专利名称：植物中由病毒诱导的基因沉默的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及植物中的功能性基因组学领域，且其涉及重组植物病毒载体之用途。具体而言，本发明涉及通过经RNA触发的基因沉默来干扰基因在植物细胞中之表达及重组病毒载体在该等细胞中之累积的方法。
背景技术：
近些年来，作为基因组工程的一部分，已经完成了大量种类的植物及动物的基因组定序。该等基因组工程的最终目标是鉴定基因组中每一基因的生物功能。基因的某些功能已通过各种方法进行了鉴定。一种进行基因功能性研究的方法是以基因表现型方式及生化方式剔除靶基因表达并监测沉默效应。此方法通过使用T-DNA或可转位因子的插入诱变作用来实施，以剔除转基因植物中的靶基因表达。除了插入诱变作用外，还使用了蛋白质的超量表达来研究基因功能。然而，每一种方法都存在若干缺点。插入诱变作用可导致靶基因的完全失效，此会使胚胎特异性基因的研究变得更加复杂，尤其当此基因作为胚胎发育的关键基因时。另一关注点是多基因家族中的基因研究，其中突变基因的功能可受到补偿。近年来出现了另外一种用来研究基因功能的可选基因沉默方法，即由病毒诱导的基因沉默(VIGS)。该方法有利于定向性转录后基因沉默(PTGS)。在有效转录宿主细胞基因的同时，RNA不会发生累积或不会在低于正常水平时发生累积。该方法组合了基于病毒的表达载体之新发展以及基因沉默之新发现。宿主基因区段通过使用能够在植物细胞中复制的病毒载体加以感染而在细胞中获得放大。细胞中存在该等异常的或超量表达的RNA区段可导致含有相同序列的宿主mRNA之退化。据报导，VIGS可由双链RNA通过经RNA调介的防御机制引起。VIGS通常会导致一特殊的表现型来指示基因沉默。例如，纤维素合成酶基因的失效会导致节间长度更短、叶片小且植株矮小的表现型。使用烟草花叶病毒及马铃薯X病毒表达来自八氢蕃茄红素去饱和酶的mRNA片段会导致受感染植物的上部叶片褪色，参见美国专利第6,376,752号。褪色原因是八氢蕃茄红素去饱和酶之mRNA水平的降低，此可导致更低的蛋白质累积水平。
然而，该等先前技术VIGS方法仅能使用有限宿主范围的单分裂(单组成)植物病毒载体。另外，该等载体若不通过系统内移动则不能仅在局部扩散。因此，需要开发能够使用具有更广宿主范围及/或不能在系统内移动的病毒载体之方法。此外，先前技术载体只能一次使一个基因沉默。假若尚不了解该等大量基因的功能，则需要可诱导多基因沉默的载体，尤其当进行代谢途径研究时。
发明内容
本发明概言之涉及用于干扰植物细胞中之基因表达及该等细胞中重组植物病毒载体之累积(二者皆由该等载体引发)的方法。重组植物病毒载体可衍生自一植物病毒的基因组成份，其中该植物病毒可为单分裂、双分裂及三分裂基因组病毒。有的载体不能在系统内移动，有的载体能够使多个基因沉默。本发明亦揭示了用于使一转基因宿主植物中的基因沉默的方法。
具体而言，本发明的一个方面提供了一种通过经RNA触发的基因沉默(其由重组病毒载体引发)来干扰选定基因在植物细胞中之表达的方法。在该方法中，该重组病毒载体在宿主植物的一或多个位置感染植物细胞。该病毒载体衍生自一植物病毒的重组基因组成份。该植物病毒的重组基因组成份具有选定基因(其与该病毒基因组异源)的一核酸区段。该载体于感染后能够在该等细胞中发生自我复制并产生该核酸区段的转录产物，但不能在宿主植物系统内移动。该核酸区段自该植物病毒外壳蛋白基因或移动蛋白基因的次基因组启动子表达，并被表达为该外壳蛋白基因或移动蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分。然后使该宿主植物生长一段时间。该转录产物可干扰选定基因在该等植物细胞中的表达。此干扰可通过一基因改变、生化改变或表现型改变来确定。该等改变皆归因于此干扰。该核酸区段不会就此出现或在该植物病毒(野生型)基因组中的同一位置出现。该核酸区段至少由约20个核苷酸组成，且至多由200个或至多由300个核苷酸组成。该选定基因可来自该宿主植物或为该宿主植物中的一转基因。此转基因可为(例如)植物病毒复制酶基因或冠婴基因，或者此转基因可来源于一单子叶或双子叶植物。次基因组启动子不为外壳蛋白基因或移动蛋白基因，而是一合成或人工或异源性次基因组启动子。核酸区段可在一独立于病毒基因的单独启动子(例如，P3或CP)下表达。
本发明的另一方面提供了一种通过经RNA触发的基因沉默来干扰选定基因在植物细胞中之表达的方法。该方法包括首先，使用一重组病毒载体在宿主植物的一或多个位置感染该等细胞，其中该重组病毒载体是该等细胞中经RNA触发的基因沉默的抑制剂及靶物。该载体具有一植物病毒的重组基因组成份及选定基因的一核酸区段。该载体于感染后能够在该等细胞中发生自我复制并产生该核酸区段的转录产物，但不能在该宿主植物系统内移动。该核酸区段自该植物病毒外壳蛋白基因或移动蛋白基因的次基因组启动子表达，并被表达为该外壳蛋白基因或移动蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分。然后使该宿主植物生长。该转录产物可干扰选定基因在该等细胞中的表达，此干扰可通过一归因于此干扰的基因改变、生化改变或表现型改变来确定。
本发明的再一方面提供了一种通过经RNA触发的基因沉默来干扰选定基因在植物细胞中之表达及重组病毒载体之累积的方法。该方法包括使用该重组病毒载体在宿主植物的一或多个位置感染该等细胞，其中该重组病毒载体是该宿主植物中经RNA触发的基因沉默的抑制剂及靶物。该病毒载体可具有一植物病毒的重组基因组成份及选定基因的一核酸区段。该病毒载体于感染后能够在该等位置发生自我复制并产生该核酸区段的转录产物，但不能在该宿主植物系统内移动。该核酸区段自该植物病毒外壳蛋白基因或移动蛋白基因的次基因组启动子表达，并被表达为该外壳蛋白基因或移动蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分。然后，使该宿主植物生长一段时间。该转录产物可干扰该等细胞中选定基因之表达(此干扰可通过一归因于此干扰的基因改变、生化改变或表现型改变来确定)及该重组病毒载体之累积。
本发明的又一方面提供了一种通过重组病毒载体(其由经RNA触发的基因沉默引发)来干扰选定基因在植物细胞中之表达的方法。在该方法中，使用至少两种类型的重组病毒载体在该宿主植物的一或多个位置感染细胞，从而使每一载体于感染后能够在该等感染位置发生自我复制并产生一核酸区段(其存在于每一载体中)的转录产物，此核酸区段亦可见于该等植物表达基因之一中。该核酸区段自该植物病毒外壳蛋白基因或移动蛋白基因的次基因组启动子表达，并被表达为该外壳蛋白基因或移动蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分。该第一类型的重组病毒载体具有一植物病毒的重组基因组成份及一第一基因的核酸区段。该第二类型的重组病毒载体具有该植物病毒的重组基因组成份及一第二基因的核酸区段。该等载体是该宿主植物中经RNA触发的基因沉默的抑制剂及靶物。然后使该宿主植物生长一段时间。该转录产物可干扰选定基因在该等细胞中的表达，此干扰可通过一归因于此干扰的基因改变、生化改变或表现型改变来确定。该等载体可构造为使该等载体能够进行有限的细胞间移动，但不能在该宿主植物中进行系统移动。该第一及第二载体可在该宿主植物的同一位置或不同位置同时或依序施与。
