专利名称：基因表达的定量的利记博彩app
背景技术：
在许多病理学的状况，例如不同的良性和恶性肿瘤、神经系统紊乱、心脏病和自身免疫紊乱中检测和定量差异表达的基因可对这些病理学状况的诊断、预后和治疗有用。基因表达的定量也可用于诊断感染性的疾病和在分子水平上追踪药物或毒素的作用。例如，基因表达数据可用于确定药物或毒素的药理学机制(Libutti et al.，Microarray technology and gene expression analysis for thestudy of angiogenesis.Expert Opin Biol Ther.2002 Jun；2(5)545-56)。
用于转录本检测和定量的方法传统上包括基于Northern-印迹杂交、核糖核酸酶保护分析、和逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)的方法。然而，除缺少灵敏性(除RT-PCR外)的缺点外，这些方法只可用于粗略地评估来自不同来源的样本间每种转录本的相对表达的变化。基于RT-PCR的不同方法是为了诊断目的的最合适的定量方法，因为它们是很灵敏的并且因此只需要合乎诊断测试所需的小的样本规模。
如果想要比较样品之间，甚至相同样品内的基因表达，需要绝对定量样品中转录本的拷贝数。然而，由于PCR反应固有的非线性特性，利用基于PCR的方法很难定量核酸的拷贝数。PCR扩增可从指数阶段变化到试剂耗尽或酶钝化的平台期阶段。经常地，必须分别确定PCR的指数阶段，其可能包括在不同时间点对PCR反应进行取样或利用不同稀释度的模板进行PCR。进一步地，由于模板间扩增效率的差异，不能在线性范围中直接比较不同PCR产物的起始数量。传统上在扩增完成后进行PCR产物的检测。一般地，通过琼脂糖凝胶电泳、用溴化乙啶染色、并且用紫外光显现来区别PCR反应产物等分的大小。备选地，可以用荧光染料或放射性的分子标记引物。比较样品间的条带强度容许定性地估计扩增的模板的相对起始浓度，但是这个方法不是定量的并且不能确定绝对的拷贝数。
已经描述了许多基于定量的RT-PCR的方法，包括利用PCR和互补的DNA(cDNA)陈列的RNA定量法(Shalon et al.，Genome Research6(7)639-45，1996；Bernard et al.，Nucleic Acids Research24(8)1435-42，1996)、基于引物延伸反应的固相迷你测序方法(美国专利号6,013,431，Suomalainen et al.Mol.Biotechnol.Jun；15(2)123-31，2000)、离子对高效液相色谱(Doris et al.J.Chromatogr.A May 8；806(1)47-60，1998)、和5′核酸酶分析或实时RT-PCR(Holland et al.Proc Natl Acad Sci USA887276 7280，1991)。
研制提供灵敏和精确的定量mRNA转录本的方法将是有用的，其可以是容易地自动化操作的，并且规模扩大至容许测试大量样品，以及克服与PCR扩增相关的问题。这种方法能够诊断不同的病理学状况，包括病毒、细菌和寄生虫，以及不同的良性和恶性肿瘤、神经系统紊乱、心脏病和自身免疫紊乱。这种方法也提供以诊断、预后和治疗为目的的定量令人感兴趣的转录本，并且最终便于基因组药理学的应用。这种方法也可提供对基因表达有影响的大量试剂的筛选。
发明概述本发明涉及测定样品中靶核酸的数量的方法，其中使用的标准物被设计成与目标基因或″靶核酸序列″相比具有一个碱基的差异。使用这种标准物与″增加″标准物与测试的核酸样品中的差异的方法的结合可，利用例如，正好在突变位点进行的碱基延伸反应，容许以相同的效率扩增标准和靶核酸，从而有助于定量靶核酸。此后使用定量″增加的″标准和靶核酸样品的手段来确定靶核酸的数量。在优选的实施方案中，定量手段是质谱法。
