235 240Asn Gly Met Val Gly Ala Thr Asn Tyr Arg Leu Thr Leu Gln Asp Gly245 250 255Gly Tyr Leu Tyr Asp Gly Gln Val Arg Pro Phe Glu Arg Arg Gln Ala260 265 270Ser Tyr Arg Leu Arg Gln Ala Asp Gly Ser Thr Val Asp Lys Pro Leu275 280 285Glu Ile Arg Ser Ser Val His Gly Pro Val Phe Glu Arg Ala Asp Gly290 295 300Thr Ala Val Ala Val Arg Val Ala Gly Leu Asp Arg Pro Gly Met Leu305 310 315 320Glu Gln Tyr Phe Asp Met Ile Thr Ala Asp Ser Phe Asp Asp Tyr Glu325 330 335Ala Ala Met Ala Arg Met Gln Val Pro Thr Phe Asn Ile Val Tyr Ala340 345 350Asp Arg Glu Gly Thr Ile Asn Tyr Ser Phe Asn Gly Val Ala Pro Lys
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权利要求
1.一种重组酶，是具有序列表中SEQ ID №6氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID NQ6的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №6的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №6衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的重组酶，其特征在于所述重组酶是序列表中的SEQ ID№6。
3.一种重组酶的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №5的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №6蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №5限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
4.根据权利要求1所述的基因，其特征在于所述重组酶的编码基因是序列表中的SEQ ID №5。
5.含有权利要求3所述基因的表达载体。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于所述表达载体为pET-ALD。
7.含有权利要求3所述基因的细胞系。
8.根据权利要求7所述的细胞系，其特征在于所述细胞系为E.coli BL21(DE3)/pET-ALD。
9.一种生产7-氨基头孢烷酸的方法，是由重组酶催化头孢菌素C生产7-氨基头孢烷酸。
10.权利要求1所述重组酶在生产7-氨基头孢烷酸中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种生产7－氨基头孢烷酸的方法及其专用重组酶，目的是提供一种具有戊二酰基－7－氨基头孢烷酸酰化酶和D－氨基酸氧化酶活性的重组酶及其编码基因，利用该重组酶催化头孢菌素C直接生产7－氨基头孢烷酸的方法。本发明所提供的重组酶，是具有序列表中SEQ ID №6氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №6的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №6的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID№6衍生的蛋白质。本发明所提供的生产7－氨基头孢烷酸的方法，是由重组酶催化头孢菌素C生产7－氨基头孢烷酸。本发明的重组酶可广泛用于7－氨基头孢烷酸的生产。本发明为酶法催化头孢菌素C生产7－ACA提供了一条新路子，具有重要的理论意义和实际意义。
文档编号C12N9/00GK1544620SQ20031011356
公开日2004年11月10日 申请日期2003年11月17日 优先权日2003年11月17日
发明者罗晖, 李强, 于慧敏, 沈忠耀, 罗 晖 申请人:清华大学