本发明的另一方面提供了一种通过重组病毒载体(其由经RNA触发的基因沉默引发)来干扰选定基因在植物细胞中之表达的方法。在该方法中，使用一第一重组病毒载体及一第二重组病毒载体在一或多个位置感染该等宿主植物，从而使每一载体于感染后能够在该等位置发生自我复制并产生一核酸区段(其存在于每一载体中)的转录产物，此核酸区段亦可见于该等植物表达基因之一中。该第一重组病毒载体具有一第一类植物病毒的重组基因组成份及一第一基因的核酸区段，因而，该第一基因的核酸区段自该第一类植物病毒外壳蛋白基因或移动蛋白基因的次基因组启动子表达，并被表达为该第一类病毒的外壳蛋白基因或移动蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分。该第二重组病毒载体具有一第二类植物病毒的重组基因组成份及一第二基因的核酸区段，因而，该第二基因的核酸区段自该第二类植物病毒外壳蛋白基因或移动蛋白基因的次基因组启动子表达，并被表达为该第二类病毒的外壳蛋白基因或移动蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分。该等载体是该宿主植物中经RNA触发的基因沉默的抑制剂及靶物。当该宿主植物生长一段时间后，该转录产物可干扰每一所述基因在该等细胞中的表达，此干扰可通过一归因于此干扰的基因改变、生化改变或表现型改变来确定。
本发明的再一方面提供了一种通过重组病毒载体(其由经RNA触发的基因沉默引发)来干扰选定基因在植物细胞中之表达的方法。使用一第一及第二重组病毒载体在宿主植物的一或多个位置感染植物细胞。该第一载体具有一第一类植物病毒的重组基因组成份及一第一基因的核酸区段，因而，该第一基因的核酸区段自该第一类植物病毒外壳蛋白基因或移动蛋白基因的次基因组启动子表达，并被表达为该第一类病毒的外壳蛋白基因或移动蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分。该第二重组病毒载体具有一第二类植物病毒的重组基因组成份及一第二基因的核酸区段，因而，该第二基因的核酸区段自该第二类植物病毒外壳蛋白基因或移动蛋白基因的次基因组启动子表达，并被表达为该第二类病毒的外壳蛋白基因或移动蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分。该等载体是该宿主植物中经RNA触发的基因沉默的抑制剂及靶物。该等载体于感染后能够发生自我复制并产生该核酸区段(其存在于每一载体中)的一转录产物。至少一个载体能够在该宿主植物中发生系统移动。使该宿主植物生长一段时间后，该转录产物可干扰每一所述基因在该等细胞中的表达，此干扰可通过一归因于此干扰的基因改变、生化改变或表现型改变来确定。
本发明的又一方面提供了一种通过经RNA触发的基因沉默来干扰选定基因在植物细胞中之表达的方法。该方法包括使用一重组病毒载体在宿主植物的一或多个位置感染该等细胞，该载体具有AlMV的重组基因组成份及选定基因的一核酸区段。该载体于感染后能够发生自我复制并产生该核酸区段的转录产物。该核酸区段自该AlMV外壳蛋白基因或移动蛋白基因的次基因组启动子表达，并被表达为该外壳蛋白基因或移动蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分，且该载体是该等细胞中经RNA触发的基因沉默的抑制剂及靶物。使该宿主植物生长，该转录产物可干扰选定基因在该等细胞中的表达，此干扰可通过一归因于此干扰的基因改变、生化改变或表现型改变来确定。该AlMV的重组基因组成份具有复制酶核酸、一编码移动蛋白的核酸序列及一编码外壳蛋白的核酸序列(其中缺少一或多个足以防止外壳蛋白翻译的核苷酸)。
本发明的另一方面提供了一种通过经RNA触发的基因沉默来干扰选定基因在植物细胞中之表达的方法。该方法包括使用一重组病毒载体在宿主植物的一或多个位置感染该等细胞。该载体具有一植物病毒的重组基因组成份、一第一基因的核酸区段(该区段恰位于移动蛋白核酸序列的上游，其中该移动蛋白核酸序列包含于AlMV的基因组成份中并受控于一同时亦控制该移动蛋白序列的次基因组启动子)及一第二基因的核酸区段(该区段恰位于外壳蛋白核酸序列的上游，其中该外壳蛋白核酸序列包含于该植物病毒的基因组成份中并受控于一同时亦控制该外壳蛋白序列的次基因组启动子)。该载体于感染后能够发生自我复制并产生该等核酸区段的转录产物。该载体是该等细胞中经RNA触发的基因沉默的抑制剂及靶物。使该宿主植物生长一段时间。该转录产物可干扰该第一或该第二基因在该等细胞中的表达，此干扰可通过一归因于此干扰的基因改变、生化改变或表现型改变来确定。该植物病毒可为TMV或AlMV。
图1为AlMV基因组的示意图。
图2为基于AlMV及TMV基因组且可引起基因沉默的重组病毒载体之改造策略示意图。
图3为使用AlMV RNA3改造的VMB-RBC(核酮糖二磷酸羧化酶，Rubisco)及VMB-bAS(β-香树素合成酶)之示意图。
图4为供多基因沉默的各种载体设计之示意图。
图5是使用wt AlMV或NF1-P1感染的植物中之CP西方墨点分析。
图6为10dpi(接种后天数)时苜蓿花叶病毒外壳蛋白在蒺藜状苜蓿(Medicago truncatula)的子叶(cot)、叶(l)及根(r)中之累积的西方墨点分析。
图7为苜蓿花叶病毒外壳蛋白在蒺藜状苜蓿(Medicago truncatula)的子叶(7dpi)及在受系统感染的叶片(14dpi)中之累积的西方墨点分析。
图8为蒺藜状苜蓿(Medicago truncatula)的照片，其展示归因于对Rubisco之干扰的表现型改变(图示所有植物皆使用一用于VIGS的病毒载体感染)。
图9为烟草属植物(Nicotiana benthamiana)的照片，其展示归因于Rubisco之干扰的表现型改变(右侧植物使用一用于VIGS的病毒载体感染，左侧植物为一对照植物)。
具体实施例方式
本发明涉及基因沉默，并提供了可选择性干扰基因表达或功能的工具及方法。基因沉默可于转录水平或转录后水平发生。本发明揭示了通过经RNA调介的基因沉默(RNA沉默)来干扰选定基因在植物细胞中之表达的方法。熟习此项技术者已熟知，RNA沉默是指一类相关的、序列特异性、RNA定向基因沉默机制。具体而言，本发明之方法允许通过RNA沉默将功能赋予一由植物细胞表达的基因。该沉默涉及核苷酸序列特异性RNA退化。本发明使用基于植物RNA病毒的病毒载体来诱导细胞RNA在宿主植物细胞中的核苷酸序列特异性退化。此载体亦可为该RNA沉默的牺牲品。因此，本文用于在植物中导致基因沉默的病毒载体可为该基因沉默的抑制剂及靶物二者。
通过使用本文所揭示的方法可干扰3种不同基因在植物细胞中的表达。该等基因为烟草转基因P12植物中的AlMV复制酶基因(P1)、蒺藜状苜蓿及烟草属植物中的核酮糖二磷酸羧化酶(Rubisco)(参见实例1及2)以及β-香树素合成酶基因(数据未提供)。
因此，本文揭示了基于植物RNA病毒的重组病毒载体。该等载体被设计为能够于感染后在宿主细胞中复制。病毒载体在宿主植物中的移动被限制为可局部扩散且不能在系统内扩散，或能够在系统内扩散。一病毒的系统感染或系统扩散能力是指该病毒能够在细胞之间扩散且能够在该整个植物中或在该植物的大多数细胞中复制或表达的能力。该等载体各具有一核酸区段，该核酸区段对应于希望用于沉默的特定植物表达细胞mRNA之全部或其一部分。换言之，通过简单地在病毒载体中插入一靶基因(选定基因)序列的单拷贝从而使该等复制载体中的序列定向于供破坏的特定转录物而达成沉默特异性。因此，该载体中的核酸区段为一异源核酸序列或为非自然存在于该病毒中插入位置的序列。该插入的核酸区段可含有若干核苷酸，此取决于选定基因及病毒载体。例如，该区段可具有20个核苷酸至300个核苷酸之长度。例如，在大多数情况下，可使用至多具有200个核苷酸长度的片段。将该核酸区段供至植物细胞及通过本发明载体在该等植物细胞中对该核酸区段的放大可达成对该靶基因的抑制或降低该靶基因的表达。
