专利名称：适合于分子生物学研究的家蚕丝腺细胞分离方法
技术领域：
本发明涉及一种适合于分子生物学研究的家蚕丝腺细胞分离方法。
背景技术：
家蚕丝腺是一对管状的、具有合成和分泌蚕丝的腺体，是蚕茧生产的物质基础，形态上可明确区分为前部丝腺、中部丝腺和后部丝腺3个部分。中部丝腺分泌丝胶蛋白，后部丝腺分泌丝素蛋白。通过对丝腺细胞的基因、蛋白质组成及功能进行研究，将有利于发现与丝腺细胞分泌丝蛋白有关的功能蛋白质及其功能基因，了解蚕茧高产的机理，为提高家蚕的生产能力奠定基础；可以丝腺细胞为模式，研究真核生物基因表达调控的作用机理。但由于丝腺细胞和丝蛋白在自然状态下紧密地结合在一起，所以至今为止还没有一种较好的方法，能够既使家蚕丝腺细胞与丝蛋白较好地剥离，又使获取的家蚕丝腺细胞的DNA样品或蛋白质样品可用于进一步的分子生物学研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种简捷、完整的适合于分子生物学研究的家蚕丝腺细胞分离方法。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是1)以任何家蚕品种的、新鲜的或冷冻的幼虫为材料，在0℃～50℃的生理盐水中解剖幼虫，分别获取家蚕中部和后部丝腺，用相应的生理盐水充分洗净后，转入预冷的30％-90％的乙醇或甲醇中，浸渍30秒～72小时后，将丝腺固定，用一把镊子一边抱握丝腺表层，一边拉动，剥取丝腺细胞；2)将上述丝腺细胞在真空干燥器中干燥5分～24小时、或在自然条件下干燥5分～72小时后，按常规的DNA提取方法、或蛋白质提取方法，分别制备得到家蚕中部和后部丝腺细胞DNA样品、或蛋白质样品，供蛋白质分析研究用。
所说的生理盐水的种类为(1)0.1％～5％克/毫升的NaCl溶液；(2)0.5％～5％克/毫升的KCl溶液；(3)0.01％～5％克/毫升的NaCl，0.01％～5％克/毫升的KCl，0～0.5％克/毫升的CaCl2，0～5％克/毫升的MgCl2，0～10％克/毫升的蔗糖；(4)在1000ml溶液中含有650～850mg CaCl2，4000～4200mg KCl，2080～2480mg MgCl2.6H2O，2580～2980mg MgSO4.7H2O，330～370mg NaHCO3，860～900mg NaH2PO4组成的溶液；(5)在1000ml溶液中含有550～750mg CaCl2，4000～4300mg KCl，2000～2200mg MgCl2，2500～2900mg MgSO4.7H2O，340～360mg NaHCO3，1000～1200mg NaH2PO4.4H2O组成的溶液。
本发明具有的有益的效果是它提供了一种简捷、完整的适合于分子生物学研究的家蚕丝腺细胞分离方法，为从事有关家蚕丝腺细胞基因和蛋白质方面的研究定基础。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明；图1 是秋丰品种后部丝腺细胞PCR反应结果图；图2 P50家蚕品种五龄不同天个体间中部丝腺细胞蛋白质双向电泳图谱；图3 P50五龄不同天个体间中部丝腺细胞蛋白质双向电泳图谱图4 家蚕同一个体两条后部丝腺双向电泳图谱。
具体实施例方式
实施例1后部丝腺细胞PCR反应结果(1)在4℃的0.7％的NaCl溶液中，解剖经液氮冷冻的、秋丰品种五龄第5天家蚕后部丝腺，用0.7％的NaCl溶液充分洗净后，转入预冷的60％的乙醇中，浸渍5分钟后，用一把镊子将丝腺一端固定，用另一把镊子一边轻轻地抱握丝腺表层，一边轻轻地拉动，剥取后部丝腺细胞。
(2)将后部丝腺细胞在真空干燥器中干燥后，每1mg后部丝腺细胞加入20μl 0.3mol/L NaOH，1％ME缓冲液，冰浴研磨10min，加50μl 60mmol/LTris-HCl pH 8缓冲液，搅拌10min，15000×g、4℃离心5min。取上清液20μl，加50μl 99％酒精，-20℃中放置15min，15000×g、4℃离心15min，沉淀用20μl无菌去离子水溶解，作为PCR反应所需的DNA模板。