本发明的方法是灵敏的、精确的和高度可重复的，并且它也不依赖于PCR循环的数目，而极大地使分析简单化。本发明的方法是独特的，因为可同时测量相同基因的不同等位基因，可获得对基因表达的绝对定量，因此可直接比较来自不同实验的数据，并且可用于高-通量分析而几乎不需要为了PCR进行优化。另外，该方法容许精确地测定生物标本，例如人的液体(血清、血浆等)中的传染物，例如病毒、细菌和寄生虫的拷贝数。
本发明提供定量生物标本中靶基因/核酸的数量或靶基因/核酸的多元性的方法，包括将已知浓度的核酸标准加入生物标本中，其中该标准被设计成与靶核酸序列具有一个碱基的差异；例如利用聚合酶链式反应用的靶和标准核酸扩增样品，通过例如用磷酸酶(例如Shrimp碱性磷酸酶)处理扩增样品以除去过量的dNTPs，并因此通过例如靶和标准核酸样品中的不同碱基来增加标准和测试核酸之间的核酸差异。标准和靶核酸产生2种不同的产物，一般具有1个至2个碱基的差异，随后进行定量。可根据扩增样品中存在的标准物的数量来计算转录本的浓度。
例如，本发明能够检测，更重要的是定量传染物。它可容易地用于高通量的方法，其中在384-规格的硅芯片上可以定量大约100个传染物。
在一个优选的实施方案中，利用MALDI-TOF质谱法(例如，利用Sequenom′s MassArrayTM系统)根据″增加的″靶和标准核酸产物的不同质量进行定量，其中使用质谱中峰值的比率来计算标准物和靶核酸的比率。可以根据扩增前样品中使用/加入的标准的初始量来计算转录本的浓度。
在一个优选的实施方案中，利用引物延伸方法来增强标准和靶核酸之间的核酸差异。
在另一个实施方案中，利用荧光标记的dNTP/ddNTP进行碱基延伸来增强PCR后靶和标准中的核酸差异。
在另一实施方案中，利用不同染料标记的ddNTPs增强PCR后靶和标准中的核酸差异，其中将不同染料标记的ddNTPs差异性地掺入到引物延伸反应中的靶和标准核酸中。
在一个实施方案中，利用实时PCR来增强PCR后靶和标准中的核酸差异。
在另一个实施方案中，利用基于杂交的方法来增强PCR后靶和标准中的核酸差异，其中2种寡核苷酸特异于设计用于杂交的靶或标准。
在另一个实施方案中，利用热测序技术来增强PCR后靶和标准中的核酸差异。
在另一个实施方案中，利用使用人工的单核苷酸多态性(SNP)作为内参照的第三浪潮侵入分析(Third Wave Invader assay)来增强PCR后靶和标准中的核酸差异。在备选的实施方案中，当使用焦磷酸测序时，不需要预扩增。
在一个实施方案中，靶核酸是来自至少一种传染物的核酸。
在另一实施方案中，本发明提供一种试剂盒，其包括至少一个，优选几个不同的引物，该引物被设计成与不同小瓶中的至少一种，优选几种靶核酸相差一个核酸，或优选地与所有的标准核酸相差一个核酸，该标准核酸以已知的预定浓度存在于适于PCR的缓冲液中，或在直接的增强反应中如上所述增加标准物和相应靶核酸之间的差异。该试剂盒也包括说明反应条件和利用标准核酸测量靶核酸数量的手册。本发明预期的试剂盒包括但不限于用于确定生物样品中传染物数量的试剂盒和确定在施用医药或药物后，或由于例如肿瘤的疾病状况而预期有增减的一种或多种转录本的数量的试剂盒。
附图简述
图1显示用于测量基因表达的实时竞争性PCR和质谱方法的流程图。为简单起见，只显示一个DNA链。在该流程图中也显示延伸的oligos一般为约20个碱基，而不是7个碱基。
图2显示相同浓度相同oligo的峰面积分布。使用0.3μm的Oligo47954(5′-ATGGCCACAGTTGTATCA-3′)，并且将15nL点样到用3-羟基吡啶甲酸(HPA)预点样的硅芯片上。相同芯片的不同位置、相同浓度斑点的oligos的绝对峰面积显示平均峰面积为12395(任意数)和标准偏差为3737的适度变异性。
图3A和3B显示质谱中峰面积比与oligo的浓度比准确相关。Courtesy of Kal Tang(Sequenom)。利用MassArrayTM(Sequenom)分析4.5nL的不同比率的2种oligo混合物溶液(1∶1、1∶2、1∶5、1∶10、1∶20)。图3A显示质谱，而图3B显示质谱中实际浓度比率对信号强度(峰面积)比率的折线图。