选定基因是内源表达基因，其可为来源于宿主植物的基因(例如，Rubisco)或可为宿主植物(例如，烟草或苜蓿)中的转基因(例如，病毒复制酶基因或冠婴基因)。宿主植物的靶基因可选自一给定数据库中的特殊序列(例如，开放阅读框或ORF)。业内已知多个植物序列数据库。例如，已知可用于阿拉伯芥(Arabidopsis)、水稻、苜蓿(Medicago)及大豆等植物的序列数据库。熟习此项技术者熟知许多可用来快速鉴定及筛选DNA序列中之开放阅读框(ORF)的工具。自每一靶基因的ORF，可选出一具有100至200个核苷酸的区段或更长的区域。PCR可用于放大期望克隆于一病毒载体中之片段。该片段以同义/反义取向克隆于一病毒载体中，然后以该载体接种一宿主植物(例如，蒺藜状苜蓿植物)。此外，熟习此项技术者可知拟插入该载体中的区段之取向。PCR产物可通过单步骤克隆直接克隆于病毒载体中。对于单步骤克隆而言，可采用下述策略。首先，自一靶基因选择靶序列。然后，设计并合成引物。在期望限制位点(亦存在于该载体的多克隆位点中)引入5’及3’引物以将靶序列克隆于病毒载体中。实施PCR。使用其位点已在靶序列PCR期间引入的相同限制酶来消化PCR产物。经消化的PCR产物接入载体中。在使用构造研究靶基因的功能活性之前可先进行序列确认。
表1列出了各种基因的核酸区段实例及用来将此等区段克隆于本发明之重组植物病毒载体中的引物。
业内已知，RNA病毒可通过互补的RNA链来复制其基因组。此病毒复制优先于对选定基因在植物细胞中之表达的干扰。对植物细胞内基因表达或RNA沉默的干扰过程可始于当复制载体的RNA量开始增多时。例如，该过程可较早始于以载体接种植物后7天时，而重度RNA沉默可于感染后14天观察到(参见下述实例)。通过对感染植物中之表现型改变与未感染对照植物或与那些以不能诱导基因沉默的载体感染的植物进行比较可确定本发明病毒载体达成之干扰。本文所用表现型改变系指外观或形态改变。或者，或除表现型改变外，所述干扰还可通过分析植物细胞所表达的选定基因之mRNA或蛋白质而加以确定。因此，熟习此项技术者应了解，基因功能可在考虑具体表现型或其它改变之后赋予，其中该等具体表现型或其它改变系通过受本发明病毒载体感染的宿主植物中RNA沉默之干扰而直接或间接导致。
图8中示出了受用于Rubisco沉默的病毒载体感染的蒺藜状苜蓿之照片。与未图示于此的对照相比，图中植物显示萎黄、小叶及灌木状生长。图9示出了烟草属植物的照片，其展示归因于对Rubisco之干扰的表现型改变。右侧植物使用一用于VIGS的病毒载体感染，与左侧对照植物相反，该受感染植物显示出小卷状叶片。
由植物细胞表达的选定基因可为(例如)木质素特异性基因、韧皮部特异性基因、类黄酮途径基因、受体基因、激素基因、针对果实成熟的基因、针对脂肪酸合成的基因、用于淀粉或纤维素合成的基因、针对种子成熟的基因、针对种子发芽的基因、用于加速根部形成的基因、用于组织体外再生的基因、用于转运蛋白组织的基因、用于信号转导的基因、冠婴基因、β-香树素合成酶基因、Rubisco基因或查耳酮合成酶基因，其可发生一可归因于此干扰的基因改变、生化改变或表现型改变。
用于实施本发明方法的重组病毒载体可通过操纵植物病毒(尤其为RNA病毒)的基因组成份来构造。此等植物病毒可为单分裂、双分裂或三分裂病毒且此等病毒已为熟习此项技术者所熟知。“基因组”指病毒的全部基因材料。
该等病毒包括苜蓿花叶病毒(AlMV)、等轴不稳定环斑病毒、南瓜花叶病毒(例如，黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV))、线性病毒或烟草花叶病毒(烟草花叶病毒属)(例如，烟草花叶病毒(TMV)、烟草蚀纹病毒(TEV)、花叶病毒(CMV))以及来自雀麦草花叶病毒属的病毒(例如，雀麦草花叶病毒(BMV)、蚕豆斑点病毒及豇豆萎黄斑点病毒)。其它适宜病毒包括稻坏死病毒(RNV)、及双粒病毒(例如，番茄金黄花叶病毒(TGMV)、木薯潜隐病毒(CLV)及玉蜀黍条纹病毒(MSV))。该等适宜病毒之群中之任一种皆可良好表征且已为熟习此项技术者所熟知。
本发明所用载体可为DNA或RNA形式。较佳的病毒载体为衍生自AlMV及TMV基因组的那些载体。熟习此项技术者已使用该等载体(AlMV及TMV)在植物中产生多肽。参见美国专利第6,042,832号、WO96/12028及WO00/25574。在本发明的一尤佳实施例中，使用苜蓿花叶病毒(AlMV)来制备用于VIGS的载体。该载体可容纳一给定基因(靶基因)的较大片段(例如长度为300个核苷酸的片段)。AlMV为一正义RNA病毒(三分裂病毒)，其基因组由3个基因组RNA及次基因组RNA4组成。AlMV病毒粒由一特殊的蛋白质(24kD)包覆并形成大小(长度为30至60nm，直径为18nm)及形状(球形、椭贺形或杆形)不同的颗粒，视包壳RNA的大小而定。此外，AlMV具有较宽的宿主范围，包括蒺藜狀苜蓿(如下所示)。
图1示出了AlMV的基因组。图1及其它图中RNA3中的箭头(->-)指示次基因组启动子。制备AlMV载体时，在体外转录反应之前，使用SmaI在病毒RNA序列的3’末端将对应于AlMV的基因组RNA1、2(分别为pUT17及pUT27)、3(recRNA3)或次基因组RNA4(pSP65A4)的纯化质粒DNA线性化。在一较佳实施例中，靶基因的一区域被克隆于RNA3中并在植物中表达为基因组RNA3及次基因组RNA4的一部分。
该等载体可具有转录末端区域。转录末端区域是一用于控制该转录物3’末端形成的序列，例如聚腺苷酸化作用序列及自解离核酶。供在其它有机体中表达的末端信号已为熟习此项技术者所熟知。亦可包括供精确剪接转录物的序列。其实例为内含子及转座子。
图2所示为基于供VIGS的载体的不同AlMV(2A及2B)及TMV(2C及2D)之示意图。其中，图2A及2C所示载体用于系统感染，图2B及2D所示载体用于局部感染。字母“s”代表植物表达基因的核酸区段。例如，该区段可为Rubisco基因或β-香树素合成酶基因，见图3。
本文所用重组病毒载体可进行体外转录。当装配完重组基因组成份及异源核酸序列后，可将该组合置于一异源启动子之后(下游)，该启动子可驱使下游序列的体外转录以产生体外转录物。供体转录的有效异源启动子的实例包括噬菌体启动子，例如T7噬菌体启动子或SP6启动子。当装配完此一病毒载体/体外转录载体组合后，用于感染的体外转录物可通过体外转录产生并与体外转录物中将病毒载体维持于植物细胞中所必需的任何其它病毒RNA混合。RNA可使用(例如)阐述于Yusibov等人之文献(1998，Virology，2421-5)中的方法来产生。例如，AlMV RNA的体外转录物可根据制造商导则使用T7(对于基因组RNA1、2及3)或SP6(对于次基因组RNA4)RNA聚合酶(Promega，Madison，WI)及纯化质粒DNA来合成。反应可于100μl体积中进行。转录物使用(例如)RNA帽结构类似物m7G(5)ppp(5)G(Biolabs，Beverly，MA)封闭。
用于感染的体外转录物可通过熟习此项技术者所熟知的任一技术施于植物细胞中。适宜技术包括但不限于手工接种(例如打磨接种，诸如叶片磨擦，在一缓冲溶液中磨擦)、机械喷雾接种、真空渗透、粒子轰击及/或电穿孔。
体外转录产物的混合物包含感染性RNA1、2、3及次基因组RNA4，可用于通过电穿孔法接种宿主植物原生质体(例如，烟草原生质体)。经电穿孔后约20小时时收集样品并进行过滤以实施病毒感染。此样品的等分试样可用于接种宿主植物(例如，蒺藜狀苜蓿种苗)。为了产生一野生型AlMV以供用于对照实验，可使用稀释于FES缓冲液(2ng/μl)中的AlMV颗粒接种一适宜植物(例如，珊西烟(N.tabacum cv.Xanthi-nc)植物)的4片上部叶片(在6叶片阶段)。接种后，可监测植物是否受到病毒感染以及是否出现基因沉默和基因沉默的可见效果。