(3)PCR反应PCR反应采用Biometra生产的梯度PCR仪，反应条件94℃预变性4min，94℃变性解链1min，42℃退火温度复性1min，72℃合成延伸1min 30s，35个循环后，72℃再延伸5min，4℃保存。引物的序列为GAAGCCAGCC。
(4)电泳检测反应产物采用1％琼脂糖凝胶电泳分离，经紫外透射仪观察并照相。结果如图1所示。
实施例2中部丝腺细胞蛋白质双向电泳结果(1)在4℃的0.7％的NaCl溶液中，解剖经液氮冷冻的、P50品种五龄不同天数家蚕，获取家蚕中部丝腺，用0.7％的NaCl溶液充分洗净后，转入预冷的60％的乙醇中，浸渍5分钟后，用一把镊子将丝腺一端固定，用另一把镊子一边轻轻地抱握丝腺表层，一边轻轻地拉动，剥取中部丝腺细胞。
(2)将中部丝腺细胞放入已称重的离心管中，在真空干燥器中干燥后，称取中部丝腺细胞重量。分次加入10乘(μl)于丝腺细胞重量(mg)的Tris-HCl抽提缓冲液(pH 9.5，40mM)，冰上充分研磨后，超声波处理2分钟，冰浴放置10分钟。
(3)4℃、15000rpm、10分钟，离心2次，量取上清液体积。
(4)加入100％TCA溶液，使终浓度为10％，冰上放置15分钟。
(5)4℃，15000rpm离心10分钟，沉淀保留，弃上清。沉淀在4℃、15000rpm再离心1分钟，沉淀保留，弃上清。
(6)在沉淀中分次加入原中部丝腺细胞重量(mg)9倍体积量(μl)的蛋白质裂解缓冲液(8M尿素，2M硫尿，4％(W/V)CHAPS，20mM Trisbase，30mM DTE，2％carrier ampholytes(pH 3.5-10))，充分搅拌溶解后，超声波处理2分钟，用2mol/l NaOH调pH值至中性，制成蛋白质样品，可直接电泳或20℃冷冻备用。
(7)加60μl蛋白样品进行蛋白质双向电泳。
(8)电泳后银染结果如图2所示，上左第二天；上右第四天；下左第六天；下右熟蚕。
实施例3中部丝腺细胞蛋白质双向电泳结果(1)在20℃的2％的NaCl溶液中，解剖P50品种五龄不同天数的新鲜家蚕，获取家蚕中部丝腺，用0.8％的NaCl溶液充分洗净后，转入预冷的80％的乙醇中，浸渍2分钟后，用一把镊子将丝腺一端固定，用另一把镊子一边轻轻地抱握丝腺表层，一边轻轻地拉动，剥取中部丝腺细胞。
(2)将中部丝腺细胞放入已称重的离心管中，在真空干燥器中干燥后，称取中部丝腺细胞重量。分次加入10乘(μl)于丝腺细胞重量(mg)的磷酸抽提缓冲液(PBS)(32.5mM K2HPO4，2.6mM KH2PO4，400mM NaCl，pH 7.6)，冰上充分研磨后，超声波处理2分钟，冰浴放置10分钟。
(3)4℃、15000rpm、10分钟，离心2次，取上清液量体积。
(4)加入100％TCA溶液，使终浓度为10％，冰上放置15分钟。
(5)4℃，15000rpm离心10分钟，沉淀保留，弃上清。沉淀在4℃、15000rpm再离心1分钟，沉淀保留，弃上清。
(6)在沉淀中分次加入原中部丝腺细胞重量(mg)9倍体积量(μl)的蛋白质裂解缓冲液(8M尿素，2M硫尿，4％(W/V)CHAPS，20mM Trisbase，30mMDTE，2％carrier ampholytes(pH 3.5-10))，充分搅拌溶解后，超声波处理2分钟，用2mol/l NaOH调pH值至中性，制成蛋白质样品，可直接电泳或20℃冷冻备用。
(7)加60μl蛋白样品进行蛋白质双向电泳。
(8)电泳后银染结果如图3所示，上左第二天；上右第四天；中左第七天；中右第九天；下左熟蚕。
实施例4后部丝腺细胞蛋白质双向电泳结果(1)将P50品种五龄不同天数的新鲜家蚕放在4℃的、1000ml溶液中含有650～850mg CaCl2，4000～4200mg KCl，2080～2480mg MgCl2.6H2O，2580～2980mg MgSO4.7H2O，330～370mg NaHCO3，860～900mg NaH2PO4组成的溶液中，解剖获取家蚕后部丝腺，用0.7％的NaCl溶液充分洗净后，转入预冷的75％的乙醇中，浸渍1分钟后，用一把镊子将丝腺一端固定，用另一把镊子一边轻轻地抱握丝腺表层，一边轻轻地拉动，剥取中部丝腺细胞。