图4A-4E显示以不同比率混合的仅有一个碱基不同的2种DNA模板的质谱。在图4A中比率是1∶1；在图4B中比率是3∶1；在图4C中比率是10∶1；在图4D中比率是1∶3；而在图4E中比率是1∶10，但是总浓度固定(2×10-7μg/μL)。通过PCR(30个循环)、碱基延伸(40个循环)来扩增模板，然后点样到用3-羟基吡啶甲酸(HPA)预点样的硅芯片上，并且用MALDI-TOF分析。
图5显示推定的DNA浓度比和测量的DNA浓度比(由峰面积比表示)之间的相关性。PCR扩增分别是20、30和40个循环，结果是不依赖于PCR-循环。各个数据点重复4次(n＝4)并显示误差线。
图6A-6H显示利用实时竞争性PCR和质谱的基因表达(GAPDH、HMBS和CXCR4)分析。
发明详述本发明涉及测量样品中基因表达或核酸量的新方法。这个方法组合了竞争性的PCR(聚合酶链式反应)、碱基延伸以及此后进行的测量。该方法可用于直接测量特异性基因的拷贝数，或比较来自不同样品的特异性基因的上调或下调。
将已知浓度的标准核酸(DNA或RNA)加入RNA样品(用于RNA标准)或逆转录产物(用于DNA标准)中。然后通过PCR扩增包括标准物的逆转录产物。将该标准物设计成与目标基因，即靶核酸相比具有一个碱基突变的差异。因此，在PCR中以相同的效率扩增标准物和靶核酸。可利用例如正好在突变位点处进行的碱基延伸反应来鉴定这2种核酸。
因此通过多种方式中的任何一种，优选通过质谱(MALDI-TOF，或矩阵辅助的激光解吸电离-飞行时间)测量PCR产物的数量。来自标准物和目标基因的产物之间的峰面积比代表了标准物和目标基因的比率。既然已知标准的浓度，可以计算目标基因的浓度。
在至少下列的方面中，本发明的方法是独特的。首先，可选择基因的自然突变来构建标准物。因此，不仅可以测量基因的表达水平，而且可以确定表达基因的基因型。第二，PCR中单一点突变的使用确保了几乎等同的扩增。这消除了由其他竞争性PCR方法中的差异扩增产生的问题，在这些竞争性的PCR中，所述的标准物一般与基因是不同长度的。
在优选的实施方案中，碱基延伸和MALDI-TOF MS检测的组合也消除了来自常规的检测方法，例如凝胶电泳遇到的形成异源双链的问题。来自标准物的延伸产物也在MALDI-TOF MS中起内标准的作用。因此，当加入到反应中的标准物的数量是已知的时，可定量地测量核酸的数量。
这个方法具有至少下列优点。首先，这个方法在PCR中几乎不需要优化。第二，这个方法不依赖于PCR循环的数目。第三，该方法是高度精确的、灵敏的和可重复的。第四，该方法可用于高通量的基因表达分析，其中在一个384-硅芯片上可以测量至少50-100个、甚至达到至少1000个基因的表达。
如下列实施例所示，通过这个方法分析在人的培养细胞中GAPDH、HMBS和CXCR4的表达可产生与其他方法一致的结果。
如在此所使用的，术语″生物样品″是指从任何来源(例如人、动物、植物、细菌、真菌、原生生物、病毒)获得的任何生物材料。为了用于本发明，该生物样品应包含核酸分子。用于本发明的合适的生物样品的实例包括固体材料(例如组织、细胞沉淀颗粒、活检样品)和生物液体(例如尿液、血液、唾液、羊水、漱口剂)。
可利用本领域已知的许多方法中的任何一种从特定的生物样品分离核酸分子，其中选择适于特定的生物样品的特定分离方法。
病毒、细菌、真菌和其他感染性的生物体包含与宿主细胞中含有的序列不同的独特的核酸序列。检测或定量特异于感染性生物体的核酸序列对于诊断或监测感染是很重要的。感染人和动物，并且可通过已公开的方法检测的致病病毒的实例包括逆转录病毒科(例如，人类免疫缺陷性病毒、例如HIV-1(也称为HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV、参见Ratner，L.et al.，Nature，Vol.313，Pp.227-284(1985)；Wain Hobson，S.et al，Cell，Vol.40Pp.9-17(1985))；HIV-2(参见Guyader et al.，Nature，Vol.328，Pp.662-669(1987)；欧洲专利
发明者C·R·坎托尔, C·丁 申请人:波士顿大学信托人