其中悬浮有重组载体以制备接种物的适宜缓冲溶液已为熟习此项技术者所熟知。例如，植物叶片可在向重组病毒载体的体外转录产物中添加1份体积(v/v)FES缓冲液[1％(w/v)焦磷酸钠，1％(w/v)变水锆石(malacoid)，1％(w/v)C盐，0.5M甘氨酸，0.3M K2HPO4，pH8.5，及磷酸]之后使用其进行接种(如Yusibov等人于1997之文献中所述)。体外转录产物及FES缓冲液的混合物可在使用金刚砂(粒度为320，Fisher，Pittsburgh，PA)打磨叶片表面后施于叶片。通过轻微磨擦以扩散接种物并进一步打磨叶片表面来实施接种。
本发明涵盖具有不同感染能力的不同类型载体。例如，可设计适宜载体用于系统感染。该等载体(如下文实例部分所述)在植物感染及靶基因沉默方面可非常高效。克隆于系统载体中的核酸区段(对于RNA沉默)可改造为在该区段的3′末端而不是在5′末端具有一起始密码子(例如，ATG)。当将此一片段置于一次基因组启动子的控制之下时，此片段并非自身进行翻译，而是为恰在该区段下游的序列提供起始密码子，以便可翻译该等下游序列。该等下游序列可为(例如)AlMV的P3或CP，其不具有起始密码子，该起始密码子可能已在载体消化及将核酸区段克隆于载体中的过程中丢失。该等载体亦可改造为，当引发靶基因沉默的同时亦会引发载体破坏及载体自植物中消除(约于接种后15至20天)，从而可最小化对发生于靶基因沉默后的病毒感染症状(与RNA沉默无关)之干扰。尽管AlMV(载体)可在受感染的蒺藜狀苜蓿植物中持续存在5个月以上，从而产生显著的矮小综合征，但上述经改造的靶构造可在接种后2至3周内清除。在该等植物中，未见到矮小综合征及残余的病毒感染症状。
图6显示在使用能够发生系统扩散的AlMV病毒载体接种后病毒载体在一宿主植物的不同器官中的累积情况。更具体而言，该示意图显示了10dpi(接种后天数)时苜蓿花叶病毒外壳蛋白在蒺藜状苜蓿的子叶(cot)、叶(l)及根(r)中之累积的西方墨点分析。图7显示苜蓿花叶病毒的西方墨点分析，其展示外壳蛋白在蒺藜状苜蓿的子叶(7dpi)及在受系统感染的叶片(14dpi)中之累积。通过14dpi，病毒载体累积可显著降低。
其它适宜载体亦可设计为仅能用于局部感染。该等载体(如下文实例部分所示)在植物感染及仅局部扩散(例如，仅限制于接种叶片，不能在系统内移动)方面可非常高效。本发明所用植物病毒载体需要通过外壳蛋白方可在系统内移动。但局部载体可设计为在外壳蛋白产生方面具有缺陷。通过使包括起始密码子的开放阅读框之若干部分缺失从而外壳蛋白RNA序列不会发生翻译可达成此设计。然而，对复制及细胞间移动非常关键的调节序列(例如，5′及3′非编码区域)必须到位。例如，基于TMV且缺乏CP序列及某些CP序列的Av序列。此等病毒载体仍保持在局部位置。为了测试载体是否能够保持于局部位置且不在系统内扩散，可使用不含外壳蛋白的受感染细胞作为标记物。或者，可使用荧光标记物(例如，可使用Av及Av+GFP作为可见的沉默标记物)。
局部载体(例如系统载体)在植物细胞中复制一段时间后，不仅会对基因表达造成干扰，而且会对载体累积造成干扰(即，定向于载体及基因二者的RNA)。该感染不会扩散于感染区域之外的范围。例如，如果一叶片受到感染，则该感染不会扩散于该叶片之外。
业内已知，基因组激活及系统感染皆需要病毒外壳蛋白基因。然而，基因组激活及系统感染并不需要全长序列。例如，业内已知，许多氨基酸(多达12个氨基酸)可自AlMV外壳蛋白N末端去除而不改变其系统功能。自AlMV外壳蛋白去除14个以上的氨基酸会使该蛋白失去其系统功能。熟习此项技术者已熟知多种自核酸序列去除序列的方法。因此，本发明亦可使用具有突变型或缺失型外壳蛋白核酸序列或病毒基因组成份的载体，以使载体保持于局部范围。亦可将去除及改造方法用于病毒的其它核酸序列，例如，编码移动蛋白的序列。
本发明亦允许抑制受感染植物中一个以上的基因。在一实施例中，就基因沉默的此一方面而言，本发明载体可具有一核酸区段，该核酸区段对应于希望用于沉默的特定植物表达细胞mRNA之全部或其一部分。例如，具有200个核苷酸的核酸区段可具有长度各为50个邻接核苷酸的序列片段(基于4个不同的植物表达基因之序列)且该等序列片段各对应于特定植物表达细胞mRNA之全部或其一部分。因此，核酸区段可构造为具有4个长度各为50个邻接核苷酸的子区段。每一子区段旨在用于特定mRNA的退化，且具有此一核酸区段的复制病毒载体可干扰4个不同基因的表达。因此，该等载体可用于多基因沉默。
在多基因沉默的另一实施例中，本发明之一载体可具有两个核酸区段，该等核酸区段对应于希望用于沉默的特定植物表达细胞mRNA之全部或其一部分。将此两个核酸区段插入载体的不同位置。其中每一核酸区段可具有上段所述的用于多基因沉默的子区段。图4显示了用来干扰2个不同的内源基因在一宿主植物中之表达的载体之示意图。靶基因片段可在2个次基因组启动子下的2个位置插入基因组RNA3(图4A)。在本文中，该类型的载体被称为供双重沉默的载体。核酸区段被表达为基因组及次基因组RNA(移动蛋白(P3)及外壳蛋白(CP))的一部分而非P3及CP之ORF的一部分。此类型的载体可用于系统感染。在图4B中，在2个次基因组启动子下的2个位置将靶基因插入基因组RNA3，但该载体具有一无效CP，因而不能在系统内扩散。次基因组启动子可为自体启动子、异源启动子或合成启动子。
在各种情况下，无论是局部情况还是系统情况，皆可将核酸区段克隆为基因组或次基因组RNA的一部分。然而，此等部分不是P3或CP ORF的一部分且未对该等区段进行翻译。
本发明载体可在不同生长阶段施与，例如，可在苗期、叶期、开花期、种子形成期及成熟期通过根、子叶、叶、种皮、种子、荚果或枝干接种等途径施与。载体接种物可在宿主植物的一或多个位置施与。例如，该接种物可在叶片及根部同时或相继施与。或者，该接种物可在同一位置(例如，在一给定叶片上)以连续间隔施与多次。此时间间隔可视实验条件及拟沉默的靶基因而定。可将两种类型的能够诱导两种不同基因的载体(例如局部及系统载体)混合在一起并在一给定位置或一个以上的位置处施与。
因此，本发明的一个方面提供了一种通过由重组病毒载体引发的RNA沉默来干扰选定基因在植物细胞中表达的方法，其中该载体不能在该宿主植物的系统内移动。该病毒载体具有该选定基因的的一核酸区段，且该载体被设计为能够于感染后发生自我复制并在受感染细胞中产生该核酸区段的转录产物。该核酸区段可自该植物病毒外壳蛋白基因或移动蛋白基因的次基因组启动子表达，并被表达为该外壳蛋白基因或移动蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分。或者，该核酸区段可自一合成次基因组启动子表达，且该核酸区段独立于该外壳蛋白基因或移动蛋白基因的mRNA表达。
本发明的另一方面提供了一种干扰一个以上的基因在植物细胞中之表达的方法。例如，提供了两种不同类型的载体，其中每一类型皆能够使一不同于另一载体的基因沉默。所使用的该第一类型的重组病毒载体(例如，TMV)具有一第一基因的核酸区段，该第二类型的重组病毒载体(例如，TMV)具有一第二基因的核酸区段。亦可使用异源载体使两个不同的基因沉默。例如，可使用具有一第一类植物病毒(例如，单分裂病毒，例如TMV)的重组基因组成份的第一重组病毒载体及具有一第二类植物病毒(例如，三分裂病毒，例如AlMV)的重组基因组成份的第二重组病毒载体。该等载体中至少有一类或两类皆可为系统载体。