(2)将后部丝腺细胞放入已称重的离心管中，在真空干燥器中干燥后，称取后部丝腺细胞重量。分次加入10乘(μl)于丝腺细胞重量(mg)的磷酸抽提缓冲液(PBS)(32.5mM K2HPO4，2.6mM KH2PO4，400mM NaCl，pH 7.6)，冰上充分研磨后，超声波处理2分钟，冰浴放置10分钟。
(3)4℃、15000rpm、10分钟，离心2次，取上清液量体积。
(4)加入100％TCA溶液，使终浓度为10％，冰上放置15分钟。
(5)4℃，15000rpm离心10分钟，沉淀保留，弃上清。沉淀在4℃、15000rpm再离心1分钟，沉淀保留，弃上清。
(6)在沉淀中分次加入原后部丝腺细胞重量(mg)9倍体积量(μl)的蛋白质裂解缓冲液(8M尿素，2M硫尿，4％(W/V)CHAPS，20mM Trisbase，30mM DTE，2％carrier ampholytes(pH 3.5-10))，充分搅拌溶解后，超声波处理2分钟，用2mol/l NaOH调pH值至中性，制成蛋白质样品，可直接电泳或20℃冷冻备用。
(7)加相当于160μg净蛋白样品进行蛋白质双向电泳。
(8)电泳后银染结果如图4所示，左左侧后部丝腺；右右侧后部丝腺。
权利要求
1.适合于分子生物学研究的家蚕丝腺细胞分离方法，其特征在于1)以任何家蚕品种的、新鲜的或冷冻的幼虫为材料，在0℃～50℃的生理盐水中解剖幼虫，分别获取家蚕中部和后部丝腺，用相应的生理盐水充分洗净后，转入预冷的30％-90％的乙醇或甲醇中，浸渍30秒～72小时后，将丝腺固定，用一把镊子一边抱握丝腺表层，一边拉动，剥取丝腺细胞；2)将上述丝腺细胞在真空干燥器中干燥5分～24小时、或在自然条件下干燥5分～72小时后，按常规的DNA提取方法、或蛋白质提取方法，分别制备得到家蚕中部和后部丝腺细胞DNA样品、或蛋白质样品。
2.根据权利要求1所述的适合于分子生物学研究的家蚕丝腺细胞分离技术，其特征在于生理盐水的种类为(1)0.1％～5％克/毫升的NaCl溶液；(2)0.5％～5％克/毫升的KCl溶液；(3)0.01％～5％克/毫升的NaCl，0.01％～5％克/毫升的KCl，0～0.5％克/毫升的CaCl2，0～5％克/毫升的MgCl2，0～10％克/毫升的蔗糖；(4)在1000ml溶液中含有650～850mg CaCl2，4000～4200mg KCl，2080～2480mg MgCl2.6H2O，2580～2980mg MgSO4.7H2O，330～370mg NaHCO3，860～900mg NaH2PO4组成的溶液；(5)在1000ml溶液中含有550～750mg CaCl2，4000～4300mg KCl，2000～2200mg MgCl2，2500～2900mg MgSO4.7H2O，340～360mg NaHCO3，1000～1200mg NaH2PO4.4H2O组成的溶液。
全文摘要
本发明公开了一种适合于分子生物学研究的家蚕丝腺细胞分离方法。是以新鲜的或冷冻的家蚕幼虫为材料，在预冷的昆虫生理盐水中解剖幼虫，获取家蚕中部和后部丝腺，并用生理盐水充分洗净后，转入预冷的乙醇或甲醇中，浸渍一定时间后，将丝腺固定，用一把镊子一边抱握丝腺表层，一边拉动，剥取丝腺细胞。将上述丝腺细胞在真空干燥器中干燥、或在自然条件下干燥后，按常规的DNA提取方法、或蛋白质提取方法，分别制备得到家蚕中部和后部丝腺细胞DNA样品、或蛋白质样品。本发明提供了一种简捷、完整的适合于分子生物学研究的家蚕丝腺细胞制备方法，为从事有关家蚕丝腺细胞基因和蛋白质方面的研究奠基础。
文档编号C12N5/06GK1539962SQ20031010838
公开日2004年10月27日 申请日期2003年10月30日 优先权日2003年10月30日
发明者钟伯雄, 时连根 申请人:浙江大学