在本发明方法中亦涵盖嵌合病毒载体。例如，可使TMV的外壳蛋白核酸序列失活并可将一异源外壳蛋白核酸序列(例如，AlMV)插入。可将该异源外壳蛋白核酸序列改造为使该载体能够在系统内移动或保持于局部区域。此一嵌合载体中的系统扩散功能系由异源外壳蛋白序列赋予。图3C为TMV嵌合载体的示意图。熟习此项技术者已将嵌合病毒载体用于在植物中产生多肽的场合。
本发明亦涉及能够在一适宜宿主植物中诱导RNA沉默的组合物及重组体外转录物。因此，本发明方法及组合物系提供用于干扰基因在植物中之表达的新颖方法。
除非另外指明，否则，本发明使用传统的分子生物学技术、微生物学技术、病毒学技术、重组DNA技术且尤其使用免疫学技术来实施，该等技术皆属于此项技术领域。用于实施本发明的重组植物病毒核酸可使用业内已知的技术来构造。简言之，通过诸如限制酶切、填充突出端以提供钝端、连接体链接等操作可提供片段互补端以便进行连接及链接。在实施各步骤的过程中使用克隆来制得期望的病毒基因组成份及异源核酸组合，以放大DNA量并允许分析此DNA从而确保该等操作皆以正确方式实施。可使用多种克隆载体，其中克隆载体包括一在大肠杆菌中发挥功能的复制系统及一允许选择转化细胞的标记物。实例载体包括pBR332、pUC系列、M13mp系列、pACYCl84等用于操纵一级DNA构造的载体，参见Life Technologies Catalogue(1999)及Amersham PharmaciaBiotech Catalogue(1999)。因此，可在一适当限制酶切位点将序列插入载体中，所得质粒用于转化大肠杆菌宿主，使大肠杆菌生长于一适宜的营养培养基中，收集并裂解细胞，回收质粒。分析可包括序列分析、限制酶切分析、电泳或诸如此类。在每一操作后，可对拟用于最终构造的DNA序列进行限制酶切并将其连接于下一序列，其中各局部构造可克隆于相同或不同质粒中。标准参考文献中已阐述了多种适宜技术，此等技术已为业内所熟知。DNA操作及酶处理皆根据制造商的推荐程序进行。
植物及植物组织(即，将外源DNA稳定纳入植物中)的基因转化可采用多种技术实施且此等技术已为业内所熟知。此包括通过土壤杆菌(agrobacterium)种属之转化及通过直接基因转移之转化。例如，可使用标准的土壤杆菌载体通过一转化方案(例如，如Moloney等人于1989，Plant Cell Rep.，8238-242以及Hinchee等人于1988，Bio/Technol.，6915-922中所述)或业内已熟知的其它技术将嵌合DNA构造引入自双子叶植物(例如，烟草及十字花科芸苔属植物)获得的宿主细胞中。例如，使用T-DNA来转化植物细胞已收到了广泛的研究结果，此详细阐述于Knauf等人(1983)之Genetic Analysis of Host RangeExpression by Agrobacterium，p245，InMolecular Genetics of theBacteria-Plant Interaction，Puhler，A.ed.，Springer-Verlag，NY、Hoekema等人(1985)之Chapter V，InThe Binary Plant Vector SystemOffset-drukkerij Kanters B.V.，Alblasserdam以及An等人(1985)之EMBO J.，4277-284中。简言之，外植体可与根瘤土壤杆菌(A.tumefaciens)或发根土壤杆菌(A.rhizogenes)一起培育，以便将转录构造转移至植物细胞中。在使用土壤杆菌进行转化之后，将植物细胞分散于适宜的培养基中进行选择，随后回收愈伤组织、枝条并最后回收植株。土壤杆菌宿主中将引入一质粒，该质粒中含有将T-DNA转移至植物细胞中所需的病毒基因。另请参见Dodds，J-ed.，Plant Genetic Engineering，Cambridge University Press，Cambridge(1985)。
使用非土壤杆菌技术时允许使用本文所述构造来达成在各种单子叶及双子叶植物以及其它有机体中的表达及转化。该等技术尤其适用于那些在土壤杆菌转化系统中难以处理的种属。其它基因转移技术包括基因枪(Sanfoid，1988，Trends in Biotech，6299-302)、电穿孔法(Fromm等人，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，825824-5828；Riggs及Bates，1986，Proc.Natl.AcadSci.U.S.A.825602-5606)或PEG调介的DNA吸收法(Potrykus等人，1985，Mol.Gen.Genet.，199169-177)。
根据本发明，各种高等及低低植物均属于本发明范围内的宿主植物。成熟植物、籽苗及种子皆包括于本发明范围内。成熟植物指处于除籽苗阶段之外任何发育阶段的植物。籽苗指处于早期发育阶段的非常幼小且未成熟的植物。具体而言，可用作宿主来产生外源序列及多肽的植物包括但不限于被子植物(Angiosperms)、苔藓植物(Bryophytes)(例如，苔纲(Hepaticae)(苔类(liverworts))植物及藓纲(藓类)(Musci(mosses)植物)、蕨类植物(Pteridophytes)(例如，蕨类(ferns)、木賊属(horsetails)及石松类(lycopods))、裸子植物(Gymnosperm)(例如，针叶植物(conifers)、苏铁(cycads)、银杏(Ginkgo)及买麻藤目(Gnetales)植物)及藻类(包括绿藻(Chlorophyceae)、褐藻(Phaeophpyceae)、红藻(Rhodophyceae)、蓝藻(Myxophyceae)、黄藻(Xanthophyceae)及裸藻(Euglenophyceae))。
用于基因沉默的宿主植物视选定植物及地理位置而定可于体内及/或体外生长。重要的是，选定植物适于在适宜田间条件及/或体外条件下培育。植物的生长条件阐述于各种关于植物学、农学、分类学及植物组织培养的基础书籍中且已为业内所熟知。
本发明特别涵盖，在被子植物中可使用各科作物及/或与作物相关的成员。用于本发明方法的植物成员亦包括种间及/或属间杂交、诱变及/基因改造植物。该等科包括且不限于豆科(豆科牧草)(Leguminosae(Fabaceae))，包括豌豆、苜蓿及大豆；禾本科(Gramineae(Poaceae))，包括水稻、玉米及小麦；茄科(Solanaceae)，尤其为番茄属(Lycopersicon)(尤其为番茄类(esculentum(番茄)))，茄属(Solanum)(尤其为马铃薯种(tuberosum(马铃薯))及茄子类(melongena(茄子)))，辣椒属(Capsicum)(尤其为胡椒类(Capsicum annum(胡椒))、烟草属及诸如此类)；伞形科(Umbelliferae)，尤其为胡萝卜属(geneiaDaucus)(尤其为胡萝卜类(carota(胡萝卜))及旱芹类(Apium)，尤其为芹菜类(graveolens dulce(芹菜))及诸如此类)；芸香科(Rutaceae)，尤其为柑橘属(genera Citrus(橙子))及诸如此类；菊科植物(Compositae)，尤其为莴苣属(genus Lactuca species sativa(莴苣))及诸如此类；十字花科植物(Family Cruciferae)，尤其为十字花科芸苔属(genera Brassica)及芥菜种(Sinapis)。十字花科(family Brassicaceae)“营养”作物成员的实例包括但不限于双染色体四倍体植物(例如，芥菜(Brassica juncea(L.)Czern.(mustard))，埃塞俄比亚芥菜(B.carinata Braun(ethopian mustard)))及单基因二倍体植物(例如，棉花(B.oleracen(L.)(cole crops))，黑芥(B.nigra(L.)Koch(black mustard))，白菜型油菜(B.campestris(L)(turnip rape))，及萝卜(Raphanus sativus(L)(radish)))。十字花科“油籽”作物成员的实例包括但不限于甘蓝型油菜(B napus(L)(油菜籽))、油菜(B.campestris(L.))、叶用芥菜(B.tourNifortii)及白芥(B，tounrifortii Sinapis alba(L)(white mustard))。本发明亦涵盖亞麻植物。
尤佳的宿主植物是那些可被AlMV感染的植物。例如，业内已知苜蓿花叶病毒具有全宿主范围。已知可受此病毒感染的其它种属为咖啡黄葵(Abelmoschusesculentus)、大花藿香蓟(Ageratum conyzoides)、大车前(Amaranthuscaudatus)、反枝苋(Amaranthus retroflexus)、金鱼草(Antirrhinum majus)、旱芹(Apium graveolens)、根洋芹(Apium graveolens var rapaceum)、落花生(Arachis hypogaea)、黄耆(Astragalus glycyphyllos)、红添菜(Betavulgaris)、蔓菁(Brassica campestris ssp rapa)、金盏菊(Calendulaofficinalis)、菜椒(Capsicum annuum)、辣椒(Capsicum frutescens)、兰香草(Caryopteris incana)、长春花(Catharanthus roseus)、青葙(Celosiaargentea)、桂竹香(Cheiranthus cheiri)、灰菜(Chenopodium album)、红藜(Chenopodium amaranticol)、绿藜(Chenopodium murale)、白藜(Chenopoditim quinoa)、鹰嘴豆(Cicer arietinum)、Cichium endiva、芫荽(Ciandrun sativum)、美丽猪屎豆(Crotalaria spectabilis)、甜瓜(Cucumismelo)、黄瓜(Cucumis sativus)、北瓜(Cucurbita pepo)、瓜儿豆(Cyamopsistetragonoloba)、胡萝卜(Daucus carota(var.saliva))、美国石竹(Dianthusbarbatus)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、一点红(Emilia sagittata)、甜荞(Fagopyrum esculentum)、大豆(Glycine max)、千日红(Gomphrenaglobosa)、向日葵(Helianthus annuus)、紫花鹊豆(Lablab purpureus)、莴苣(Lactuca sativa)、香豌豆属(Lathyrus odatus)、小扁豆(Lens culinaris)、普通亚麻(Linum usitatissimum)、羽扇豆(Lupinus albus)、番茄(Lycopersiconesculentum)、宽翼豆(Macroptilium lathyroides)、锦葵(Malva parvifla)、紫罗兰(Matthiola incana)、苜荠头(Medicago hispida)、紫花苜蓿(Medicagosativa)、白香草木樨(Melilotus albus)、印地安南西烟草(Nicotianabigelovii)、克利夫兰烟(Nicotiana clevelandii)、debneyi烟(Nicotianadebneyi)、心叶烟(Nicotiana glutinosa)、megalosiphon烟(Nicotianamegalosiphon)、马合烟草(Nicotiana rustica)、林生烟草(Nicotianasylvestris)、角蒿(Nicotiana tabacum)、香菜(Ocimum basilicum)、矮牵牛(Petunia hybrida)、白扁豆(Phaseolus lunatus)、菜豆(Phaseolusvulgaris)、山梅(Philadelphus)、洋酸浆(Physalis flidana)、小果酸浆(Physalis peruviana)、美国商陆(Phytolacca americana)、豌豆(Pisumsativum)、野生马铃薯种(Solanum demissum)、茄子(Solanum melongena)、龙葵(Solanum nigrum)、茄属植物(Solanum nodiflum)、刺萼龙葵(Solamimrostratum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、苣荬菜(Sonchus oleraceus)、菠菜(Spinacia oleracea)、鱼肠菜(Stellaria media)、番杏(Tetragoniatetragonioides)、黄花苜蓿(Trifolium dubium)、杂三叶(Trifoliumhybridum)、绛三叶(Trifolium incarnatum)、红三叶(Trifolhim pratense)、白三叶(TrifoHum repens)、地三叶草(Trifolium subterraneum)、金莲花(tropaeolum majus)、欧洲绣球(Viburnum opulus)、蚕豆(Vicia faba)、绿豆(Yigna radiata)、豇豆(Vigna unguiculata)、长豇豆(Yigna unguiculatassp sesquipedalis)及百日菊(Zinnia elegans)。
下述实例进一步阐释了本发明，但当然不应将其理解为以任何方式限制其范围。除非另外详细说明，下述实例皆使用业内所熟知的标准技术实施。
实例1在转基因P12植物中由RNA触发的AlMV复制酶基因(P1)的基因沉默对于转基因P12植物中AlMV复制酶基因(P1)的VIGS而言，在RNA4的次基因组启动子的控制下将用于编码AlMV P1蛋白质(RNAl)C末端的长度为100个核苷酸的区段改造于AlMV的基因组RNA3中。使用重组病毒构造(NF1-P1)来接种表达AlMV P1及P2(P12)复制酶基因的转基因野生型烟草(Nicotianatabacum(N.tabacum)cv.Samsun NN)植物。接种时，在用金刚砂(粒度为320，Fisher，Pittsburgh，PA)打磨叶片表面后将体外转录产物以1∶2稀释于FES缓冲液中的混合物(RNA4∶RNA3＝1∶1000)施与转基因P12植物的叶片，并轻轻磨擦叶片表面，以使接种物扩散及进一步打磨此表面。在接种后14天时，通过免疫印迹法评价叶片样品是否存在AlMV CP。图5所示为受wt AlMV或NF1-P1感染的植物中之CP的西方墨点分析。在12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离蛋白质，随后转移至一膜中并与不同的抗体反应。对AlMV CP具有特异性的单克隆抗体仅在自受wt RNA3感染的植物中得到的提取物中识别出24.0kDa蛋白质。如图5所示，仅能在接种有野生型RNA3的植物中检测出AlMV CP，但不能在自接种有重组RNA3(含有来自AlMV RNA1的序列)的植物获得的样品中检测出AlMVCP。这些结果表明，RNA1转基因沉默化后可导致对AlMV RNA的抑制。
实例2在蒺藜状苜蓿及烟草属植物中由RNA触发的核酮糖二磷酸羧化酶(Rubisco)的基因沉默以w/t AlMV(c+)或重组病毒(bis)(含有来自核酮糖二磷酸羧化酶短链前驱体的片段)接种植物。在7dpi时病毒在bis的子叶中达到期望累积并与c+的累积相当。然而，14dpi后，AlMV CP在bis中的累积与c+的累积相比显著降低。此结果与在使用含有查耳酮合成酶基因的病毒感染期间所观测到的图片相似。此类病毒累积降低未在wt AlMV感染期间观测到。因此，AlMV累积的降低可能是由基因沉默所致。
结果如图6及图7所示。图6示出了在使用能够在系统内扩散的病毒载体接种后AlMV外壳蛋白在宿主植物的不同器官中的累积情况。更具体而言，图示显示了10dpi(接种后天数)时苜蓿花叶病毒外壳蛋白在蒺藜状苜蓿的子叶(cot)、叶(l)及根(r)中之累积的西方墨点分析。图7所示为苜蓿花叶病毒的西方墨点分析，其展示外壳蛋白在蒺藜状苜蓿的子叶(7dpi)及在受系统感染的叶片(14dpi)中的累积情况。应注意，在14dpi时，AlMV外壳蛋白累积显著降低。
实例3在蒺藜状苜蓿植物中由RNA触发的β-香树素合成酶(bAS)基因的基因沉默为了验证β-香树素合成酶基因在蒺藜状苜蓿植物中的沉默，使用一AlMV载体(含有一供蒺藜状苜蓿之β-香树素合成酶基因的区段)感染该等植物。5dpi时该等植物的西方墨点分析显示CP在植物中局部显著累积。14dpi后的西方墨点分析显示感染植物中的CP显著降低或不存在。使用自受野生型AlMV感染的植物(阳性对照)、受重组AlMV病毒载体(含有β-香树素合成酶片段)感染的植物及健康植物获得的叶片样品进行西方墨点分析。本文中未提供数据。
本说明书引用的所有出版物及参考文献(包括但不限于专利)皆以引用方式全部并入本文中，就如同已特定地及个别地指明将各个出版物或参考文献之整体内容以引用的方式并入一般。尽管已参照具体实施例阐述了本发明，但熟习此项技术者应了解，可对该等方法及组合物进行各种改变，此意味着本发明可以未特定阐述于本文中的其它方式来实施。因此，本发明包括涵盖于如权利要求书所界定的本发明之精神及范畴的所有修改。
表1基因片段及PCR引物的序列
权利要求
1.一种通过经RNA触发的基因沉默来干扰一选定基因在植物细胞中之表达的方法，其中所述基因沉默由一重组病毒载体引发；该方法包括(a)使用所述重组病毒载体在一宿主植物的一或多个位置感染所述植物细胞，所述病毒载体包含一植物病毒的重组基因组成份及所述选定基因的一核酸区段，其中所述载体于感染后能够在所述细胞中发生自我复制并产生所述核酸区段的转录产物，但不能在所述宿主植物内进行系统移动；其中所述核酸区段自所述植物病毒外壳蛋白基因或移动蛋白基因的次基因组启动子表达，并被表达为所述外壳蛋白基因或移动蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分；及(b)使所述宿主植物生长，其中所述转录产物将干扰所述选定基因在所述细胞中的表达。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述选定基因来自所述宿主植物。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述选定基因是木质素特异性基因、韧皮部特异性基因、类黄酮途径基因、受体基因、激素基因、针对果实成熟的基因、针对种子成熟的基因、针对种子发芽的基因、用于加速根部形成的基因、用于组织体外再生的基因、用于转运蛋白组织的基因、用于信号转导的基因、冠婴基因、β-香树素合成酶基因、Rubisco基因或查耳酮合成酶基因。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述选定基因是所述宿主植物中的一转基因。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述转基因是植物病毒复制酶基因或冠婴基因。
6.如权利要求4所述的方法，其中所述转基因来自于单子叶或双子叶植物。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述次基因组启动子不是所述外壳蛋白基因或移动蛋白基因的次基因组启动子，而是一合成次基因组启动子，且所述核酸区段独立于所述mRNA表达。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述病毒是单分裂病毒。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述病毒是烟草花叶病毒。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述病毒是三分裂病毒。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述病毒是AlMV、等轴不稳定环斑病毒或黄瓜花叶病毒。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸区段不会就此出现在所述植物病毒的基因组中。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述核酸区段至少由约20个核苷酸组成。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述核酸区段至多由200个核苷酸组成。
15.一种通过经RNA触发的基因沉默来干扰一选定基因在植物细胞中之表达的方法，该方法包括(a)使用一重组病毒载体在一宿主植物的一或多个位置感染所述细胞，其中所述重组病毒载体是所述细胞中经RNA触发的基因沉默的抑制剂及靶物；所述载体包含一植物病毒的重组基因组成份及所述选定基因的一核酸区段，其中所述载体于感染后能够在所述细胞中发生自我复制并产生所述核酸区段的转录产物，但不能在所述宿主植物内进行系统移动；其中所述核酸区段自所述植物病毒外壳蛋白基因或移动蛋白基因的次基因组启动子表达，并被表达为所述外壳蛋白基因或移动蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分；及(b)使所述宿主植物生长，其中所述转录产物将干扰所述选定基因在所述细胞中的表达。
16.一种通过经RNA触发的基因沉默来干扰一选定基因在植物细胞中之表达及一重组载体在所述细胞中之累积的方法，该方法包括(a)使用所述重组病毒载体在一宿主植物的一或多个位置感染所述细胞，其中所述重组病毒载体是所述宿主植物中经RNA触发的基因沉默的抑制剂及靶物；所述病毒载体包含一植物病毒的重组基因组成份及所述选定基因的一核酸区段，其中所述病毒载体于感染后能够在所述位置发生自我复制并产生所述核酸区段的转录产物，但不能在所述宿主植物内进行系统移动；其中所述核酸区段自所述植物病毒外壳蛋白基因或移动蛋白基因的次基因组启动子表达，并被表达为所述外壳蛋白基因或移动蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分；及(b)使所述宿主植物生长，其中所述转录产物将干扰所述选定基因在所述细胞中的表达及所述重组病毒载体的累积，其中此干扰可通过一归因于此干扰的基因改变、生化改变或表现型改变来确定。
17.一种通过经RNA触发的基因沉默来干扰一选定基因在一宿主植物的植物细胞中之表达的方法，其中所述基因沉默由一重组病毒载体引发；该方法包括(a)使用至少两种类型的重组病毒载体在所述宿主植物的一或多个位置感染所述细胞，从而使所述载体中的每一载体于感染后皆能够在所述位置发生自我复制并产生一核酸区段的转录产物，其中所述核酸区段存在于所述载体的每一载体中，此核酸区段亦可见于所述植物表达的基因之一中；其中所述核酸区段自所述植物病毒外壳蛋白基因或移动蛋白基因的次基因组启动子表达，并被表达为所述外壳蛋白基因或移动蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分；其中一第一类型的重组病毒载体包含一植物病毒的重组基因组成份及一第一基因的核酸区段；其中一第二类型的重组病毒载体包含所述植物病毒的重组基因组成份及一第二基因的核酸区段；其中所述载体是所述宿主植物中经RNA触发的基因沉默的抑制剂及靶物；及(b)使所述宿主植物生长，其中所述转录产物将干扰所述选定基因在所述细胞中的表达。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述载体构造为使所述载体能够进行有限的细胞间移动但不能在所述宿主植物内进行系统移动。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述第一及第二载体在所述宿主植物的相同位置或不同位置同时或依序施与。
20.一种通过经RNA触发的基因沉默来干扰选定基因在一宿主植物的植物细胞中之表达的方法，其中所述基因沉默由一重组病毒载体引发；该方法包括(a)使用一第一重组病毒载体及一第二重组病毒载体在一或多个位置感染所述宿主植物，从而使所述载体中的每一载体于感染后皆能够在所述位置发生自我复制并产生一核酸区段的转录产物，其中所述核酸区段存在于所述载体的每一载体中，此核酸区段亦可见于所述植物表达的基因之一中；其中所述第一重组病毒载体包含一第一类植物病毒的重组基因组成份及一第一基因的核酸区段，从而使所述第一基因的核酸区段自所述第一类植物病毒外壳蛋白基因或移动蛋白基因的次基因组启动子表达，并被表达为所述第一类病毒的外壳蛋白基因或移动蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分；其中所述第二重组病毒载体包含一第二类植物病毒的重组基因组成份及一第二基因的核酸区段，从而使所述第二基因的核酸区段自所述第二类植物病毒外壳蛋白基因或移动蛋白基因的次基因组启动子表达，并被表达为所述第二类病毒的外壳蛋白基因或移动蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分；其中所述载体是所述宿主植物中经RNA触发的基因沉默的抑制剂及靶物；及(b)使所述宿主植物生长，其中所述转录产物将干扰所述基因在所述细胞中的表达。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述第一及第二载体在所述宿主植物的相同位置或不同位置同时或依序施与。
22.一种通过经RNA触发的基因沉默来干扰选定基因在植物细胞中之表达的方法，其中所述基因沉默由一重组病毒载体引发；该方法包括(a)使用一第一重组病毒载体及一第二重组病毒载体在一宿主植物的一或多个位置感染所述细胞，所述第一载体包含一第一类植物病毒的重组基因组成份及一第一基因的核酸区段，从而使所述第一基因的核酸区段自所述第一类植物病毒外壳蛋白基因或移动蛋白基因的次基因组启动子表达，并被表达为所述第一类病毒的外壳蛋白基因或移动蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分；所述第二载体包含一第二类植物病毒的重组基因组成份及一第二基因的核酸区段，从而使所述第二基因的核酸区段自所述第二类植物病毒外壳蛋白基因或移动蛋白基因的次基因组启动子表达，并被表达为所述第二类病毒的外壳蛋白基因或移动蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分；其中所述载体是所述宿主植物中经RNA触发的基因沉默的抑制剂及靶物；其中所述载体中的每一载体于感染后皆能够发生自我复制并产生所述核酸区段的转录产物，其中所述核酸区段存在于所述载体的每一载体中，及其中所述载体中的至少一个载剂能够在所述宿主植物中进行系统移动；及(b)使所述宿主植物生长，其中所述转录产物将干扰所述基因在所述细胞中的表达。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述第一及第二载体在所述宿主植物的相同位置或不同位置同时或依序施与。
24.一种通过经RNA触发的基因沉默来干扰一选定基因在植物细胞中之表达的方法，该方法包括(a)使用一重组病毒载体在一宿主植物的一或多个位置感染所述细胞，所述载体包含AlMV的一重组基因组成份及所述选定基因的一核酸区段，其中所述载体于感染后能够发生自我复制并产生所述核酸区段的转录产物，其中所述核酸区段自所述AlMV外壳蛋白基因或移动蛋白基因的次基因组启动子表达，并被表达为所述外壳蛋白基因或移动蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分；其中所述载体是所述细胞中经RNA触发的基因沉默的抑制剂及靶物；及(b)使所述宿主植物生长，其中所述转录产物将干扰所述选定基因在所述细胞中的表达。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述AlMV的重组基因组成份包括复制酶核酸、一编码移动蛋白的核酸序列及一编码外壳蛋白的核酸序列，所述外壳蛋白编码的核酸序列中缺少一或多个足以防止外壳蛋白翻译的核苷酸。
26.一种通过经RNA触发的基因沉默来干扰选定基因在植物细胞中之表达的方法，该方法包括(a)使用一重组病毒载体在一宿主植物的一或多个位置感染所述细胞，所述载体包括一植物病毒的重组基因组成份；一第一基因的核酸区段，所述区段恰位于移动蛋白核酸序列的上游，其中所述移动蛋白核酸序列包含于所述AlMV的基因组成份中并受控于一同时亦控制所述移动蛋白序列的次基因组启动子；一第二基因的核酸区段，所述区段恰位于外壳蛋白核酸序列的上游，其中所述外壳蛋白核酸序列包含于所述植物病毒的基因组成份中并受控于一同时亦控制所述外壳蛋白序列的次基因组启动子；其中所述载体于感染后能够发生自我复制并产生所述核酸区段的转录产物；及其中所述载体是所述细胞中经RNA触发的基因沉默的抑制剂及靶物；及(b)使所述宿主植物生长，其中所述转录产物将干扰所述第一或所述第二基因在所述细胞中的表达，此干扰可通过一归因于此干扰的基因改变、生化改变或表现型改变来确定。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述植物病毒为TMV或AlMV。
全文摘要
本发明揭示了使用复制重组病毒载体来干扰基因在植物细胞中之表达的方法。一宿主植物在一或多个位置受到一重组病毒载体的感染。该载体是该等植物细胞中经RNA触发的基因沉默的抑制剂及靶物。该载体于感染后能够发生自我复制并产生一核酸区段的转录产物。该转录产物可干扰特定基因在植物细胞中的表达。
文档编号C12N15/63GK1768143SQ03822979
公开日2006年5月3日 申请日期2003年7月25日 优先权日2002年7月25日
发明者维达季·尤西波夫 申请人:美国弗劳恩霍夫股份有限公司